WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 35 | 36 || 38 | 39 |   ...   | 43 |

ПЦР проводили в следующем режиме: 95C 1 мин, 1 цикл; затем циклов: денатурация 94C 30 с, отжиг 40 с (при соответствующих Tm, указанных в табл. 1), элонгация 72 C 1.5 мин, и достройка 72C 1 мин, 1 цикл.

Таблица Нуклеотидные последовательности праймеров Праймер Последовательность (5 – 3 ) Ген Температура отжига Acea1f GGT ACC ATA ACT ATG GAG CAT CTG CAC aceA Acear GAA TTC GTT GTT GCT TAG AAC TGC GA aceA P-AM1f GGT ACC AAC GAT CAC TCC ACC GGG TT phaC P-AM1r GTC GAC TGT TGC AAC GCG CTT CTA TC phaC Праймеры были синтезированы в ЗАО Синтол (г. Москва). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Элюцию фрагментов из агарозного геля проводили, используя набор Wizard SV Gel (Promega, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Конструирование плазмид для экспрессии изоцитратлиазы и ПГБ-синтазы. Для экспрессии изоцитратлиазы в метилобактериях получали плазмиду pACE, содержащую ген aceA из E. coli K-12 под контролем регулируемого промотора метанолдегидрогеназы (PmxaF).

Фрагмент ДНК из E. coli K-12 (NCBI GenBank NP_418439.1), содержащий ген aceA размером 1304 п.н., амплифицировали при помощи ПЦР с Taq-полимеразой и праймерами Aceaf1/Acear1. Фрагмент клонировали в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Литва) по А-Т сайтам. Затем из полученного вектора pTZ57R/T-aceA вырезали фрагмент ДНК, содержащий ген aceA, по сайтам EcoRI и KpnI и субклонировали в плазмидном векторе pCM 160 [16], линеаризованном этими же рестриктазами.

Для экспрессии ПГБ-синтазы в M. extorquens G10 использовали плазмиду pPHA, несущую ген phaC c собственной промоторной областью.

Соответствующий фрагмент ДНК (1817 п.н.), содержащий ген phaC и промоторную область (NCBI GenBank YP_002964321.1), амплифицировали из геномной ДНК M. extorquens AM1 при помощи ПЦР с Taq-полимеразой и парой праймеров P-AM1f/P-AM1r, и клонировали в вектор pTZ57R/T по А-Т сайтам. Затем данный фрагмент ДНК вырезали из вектора pTZ57R/T-phaC по сайтам EcoRI и субклонировали в плазмидном векторе pCM 160, линеаризованном этой же рестриктазой.

Для введения гена aceA E. coli в хромосому M. extorquens Gиспользовали плазмиду pTnACE, которую получали на основе вектора pTn-modOKm. Данный вектор является пласпозоном, способным к Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата единичному переносу генетического материала между репликонами [17].

Для конструирования pTnACE плазмиду pACE, содержащую ген aceA под контролем PmxaF, гидролизовали эндонуклеазой рестрикции VneI, обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой в присутствии дНТФ для получения тупых концов, затем гидролизовали эндонуклеазой рестрикции NheI и полученный фрагмент помещали в вектор pTn-modOKm, линеаризованный по сайтам SmiI и SpeI.

Гидролиз ДНК проводили, используя для каждой эндонуклеазы рестрикции соответствующий буфер и температурный режим. Полученные генетические конструкции для генов phaC и aceA трансформировали в штамм E.coli XLI-blue. Наличие генов в трансформантах проверяли ПЦР. Далее рекомбинантные плазмиды pACE, pPHA и pTnACE трансформировали в коньюгативный штамм E. coli S17-1. Анализ уровня экспрессии клонированных белков у полученных колоний проводили стандартным электрофорезом по методу Лэммли [18].

Приготовление компетентных клеток и трансформация E. coli.

Компетентные клетки штаммов E. coli и их трансформацию проводили модифицированным кальциевым методом [19]. Отбор трансформантов осуществляли на агаризованных средах с добавлением канамицина (мкг/мл).

