WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 29 | 30 || 32 | 33 |   ...   | 43 |

Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием гальванопотенциостата IPC 2L (Кронас, Россия), интегрированного с персональным компьютером, и специализированного программного обеспечения IPC-micro (Кронас, Россия) для регистрации и обработки сигналов сенсоров. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде 9,2 мг/дм3, составляла нА при шуме 0,25 нА. Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буфер (рН = 6,8), концентрация солей составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200–1000 мкл, 20-200 мкл) ( Ленпипет, Россия).

Выращенные клетки микроорганизмов непосредственно перед иммобилизацией промывали фосфатным буферным раствором (20 мM, pH 6.8), центрифугировали, осадок сырой массы клеток взвешивали и разбавляли буферным раствором до концентрации 200 мг/см3. Для приготовления рецепторного элемента на основе трех штаммов суспензии отдельных культур дрожжей смешивали в соотношении 1:1:1 после чего мкл полученного раствора наносилось на стекловолоконный фильтр GF/A (Sigma) размером 33 мм. Рецепторный элемент подсушивали в течение 5–15 минут и фиксировали с помощью капроновой сетки на электроде.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В работе были использованы дрожжевые штаммы Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Arxula adeninovorans ВГИ (78)-6 и Pichia angusta ВКМ Y-2518. Дрожжи вида Arxula adeninovorans обладают широкой субстратной специфичностью и активно используются для анализа БПК с использованием биосенсора [9, 13]. Дрожжи Pichia angusta отличается высокой чувствительностью к спиртам [14]. Дрожжи Debaryomyces hansenii также отличаются широкой субстратной специфичностью и устойчивостью к негативным факторам окружающей среды [10]. Таким образом, рецепторный элемент на основе ассоциации этих микроорганизмов будет сочетать в себе широкую субстратную специфичность, высокую чувствительность и устойчивость к неблагоприятным условиям среды.

Были получены кривые роста дрожжевых штаммов A. adeninovorans, P. angusta и D. hansenii. Кривую роста микроорганизмов регистрировали спектрофотометрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени.

Проводя сравнительный анализ кривых роста можно отметить, что дрожжи Debaryamyces hansenii имеют более длительную лаг-фазу (21 час).

А штамм A. adeninovorans имеет длительные фазы экспоненциального, линейного и замедления роста, что приводит к более позднему выходу 292 В. А. Арляпов, Д. П. Вельмякин, М. А. Чепурнова, Е. Е. Бабкина, В. А. Алферов Таблица Фазы роста исследуемых дрожжевых микроорганизмов Arxula adeni- Pichia angus- Debaryomyces novorans ta BKM hansenii ВГИ (78)-6 Y-2518 BKM Y-Лаг-фаза, ч 0-12 0-8 0-Экспоненциаль- 12-20 8-10 21-ная фаза, ч Фаза линейного 20-30 10-14 24-роста, ч Фаза замедления 30-38 14-24 26-роста, ч Стационарная 38-42 24-42 30-фаза, ч на стационарную фазу. На кривой роста штамма Pichia angusta наиболее длительной фазой, по сравнению с другими штаммами, была фаза замедления роста, которая началась уже через 14 часов посева. Таким образом, микроорганизмы P. angusta имеют большую скорость роста чем A.

adeninovorans, D. hansenii.

Для изучения устойчивости во времени созданной ассоциации дрожжевых микроорганизмов было проведено исследование субстратной специфичности рецепторных элементов биосенсора на основе отдельных дрожжевых штаммов A. adeninovorans, D. hansenii, P. angusta и их ассоциации. Клеточное дыхание регистрировали, используя кислородный электрод типа Кларка, на поверхности которого располагали рецепторный элемент. В качестве метода иммобилизации применялась адсорбция на стекловолокне. Данный способ иммобилизации в силу своей простоты и безреагентности позволяет в меньшей степени разрушать клетки.

Оценка субстратной специфичности ассоциации иммобилизованных микроорганизмов P. аngusta, A. adeninovorans и D. hansenii проведена с использованием субстратов, относящихся к различным классам органических соединений: спирты, углеводы, аминокислоты, карбоновые кислоты, альдегиды. За 100% был принят максимальный сигнал каждого сенсора, ответы сенсора на остальные субстраты даны в процентных отношениях к максимальному ответу (рис. 1).

Установлено, что штамм P. angusta хорошо окисляет спирты, органические кислоты и альдегиды. Сенсор на основе дрожжевого штамма D. hansenii дает высокие ответы на спирты и углеводы, а так же на органические кислоты и альдегиды. К достоинствам сенсора на основе штамма A. adeninovorans можно отнести его способность к окислению органических кислот и альдегидов.

