WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

Компенсаторные процессы в мозгу мышей при различной степени деградации нигростриатной дофаминергической системы и новый подход к их выявлению

Автореферат кандидатской диссертации

 

На правах рукописи

Хакимова Гульнара Ринатовна

КОМПЕНСАТОРНЫЕ ПРОЦЕССЫ В МОЗГУ МЫШЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ДЕГРАДАЦИИ НИГРОСТРИАТНОИ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОИ СИСТЕМЫ И НОВЫЙ ПОДХОД

К ИХ ВЫЯВЛЕНИЮ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012


Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Научный руководитель:

академик, доктор биологических наук, профессор Угрюмов Михаил Вениаминович

Официальные оппоненты:

Узбеков Марат Галиевич - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский институт психиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, руководитель лаборатории патологии мозга

Базиян   Борис   Хоренович   -   доктор   биологических   наук, Федеральное

государственное    бюджетное    учреждение    «Научный    центр неврологии»

Российской академии медицинских наук, руководитель                 лаборатории

нейрокибернетики

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится « 18 » апреля 2012 г. в 1500 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26

Автореферат разослан «     » марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук                              у        .    Е.Б. Абрамова

e-mail: ele0806@yandex.ru                    (7У^у       /


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее актуальных задач современной физиологии является изучение механизмов пластичности мозга, которые функционируют как в норме (в онтогенезе, при обучении и т.д.), так и при патологии. В последнем случае нейропластичность выражена в гораздо большей степени. Особый интерес вызывают резервы пластичности нигростриатной дофаминергической (ДА-ергической) системы, поскольку её деградация лежит в основе патогенеза одного из наиболее распространённых нейродегенеративных заболеваний - болезни Паркинсона (БП).

Нигростриатная система представлена ДА-ергическими нейронами компактной части черной субстанции (ЧС) и их аксональными проекциями в стриатуме (Суворов, 1980). Она является ключевым звеном центральной регуляции моторного поведения (Rosegay, 1944).

Функциональная недостаточность нигростриатной системы (моторные симптомы БП) возникает при достижении порового уровня её деградации (на 60-80%). Надпороговая гибель ДА-ергических нейронов ЧС может продолжаться многие годы (Ehringer and Hornykiewicz, 1960). Наиболее часто длительное бессимптомное течение БП связывают с компенсаторной активацией сохранившихся ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, выраженной в усилении синтеза и выделения ДА в синаптическую щель, а также в снижении скорости его обратного захвата (Zigmond, 1997).

Компенсаторные резервы сохранившихся ДА-ергических нейронов остаются неизвестными, т.к. БП диагностируют при их исчерпании - после появления моторных симптомов заболевания. Оценка компенсаторного потенциала сохранившихся нейронов представляется возможной при сравнительном анализе функциональных показателей ДА-ергических нейронов на двух стадиях развития БП - досимптомной и симптомной. Поскольку изучение состояния нигростриатной системы человека на досимптомной стадии развития БП невозможно ввиду отсутствия доступной своевременной диагностики, выходом из положения является экспериментальное моделирование данного заболевания на животных. Однако подавляющее большинство описанных в литературе моделей БП воспроизводят выраженную

3


симптомную стадию заболевания (Strome and Doudet, 2007). И только ограниченное число работ посвящено моделированию досимптомной стадии паркинсонизма. При этом исследований, в которых воспроизводили бы одновременно обе стадии БП с целью их сравнительного анализа, - единицы (Pifl and Hornykiewicz, 2006; Perez et al., 2008). Причем ни в одном из указанных исследований не дана комплексная оценка всех трёх предполагаемых механизмов компенсации функций погибших нейронов нигростриатной системы - синтеза ДА, его выделения и обратного захвата. Поэтому первая часть настоящей работы посвящена изучению компенсаторных резервов сохранившихся ДА-ергических нейронов нигростриатной системы в процессе прогрессирования её деградации (на досимптомной и симптомной стадиях паркинсонизма у мышей).

