WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Однако этот метод достаточно дорогой. Кроме того, он сопряжен с определенными трудностями, обусловленными необходимостью наличия специальных сред, оптимальной температуры, влажности, качества атмосферного воздуха и т.д. Это приводит к тому, что рост колоний микроорганизмов удается получить далеко не всегда. Неудобство метода связано и с тем, что его результатов приходится ждать, как правило, не менее 10-дней. В клинической практике он применяется в основном в случаях инфекции Н. pylori, резистентной к обычным схемам антигеликобактерной терапии.

H. pylori крайне «капризен», требует специальных условий культивирования и дорогостоящего оборудования. Большой шаг вперед в успешном культивировании H. pylori принадлежит транспортным средам, которые дают возможность продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до суток (среды Стюарта, КэриБлэйера, Био Мерьо).

Таблица 4.

Среды, используемые для транспортировки биопсийного материала Время Среды транспортировки (часы) 4-6 Физиологический раствор Тиогликолевая среда 6-Cary-Blaer Semi-solid Stuart’s (STM) До 48 Pylori Следующий шаг – посев биоптата на неселективные (например, агар «Колумбия») и селективные среды (селективная добавка содержит, например ванкомицин, триметоприм, полимиксин, подавляющие сопутствующей микрофлоры) (таблица 5).

Таблица 5.

Питательные среды для выделения Н. pylori Вид среды Состав среды колумбийский агар – 37 г Неселективная дистиллированная вода – 1000мл среда стерильная цельная баранья, лошадиная, или кроличья кровь – мл полимиксин В – 2500 МЕ/л Селективная среда ванкомицин – 10 мг/л триметоприм – 5 мг/л амфотеррицин В – 10 мг/л трифенилтетразолий хлорид – 40 мг/л Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. H. pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды.

Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0.

Многие штаммы H. pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32°С... +39°С, но не растут при +27°С... +42°С. Время инкубации: первичное исследование – 7 дней, контроль лечения - 14 дней.

На неселективной питательной среде H. pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Н. pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида.

При появлении колоний, сходных по морфологии с H. pylori (диаметром до 0,5 – 2 мм в виде «капель росы» или при сплошном росте, образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Предложена методика полуколичественного определения обсеменения СОЖ в зависимости от числа выросших микробных колоний: до 10 колоний в чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 колоний (4+).

Для идентификации мазки окрашивают по Граму. Под микроскопом в случае H. pylori обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование – уреазная, каталазная, оксидазная активность, H. pylori не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол.

2.2 Морфологические методы Гистологический метод «Гистологический» метод выявления H. pylori считают «золотым стандартом» диагностики инфекции. Его специфичность оценивается как 97%, а чувствительность – 80-90%. Это прямой метод диагностики H. pylori, для которого используют окраски акридиновым оранжевым, по Гимзе, Граму, толуидиновым синим, серебрением по Вартину – Старри и др., он позволяет не только с высокой степенью надежности выявить наличие НР, но и количественно определить степень обсеменения. Наиболее чувствительными оказались окраски: акридиновым оранжевым (85%) и по Гимзе (79%); несколько меньше – по Грамму (72%) и по Вартин-Старри(67%) (Simor A.E. и осавт., 1990) H. pylori располагаются обычно в СОЖ параллельно тяжам мукопротеина, главным образом в зоне межклеточных контактов, могут иметь спиралевидную, изогнутую, S-образную форму, могут быть в виде "крыльев летящей чайки".

Степень обсемененности слизистой оболочки желудка инфекцией H. pylori оценивается методом световой микроскопии по критериям Аруин Л.И. с соавт. (1993), согласно которым выделяют три степени обсемененности слизистой оболочки:

слабая (+) – до 20 микробных тел в поле зрения (при х 630) средняя (++) – 20-50 микробных тел в поле зрения;

высокая (+++) – более 50 микробных тел в поле зрения.

Взятие биопсийного материала производится из мест с максимально выраженной гиперемией и отёком. Взятие материала из дна язв и эрозий, а также из их краев, является ошибкой, поскольку в них нет эпителиальных клеток, обладающих свойствами, необходимыми для адгезии и колонизации H. pylori.

Поскольку бактерии H. pylori могут быть разбросаны по СОЖ в виде очагов, то для повышения чувствительности метода биоптаты целесообразно брать из разных частей желудка.

Таблица 6.

