WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Физика твердого тела, 2004, том 46, вып. 4 Создание люминесцентного биочипа с использованием наноалмазов и бактериальной люциферазы © А.П. Пузырь, И.О. Позднякова, В.С. Бондарь Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук, 660036 Красноярск, Россия E-mail: apuzyr@mail.ru Сообщается о создании на плоской подложке надмолекулярной структуры окисная пленка алюминия– адгезионный слой–наноалмаз–люцифераза. Показано, что фермент сохраняет каталитическую активность в данной структуре и она может рассматриваться как прототип люминесцентного биочипа для использования в биолюминесцентном анализе.

В последние годы возрос интерес к исследованиям по ным методом в присутствии борного ангидрида [7].

созданию новых технологий для решения прикладных Гидрозоли из частиц НА готовились по технологии, задач в области биологии, белковой химии, биофизики, предложенной ранее [5]. Препараты люциферазы и молекулярной биологии, экологии и т. д. Например, НАДН : ФМН-оксидоредуктазы получались известными представляется перспективным создание различных ин- методами [8,9]. Активность люциферазы измерялась дикаторных систем регистрации, основанных на при- с помощью биферментной реакции и с использованием менении белковых молекул, обладающих маркерными фотовосстановленного ФМН [9]. Измерения проводисвойствами. К белкам-маркерам относятся, в частности, лись на биолюминометре (БЛМ 8801) производства светоизлучающие белки, способные в процессе их функ- СКТБ „Наука“ (Красноярск), калиброванном по рационирования генерировать кванты света в видимом диоактивному стандарту Гастингса–Вебера [10]. Одна диапазоне спектра. Перспективность разработки таких люминесцентная единица соответствовала 107 photon/s.

методов тестирования определяется их высокой чувстви- При определении активности люциферазы с помощью тельностью, быстротой анализа, простотой регистрации биферментной реакции в измерительную кювету вносветового сигнала, широтой применений и т. д. [1–4]. силось 450 µl 4 mM Трис-HCl буфера (pH 7.0), 10 µl Недавно нами был создан прототип люминесцентного 4.7 · 10-6 M C14 альдегида, 10 µl 7.8 · 10-5 M ФМН, биочипа с использованием частиц детонационных нано- 1-3 µl препарата НАДН : ФМН-оксидоредуктазы (активалмазов (НА) и светоизлучающего белка обелина [5]. ность фермента 1 E/ml), 5-50 µl исследуемого образца.

Используемый белок генерирует кванты видимого света Реакция запускалась при добавлении 5 µl 10-2 MНАДН.

при взаимодействии с ионами Ca2+, поэтому биочип При определении активности люциферазы с помощью может применяться для их регистрации в различных фотовосстановленного ФМН реакционная смесь вклюжидкостях, включая биологические [5]. В то же вре- чала 450 µl указанного выше буфера, 50 µl 4.7 · 10-6 M мя представляет интерес создание аналогичных инди- C14 альдегида, 5-50 µl исследуемого образца. Реакция каторных тест-систем с использованием других свето- запускалась при введении 500 µl 7.8 · 10-5 M восстановизлучающих белков. С одной стороны, это позволяет ленного ФМН.

развить представления о механизмах взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц НА, с дру2. Результаты и обсуждение гой — расширить спектр возможных приложений таких биолюминесцентных датчиков. Например, в этих целях На первом этапе исследований было показано, что домогут использоваться люциферазы морских бактерий, бавление водного раствора люциферазы к суспензии чашироко применяемые в биолюминесцентном анализе стиц НА и последующее перемешивание смеси приводит как моноферменты, в составе биферментной (люцифек быстрой и полной адсорбции фермента на поверхности раза — НАДН : ФМН-оксидоредуктаза) и сопряженных частиц. После осаждения НА центрифугированием смесистем [6]. Белки этой группы имеют молекулярную си при 16 000g в течение 1-3 min в супернатанте не массу около 80 kDa, являются гетеродимерами (состоят онаруживается активности люциферазы. Соотношение из - и -субъединиц) и содержат в своей структуре белок : НА для полной адсорбции фермента из раствора флавин в качестве кофактора.

можно рассчитать, исходя из адсорбционной емкости Настоящая работа посвящена созданию прототипа наночастиц. С помощью маркерных белков (бычий сылюминесцентного биочипа на основе детонационных НА вороточный альбумин и цитохром C) было показано, и бактериальной люциферазы.

что 1 mg частиц НА может адсорбировать на поверхности 0.3-0.5 mg белка. После адсорбции люцифераза прочно удерживается на поверхности НА и не смывает1. Материалы и методы ся при многократной промывке осадка частиц водой и В экспериментах использовались НА, синтезирован- буфером 20 mM Трис-HCl (pH 7.0). Фермент, адсорбиные в Отделе физики высокодисперсных материалов рованный на частицы способен проявлять свою каталиКрасноярского научного центра и очищенные газофаз- тическую активность как в ходе биферметной реакции, Создание люминесцентного биочипа с использованием наноалмазов и бактериальной... активности люциферазы на полученной подложке также проводилась двумя способами (биферментной реакцией и с использованием фотовосстановленного ФМН).

Для этого подложка помещалась в буфер, находящийся в измерительной кювете, и добавкой необходимых ингредиентов запускалась реакция. В обоих случаях наблюдалось развитие люминесцентного сигнала. После получения светового ответа подложка вынималась из измерительной кюветы и повторно проводилась регистрация сигнала. Несмотря на отсутствие подложки, в реакционной смеси обнаруживалась люциферазная активность. Этот факт указывает на то, что, как и в экпериментах с суспензиями, в ходе реакции происРис. 1. Гипотетическая схема надмолекулярной структуходила десорбция части фермента с поверхности чипа.