Заманчиво предположить, что полученные в первой части работы данные могли бы быть использованы в терапии БП - медикаментозном управлении компенсаторными процессами. Так, в случае снижения эффективности того или иного функционального показателя сохранившихся ДА-ергических нейронов его искусственное усиление могло бы продлить стадию бессимптомного течения заболевания. Вероятно, данный терапевтический подход имел бы успех при его применении до момента срыва компенсаторных процессов, а следовательно, на досимптомной стадии развития БП. Однако единственный метод, который может позволить диагностировать БП в указанный период -позитронно-эмиссионная томография, является дорогостоящим и редким, а поэтому не может быть применен при диспансеризации населения. В связи с этим второй задачей нашего исследования была проверка гипотезы о возможности использования легкодоступной фармакологической «провокации» кратковременной функциональной недостаточности нигростриатной ДА-ергической системы в период скрытого развития БП как способе диагностики данного заболевания.

Цель работы: изучение компенсаторных процессов в нигростриатной системе при различной степени её деградации, а также доклиническая разработка экономичного и широкодоступного метода диагностики БП на досимптомной стадии течения заболевания.

4


Задачи исследования:

  1. Оценка основных функциональных характеристик нигростриатной ДА-ергической системы на моделях досимптомной и симптомной стадий БП у мышей: скорости синтеза, выделения и обратного захвата ДА.
  2. Фармакологическая «провокация» кратковременных нарушений моторного поведения у мышей на модели досимптомной стадии БП.

Научная новизна. В настоящей работе впервые получена информация о функциональном состоянии отдельных сохранившихся ДА-ергических нейронов при различной степени деградации нигростриатной системы мышей, соответствующей досимптомной и симптомной стадиям БП у человека. Дана оценка активности тирозингидроксилазы (ТГ), скорости синтеза, выделения и обратного захвата ДА. На основании полученных данных проведен сравнительный анализ двух стадий паркинсонизма, что позволило выяснить, изменение какого(-их) из свойств нейронов может быть одной из причин появления нарушений моторного поведения.

В исследованиях на экспериментальной модели досимптомной стадии БП успешно разработана принципиально новая, легко воспроизводимая и экономичная технология диагностики скрытой формы заболевания - так называемый «провокационный тест», основанный на кратковременном частичном выключении синтеза ДА в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы путем введения обратимого ингибитора ТГ - ключевого фермента синтеза ДА. При этом впервые показано отсутствие длительных и необратимых эффектов выбранного ингибитора ТГ на активность фермента в сохранившихся ДА-ергических нейронах частично деградировавшей нигростриатной системы, а также на общее содержание ДА в телах и аксональных терминалях нейронов и моторную активность животных.

Научная и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о потенциальных возможностях ДА-ергических нейронов изменять эффективность основных функциональных свойств - скорости синтеза, выделения и обратного захвата ДА при прогрессирующей деградации нигростриатной системы. Это, в свою очередь, позволяет приблизиться к пониманию механизмов, лежащих в основе появления  нарушений  двигательной  активности  при БП,   а  следовательно,

5


может быть использовано при разработке новых или совершенствовании существующих методов лечения данного заболевания.

Разработанный метод кратковременной фармакологической «провокации» нарушений произвольной двигательной активности на досимптомной стадии развития БП ввиду успешной апробации в исследованиях на животных может быть рекомендован для клинических испытаний в специализированных неврологических клиниках с целью выявления скрытой формы данного заболевания у людей.

