WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 39 | 40 || 42 | 43 |

roseopersicina, и кишечник млекопитающих и человека для E. coli). Кроме того, они имеют принципиально разные типы питания (преимущественно фотогетеротрофный для T. roseopersicina и хемогетеротрофный для кишечной палочки). Вместе с тем, их экологические ниши предполагают прямой контакт с молекулярным водородом. Поэтому эти бактерии содержат много разных гидрогеназ, кодируемых разными генами и синтезирующихся в разных условиях. Обе бактерии способны к поглощению и выделению водорода при брожении. Более того, T. roseopersicina способна к поглощению водорода при дыхании и фотосинтезе, а E. coli также может поглощать Н2 за счет функционирования hya гидрогеназы [9, 10]. Таким образом, несмотря на различные экологические ниши, занимаемые бактериями, можно полагать, что основные биохимические пути созревания активного центра этих ферментов у Thiocapsa и E. coli эволюционно консервативны.

Целью данной работы являлось создание штамма-продуцента E. coli, накапливающего обе субъединицы Ni-Fe гидрогеназы HydSL в одной клетке, и изучение возможности созревания фермента.

Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina Материалы и методы Штаммы E. coli и условия выращивания. В работе использовали штаммы E. coli DH5 и BL21 (DE3). Клетки E. coli выращивали при +37С на среде Луриа-Бертани (ЛБ): триптон 1%, дрожжевой экстракт 0.5%, NaCl 1%, pH 7.5); в случае твердой среды 2% агара. Выращивание жидкой культуры проводили при постоянном перемешивании 240 об/мин на орбитальном шейкере IKA KS 4000i control (IKA, Германия). Содержание антибиотиков в среде выращивания составляло: ампициллин (Am) мкг/мл в жидкой среде и 100 мкг/мл в агаризованной, хлорамфеникол (Cm) 17 мкг/мл в жидкой среде и 34 мкг/мл в агаризованной.

Плазмиды. В работе использовали плазмиды pET22b (Novagen, США) и p15KS(+) (предоставлена проф. Fischer и Hengstenberg, Германия).

Амплификация генов hydS и hydL из геномной ДНК T.

roseopersicina BBS. Последовательности структурных генов Ni-Fe гидрогеназы HydSL известны и доступны в базе данных Genbank.

Мы использовали их для полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую ставили на термоциклере фирмы Eppendorf (Германия). Прямой и обратный праймеры: для hydS 5’-AAACATATGGCTGCCCGTAACCCCACT-3’ (NdeI) и 5’-ACCGAATTCTTATAGCTTGGCCTCCAATTCT-3’ (EcoRI) соответственно, для hydL 5’-AAAGAATTCATGAGCGAACGCATCGTC-3’ (EcoRI) и 5’-CCGAAGCTTTTAGGTGATCTTGATCTCCATC-3’ (HindIII) соответственно.

Смесь для ПЦР (50 мкл) содержала 100 нг геномной ДНК, по 200 нМ каждого из праймеров, по 2 мкМ каждого из 4 дНТФ, 2.0 мМ MgCl2, мкл х10 реакционного буфера и 5 ед. Pfu-полимеразы (СибЭнзим, Россия).

Условия амплификации для обоих генов: 94С/3 мин; 94С/30 с, 59С/с, 72С/2 мин – 30 циклов; 72С/5 мин. Продукты ПЦР анализировали в 1%-ном агарозном геле.