Количество биопсийных образцов для диагностики Н. pylori Вид исследования Количество биоптатов Первичное антральный отдел, вдоль большой исследование кривизны – средняя часть желудка – Контроль лечения антральный отдел, вдоль большой кривизны –средняя часть желудка – Возможность оценить состояние слизистой оболочки желудка, а не только наличие H. pylori – огромное преимущество гистологического метода. Для оценки выраженности морфологических изменений слизистой оболочки желудка пользуются визуально аналоговой шкалой (Dixon M.F. et al., 1994).

Морфологическое исследование позволяет выявить в клетках слизистой оболочки наличие пролиферативных процессов, степень их выраженности, метаплазию (кишечную в желудке и желудочную в двенадцатиперстной кишке), малигнизацию.

Критерием начальной атрофии является снижение высоты желез, выраженной атрофии – определение в поле зрения менее 3-поперечно срезанных желез. При обнаружении кишечной метаплазии оценивают ее тип. I тип (полная тонкокишечная) характеризуется наличием бокаловидных клеток, расположенных среди абсорбтивных с отчетливой щеточной каемкой. При II типе бокаловидные клетки разбросаны среди свойственных желудку эпителиоцитов. Для III типа (неполная, толстокишечная) характерны извитые ветвящиеся крипты, выстланные клетками, напоминающими колоноциты и содержащими сульфомуцины.

По преобладанию тех или иных клеточных элементов судят об активности и выраженности воспаления. Активность фонового гастрита определялась наличием нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки желудка. Выраженность воспаления определялась степенью лимфоплазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки желудка, поверхностного и ямочного эпителия. Согласно критериям Аруин Л.И. с соавт. (1993), принято выделять три степени воспаления:

легкая – слабая инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка;

средняя – умеренная инфильтрация собственной пластинки, поверхностного и ямочного эпителия;

тяжелая – наряду с выраженной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки желудка, поверхностного и ямочного эпителия наблюдаются внутриямочные крипт-абсцессы.

Учитывается наличие лимфатических узелков (фолликулов) с герминативными центрами. Выявление их в 100% случаев позволяет диагностировать H. pylori инфекцию (Аруин Л.И., 1997, Комптон К.К., 1998).

Гистологическое исследование имеет ряд преимуществ:

широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов и возможность их оценки в любое время любым специалистом, который легко сможет провести ретроспективный анализ. Гистологический метод позволяет оценить любую из форм повреждения СО желудка. Исходя из этого, прямая визуализация H. pylori является «золотым стандартом» диагностики геликобактериоза.

Цитологический метод Используется только в России. Метод основан на выявлении бактериальных тел в мазках-отпечатках биоптатов СОЖ. В зависимости от способа получения материала из желудка для дальнейшего цитологического изучения различают несколько вариантов метода:

-crush cytology – раздавливание биоптата;

-imprint, или touch cytology – прикосновение и отпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу;

-brush cytology – получение пристеночной слизи с помощью специальной щеточки, входящей в комплект современных эндоскопов.

Мазки окрашиваются по методу Романовского-Гимзы. Бактерии располагаются в слизи, имеют спиралевидную или S-образную формы. Помимо Н. pylori выявляется также клеточная инфильтрация, представленная лимфоцитами, нейтрофилами, плазматическими клетками и эозинофилами. По преобладанию тех или иных клеток можно приблизительно судить об активности и выраженности воспаления. Цитологическое исследование позволяет выявить наличие пролиферативных процессов, метаплазии и дисплазии, а также оценить степень их выраженности. Можно обнаружить и неопластические изменения, но этот метод недостаточно информирует о структурных изменениях СОЖ. В странах дальнего зарубежья этот метод не используется из-за его очень низкой чувствительности, которая составляет в среднем 18-20%. Н. pylori в цитологических препаратах можно выявить только в случае максимального обсеменения слизистой оболочки.

Несмотря на существенные ограничения данной методики в диагностике H. pylori в нашей стране она играет не последнюю роль. Поэтому, считаем полезным остановиться на мерах оптимизации цитологического метода, предложенных отечественными специалистами для повышения диагностической значимости теста.