Личное участие автора. В диссертацию вошли результаты экспериментов, проведенных непосредственно автором. Выводы сформулированы на основе полученных в ходе исследований оригинальных данных и соответствуют заявленной цели.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на: Конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2009 г.), конференции «Теория функциональных систем: концептуальные и экспериментальные аспекты» (Москва, 2009 г.), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова, 2010 (Калуга, 2010 г.), Первой Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Сафага, Египет, 2010 г.), V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 2010 г.), II Национальном конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений (Москва, 2011 г.), IV International Meeting «Early Events in Human Pathologies» (Ереван, Армения, 2011 г.), 41st annual meeting Society for Neuroscience (Вашингтон, США, 2011 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 247 источников. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста и содержит 30 рисунков.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах перечня ВАК, 9 тезисов докладов на российских конференциях, 3 тезисов докладов на зарубежных конференциях.

6


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе использовано 306 (п = 306) мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 2-2.5 месяца и весом 22-26 г. Мыши содержались в стандартных условиях вивария.

Моделирование досимптомной и симптомной стадий паркинсонизма у мышей. В эксперименте 104 животным двукратно (модель досимптомной стадии БП) и 45 животным четырехкратно (модель симптомной стадии БП) с двухчасовым интервалом между инъекциями подкожно вводили 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТИ, пронейротоксин) (Sigma, США). Животным в контроле по такой же схеме вводили только 0.9% NaCl (п = 104/45 в каждой контрольной группе). Дальнейшие манипуляции с животными проводили на 15 день после введения МФТИ.

Оценка активности тирозингидроксилазы. Животным (п = 7 в каждой контрольной и экспериментальной группе) за 30 минут до декапитации внутрибрюшинно вводили NSD-1015 (Sigma, США) - ингибитор декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (ДАА) в дозе 100 мг/кг. Затем выделяли ЧС и стриатум и измеряли в них с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД) содержание 3,4-дигидроксифенилаланина (L-ДОФА) - продукта реакции, катализируемой ТГ.

Оценка скорости синтеза дофамина. Фронтальные вибратомные (Vнbrateme 1000 Plus, Vнbrateme, США) срезы ЧС и стриатума правых полушарий толщиной 300 мкм экспериментальных животных (п = 14 в каждой из моделей) сразу после выделения замораживали для дальнейшего определения содержания в них ДА. Срезы ЧС и стриатума левых полушарий этих же животных объединяли от двух мышей и переносили в камеры объемом 400 мкл для дальнейшей перфузии. Перфузию проводили при 37°С в течение 120 минут в модифицированном растворе Кребса-Рингера следующего состава (мМ): NaCl - 120.0, КС1 - 4.8, СаС12 - 2.0, MgS04 - 1.2, NaHC03 - 25.0, D-глюкоза - 10.0, HEPES - 20.0, аскорбиновая кислота - 0.13, со скоростью 100 мкл/мин (Tubing Pump IPC 8, Канада). В полученных образцах перфузионной среды и ткани после перфузии определяли содержание ДА с помощью ВЭЖХ-ЭД. Скорость синтеза ДА рассчитывали по формуле:

7


Синтез ДА = (В + С)-A,

где ДА - дофамин, В - содержание дофамина в срезах левого полушария, С - содержание дофамина в перфузионной среде, А - содержание дофамина в срезах правого полушария.

Оценка скорости выделения дофамина. Фронтальные вибратомные срезы ЧС и стриатума толщиной 300 мкм переносили в камеры объемом 400 мкл для дальнейшей перфузии при 37°С в модифицированном растворе Кребса-Рингера (вышеуказанного состава) со скоростью 100 мкл/мин. После 40-минутного стабилизационного периода собирали фракции спонтанного выделения ДА. Затем повышали в перфузионной среде содержание калия до 56 мМ и собирали фракции стимулированного выделения ДА. В собранных образцах перфузионной среды определяли содержание ДА с помощью ВЭЖХ-ЭД.

