WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 40 | 41 || 43 |

Клетки, в которых индуцировали продукцию HydS, HydL и HydSL, заметно Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina отличаются друг от друга. Нуклеоид (Н) в клетках продуцентов HydS и HydL (рис. 3б, г) распределен дискретно в виде зон небольшой протяженности и отличается высокой степенью компактизации нитей ДНК, что обычно наблюдается в клетках микроорганизмов при стрессовых условиях [21, 22]. В цитоплазме клеток продуцента HydS (рис. 3б) видны обширные включения (до 0,8 мкм) овоидной формы, которые имеют низкую электронную плотность и явное сродство к мембране, что можно объяснить следующим образом. Нативная гидрогеназа в клетках T. roseopersicina является мембрансвязанной и, как полагают, ассоциируется с мембраной посредством N-концевой последовательности HydS. На N-конце малой субъединицы находится сигнальный пептид, содержащий специфичный RRGFLK мотив, узнаваемый белками двойного аргининового транслокационного пути (ТАТ). При помощи данного пути транслокации созревший фермент доставляется и крепится к внешней стороне цитоплазматической мембраны [23, 24]. Продуцент HydL (рис. 3г) имеет гомогенные включения со значительно более высокой электронной плотностью по сравнению с ТВ, присутствующими в продуценте HydS. Эти образования представлены скоплениями множественных мелких (0,1 мкм и менее) глобул неправильной формы, тесно примыкающих друг к другу и занимающих большую часть цитоплазмы клеток. В клетках третьего штамма, продуцирующего обе структурные субъединицы гидрогеназы HydSL (рис. 3е), нуклеоид менее компактизован по сравнению с первыми двумя вариантами. Он имеет много коротких толстых тяжей ДНК и занимает более обширную область цитоплазмы. Синтезирующиеся субъединицы гидрогеназы также выпадают в ТВ: хорошо видны овоидные ТВ HydS, а темные скопления возле них HydL. В продуценте обеих субъединиц ТВ HydL расположены вблизи ТВ HydS в отличие от продуцента одной большой субъединицы, где ТВ распределены по всей цитоплазме.

Наличие Ni в тельцах включения гидрогеназы HydSL как показатель возможного частичного формирования активного центра при гетерологичной экспрессии в E. coli. Образование ТВ при экспрессии многих чужеродных генов в гетерологичной системе E. coli происходит в результате неправильного свертывания и агрегации продуктов экспрессии [25, 26]. Однако ТВ могут содержать достаточно протяженные структуры, напоминающие природные альфа-спирали и бета-складки. Показано, что состав телец включения негомогенен, и, наряду с неправильно свернутыми доменами, могут находиться правильно свернутые последовательности или даже полноценно свернутые белки.

Процент правильно свернутых белков в ТВ варьируется и зависит от специфики белка и условий формирования ТВ. Иногда достаточно простые белковые молекулы сохраняют активность даже в ТВ [27]. Поскольку многие вспомогательные гены T. roseopersicina имеют соответствующие гомологи у E. сoli, существует вероятность того, что экспрессия структурных генов малой и большой субъединиц в клетке E. coli может привести к 372 Г. Н. Ширшикова, А. Н. Хуснутдинова, А. А. Цыганков, А. М. Бутанаев появлению в ТВ полипептидных структур, подобных природным, а также к включению в активный центр никеля и (или) железа и (или) формированию электронпроводящей цепочки, напоминающей природную, и состоящей из железо-серных кластеров.

У Ni-Fe гидрогеназы HydSL белковая оболочка окружает металлсодержащий активный центр, обеспечивая особые условия для работы атомов Ni и Fe. Фермент состоит из малой электронпереносящей субъединицы HydS, содержащей железо-серные (Fe-S) кластеры, и большой каталитической HydL, которая содержит Ni-Fe активный центр. В большой субъединице Ni координирован четырьмя цистеиновыми лигандами, два из которых присоединяют атом железа [28]. Атом железа также координирован диатомными небелковыми лигандами двумя СО и одним СN, что стабилизирует его в низкопотенциальном состоянии. Железосерные кластеры малой субъединицы формируют электронпроводящий канал внутри белковой молекулы, осуществляя перенос электронов от активного центра к поверхности молекулы. Хотя пространственная структура гидрогеназы HydSL из T. roseopersicina не изучена, известно [29], что малая субъединица фермента включает от 10 до 12 атомов железа, составляющих несколько железо-серных кластеров. Большая субъединица в активном центре содержит атом железа и атом никеля. Используя метод атомно-эмиссионной спектрометрии, мы определили содержание железа и никеля в тельцах включения, выделенных из продуцентов малой и большой субъединиц, продуцента обеих субъединиц Ni-Fe гидрогеназы HydSL, а также из контрольного штамма, продуцирующего белок PsbO, который не содержит железа и никеля, но образует ТВ. Результаты измерений показали хорошее совпадение расчетных и фактических данных (молярное соотношение металл/белок) только по никелю у продуцента обеих субъединиц (1.0 и 1.2 mol/mol, соответственно). Присутствие никеля в тельцах включения HydSL позволяет предположить, что для сборки активного центра необходимо участие обеих субъединиц, и возможно, только в этом случае происходит включение металлов в структуры, подобные природному активному центру. Наши предположения подтверждают исследования, проведенные на HoxBC Ni-Fe гидрогеназе из Ralstonia eutropha, где экспрессия только большой субъединицы приводит лишь к частичной сборке активного центра [30].