Создание конструкций для экспрессии структурных генов гидрогеназы. ДНК амплифицированных фрагментов hydS и hydL выделяли из агарозного геля посредством набора QIAquick Gel Extraction Kit (50) (QIAGEN, Германия). Последовательность обоих генов была подтверждена секвенированием. Фрагмент ДНК hydS обрабатывали рестриктазами NdeI и EcoRI, лигировали с ДНК вектора pET22b, обработанной теми же рестриктазами и трансформировали лигазной смесью штамм E coli DH5. Таким образом, получили плазмиду pET22b-hydS. Фрагмент ДНК hydL обрабатывали рестриктазами EcoRI и HindIII, лигировали с ДНК вектора pET22b-hydS и трансформировали лигазной смесью штамм E coli DH5. Получена плазмида pET22b-hydS-hydL. Далее ДНК плазмиды pET22b-hydS-hydL обрабатывали рестриктазами NdeI и EcoRI, выделяли из агарозного геля фрагмент pET22b-hydL, заполняли концы с помощью полимеразы Т4, лигировали и трансформировали штамм DH5. Таким образом, получили плазмиду pET22b-hydL. ДНК плазмиды pET22b-hydL 366 Г. Н. Ширшикова, А. Н. Хуснутдинова, А. А. Цыганков, А. М. Бутанаев обрабатывали рестриктазами BglII и NotI, выделяли фрагмент, содержащий ген hydL вместе с Т7-промотором, лигировали его с ДНК плазмиды p15KS(+), обработанной рестриктазами BamHI и NotI, и лигазной смесью трансформировали штамм DH5. Так получили плазмиду p15-hydL. Далее плазмиды pET22b-hydS, pET22b-hydL и pET22b-hydS-hydL переносили в штамм BL21 (DE3) для получения продукции субъединиц гидрогеназы в клетках E. coli. Кроме того, BL21 (DE3) последовательно трансформировали ДНК плазмид pET22b-hydS и p15-hydL для получения продуцента E. coli, в котором структурные гены субъединиц расположены на разных плазмидах.

Трансформация. Штаммы E. coli трансформировали плазмидной ДНК на электропораторе MicroPulser (Bio-Rad, США) с контролируемым импульсом в 0.1 см кювете при значении силы поля 1.75 кВ/см, достигаемом за один импульс на образец. Электрокомпетентные клетки E. coli готовили предварительно, как указано в описании к электропоратору MicroPulser, и хранили при -70С. После электропорации клетки из кюветы переносили в 1 мл среды SOC, выдерживали 1 час при +37С, затем отбирали аликвоту и высевали на чашку с агаризованной средой ЛБ, содержащей антибиотик.

Индукция экспрессии генов в стандартных условиях, а также при пониженной температуре, в анаэробных условиях и с добавкой никеля. Клетки E. coli выращивали ночь в жидкой культуре на качалке при +37С. Утром ночной суспензией (0.2 мл) инокулировали 5 мл свежей LB с соответствующим антибиотиком. Далее растили: стандартно при +37С, а также при t = +23C или с добавкой никель (1 мкл 20 мМ NiCl2 на 1 мл суспензии клеток) до наступления ранней логарифмической фазы (плотность при 600 = 0.6). Вариант анаэробного выращивания переносили в пробирку с крышкой, заполняя ее до верха. Затем в опытные варианты добавляли индуктор IPTG в конечной концентрации 1 мМ и продолжали выращивание: t = +37C 2.5 ч, = +23C 5 ч, анаэробно 4 ч и с добавкой Ni 3 ч. К каждому варианту был контроль без индукции. По окончании выращивания осаждали в эппендорфы по мл суспензии клеток, супернатант удаляли, а осадки использовали для белкового SDS-электрофореза.

Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях.

Белки разделяли в вертикальных пластинах 10%-ного полиакриламидного геля в денатурирующих условиях (ДДС-Na) при комнатной температуре с силой тока 40 мА в течение 30–40 мин в камере фирмы BioRad (США).

После завершения электрофореза белки окрашивали, выдерживая гель в течение 30 мин в растворе, содержащем 0.25% Кумасси R-250, 45% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты. Затем раствор удаляли, а гель кипятили в дистиллированной воде 2–5 мин до проявления четких полос.

