WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

— осушить и налить на стекло несколько капель водного раствора Люголя на 2 мин;

— смыть раствор слабой струей воды и осушить;

— обесцветить в 2 сменах смеси спирта и ацетона (1: 1) путем 4— 5-кратного погружения в каждый;

— смыть проточной водой с двух сторон стекла и осушить;

— окрасить 0,1% водным раствором сафранина О в течение 2 мин;

— смыть краску проточной водой и окончательно высушить препарат.

Таким образом, для оптимизации цитологической диагностики инфекции Н. pylori и оценки ее эрадикации необходимо исследовать полученную brush-способом слизь, взятую не менее чем из 4 участков обоих отделов желудка.

Для повышения качества диагностики и снижения числа ложноположительных результатов при оценке эрадикации необходимо использовать окраску цитологических препаратов по Граму в предложенной модификации.

Фазово-контрастная микроскопия Н. pylori может быть обнаружен до микробиологического или гистологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Н. pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.

Преимущества фазово-контрастной микроскопии:

- нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани;

- исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях;

- результат может быть получен через 1-2 мин.

Процедура выполнения исследования:

1. Поместить биоптат на предметное стекло.

2. Измельчить биоптат на стекле и добавить каплю физиологического расвора.

3. Поместить на измельченный биоптат покровное стекло.

4. Поместить приготовленный препарат в фазово-контрастный микроскоп.

Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с спользованием иммерсионного масла. В препарате - типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.

Иммуногистохимический метод Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Н.

pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Н. pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности СОЖ Н. pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления морфологически измененных (кокковых форм) Н. pylori.

2.3 Методы, основанные на уреазной активности H. pylori Уреазный дыхательный тест В развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал уреазный дыхательный тест, который основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО3 и NH4 +. Из НСО3 образуется СО2, который, попадая в кровоток, затем транспортируется в легкие. Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом С или 14С. Чаще в клинической практике применяется нерадиоакивный стабильный углерод С. С используется реже, так как является источником излучения низкоэнергетических -частиц, которые обнаруживаются сцинтилляционным счетчиком. Изотоп количественно определяют газовым хроматомасс-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.

В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат; в течение 1 часа, с интервалами в 15 минут, у него берут 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение СО2 – СО 2, его экскреция (‰) и считается положительной при значениях выше 5‰.

В ряде стран используется определение изотопного отношения концентраций СО2/СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.

При использовании дыхательного уреазного теста ложноположительные результаты считаются редкими (4-10%), ложноотрицаельные результаты возможны у пациентов, принимавших перед исследованием антисекреторные и висмутсодержащие препараты, которые ингибируют уреазу бактерий, в связи с чем рекомендуется осуществлять диагностику эрадикации уреазными методами не ранее чем через месяц после приема этих препаратов.

Показаниями для проведения УДТ служат: эпидемиологические исследования, скрининг перед эндоскопией и наблюдение больных после лечения.

Метод быстрый, удобный, но ограничен в распространении изза необходимости использовать дорогостоящее оборудование и изотопные препараты. Поскольку уменьшение стоимости изотопа невозможно, были предложены варианты масс-спектрометров на основе лазерного и инфракрасного излучения, стоимость которых существенно ниже. С другой стороны, использование микрокапсул для упаковки мочевины, меченной радиоактивным изотопом, позволило свести к минимуму трудности, связанные с хранением, утилизацией и безопасностью данного изотопа. В США продажа микрокапсул с мочевиной, меченной углеродом, разрешена FDA наравне с обычными лекарственными препаратами через аптечную сеть, что является свидетельством полной безопасности данного изотопа для обследуемых и окружающей среды. Появление такой формы меченной мочевины существенно повышает конкурентноспособность этой методики, т.к. стоимость и самого изотопа, и оборудования для его проведения в среднем меньше в раз, чем масс-спектрометра.

Иногда используют аэротест – определение концентрации аммиака калориметричеким методом в выделяемом воздухе пациента, однако точность метода недостаточно высока.

