WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Физика твердого тела, 2004, том 46, вып. 4 Применение наноалмазов для разделения и очистки белков © В.С. Бондарь, И.О. Позднякова, А.П. Пузырь Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук, 660036 Красноярск, Россия E-mail: bondvs@mail.ru Сообщается об использовании детонационных наноалмазов для выделения рекомбинантного апообелина и рекомбинантной люциферазы из бактериальных клеток E. coli. Применение наноалмазов упрощает процедуры очистки белков, сокращает время их выделения до 30–40 минут, исключает из процесса специализированное хроматографическое оборудование, позволяет получить высокоочищенные препараты апообелина и люциферазы с выходом белков 35–45 и 45–60% соответственно. Рассматриваются возможные механизмы взаимодействия белковых молекул с частицами наноалмазов.

Детонационные наноалмазы (НА) [1] представля- При экспрессии некоторых генов в клетках E. coli ют несомненный интерес для специалистов, работаю- синтезируемые ими рекомбинантные белки накапливащих в области биохимии. Это обусловлено физико- ются в виде нерастворимых агрегатов, так называемых химическими свойствами НА: высокоразвитой поверх- „телец включения“ [9]. На данном свйстве основано ностью частиц (270–280 m2/g), большим количеством выделение этих белков, в том числе апофотопротеиповерхностных ионогенных групп (карбоксильные, кар- нов [10,11]. Общепринятая схема очистки состоит из бонильные, гидроксильные, эфирные), углеводородных выделения фракции телец включения после разрушения фрагментов и микропримесей металлов [2,3], позволяюклеток (например, ультразвуком или френч-прессом), щими рассматривать НА как новый сорбент, пригодный экстракции из нее рекомбинантного белка высокими для разделения и очистки белков.

концентрациями денатурирующего хаотропного агента Настоящая работа посвящена использованию НА для (мочевина, гуанидин-HCl), хроматографической очистки выделения рекомбинантного Ca2+-активируемого фотои рефолдинга белка после удаления хаотропного агента.

протеина апообелина и рекомбинантной люциферазы из Очистка рекомбинантного апообелина по такой схеме бактериальных клеток Escherichia coli.

занимает не менее двух суток [6,11]. В то же время многие рекомбинантные белки, например, люциферазы могут накапливаться в цитозольной фракции синтези1. Объекты исследований рующих клеток без образования телец включения [7].

Люциферазы имеют более сложную структурную орИспользованы НА, синтезированные в Отделе физики ганизацию, чем фотопротеины, и более чувствительны высокодисперсных материалов Красноярского научного к различным повреждающим факторам, например, хаоцентра [3].

тропным агентам и ионам тяжелых металлов, поэтому Выбор белков определялся тем, что они принадлежат в методах их выделения учитываются эти особенности.

к разным видам люминесцентных систем, имеют значиОчистку люциферазы проводят без денатурирующих тельные различия в структурно-функциональной оргаагентов по схеме, включающей несколько хроматогранизации молекул, общепринятые методы их выделения фических стадий [5] и занимающей не менее двух-трех содержат существенные отличия. Ca2+-активируемые суток.

фотопротеины — светоизлучающие EF-белки, которые присутствуют в морских кишечнополостных организмах и генерируют кванты видимого света при взаимодей2. Результаты и обсуждение ствии с ионами кальция [4]. Они представляют собой стабильные фермант-субстратные комплексы, состоящие Выделение апообелина с помощью НА выполнялось из небольшой односубъединичной молекулы апобелка по следующей схеме. Клеточные белки экстрагировались (около 20 kDa), субстрата (целентеразин) и кислорода.

из биомассы в течение 1 часа хаотропным агентом Люциферазы — светоизлучающие белки, присутствую(6M мочевина), а клеточный дебрис удалялся ценщие в морских светящихся бактериях. Эти белки являтрифугированием. В супернатанте ресуспендировались ются гетеродимерами (состоят из - и -субъединиц), частицы НА, которые собирались с помощью центрифуимеют молекулярную массу около 80 kDa, содержат в гирования. Осадок частиц с адсорбированными белками, своей структуре флавин в качестве кофактора [5]. Гены апообелина и люциферазы были клонированы и экспрес- в том числе апообелином, дважды промывался буфером сированы в клетках E. coli, что позволило получить для удаления несорбированных балластных белков. Апоштаммы-продуценты этих белков [6,7]. Фотопротеины и обелин десорбировался с поверхности частиц буфером, люциферазы активно используют как светоизлучающие содержащим SH-реагент (дитиотреитол) в концентрации индикаторы в биолюминесцентном анализе [5,8]. 10 mM. Полученный по данной технологии препарат 11 738 В.С. Бондарь, И.О. Позднякова, А.П. Пузырь биомассы) за 30–40 минут удается получить концентрированный практически гомогенный препарат этого белка с выходом 40–50%. В условиях колоночной хроматографии такой прием невозможен, поскольку вещества из колонки вымываются объемом элюента, определяемым параметрами удерживания колонки и массопереносом веществ. Следует также отметить, что применение НА позволяет полностью отделить люциферазу от эндогенной бактериальной НАДН : ФМН-оксидоредуктазы. Это весьма существенно, так как загрязнение оксидоредуктазой, участвующей в работе люминесцентной биферментной системы [5], снижает качество препарата люциферазы при его аналитических применениях.