Электронная микроскопия. Образцы фиксировали в 1,5%-ом растворе глутарового альдегида на 0,05М какодилатном буфере (рН 7,2) и затем в 1%-м растворе OsO4 в том же буфере. После обезвоживания в серии спиртов материал заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Ультратонкие Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina срезы монтировали на опорные сеточки, контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [11]. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Выделение телец включения. Клетки E. coli, в которых была индуцирована экспрессия генов, осаждали в течение 15 минут при об/мин на центрифуге К-23 (Janetzki, ГДР). Осадок суспендировали в 2 мл буфера для дезинтеграции (50 mM Tris-HCl pH=8,0, 50 mM NaCl и 0,5% Triton X-100), а затем разрушили ультразвуком на приборе УЗГ-13-0,1/(ВНИИТВЧ, Санкт-Петербург, Россия) режим 2, охлаждая во льду между разрушениями в течение 2 мин. После разрушения гомогенат центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин на центрифуге с охлаждением Centrifuge 5417R (Eppendorf, Германия). Осадок дважды промывали в 2 мл того же буфера, получая в осадке тельца включения.

Определение металлов. Содержание Fe и Ni в тельцах включения HydS, HydL и HydSL определяли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Optima 2100 DV (PerkinElmer, США).

Приготовление сред и буферов, а также стандартные процедуры рестрикции эндонуклеазами, лигирование ДНК, электрофорез в агарозном и полиакриламидном гелях выполняли, как описано в [12].

Результаты и обсуждение Работы в области получения нативной Ni-Fe гидрогеназы, которые ведутся во многих научных лабораториях, пока позволили получить активный фермент только при гетерологичной экспрессии в близкородственных организмах [13, 14]. В наших экспериментах мы использовали две бактерии, не являющиеся близкими родственниками (рис. 1), но имеющие много общего в метаболизме водорода.

Клонирование и индукция экспрессии структурных генов hydS и hydL гидрогеназы HydSL. Мембрансвязанная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из T. roseopersicina представляет собой димер, состоящий из малой (HydS, 39 кДа) и большой (HydL, 64 кДа) субъединиц, которые кодируются структурными генами hydS (1100 п.н.) и hydL (1700 п.н.).

Гены были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции и использованы для создания генетических конструкций.

Кроме структурных генов гидрогеназы, важную роль играют также аксессорные (вспомогательные) гены, кодирующие ответственные за созревание фермента белки. Все содержащие Ni-Fe гидрогеназу протеобактерии, в том числе Thiocapsa и E. coli, имеют сходный набор как минимум семи аксессорных hyp генов [1]. Но у T. roseopersicina они не расположены в отдельном опероне, а распределены по всему геному, что не позволяет клонировать полностью весь оперон, содержащий 368 Г. Н. Ширшикова, А. Н. Хуснутдинова, А. А. Цыганков, А. М. Бутанаев Рис. 1. Филогенетическое положение Thiocapsa roseopersicina и Escherichia coli [15, 16] структурные и аксессорные гены, как у Ralstonia eutropha H16 [14].

Поскольку E. coli способна к синтезу не менее 4 собственных гидрогеназ, использующих универсальный набор аксессорных генов hyp-оперона [17, 18], мы предположили, что в определенных условиях экспрессия структурных генов hydSL гидрогеназы T. roseopersicina в E. coli может привести к появлению функционально активных молекул фермента при участии аксессорных генов E. coli.

Первые генетические конструкции, созданные нами, имели собранные в один искусственный оперон структурные гены hydS и hydL, которые находились под промотором фага Т7. При анализе продуктов экспрессии оказалось, что если два структурных гена присутствуют на одной плазмиде pET22b, то продукт второго гена практически отсутствует. При этом происходила экспрессия только того гена, который стоял первым после промотора в конструкции для экспрессии (данные не приведены). Поэтому структурные гены были разнесены в две плазмиды: pET22b и p15KS(+), относящиеся к разным группам совместимости. Это позволило нам получить штаммы-продуценты отдельно малой (HydS), отдельно большой (HydL) и обеих вместе субъединиц Ni-Fe гидрогеназы HydSL. При индукции генов hydS и hydL в трех вариантах продуцентов (HydS, HydL и HydS+HydL) происходило накопление продуктов их экспрессии (рис. 2).