Быстрый уреазный тест (оценка местной уреазной активности) В основу определения уровня желудочной уреазной активности положен следующий принцип: уреаза катализирует быстрый гидролиз мочевины, находящейся в содержимом желудка. В результате реакции образуется аммиак и углекислый газ, рН среды сдвигается в щелочную сторону и это изменение можно зафиксировать с помощью индикатора. Быстрота изменения окраски индикатора зависит от уреазной активности, которая, в свою очередь, зависит от количества бактерий. В некоторых случаях уреазный тест становится положительным через несколько минут. При малом количестве бактерий изменение окраски в уреазном тесте может произойти через несколько часов, а иногда возможен и ложноотрицательный результат. При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован H.heilmanii, имеющим близкое сродство с Н. pylori. В настоящее время разработано большое количество промышленно изготовленных уреазных тестов, среди которых наиболее распространен CLO-тест (Австралия). В последующем этот метод модифицировали и упрощали: Нр-тест по Varia, CUT-тест, Campyтест (МП ЦОЛИУВ «Стимул»), а также экспресс-методы по Arvid, Yeung, «Хеликотест-экспресс» (ЦНИИ эпидемиологии).

Коммерческий CLO-тест представляет собой гелеобразную таблетку, содержащую мочевину, феноловый красный (индикатор рН) и бактериостатический агент. Биоптат кладут на поверхность таблетки и при наличии уреазы индикатор изменяет ее окраску от желтой до малиновой. Через 20 минут этот тест положителен в 75% случаев, а через 24 часа в 95% случаев у больных с подтвержденным бактериологически хеликобактериозом.

Время появления малинового тона косвенно указывает на количество микроорганизмов:

(+) - незначительная инфицированность (малиновое окрашивание к концу суток);

(++) - умеренная инфицированность (малиновое окрашивание в течение 2 часов);

(+++) - значительная инфицированность (малиновое окрашивание появляется в течение первого часа) (-) - отрицательный результат (малиновое окрашивание не наступает).

В России чаще всего используется уреазный тест, приготовленный, непосредственно в лаборатории. Этот тест экономичен, надежен, прост в использовании.

Применяемые реагенты:

Мочевина - 2 г Феноловый красный 0,5% - 10 г Азид натрия - 20 мг 0,01М фосфатный буфер рН 6,5 - 100 мл Метод приготовления:

Готовят по обычной рецептуре: 0,01М фосфатный буфер рН 6,разливают по флаконам, стерилизуют при +121°С 15 мин. К охлажденному буферу добавляют мочевину - 2 г, раствор фенолового красного и азид натрия (обладающий свойствами консерванта). Цвет реактива должен быть желто-розовым. При подкислении реактива его цвет меняется на соломенно-желтый, при подщелачивании - на малиновый. Приготовленный реактив должен быть соломенно-желтого цвета и может длительно храниться в темной упаковке при температуре +2°С...+6°С.

Процедура выполнения теста (с 2% мочевиной):

1. Поместить 2 капли реагента в пробирки типа эппендорф.

2. Поместить биопсийный материал в первую пробирку, вторая пробирка используется в качестве контрольной.

3. Плотно закрыть пробирки.

4. Записать время начала выполнения теста.

5. Микропробирки инкубируют при температуре +370С.

6. Учитывать результат через 20 мин, 1 ч, 3 ч, 24ч.

При проведении контроля лечения возможно увеличение интервалов времени изменения цвета реактива или получение ложноотрицательных результатов, поэтому тест в данном случае считается неспецифичным.

Таблица 7.

Учет результатов и показатели изменения времени окраски реагента через определенные промежутки времени Время учета 20 мин 1ч 3 ч 24 ч % положительных 75 85 90 результатов Последующие модификации БУТ дали возможность получения более быстрого результата. При использовании незабуферного раствора мочевины положительный результат регистрируют в течение 1 мин у 90% больных хеликобактериозом, подтвержденным бактериологически. Однако этот метод может давать положительные результаты, если результат оценивается позже 1 минуты.

В связи с этим, было предложено использовать 6% раствор мочевины. В этом случае результаты теста учитываются в течение 15 мин.

К недостаткам теста относится его инвазивность, получение ложноотрицательных (при малом количестве микробных тел) или ложноположительных (контаминирование материала другими уреазопродуцентами) результатов, а также невозможность оценить состояние СОЖ.