Коньюгативный перенос плазмидной ДНК из E. coli в метилобактерии. Клетки E.coli S17-1, несущие плазмидный вектор со вставкой, выращивали при 37C в течение 24 ч с добавлением канамицина (50 мкг/мл). Для коньюгации отбирали 1 мл культуры и центрифугировали (4000 об/мин, 30 мин) для осаждения клеток. Осадок промывали 1 мл среды К и суспендировали в 1 мл этой среды.

Параллельно выращивали метилобактерий до ОП600 = 0.2 - 0.3 на среде К (30 мкг/мл). Клетки из 30 мл культуры собирали центрифугированием (4000 об/мин х 30 мин). Осадок ресуспендировали в 2 мл среды К и переносили в пробирку с 1 мл отмытых клеток E. coli. После перемешивания суспензию фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр (Hybond, Amersham, Англия) с размером пор 0.45 мкм. Фильтр помещали на агаризованную среду К, добавляя 0.1% метанола и 0.02% протеозного пептона, и инкубировали в течение 1 сут. при 28C. Далее клетки смывали с фильтра 2 мл среды К с 0.5% метанола, 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 50 мкг/мл канамицина, суспендировали и высевали по 100 мкл на ту же агаризованную среду. Чашки инкубировали при 28С до появления индивидуальных колоний. Выросшие колонии метилобактерий очищали от E. coli, повторно пересевая на ту же среду.

Определение активности ферментов. Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали при 6000g 30 мин и отмывали 0.05 M Трис-HCl буфером pH 7.5 ресуспендировали в том же буфере и разрушали ультразвуком на дезинтеграторе MSE (Англия) при 20 кГц (6х30 с) на холоду. После центрифугирования (15000g, 30 мин) полученный супернатант 338 Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко диализовали в течение 1 сут в Трис-HCl буфере 50 мМ, pH 7.5. Активности ферментов определяли при 30C. Концентрацию белка в бесклеточном экстракте определяли по методу Лоури. Изоцитратлиазу (КФ 4.1.3.1) определяли спектрофотометрически по образованию комплекса фенилгидразона с глиоксилатом при 324 нм [20]. Реакционная смесь содержала (мкмоль/мл): Трис-HCl (pH 7.5) 50, цистеин-HCl 2, MgCl· 6H2O 10, фенилгидразин-HCl (pH 8.0) 10.5, L-изоцитрат натрия 5, экстракт. ПГБ-синтазу (КФ 2.3.1.-) определяли спектрофотометрически при 412 нм [21]. Реакционная смесь содержала (мкмоль/мл): Трис-HCl (pH 7.5) - 25, 5,5’-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (ДТНБ) 0.1, гидроксибутирил-КоА 3, экстракт.

Количественный анализ ПГБ. Содержание ПГБ в биомассе определяли методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы LKB (Швеция) [22].

Все количественные данные представляют среднюю арифметическую из не менее трех измерений.

Результаты и их обсуждение Клонирование гена изоцитратлиазы aceA из E. coli в M.

extorquens. Поскольку увеличение в клетках метилотрофных бактерий уровня глиоксилата, являющегося предшественником глицина первичного акцептора С1-соединений в сериновом пути, могло позитивно влиять на скорость роста и выход биомассы метилобактерий, ожидалось, что экспрессия гена aceA E. coli в штамме-продуценте ПГБ M. extorquens AMусилит образование ацетил-КоА в сериновом цикле. При этом ацетил-КоА будет накапливаться в виде ПГБ.

Трансформация вектора pACE, несущего ген aceA E. coli, в M. extorquens AM1 привела к появлению в клетках активности изоцитратлиазы на уровне 15 нмоль/мг белка мин. ПААГ-электрофорез цитоплазматических белков трансформанта выявил дополнительную белковую полосу, которая по молекулярной массе соответствовала изоцитратлиазе (рис. 1).