При культивировании продуцента двух субъединиц на среде с концентрацией антибиотиков: ампициллин (Am) 50 мкг/мл и хлорамфеникол (Cm) 25 мкг/мл, мы наблюдали на электрофореграмме ПААГ хорошую продукцию малой субъединицы HydS и гораздо меньшую большой субъединицы HydL. Для получения примерно эквимолярного соотношения субъединиц была изменена концентрация антибиотиков в среде культивирования. Плазмида pET22b (Am), которая несет ген малой субъединицы HydS, многокопийная, а p15КS(+) (Cm) с геном hydL малокопийная. Мы понизили селективное давление на плазмиду pET22b, Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina убрав из среды культивирования ампициллин и снизив концентрацию хлорамфеникола до 17 мкг/мл. Так был увеличен выход белкового продукта HydL, что и отражено на рис. 2, дорожка 6.

На электрофореграммах белковых экстрактов из клеток-продуцентов E.

coli мы обнаружили, что малая и большая субъединицы гидрогеназы при их экспрессии как раздельно, так и совместно в одной клетке находились в нерастворимой мембранной фракции в виде телец включения (ТВ).

Рис. 2. Электрофореграмма белков, полученных при экспрессии в E. coli структурных генов малой HydS (2), большой HydL (4) и обеих вместе (6) субъединиц термостабильной гидрогеназы HydSL из T. roseopersicina (М белковые метчики; 1, 3, 5 неиндуцированная культура) Для повышения вероятности получения белковых субъединиц в растворимой фазе рекомбинантные клетки выращивают при пониженной температуре, в анаэробных условиях, а также добавляя в среду культивирования металлы для металлсодержащих белков [19, 20]. Проведя индукцию экспрессии структурных генов гидрогеназы в клетках E. coli при +23С, добавив в среду при выращивании продуцентов ионы никеля в конечной концентрации 0.02 мМ, т.к. никель требуется для формирования активного центра, и вырастив штаммы-продуценты в анаэробных условиях, мы не обнаружили появления белковых субъединиц HydS, HydL и HydSL в растворимой фракции. Электрофореграммы белков из последних экспериментов не отличались от изображенных на рис. 3 и поэтому не приведены.

Для подтверждения этого предположения мы провели электронномикроскопическое исследование продуцентов E. coli, синтезирующих малую, большую и обе вместе субъединицы гидрогеназы.

370 Г. Н. Ширшикова, А. Н. Хуснутдинова, А. А. Цыганков, А. М. Бутанаев Электронно-микроскопические исследования штаммов E.

coli продуцентов субъединиц гидрогеназы HydSL. Мы провели электронно-микроскопическое исследование трех продуцентов E. coli, синтезирующих отдельно малую, большую, а также обе субъединицы гидрогеназы вместе. На электронных микрофотографиях видно, что контрольные клетки, в которых не было индукции синтеза субъединиц, имеют сходную морфологию и ультраструктурную организацию (рис. 3).

Рис. 3. Ультратонкий срез клеток E. coli BL21 (DE3): контрольных вариантов без индукции (а, в, д) и продуцентов (б, г, е) малой HydS (а, б), большой HydL (в, г) и двух субъединиц (д, е) термостабильной гидрогеназы HydSL из T. roseopersicina. Обозначения: Н нуклеоид, Ц цитоплазма, ТВ тельца включения. Длина масштабной линейки 0,мкм Во всех контрольных вариантах (рис. 3а, в, д) нуклеоид распределен диффузно по центральной части цитоплазмы клеток и выявляется в виде просветленных зон с характерным гранулярно-сетчатым строением.

Pages:     | 1 |   ...   | 39 | 40 || 42 | 43 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.