Этот тест неприемлем для выявления других возможных очагов локализации Н.pylori в желудочно-кишечном тракте - в ротовой полости и толстой кишке из-за нейтральной среды и из-за присутствия там большого количества других уреазопродуцентов.

Экспрессия фермента характерна для таких микроорганизмов, как Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Morganella Morganii, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxitoca.

Невозможность использования уреазного теста для обнаружения во внешней среде очевидна не только из-за его недостаточной чувствительности, но и потому, что Н. pylori принимают кокковую форму, которая не проявляет ферментативной активности.

Несмотря на указанные недостатки БУТ, предлагаемый для идентификации Н. pylori в эпителии желудка вполне адекватен требованиям диагностики, так как ни один другой микроорганизм не заселяет СОЖ в таком большом количестве и не обладает столь мощной уреазной активностью. Преимуществами уреазных тестов является их простота и возможность получения быстрого (в течение нескольких часов, минут) ответа.

Хелик-тест Экспресс-метод (Корниенко Е.А., Милейко В.Е., 1996, патент № 2100010), основанный на уреазной активности H. pylori, неинвазивный. Разработанный учеными Санкт-Петербурга "Хеликтест" базируется на кинетической оценке концентрации аммиака в воздухе полости рта, после приема пациентом порции карбамида (500мл) обычного углеродного состава.

Пациент выдыхает в индикаторную трубку 2 литра воздуха из ротовой полости. Оценивается индикационный эффект (размер темно-синего столба) по шкале или коэффициенту пересчета С (mg/m3) = K(0,1) x L(mm), то есть один миллиметр соответствует 0,1 мг/м3. Затем пациенту предлагается выпить10 мл 5% водного раствора карбамида (0,5г) и 10 мл воды – запить. Через 5 минут повторяли процедуру измерения с другой стороны той же индикаторной трубки. Оценивали прирост концентрации аммиака.

Если прирост превышал 0,5 mg/m3, то тест на H. pylori считается положительным. Селективность и чувствительность теста 95-97 %.

Есть и другие не столь оптимистичные мнения в отношении чувствительности и специфичности данного метода. В соответствии с критериями доказательной медицины, рекомендованными для оценки точности диагностического метода, был проведен анализ информативности "Хелик-теста" (И. Ю.

Исаенко, Воронеж). Такими критериями были: чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность, прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР), прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР).

Чувствительность "Хелик-теста" по сравнению с цитологическим методом составила 100%, специфичность - 0%, диагностическая эффективность - 50%, ПЦПР - 56%, ПЦОР - 0%.

Полученные данные связаны с тем, что слизь, как правило, не снимается полностью с поверхности слизистой оболочки, что снижает надежность диагностики хеликобактериоза. С другой стороны, уплотненный слой слизи при обезвоживании ткани отслаивается, а если и сохраняется, то при стандартных методах окраски очень сложно дифференцировать бактериальные тела.

Чувствительность метода по сравнению с уреазным тестом составила 90%, специфичность - 36%, диагностическая эффективность - 63%, ПЦПР - 56%, ПЦОР - 80%. Положительные результаты "Хелик-теста" при отрицательных данных уреазного теста могут быть связаны с невысокой степенью обсемененности ткани, из-за чего и суммарная уреазная активность инфекции может быть низкой. Вместе с тем иногда встречаются уреазонегативные штаммы бактерии, которые нельзя обнаружить с помощью уреазного теста.

Проведенный сравнительный анализ диагностической информативности "Хелик-теста" со стандартными методами выявления Helicobacter pylori позволяет сделать следующие выводы:

1. Чувствительность "Хелик-теста" составляет 100 - 90%, следовательно, отрицательный результат теста позволяет с большой вероятностью исключить данную инфекцию.

2. Специфичность составляет 30 - 36%, что означает высокую вероятность ложноположительных результатов.

3. Диагностическая эффективность - 63 - 65%, что позволяет использовать метод для исключения хеликобактериоза, а для подтверждения Helicobacter pylori требуется использование других методов.

4. Прогностическая ценность положительного результата 42 - 56%, прогностическая ценность отрицательного результата 80 - 100%.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.