Устойчивость во времени ассоциации дрожжевых микроорганизмов а б Рис. 1. Субстратная специфичность рецепторных элементов:

а рецепторные элементы на основе отдельных штаммов микроорганизмов; б рецепторные элементы на основе ассоциации микроорганизмов в разное время после создания При изучении субстратной специфичности рецепторных элементов на основе ассоциаций дрожжевых штаммов в промежутке времени недель показано, что к третьему измерению в составе ассоциации остались практически только клетки дрожжевого штамма Pichia angusta. Об этом свидетельствует наличие ответов биосенсора на метанол, пропанол, глицерин, муравьиную кислоту, формальдегид и отсутствие ответов на третбутанол, который не окисляется микроорганизмами Pichia angusta и маннозу и глутаминовую кислоту, которые плохо окисляются данными микроорганизмами. Однако наличие ответа биосенсора на основе ассоциации микроорганизмов на глюкозу в течение всего времени эксперимента свидетельствует о некоторой выживаемости и других микроорганизмов, входящих в ассоциацию.

Для изучения вида колоний микроорганизмы Pichia angusta, Arxula adeninovorans и Debaryamyces hansenii выращивали на твердой агаризованной среде LB. У всех штаммов колонии белые, пастообразные.

Единичные колонии штаммов A. adeninovorans и P. angusta четко выражены.

Колонии D. hansenii не выражены, рост сплошным газоном.

Высаживание ассоциации трех культур микроорганизмов на твердую среду проводили три раза в промежутке времени три недели. Внешний вид колонии микроорганизмов, высеянных через шесть недель после создания ассоциации заметно изменился, плотность газона уменьшилась, увеличилось число единичных клеток. Внешне вид колонии третьего посева напоминал колонии штамма P. angusta.

Культуры микроорганизмов и их ассоциации, высеянные на твердой среде, исследовались методом светового микроскопирования. Фотографии под микроскопом отдельных штаммов микроорганизмов и их ассоциации представлены на рис. 2.

294 В. А. Арляпов, Д. П. Вельмякин, М. А. Чепурнова, Е. Е. Бабкина, В. А. Алферов а б в г д Рис. 2. Фотографии под микроскопом отдельных штаммов микроорганизмов и их ассоциаций. а фотография микроорганизмов Arxula adeninovorans; б фотография микроорганизмов Debaryamyces hansenii; в фотография микроорганизмов Pichia angusta;

г фотография ассоциации микроорганизмов в момент создания;

д фотография ассоциации микроорганизмов через 6 недель после создания Из проведенных микроскопических исследований видно, что клетки микроорганизмов A. adeninovorans имеют четко выраженную палочковидную форму, клетки D. hansenii имеют овальную форму, а клетки P. angusta крупные, имеют шаровидную форму.

В образцах первого посева ассоциации (рис. 2, г) отчетливо видны клетки всех трех штаммов. В образцах второго посева также присутствуют клетки трех штаммов, но количество клеток дрожжей A. adeninovorans и D. hansenii уменьшилось. В образцах третьего посева (рис. 2, д) четко видны только клетки P. angusta.

Таким образом, ассоциация трех штаммов в пропорции 1:1:1 за шесть недель заметно изменилась, доминирующим стал штамм P. аngusta. Скорее всего это связано с более высокой скоростью роста данных микроорганизмов (см. табл. 1). Исходя из полученных данных, при создании ассоциаций микроорганизмов рекомендуется использовать штаммы с близкими скоростями роста.

Устойчивость во времени ассоциации дрожжевых микроорганизмов Выводы Спектрофотометрическим методом анализа были получены кривые роста дрожжевых штаммов Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Arxula adeninovorans ВГИ (78)-6 и Pichia angusta ВКМ Y-2518 в жидкой глюкозо-пептонной среде и определена длительность каждой стадии роста. Выявлено, что микроорганизмы P. angusta имеют большую скорость роста чем A. Adeninovorans и D. hansenii.

Изучено изменение субстратной специфичности ассоциации микроорганизмов Debaryomyces hansenii, Arxula adeninovorans и Pichia angusta с течением времени. Показано, что через шесть недель после создания ассоциации ее субстратная специфичность наиболее соответствует субстратной специфичности микроорганизмов P. аngusta.

Дрожжевые штаммы Debaryomyces hansenii, Arxula adeninovorans и Pichia angusta и их ассоциация были изучены методом микроскопирования с использованием оптического микроскопа. Показано, что через шесть недель после создания ассоциации доминирующим штаммом в ней является P.