Оценка скорости обратного захвата дофамина. Фронтальные вибратомные срезы ЧС и стриатума толщиной 300 мкм переносили в камеры с 500 мкл модифицированного раствора Кребса-Рингера (вышеуказанного состава), содержащего также 0.001 мМ паргилина (Sigma, США) - ингибитора моноаминоксидазы А и Б - ферментов деградации биогенных аминов. Затем при 37°С и «мягком» встряхивании последовательно проводили три 10-минутные инкубации: преинкубацию, инкубацию с добавлением в часть камер номифензина - ингибитора обратного захвата ДА - в концентрации 10" Ми инкубацию с добавлением во все камеры Н-ДА со специфической активностью 30 Ки/ммоль до конечной концентрации 30x10" М (за предоставленный Н-ДА благодарим академика Н.Ф. Мясоедова, Институт молекулярной генетики РАН). Далее из полученных образцов экстрагировали радиоактивный продукт в 1 мл 96% этанола в течение 18 часов, добавляли к каждому из них 10 мл сцинтилляционной жидкости (liquid scintillator 402, Koch-light LTD, Англия) и определяли содержание тритиевой метки методом жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Специфический захват Н-ДА определяли как разницу между значениями радиоактивности образцов, полученных без использования номифензина (общий захват) и с его применением (неспецифический захват).

Расчет данных на отдельно взятые тела дофаминергических нейронов в черной субстанции и терминали их аксонов в стриатуме. Пересчет полученных в ходе исследования данных на отдельные тела и аксональные

8


терминали сохранившихся ДА-ергических нейронов проводили, используя отношение полученного на область ЧС или стриатума значения оцениваемого функционального показателя к количеству тел или аксональных терминален ДА-ергических нейронов, которые были определены в нашей лаборатории ранее (Ugramov et al., 2011).

Измерение поведенческой активности животных. Животных тестировали в "открытом поле" в автоматизированном режиме с помощью системы "Opto-varimex-3" ("Columbus Instruments International Corp.", США), регистрируя в течение 6 минут их локомоторную и исследовательскую активность (Kryzhanovsky et al., 1997).

Подбор дозы альфа-метил-пара-тирозина (аМПТ) на интактных животных для проведения «провокационного теста». Интактных животных через сутки после оценки их локомоторной и исследовательской активности на основании полученных значений разделили на пять статистически одинаковых групп (п = 9 в каждой). Животным из первой группы (контрольной) однократно подкожно вводили 0.9% NaCl, тогда как животным из оставшихся четырех групп - аМПТ (Sigma, США) в одной из концентраций: 100, 125, 150 или 170 мг/кг. Через 4 часа после инъекций 0.9% NaCl или аМПТ поведенческую активность животных оценивали повторно. Далее их декапитировали и выделяли ЧС и стриатум для оценки содержания ДА и норадреналина (НА) с помощью ВЭЖХ-ЭД.

Проведение «провокационного теста» на модели досимптомной стадии болезни Паркинсона. На основании значений локомоторной и исследовательской активности животных в модели досимптомной стадии БП разделили на четыре статистически одинаковые подгруппы (п = 9 в каждой): «NaCll» и «NaCl2», «МФТП1» и «МФТП2». Животным из подгрупп «NaCll» и «МФТП1» однократно подкожно вводили 0.9% NaCl, тогда как животным из подгрупп «NaCl2» и «МФТП2» - аМПТ в дозе 125 мг/кг. Через 4 и 24 часа, а также на 7 день после инъекций 0.9% NaCl или аМПТ оценивали поведенческую активность животных. После каждого из измерений у животных всех подгрупп (п = 9 в каждой) выделяли ЧС и стриатум для оценки содержания ДА и НА с помощью ВЭЖХ-ЭД. Кроме того, на 7 день после

9


инъекций 0.9% NaCl или ???? оценивали активность ТГ (используя вышеописанный подход).

Высокоэффективнаяжидкостная        хроматография.Разделение

катехоламинов и их метаболитов проводили на обращённо-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4x100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, «Элсико», Россия) в 0.1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 3.0), содержащем 1.1 мМ октансульфоновой кислоты, 0.1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 9% ацетонитрила, с последующей электрохимической детекцией на стеклоугольном электроде (+0.85 V).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью F-теста для определения однородности выборки и t-теста Стьюдента для определения достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Функциональная активность нигростриатной дофаминергической системы при моделировании паркинсонизма у мышей Активность тирозингидроксилазы и синтез дофамина. В ткани ЧС, а также в сохранившихся телах ДА-ергических нейронов различий в скорости синтеза ДА между моделями досимптомнои и симптомнои стадий БП не обнаружено (Рис. 1).