Данные, полученные при очистке апообелина и люциферазы с помощью НА, позволили развить представления о возможных механизмах взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц. Элюция апообелина под действием SH-реагента, а также исследования с применением обработки поверхности наночастиц избирательным блокатором SH-групп (ДТНБ) и хелатором двухвалентных ионов (ЭДТА) показали, что белковые молекулы могут взаимодействовать с НА как посредРис. 1. Электрофореграмма образцов рекомбинантного апоством образования S–S-мостиков (около 10% молекул), обелина на этапах его выделения из бактериальных клетак и образования координационных связей (около 40% ток E. coli с применением частиц НА. На треках: 1 —исходный молекул). Оставшиеся 50% молекул белка, вероятно, экстракт, 2 — конечный препарат. Стрелкой показано положесвязываются с частицами НА по иным механизмам.

ние апообелина.

Например, вполне вероятен механизм многоточечного взаимодействия белковых молекул с разными функциапообелина имеет высокую степень чистоты (рис. 1), выход апобелка составляет не менее 35–45%.

Схема очистки люциферазы включала следующие стадии. Биомасса разрушалась в воде ультразвуком, клеточный дебрис удалялся центрифугированием. В супернатант добавлялись НА и после перемешивания частицы собирались центрифугированием. Осадок дважды промывался для удаления неадсорбированных балластных белков. Люцифераза десорбировалась с поверхности частиц 20 mM десорбирующим буфером. Конечный препарат белка по данным электрофореза (рис. 2) имеет высокую степень чистоты, а его выход составляет 45–60%.

Необходимо отметить высокую экспрессность технологии очистки белков с помощью НА. После получения исходных экстрактов вся процедура выделения занимает не более 30–40 минут. Вероятно, данную технологию правильнее расценивать, как адсорбционнодесорбционную хроматографию в объеме. Тем не менее она позволяет значительно упростить процедуру выделения белков, сократить временные затраты и исключить из схемы очистки специализированное хроматографиРис. 2. Электрофореграмма образцов рекомбинантной люческое оборудование. Преимуществом применения НА циферазы на этапах ее очистки из биомассы бактериальявляется то, что одновременно с эффективным выделеных клеток E. coli с применением частиц НА. На треках:

нием белка можно осуществить его концентрирование, 1 — исходный экстракт, 2, 3 — финальные препараты люцифепоскольку десорбция белка может проводиться очень разы, полученные при последовательной десорбции фермента малыми объемами элюента. Например, из клеток с с поверхности наночастиц элюирующим буфером. Стрелкой очень низкой продукцией апообелина (30-300 µg в 1 g отмечено положение - и -субъединиц люциферазы.

Физика твердого тела, 2004, том 46, вып. Применение наноалмазов для разделения и очистки белков ональными группами поверхности частиц. Возможны, очевидно, ионные, гидрофобные, ковалентные (исключая S–S-связи) взаимодействия или их возможные комбинации. В пользу этого обстоятельства свидетельствует то, что повторная обработка или повышение концентрации SH-реагента не вызывает увеличения выхода апообелина на стадии элюции, а десорбция люциферазы эффективно осуществляется простым повышением молярности буфера. Наличие разных механизмов взаимодействия белков с частицами, очевидно, следует расценивать, скорее, как преимущество, позволяющее рассматривать НА как сорбент с универсальными свойствами, на котором можно проводить разные типы хроматографий.

В приведенных выше примерах очистка белков с помощью НА осуществлялась в объеме. В то же время не менее перспективным представляется применение НА в качестве нового материала для колоночной хроматографии. В результате проведенных исследований на основе НА был создан сорбент, позволяющий проводить колоночную хроматографию обычного давления.

Его пригодность для адсорбциии-десорбции белковых молекул была показана на примере цитохрома C.

Список литературы [1] А.М. Ставер, Н.В. Губарева, А.И. Лямкин, Е.А. Петров.

Физика горения и взрыва 20, 3, 100 (1984).

[2] Г.А. Чиганова. Коллоид. журн. 56, 2, 266 (1994).

[3] Г.А. Чиганова, С.А. Чиганов. Неорган. материалы 35, 5, 581 (1999).

[4] J.R. Blinks, F.G. Prendergast, D.G. Allen. Pharmacol. Rev. 28, 1 (1976).

[5] И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.И. Медведева, Г.А. Примакова, С.И. Барцев, Г.А. Кратасюк, В.Н. Петушков, В.В. Межевикин, Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.А. Кратасюк. Светящиеся бактерии. Наука, Новосибирск (1984), 278 с.

[6] B.A. Illarionov, L.A. Frank, V.A. Illarionova, V.S. Bondar, E.S. Vysotski, J.R. Blinks. Meth. Enzymol. 305, 223 (2000).

[7] Б.А. Илларионов, Н.А. Тюлькова. Патент РФ № 2073714, C12N1/21 (1997).

[8] J.R. Blinks, W.G. Wier, P. Hess, F.G. Prendergast. Prog.

Biophys. Molec. Boil. 40, 1 (1982).

[9] R.C. Hockney. Trends in Biotechnology 12, 456 (1994).

[10] N.L. Stults, N.F. Stocks, H. Rivera, J. Gray, R.O. McCann, D. O’Kane, R.D. Cummings, M.J. Cormier, D.F. Smith.

Biochemistry 31, 1433 (1992).

[11] V.S. Bondar, A.G. Sergeev, B.A. Illarionov, J. Vervoort, W.R. Hagen. Biochim. Biophys. Acta 1231, 29 (1995).

11 Физика твердого тела, 2004, том 46, вып.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.