аngusta.

Полученные данные показывают, что в ассоциации микроорганизмов Debaryomyces hansenii, Arxula adeninovorans и Pichia angusta с течением времени начинают значительно преобладать микроорганизмы Pichia angusta. Скорее всего это связано с более высокой скоростью роста данных микроорганизмов. Таким образом, при создании ассоциаций микроорганизмов рекомендуется использовать штаммы с близкими скоростями роста.

Список литературы 1. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. 25 с.

2. D’Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. V.16. Р.337–353.

3. Rodriguez-Mozaz S., de Alda M.J.L., Barcelo D. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V.386, №4, Р.1025–1041.

4. Теория и применение микробных биосенсоров для оперативного мониторинга биохимического потребления кислорода / О.Н. Понаморева [и др.] // Вестник биотехнологии. 2009. Т.5, №1. C.42–48.

5. The use of co-immobilization of Trichosporon cutaneum and Bacillus licheniformis for a BOD sensor / L. Suriyawattanakul [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002.

V.59, №1. P.40–44.

6. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода / О.Н. Понаморева [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология.

2011. Т.47, №1. C.5–15.

296 В. А. Арляпов, Д. П. Вельмякин, М. А. Чепурнова, Е. Е. Бабкина, В. А. Алферов 7. A flow injection analysis system with encapsulated high-density Saccharomyces cerevisiae cells for rapid determination of biochemical oxygen demand / K.S. Seo [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. V.83, №2. P.217–223.

8. Quick and reliable estimation of BOD load of beverage industrial wastewater by developing BOD biosensor / P. Dhall [et al.] // Sens. Act. B. 2008. V.133, №2.

P.478–483.

9. Measurement of biodegradable substances using the salt-tolerant yeast Arxula adeninivorans for a microbial sensor immobilized with poly(carbamoyl)sulfonate (PCS): Part II: application of the novel biosensor to real samples from coastal and island regions / M. Lehmann [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. V.14, Iss.3.

P.295–302.

10. Биосенсор для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода на основе дрожжевых микроорганизмов родов Candida и Debaryomyces / О.Н.

Понаморева [и др.] // Вестник биотехнологии. Т.6, №3. 2010. C.5–12.

11. Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах / В.А. Арляпов [и др.] // Сенсорные системы. 2011. Т.25, №3.

12. Микробные биосенсоры для экспресс-определения БПК сточных вод предприятий пищевой промышленности / В.А. Арляпов [и др.] // Вода: Химия и Экология. 2008. №3. C.23–30.

13. Использование дрожжей рода Arxula для определения БПК / Е.А. Воронова [и др.] // Микроорганизмы и биосфера: тез. докл. Междун. научн. конф. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. 2007.

14. Воронова Е.А., Ильясов П.В., Решетилов А.Н. Исследование параметров сенсора для детекции этанола на основе метилотрофных дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2518 // Альманах клинической медицины. 2006. №12. С.107–107.

Арляпов Вячеслав Алексеевич (gwinbleidd@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Вельмякин Денис Павлович (norman-90@mail.ru), студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Чепурнова Майя Александровна (chepurnovama@rambler.ru), к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Бабкина Елена Евгеньевна (babkinael@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., профессор, зав.кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Устойчивость во времени ассоциации дрожжевых микроорганизмов Stability analysis of association of yeast microorganisms Pichia angusta, Arxula adeninovorans and Debaryamyces hansenii V. A. Arlyapov, D. P. Velmyakin, M. A. Chepurnova, E. E. Babkina, V. A. Alferov Abstract. Stability of the time the association of yeast microorganisms Pichia angusta VKM Y-2518, Arxula adeninovorans VGI 78(6) and Debaryamyces hansenii VKM Y-2482 was studied. Methods of sowing on solid medium, optical microscopy and by using amperometric biosensor shows that, six weeks after the establishment of the association of dominant strain in it is a P. angusta, which is associated with a higher rate of growth of these microorganisms.

Keywords: biosensors, biochemical oxygen demand, BOD, association of microorganisms, Pichia angusta, Arxula adeninovorans, Debaryamyces hansenii.

Arlyapov Vyacheslav (gwinbleidd@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Velmyakin Denis (norman-90@mail.ru), student, department of biotechnology, Tula State University.

Chepurnova Maya (chepurnovama@rambler.ru), candidate of biological sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.

Babkina Elena (babkinael@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Alferov Veleriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.

Pages:     | 1 |   ...   | 29 | 30 || 32 | 33 |   ...   | 43 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.