Сопоставление цитологических препаратов, приготовленных различными способами, показало, что и crash- и touch-способам присущи объективные недостатки снижающие в конечном итоге качеcтво и надежность диагностики НР инфекции. При раздавливании биоптата на предметном стекле, распределении его материала на площади, около 2 см и удалении нераздавленных фрагментов (соединительная ткань) в препарате присутствует чрезвычайно много клеточных элементов в виде отдельных клеток и эпителиальных пластов, перекрывающих слизистые наложения.

Поэтому поиск бактерий в подобном препарате осуществляется по периферии клеточных скоплений. Это требует особо тщательного просмотра препарата и больших затрат времени.

При отпечатке слизи с люминальной поверхности биоптата в цитологическом препарате оказывается очень мало материала для исследования. Слизь, как правило, не снимается полностью с поверхности слизистой оболочки, что существенно снижает надежность диагностики Н. pylori - инфекции. Качество диагностики этим способом страдает еще больше после проведения неадекватной эрадикационной терапии, когда популяция бактерий в слизи и на поверхности слизистой оболочки снижается, но не уничтожается.

С точки зрения надежности диагностики НР инфекции, наиболее приемлемым оказался brush-способ. При этом необходимо учитывать, что щеточное снятие слизи с поверхности слизистой оболочки в нескольких местах во столько же раз повышает диагностическую надежность. Необходимо, чтобы щеточка при каждом прикосновении погружалась в слизь до клеточной поверхности слизистой оболочки. После этого слизь стряхивается и сдвигается со щеточки на предметное стекло и распределяется на площади не более 1 см С полученным препаратом можно поступить двояко. Если материал собирается от нескольких больных, и диагностика отсрочивается на 1—2 сут, предметные стекла подсушивают на воздухе и хранят в холодильнике. В случае если диагностика осуществляется сразу, предметные стекла подсушивают и фиксируют над пламенем спиртовой горелки в течение 20—30 с на расстоянии не менее 10 см. После этого их окрашивают и изучают в световом микроскопе под иммерсией.

Для элективной окраски НР можно применять разнообразные тинкториальные методики, а также иммуноцитохимический метод.

Однако при очевидных его преимуществах он пока малодоступен в практике. Однако и обычные методы окраски красителем Гимзы, акридиновым оранжевым, серебрение по Вартину—Старри и, конечно, по Граму достаточно специфичны.

Вместе с тем следует использовать и экспресс- методы окраски с доступными, дешевыми реактивами и с хорошей воспроизводимостью с минимальным числом артефактов. В результате сравнения различных способов пришли к выводу, что целесообразно использовать два из них: окраску мазков слизи 0,05% раствором акридинового оранжевого и по Грамму. Для первого способа существуют два ограничения – отсутствие у исследователя люминесцентного микроскопа и кокковая форма бактерий.

Окраска акридиновым оранжевым (5 мг на 10 мл дистиллированной воды или физиологического раствора) осуществляется путем нанесения небольшой капли (15—20 мкл) на поверхность фиксированного мазка. Капля накрывается покровным стеклом, а избыток раствора по его краям отбирается фильтровальвой бумагой. Через 1—2 мин препарат изучают в темном поле люминесцентного микроскопа под объективом с водной иммерсией. Бактерии специфической S-образной формы дают оранжевую флюоресценцию. Способ очень надежен для первичной диагностики и мало пригоден для оценки эрадикации.

По всем параметрам (простоте, специфичности, надежности, доступности реактивов и стоимости) способ окраски во Граму оказался наилучшим. Даже после лечения блокаторами секреции HCl и антигеликобактерными препаратами подтверждена надежность способа при дифференциальной оценке вида кокковой микрофлоры.

При окраске по Граму цитологических препаратов для диагностики НР-инфекции есть особенности при приготовлении красителей и окрашивании, которые необходимо учитывать для достижения хорошего качества. Если обычно используется 1% раствор генциан- или кристаллвиолета, то в нашем случае раствор должен быть 0, 1% и окрашивание проводиться не 1 мин, а 20—с. После каждого красителя обязательно нужно ополаскивать препарат проточной водой и осушать фильтровальной бумагой или марлевым тампоном.

Оптимальный режим окраски цитологического препарата по Граму для диагностики НР-инфекции имеет следующий алгоритм:

— фиксировать препарат над пламенем, как указано выше;

— покрыть зону окрашивания фильтровальной бумагой и нанести на нее несколько капель 0,1% раствора генцианвиолета на 20—30 с;

— снять фильтровальную бумагу и промыть слабой струей проточной воды;

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.