Поскольку в нашем исследовании показано, что в каждой из рассматриваемых экспериментальных моделей БП в ЧС стимулированное выделение ДА соответствует контрольному значению, для описанных условий увеличение скорости обратного захвата в ЧС экспериментальных животных до контрольного значения закономерно. Более того, оно необходимо для поддержания содержания ДА во внеклеточном пространстве на уровне нормы, т.к. препятствует возникновению токсического воздействия избыточного количества ДА (Quinton and Yamamoto, 2006).

В стриатуме в модели досимптомной стадии БП наблюдается небольшое, но статистически достоверное увеличение захвата Н-ДА, в то время как в модели ранней симптомной стадии различий между контролем и экспериментом не обнаружено (Рис. 5). Учитывая результаты нашего исследования по оценке выделения ДА в стриатуме в изучаемых моделях, где было показано, что в модели досимптомной стадии БП наблюдается увеличенное по отношению к контролю выделение ДА, а в ранней симптомной

14


- сниженное (Рис. 4Б), можно предположить, что в первой из рассматриваемых моделей незначительное увеличение обратного захвата в стриатуме экспериментальных животных является необходимым изменением, обеспечивающим поддержание содержания ДА во внеклеточной среде на уровне нормы. Однако в модели ранней симптомной стадии БП на фоне снижения выделения ДА вопреки ожидаемому снижению обратного захвата ДА исследуемый показатель продолжает увеличиваться. Это свидетельствует о нарушении сбалансированности процессов, регулирующих содержание ДА во внеклеточной среде, которое на уровне стриатума является ключевым параметром в управлении моторным поведением (Wickens, 1990).

Суммируя результаты исследований по оценке скорости синтеза, выделения и обратного захвата ДА в моделях досимптомной и ранней симптомной стадий БП, важно отметить, что все основные функциональные показатели сохранившихся ДА-ергических нейронов нигростриатной системы претерпевают изменения при её деградации. Знание направленности этих изменений, в свою очередь, позволило приблизиться к пониманию причин проявления нарушений произвольной двигательной активности у животных при паркинсонизме (первых симптомов БП у человека).

«Провокационный тест»

На досимптомной стадии БП компенсаторные процессы «маскируют» патологические изменения в нигростриатной системе. При этом в стриатуме наблюдается надпороговое (менее чем на 70-80%) снижение содержания ДА. В нашей лаборатории была выдвинута гипотеза, согласно которой введение людям ингибитора ТГ в дозе, при которой в норме он не вызывает порогового снижения содержания ДА в стриатуме, у лиц с ещё не диагностированной формой БП уровень нейромедиатора окажется ниже порогового значения, что приведет к преждевременному появлению у испытуемых моторных симптомов заболевания - так называемый «провокационный тест» {Угрюмое М.В., патент на изобретение: «Способ доклинической диагностики болезни Паркинсона у практически здоровых лиц» № 2318437).

На самой ранней стадии развития БП содержание ДА в стриатуме может отличаться от контрольного значения незначительно. Поэтому для того, чтобы «провокационный тест»  в  любом  случае  привел  к пороговому  снижению

15


содержания ДА в мозгу у людей со скрытой БП, доза ингибитора должна быть максимальной из того диапазона доз, при которых нет изменений двигательной активности у людей без БП.

Для разработки «провокационного теста» мы использовали модель досимптомной стадии БП. В качестве ингибитора ТГ был выбран аМПТ, который, как известно, снижает в организме содержание биогенных аминов -ДА и НА, не влияя на уровень серотонина (Hutchins and Rogers, 1973).