Заключение Нам удалось, клонируя (порознь и совместно) структурные гены Ni-Fe гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina, подобрав оптимальные концентрации антибиотика для выравнивания продукции малой (HydS) и большой (HydL) субъединиц и используя такие методы в исследовании гидрогеназы как электронная микроскопия штаммов-продуцентов и определение металлов в тельцах включения, получить в Escherichia coli Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina гетерологичную экспрессию структурных генов гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina и показать возможность включения никеля в активный центр фермента даже в ТВ, но лишь при совместной продукции обеих субъединиц. В литературе отсутствуют данные о посубъединичном клонировании структурных генов Ni-Fe гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina, их экспрессии в гетерологичной системе E. coli и определении металлов в ТВ, поэтому наши результаты могут служить отправными для дальнейших более детальных исследований.

Список литературы 1. Vignais P.M., Billoud B. Classification, and biological function of hydrogenases: an overview // Chem. Rev. 2007. V.107. P.4206–4272.

2. Morozov S.V., Voronin O.G., Karyakina E.E. Tolerance to oxygen of hydrogen enzyme electrodes // Electrochem. Comm. 2006. V.8. P.851–854.

3. Karyakin A.A., Morozov S.V., Voronin O.G. The limiting performance characteristics in ioelectrocatalysis of hydrogen enzymes // Angew. Chem. 2007. V.119.

P.7382–7384.

4. Цыганков А.А., Гоготов И.Н. Непрерывное культивирование фототрофных бактерий // Прикл. Биохим. Микробиол. 1979. Т.15. С.665–670.

5. Umeda F., Min H., Urushihara M. Conjugal transfer of hydrogen-oxidizing ability of Alcaligenes hydrogenophilus to Pseudomonas oxalaticus // Biochem. Biophys. Res.

Commun. 1986. V.137. P.108–113.

6. Mura G.M., Pedroni P., Pratesi C. The [Ni-Fe] hydrogenase from the thermophilic bacterium Acetomicrobium flavidum // Microbiology. 1996. V.142. P.829–836.

7. Asada Y., Koike Y., Schnackenberg J. Heterologous expression of clostridial hydrogenase in the Cyanobacterium synechococcus PCC7942 // Biochim Biophys Acta.

2000. V.1490. №3. Р.269–278.

8. Rousset M., Magro V., Forget N. Heterologous expression of the Desulfovibrio gigas [NiFe] hydrogenase in Desulfovibrio fructosovorans MR400 // J. Bacteriol. 1998.

V.180. P.4982–4986.

9. Laurinavichene T.V., Rkhely G., Kovcs K.L. The effect of sulfur compounds on H2 evolution/consumption reactions, mediated by various hydrogenases, in the purple sulfur bacterium, Thiocapsa roseopersicina // Arch. Microbiol. 2007. V.188, №4. Р.403–410.

10. Laurinavichene T.V., Tsygankov A.A. H2 consumption by Escherichia coli coupled via hydrogenase 1 or hydrogenase 2 to different terminal electron acceptors // FEMS microbiology letters. 2001. V.202, №1. Р.121–124.

11. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1963. V.17. P.208–213.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

13. Rousset M., Magro V., Forget N. Heterologous expression of the Desulfovibrio gigas [NiFe] hydrogenase in Desulfovibrio fructosovorans MR400 // J. Bacteriol. 1998.

V.180. P.4982–4986.

374 Г. Н. Ширшикова, А. Н. Хуснутдинова, А. А. Цыганков, А. М. Бутанаев 14. Lenz O., Gleiche A., Strack A. Requirements for Heterologous Production of a Complex Metalloenzyme: the Membrane-Bound [NiFe] Hydrogenase // J. Bacteriol.