У трансформанта M. extorquens AM1 выявлено изменение динамики роста и увеличение накопления ПГБ, по сравнению с контрольным штаммом (рис. 2А). Обнаружены два пика накопления ПГБ: в начале фазы активного роста и в стационарной фазе.

По-видимому, снижение уровня ПГБ в фазе активного роста связано с необходимостью дополнительного расхода углерода для роста и деления трансформированных клеток. Аналогичные трансформанты по гену ace изоцитратлиазы были получены для M. extorquens G10 с близкими ростовыми параметрами, но более высоким накоплением ПГБ (рис. 2Б).

Поскольку в промышленном масштабе продуцент, несущий необходимый ген на векторе, может оказаться малоэффективным из-за необходимости добавления антибиотика в среду и проблем с элиминацией плазмид в процессе культивирования, целевой ген необходимо встроить в хромосому.

Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата Рис. 1. 12% ДСН-ПААГ-электрофорез клеточных белков M. extorquens AM1: 1 исходного штамма; 2 клеток, трансформированных плазмидой pCM160 (контроль); 3 клеток, несущих плазмиду pACE с геном изоцитратлиазы; М маркеры После коньюгативного переноса pTnACE из E. coli в M. extorquens G10 на тестовой среде с канамицином выросло 65 колоний.

Полученные штаммы ICL, представляющие собой M. extorquens G10 с встроенным в хромосому геном aceA, экспрессировали данный фермент, что выявил электрофорез тотальных клеточных белков (рис. 3).

Наличие вставки в геноме проверяли геномной гибридизацией по Саузерну, где в качестве маркерной последовательности использовали фрагмент гена aceA (рис. 4).

На основании критерия скорости роста были отобраны 4 штамма ICL, у которых определяли накопление ПГБ в стационарной фазе роста на полной среде К или на среде без источника аммонийного азота. В результате физиологических экспериментов был отобран наиболее активный штамм M.

extorquens ICL35, который накапливал 61% ПГБ, что существенно выше, чем у исходного штамма G10 (табл. 2).

Таблица Уровни накопления ПГБ (в % от веса сухой биомассы) трансформантами M. extorquens G10 со встроенным геном aceA Условия роста M. extorquens G10 IСL8 IСL21 IСL35 IСLСтационарная фаза 30 44 45 50 Лимит по азоту 46 45 35 61 Клонирование гена ПГБ-синтазы M. extorquens AM1 в M.

extorquens G10. Для увеличения в M. extorquens G10 копийности 340 Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко Рис. 2. Накопление ПГБ (% от сух. веса) у M. extorquens AM1 (А) и G(Б). 1 и 3 ОД600 и содержание ПГБ у контрольных культур (клетки трансформированы вектором pCM160); 2 и 4 ОД600 и содержание ПГБ у штаммов, несущих ген изоцитратлиазы (клетки трансформированы плазмидой pACE) гена phaC, кодирующего ПГБ-синтазу, использовали ген phaC из M.

extorquens AM1, так как его полная последовательность известна (www.ncbi.nlm.nih.gov NC_012808). Электрофорез цитоплазматических белков штамма, трансформированного плазмидой pPHA, несущей ген phaC и его промоторную область (1817 п.н.), показал, что уровень экспрессии phaC не отличался от контрольного штамма G10, трансформированного вектором pCM160 без гена phaC. Однако активность ПГБ-синтазы в бесклеточном экстракте трансформанта была выше и составляла 1.4 нмоль/мг белка мин, по сравнению с экстрактом контрольного штамма (0.48 нмоль/мг белка мин).

В клетках M. extorquens G10, трансформированных вектором pPHA из M. extorquens AM1 или pCM160 (без гена phaC), выявлены различия в уровне и динамике накопления ПГБ, при этом скорость роста этих трансформантов была практически одинакова (рис. 5).

Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата Рис. 3. 10% ДСН-ПААГ электрофорез цитоплазматических белков M.

extorquens G10 (контроль) и штаммов M. extorquens ICL8, M. extorquens ICL35, несущих в хромосоме ген aceA; М маркеры Рис. 4. Гибридизация Р-меченного зонда на ген aceA: 1 с геномной ДНК M. extorquens G10 (дикий тип), обработанной рестриктазой BamH I; с ДНК штамма M. extorquens ICL35, обработанной рестриктазами BamH I; 3 Sac I; 4 EcoR I; 5 Xma I; 6 Xba I Максимальное накопление ПГБ у штамма с дополнительным геном phaC происходило в конце логарифмической фазы роста и достигало 75%, в отличие от контрольного штамма, максимально накапливающего ПГБ в стационарной фазе.

Заключение Таким образом, клонирование генов aceA и phaC в M. extorquens Gи AM1 привело к повышению уровня синтеза ПГБ метилобактериями, при этом скорость роста трансформантов практически не изменилась.

Описанные приемы генной модификации метаболизма потенциального 342 Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко Рис. 5. Кривые роста (1, 2) и накопления ПГБ (3, 4) M. extorquens G10, трансформированной векторами pCM160 (1, 3 контроль) и pPHA (2, несущие ген ПГБ-синтазы) продуцента ПГБ M. extorquens G10 и дальнейшие исследования свойств ПГБ-синтаз метилобактерий могут представить интерес при конструировании продуцента ПГБ из метанола.

Авторы признательны д.б.н. Хмелениной В.Н. за помощь в подготовке статьи и к.х.н. Шляпникову М.Г. (ИБФМ РАН) за секвенирование ДНК.

Список литературы 1. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol Rev. 1990 V.54, №4. P.450–472.

2. Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. Содержание поли--оксибутирата у метилотрофных бактерий с различными путями первичной ассимиляции метанола // Прикл. биохимия и микробиол. 1991. Т.27, №1. С.98–101.

3. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3-оксибутирата/3-оксивалерата метилобактериями с сериновым путем метаболизма // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.33, №4.

С.398–403.

4. Suzuki Т., Yamane Т., Shimizu S. Mass production of poly--hydroxybutyric acid by fully automatic fed-batch culture of methylotroph // Appl. Microbiol. Biotechnol.

1996. V.23. P.322–329.

5. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата Methylobacterium extorquens:

метаболизм пропанола, пропионата и валерата // Микробиология. 1999. Т.68, №3. С.351–359.

6. Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1 from a genomic point of view / L. Chistoserdova [et al.] // J. Bacteriol. 2003. V.185. P.2980–2987.

7. Genome of Methylobacillus flagellatus, molecular basis for obligate methylotrophy, and polyphyletic origin of methylotrophy / L. Chistoserdova [et al.] // J. Bacteriol.

2007. V.189. P.4020–4027.

Генетическая модификация синтеза полигидроксибутирата 8. Anthony C. The Biochemistry of Methylotrophs. London: Academic, 1982.

P.113–114.

9. Korotkova N., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Identification of genes involved in the glyoxylate regeneration cycle in Methylobacterium extorquens AM1, including two new genes, meaC and meaD // J. Bacteriol. 2005. V.187. P.1523–1526.

10. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway / T.J. Erb [et al.] // PNAS. 2007.

V.104, №25. P.10631–10636.

11. Korotkova N., Lidstrom M.E. Connection between poly-beta-hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C(1) and C(2) compounds in the methylotroph Methylobacterium extorquens AM1 // J. Bacteriol. 2001. V.183. P.1038–1046.

12. Nunn D.N., Lidstrom M.E. Isolation and complementation analysis of 10 methanol oxidation mutant classes and identification of the methanol dehydrogenase structural gene of Methylobacterium sp. strain AM1 // J Bacteriol. 1986. V.166. P.581–590.

13. Attwood M.M., Harder W. A rapid and specific enrichment procedure for Hyphomicrobium sp // Ant. Leeuwenhoek. 1972. V.38. P.369–377.

14. Marmur J.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. V.63. P.1208–1218.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 c.

Pages:     | 1 |   ...   | 35 | 36 || 38 | 39 |   ...   | 43 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.