ры окисная пленка алюминия–адгезионный слой–наноалмаз– Подложка промывалась струей дистиллированной воды люцифераза при расположении применяемых компонентов для удаления продуктов реакции и остатков десорбив монослое.

рованного белка, помещалась в чистую измерительную кювету с буфером, затем снова проводилось измерение.

Выяснилось, что интенсивность люминесцентных сигнатак и с фотовосстановленным ФМН. Однако в обоих лов с подложки снижалась при каждом последующем случаях наблюдается частичная десорбция люциферазы измерении (рис. 2). Наблюдаемое изменение не является с поверхности частиц НА. После проведения реакции серьезным препятствием для использования полученных и удаления частиц из реакционной смеси в ней реги- тест-систем в люминесцентном анализе. Интенсивность стрируется люциферазная активность. В то же время световых импульсов подложек достаточно велика, что частицы продолжают удерживать на своей поверхности позволяет проводить их регистрацию, несмотря на сниеще значительное количество молекул фермента. После жение количества фермента на поверхности чипа.

отмывки частиц НА от компонентов реакционной смеси Таким образом, в работе показана возможность сои продуктов реакции их снова можно использовать для здания прототипа люминесцентного биочипа, основизмерения люминесценции. В экспериментах показано, ным элементом которого являются частицы детонационных НА, несущие на своей поверхности светоизлучто с одним образцом частиц НА можно выполнить десять и более измерений. Причем каждый раз наблю- чающий белок люциферазу. Полученная тест-система может использоваться в биолюминесцентном анализе.

дается десорбция части фермента. Вероятнее всего, это Более прочная фиксация фермента на поверхности подобусловлено конформационными изменениями молекул ложки, вероятно, может быть осуществлена как химифермента, которые происходят в момент осуществления ческими (например, ковалентные сшивки с использокаталитической функции. В пользу этого предположения свидетельствует то, что отдельные компоненты биолю- ванием химических реагентов), так и биологическими минесцентной реакции (C14 альдегид, ФМН, НАДН) и их различные комбинации, а также отдельная добавка оксидоредуктазы не вызывали десорбции люциферазы с поверхности НА.

На следующем этапе была исследована возможность создания прототипа люминесцентного биочипа, элементом которого является комплекс НА–люцифераза. Для этих целей была использована алюминиевая подложка.

Установлено, что окисная пленка алюминия не адсорбирует из белкового раствора молекулы люциферазы, а из суспензий — частицы НА и частицы с адсорбированным ферментом. Поэтому, как и при создании биочипа на основе НА и обелина [5], комплекс НА–люцифераза закреплялся на подложке с помощью адгезионного слоя, предварительно нанесенного на окисную пленку алюминия. Полученная надмолекулярная структура представлена в виде гипотетической схемы (рис. 1). Данная Рис. 2. Динамика интенсивности люминесцентных сигналов структура, индикаторным элементом которой является при многократном использовании плоской подложки, содеркомплекс НА–люцифераза, не смывается с подложки жащей надмолекулярную структуру, индикаторным элементом водой и 20 mM Трис-HCl буфером (pH 7.0). Это укакоторой является комплекс НА–люцифераза. 1 — подложзывает на достаточно высокую ее устойчивость и проч- ка находится в реакционной смеси измерительной кюветы, ность сцепления с поверхностью подложки. Проверка 2 — реакционная смесь после удаления подложки.

Физика твердого тела, 2004, том 46, вып. 742 А.П. Пузырь, И.О. Позднякова, В.С. Бондарь методами (в частности, белок-белковые взаимодействия с использованием дополнительных молекул). Проверка таких возможностей является предметом дальнейших исследований.

Список литературы [1] J.R. Blinks, W.G. Wier, P. Hess, F.G. Prendergast. Prog.

Biophys. Mol. Biol. 40, 1 (1982).

[2] В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон. Успехи микробиологии 21, 3 (1987).

[3] В.С. Бондарь, Е.С. Высоцкий, О.М. Рожманова, С.Г. Воронина. Биохимия 56, 806 (1991).

[4] B.A. Illarionov, L.A. Frank, V.A. Illarionova, V.S. Bondar, E.S. Vysotski, J.R. Blinks. Meth. Enzymol. 305, 223 (2000).

[5] К.В. Пуртов, В.С. Бондарь, А.П. Пузырь. ДАН 380, 3, 411 (2001).

[6] И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.И. Медведева, Г.А. Примакова, С.И. Барцев, Г.А. Кратасюк, В.Н. Петушков, В.В. Межевикин, Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.А. Кратасюк. Светящиеся бактерии. Наука, Новосибирск (1984).

278 с.

[7] Г.А. Чиганова, С.А. Чиганов. Неорган. материалы 35, 5, 581 (1999).

[8] В.С. Бондарь, Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.В. Межевикин, А.А. Райбекас. Прикл. биохимия и микробиология 24, 6, 745 (1988).

[9] В.Н. Петушков, Г.А. Кратасюк, Н.С. Родионова, А.М. Фиш, П.И. Белобров. Биохимия 49, 4, 692 (1984).

[10] J.W. Hastings, G. Weber. J. Opt. Soc. Am. 53, 1410 (1963).

Физика твердого тела, 2004, том 46, вып.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.