В первой серии экспериментов с целью подбора интересующей нас дозы аМПТ был проведен скрининг влияния различных доз ингибитора ТГ на двигательную активность, а также на содержание ДА и НА в ЧС и в стриатуме интактных животных. После введения аМПТ в дозах 100, 125 и 150 мг/кг изменений моторного поведения животных не наблюдалось, тогда как аМПТ в дозе 170 мг/кг привел к снижению их двигательной активности (Табл. 1). Другими словами, в данном эксперименте была определена максимальная доза аМПТ, не влияющая на локомоцию мышей - 150 мг/кг. Однако анализ содержания катехоламинов в ЧС и в стриатуме животных после инъекций 150 и 170 мг/кг аМПТ показал, что эффект аМПТ в указанных дозах одинаков.

Табл. 1. Поведенческие показатели мышей в «открытом поле», а также содержание катехоламинов в их черной субстанции и в стриатуме через 4 часа после однократного подкожного введения альфа-метил-пара-тирозина (аМПТ) в дозах 100, 125, 150 и 170 мг/кг (эксперимент); в контроле вводили 0.9% NaCl. Показатели в контроле приняты за 100%.

\ Показатель Группа       \

Пройденный путь

Вертикальные стойки

Время без движения

Содержание катехоламинов

в черной субстанции

Содержание катехоламинов

в стриатуме

ДА

НА

ДА

НА

0.9% NaCl

lOO.Oill.O

100.0±14.3

lOO.Oill.O

100.0±5.7

100.0±10.8

100.0±5.1

100.0±18.1

аМПТ 100 мг/кг

75.9±13.7

84.4±16.5

75.9±13.7

72.9±6.7*

56.3±8.9*

59.8±8.6*

103.3±14.5

аМПТ 125 мг/кг

85.5±6.7

112.4±8.6

85.5±6.7

62.7±4.2*

58.0±5.5*

54.9±4.8*

70.6±22.5*

аМПТ 150 мг/кг

95.8±10.2

83.6±9.2

95.8±10.2

48.3±7.5*

45.8±5.0*

39.2±3.6*

58.9±7.1*

аМПТ 170 мг/кг

58.6±4.4*

54.6±6.3*

58.6±4.4*

39.4±9.8*

48.6±3.4*

39.2±2.6*

59.0±3.6*

Достоверные различия (р < 0.05): * -по отношению к группе «0.9% NaCl»,

# -по отношению к группе «аМПТ 100 мг/кг», $ -по отношению к группе «аМПТ 125 мг/кг».

16


Табл. 2. Поведенческие показатели мышей (модель досимптомной стадии болезни Паркинсона) в «открытом поле» за сутки до введения альфа-метил-пара-тирозина (аМПТ), a также через 4, 24 часа и на 7 день после однократного подкожного введения аМПТ в дозе 125 мг/кг (эксперимент); в контроле вводили 0.9% NaCl. Для первого из измерений (за сутки до введения аМПТ) за 100% принята активность мышей в группе «NaCll»; для последующих измерений - в группе «NaCll+NaCl».

».

Тест

Группа

За сутки до введения ????

Группа

Через 4 часа после введения аМПТ

Через 24 часа после введения аМПТ

На 7 день после введения аМПТ

NaCll

100.0±6.5

NaCll+NaCl

100.0±6.2

100.0±7.9

100.0±14.7

Пройденный путь

NaCl2 ?????

100.2±6.1 93.7±6.2

NaCl2+aMnT ?????+NaCI

91.Ь8.0 102.4Ь1.2

91.7±6.7 107.3±11.5

90.9±8.8 96.6±10.4

МФТП2

95.9±11.4

????2+????

37.8±8.8 * # $

93.7±7.1

106.1±11.0

NaCll

100.0±9.3

NaCll+NaCl

lOO.OilO.6

100.0±12.4

100.0±21.7

Вертикальные

NaCl2

98.7±9.8

NaCl2+aMnT

90.7±12.3

89.7±9.6

107.4±20.1

стойки

?????