2005. V.187, №18. P.6590–6595.

15. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П. и др. в 2-х томах. М.: Мир, 1997. Т.1. 432 с.

16. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. М.: Академия, 2007. 352 с.

17. Bck A., King P.W., Blokesch M. Maturation of hydrogenases // Advances in Microbial Physiology. 2006. V.51. P.1–71.

18. Marti G., Fodor B.D., Rakhely G. Accessory proteins functioning selectively and pleiotropically in the biosynthesis of [NiFe] hydrogenases in Thiocapsa roseopersicina // Eur. J. Biochem. 2003. V.270. P.2218–2227.

19. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т.1. Генная и белковая инженерия. М.: Наука, 2004. 526 с.

20. Lee S.Y., Lee H.J., Park J.-M. Bacterial hydrogen production in recombinant Escherichia coli harboring a HupSL hydrogenase isolated from Rhodobacter sphaeroides under anaerobic dark culture // Intern. J. Hydrogen Energy. 2010. V.35.

P.1112–1116.

21. Сузина Н.Е., Ставская С.С., Фихте Б.А. Изменения в ультраструктурной организации клеток Pseudomonas aeruginosa под действием додецилсульфата натрия // Микробиология. 1988. Т.57. С.255–257.

22. Suzina N.E., Moulyukin A.L., Dmitriev V.V. The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-forming bacteria // Advances in Space Research. 2006. V.38.

Р.1209–1219.

23. Vignais P.M., Billoud B., Meyer J. Classification and phylogeny of hydrogenases // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V.25. P.455–501.

24. Wu L.F., Chanal A., Rodrigue A. Membrane targeting and translocation of bacterial hydrogenases // Arch. Microbiol. 2000. V.173. P.319–324.

25. Kopito R.R. Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation // Trends Cell Biol. 2000. V.10. P.524–530.

26. Villaverde A., Carrio M.M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies // Biotechnol. Lett. 2003. V.25. P.1385–1395.

27. Garca-Fruits E., Martnez-Alonso M., Gonzlez-Montalbn N. Divergent genetic control of protein solubility and conformational quality in Escherichia coli // J. Mol.

Biol. 2007. V.374. P.195–205.

28. Kovcs K.L., Kovcs A.T., Marti G. Hydrogenases of Thiocapsa roseopersicina // Biochem. Soc. Trans. 2005. V.33. P.61–63.

29. Szilagyi A., Kovcs K.L., Rkhely G. Homology modeling reveals the structural background of the striking difference in thermal stability between two related NiFe hydrogenases // J. Molecular Modeling. 2002. V.8. P.58–64.

30. Winter G., Buhrke T., Lenz O. A model system for [NiFe] hydrogenase maturation studies: Purification of an active site-containing hydrogenase large subunit without small subunit // FEBS Lett. 2005. V.579. P.4292–4296.

Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina Ширшикова Галина Николаевна (gsh99@rambler.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Хуснутдинова Анна Наилевна (hvosta@gmail.com), младший научный сотрудник, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Цыганков Анатолий Анатольевич (ttt-00@mail.ru), д.б.н., заведующий лабораторией, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Бутанаев Александр Михайлович (boutanaev@mail.ru), к.б.н., и.о. зав.

сектором, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Thermostable [NiFe]-containing HydSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina: to study the enzyme production in Escherichia coli heterologous system G. N. Shirshikova, A. N. Khusnutdinova, A. A. Tsygankov, A. M. Butanaev Abstract. Thermostable Ni-Fe containing HydSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina is a dimer, consisting of the small (HydS, 39 kDa) and the large (HydL, 64 kDa) subunits, which are encoded by hydS (1100 b.p.) and hydL (b.p.) structural genes, respectively. This work describes an expression of the hydrogenase structural genes in Escherichia coli both separately and jointly. In all cases, hydrogenase subunits precipitated into inclusion bodies (IB) that have different electronic densities, as shown by electron microscopy of producers. We showed that the presence of Ni in IBs is only possible at simultaneous expression of both subunits. The obtained results allowed us to suggest that the expression of at least two structural genes in the same cell is required for the successful maturation of the active enzyme center in Escherichia coli heterologous system.

Keywords: Ni-Fe hydrogenase, heterologous expression, purple sulfur bacteria, Escherichia coli.

Shirshikova Galina (gsh99@rambler.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Khusnutdinova Anna (hvosta@gmail.com), junior researcher, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Tsygankov Anatoly (ttt-00@mail.ru), doctor of biological sciences, head of laboratory, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Boutanaev Alexander (boutanaev@mail.ru), candidate of biological sciences, section head, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Pages:     | 1 |   ...   | 40 | 41 || 43 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.