100.0±12.9

?????+NaCI

83.7±10.0

96.5±13.8

113.2±18.5

????2

97.0±9.1

????2+????

30.9±10.6*#$

91.Ь9.9

120.6±19.6

NaCll

100.0±8.0

NaCll+NaCl

100.0±6.1

100.0±4.6

100.0±4.2

Время без

NaCl2

98.6±6.5

NaCl2+aMnT

111.3±6.9

112.9±8.1

95.8±5.8

движения

?????

105.0±11.3

?????+NaCI

95.0±9.9

94.6±9.5

97.9±6.6

????2

104.7±9.3

????2+????

182.8Ь2.8 * # $

107.6±8.2

100.4±4.8

Время

NaCll

100.0±5.1

NaCll+NaCl

100.0±6.4

100.0±5.6

100.0±4.8

NaCl2

101.0±4.0

NaCl2+aMnT

86.4±6.4

89.7±6.8

90.0±5.2

передвижения в камере

????? ????2

94.8±6.6 96.4±4.7

?????+NaCI ????2+????

104.4±9.1 37.3±8.4 * # $

105.0±8.6 97.7±6.8

99.3±7.0 100.8±5.3

NaCll

100.0±2.1

NaCll+NaCl

lOO.Oil.7

100.0±2.6

100.0±9.5

Число стереотипных

NaCl2

101.6±1.4

NaCl2+aMnT

100.0±2.1

100.6±2.4

106.9±9.5

движений

?????

99.6±3.1

?????+NaCI

102.0±2.9

103.5±1.6

94.8±11.1

????2

98.0±1.7

????2+????

67.7±4.8 * # $

99.3±3.0

96.6±7.3

Время

NaCll

100.0±2.1

NaCll+NaCl

lOO.Oil.4

100.0±2.1

100.0±13.6

NaCl2

99.3±2.1

NaCl2+aMnT

102.3Ь.9

103.9±2.1

92.9±12.4

стереотипных движений

????? ????2

103.Ь3.0 101.4±2.2

?????+NaCI ????2+????

100.3±2.5 81.9±6.2*#$

106.4±3.0 101.7±3.0

112.2±13.6 109.2±11.0

Достоверные различия (р < 0.05): * -по отношению к группе «NaCll» /«NaCll+NaCl», # -по отношению к группе «NaCl2+ аМПТ», $ -по отношению к группе «?????+NaCl».


Табл. 3. Содержание дофамина (ДА) в черной субстанции (ЧС) и в стриатуме у мышей (модель досимптомной стадии болезни Паркинсона) через 4, 24 часа и на 7 день день после подкожного введения альфа-метил-пара-тирозина (аМПТ) в дозе 125 мг/кг; в контроле вводили 0.9% NaCl. Содержание ДА в контроле (группа «NaCll+NaCl») принято за 100%.

ДОФАМИН

Через 4 часа после введения аМПТ

Через 24 часа после введения аМПТ

На 7 день после введения аМПТ

^~~^-^Структура Группа  ^^^-^^

ЧС

Стриатум

ЧС

Стриатум

ЧС

Стриатум

NaCli+NaCI

100.0±9.4

100.0±4.2

100.0±7.6

100.0±6.3

100.0±13.7

100.0±4.0

NaCl2+aMnT

53.9±3.9*

62.9±2.8*

93.3±6.7

90.8±4.9

105.8±20.9

95.7±5.3

?????+NaCI

93.0±6.3

47.1±3.8*#

105.0±7.6

42.1±3.1*#

93.5±13.7

40.5±3.6*#

МФТПг+аМПТ

45.3±3.1*$

18.0±1.1*#$

93.3±5.9

40.9±2.9*#

91.4±8.6

45.2±6.0*#

Достоверные различия (р < 0.05): * -по отношению к группе «NaCll+NaCl», # -по отношению к группе «NaCl2+ оМПТ», $ -по отношению к группе «?????+NaCl».

Табл. 4. Содержание норадреналина (НА) в черной субстанции (ЧС) и в стриатуме у мышей (модель досимптомной стадии болезни Паркинсона) через 4, 24 часа 48 часов и на 7 день после подкожного введения альфа-метил-пара-тирозина (аМПТ) в дозе 125 мг/кг; в

ши.У% JNaCl. Соде

зжание НА в контроле (групп

a«JNaCll+JNaCl

») принято за 1UL

%.

НОРАДРЕНАЛИН

Через 4 часа после введения аМПТ

Через 24 часа после введения аМПТ

На 7 день после введения аМПТ

^^^^Структура Группа   ^^^^^

ЧС

Стриатум

ЧС

Стриатум

ЧС

Стриатум

NaCli+NaCI

100.0±5.3

100.0±12.5

100.0±21.9

100.0±11.8

100.0±9.9

100.0±7.7

NaCl2+aMnT

54.0±2.7*

67.3±5.0*

92.5±8.8

104.3±13.3

91.2±6.6

96.4±7.7

?????+NaCI

92.0±4.0

44.5±3.2*#

90.6±5.6

53.1±3.8*#

106.6±11.0

72.0±10.7*#

МФТПг+аМПТ

51.3±4.7*$

36.3±3.2*#$

81.9±5.6

54.0±4.3*#

91.2±7.7

72.0±10.7*#

Достоверные различия (р < 0.05): * -по отношению к группе «NaCll+NaCl», # -по отношению к группе «NaCl2+ оМПТ», $ -по отношению к группе «?????+NaCl».


Вероятно, после введения 170 мг/кг аМПТ нарушение двигательной активности животных было связано не со снижением содержания катехоламинов в мозгу, а с токсическим эффектом ингибитора ТГ. Поскольку по биохимическим показателям между дозами 150 и 170 мг/кг аМПТ не было обнаружено различий, мы рассмотрели эффект аМПТ в дозе 125 мг/кг: снижение содержания ДА в ЧС и в стриатуме было менее выраженным по отношению к двум наивысшим использованным дозам аМПТ, изменения двигательной активности животных отсутствовали. Поэтому аМПТ в дозе 125 мг/кг был использован далее для проведения «провокационного теста» на модели досимптомной стадии БП.

Через 4 часа после введения аМПТ мышам в модели досимптомной стадии БП только у экспериментальной подгруппы наблюдалось ярко выраженное снижение двигательной активности по отношению к трем оставшимся подгруппам: контрольной, которой ввели аМПТ, a также контрольной и экспериментальной, которым ввели 0.9% NaCl (Табл. 2).

Далее для всех групп мышей был проведен биохимический анализ содержания катехоламинов в ЧС и в стриатуме, который показал, что через 4 часа после введения аМПТ у животных как контрольной, так и экспериментальной группы в обеих структурах мозга произошло статистически одинаковое снижение содержания ДА по отношению к исходному значению. Так, в ЧС это снижение составило 46% и 48% соответственно, тогда как в стриатуме - 37% и 29% (Табл. 3). Снижение содержания НА в ЧС также было одинаковым, составив 46% для контрольной группы и 41% - для экспериментальной. Однако в стриатуме, в отличие от 33%-ного уменьшения содержания НА в контрольной группе, в экспериментальной группе оно было незначительным - 8% (Табл. 4), что позволило нам предположить отсутствие влияния данного показателя на двигательную активность экспериментальных животных в нашем исследовании.

Поскольку у экспериментальных животных содержание ДА в стриатуме при введении аМПТ составляло всего 40% от контрольного значения, то дополнительное снижение уровня нейромедиатора ещё на треть от оставшегося количества стало пороговым. Последнее, как мы полагаем, и объясняет появление нарушений моторного поведения в этой группе животных.


Далее необходимо было удостовериться в том, что, «провоцируя» моторные нарушения у животных в модели досимптомной стадии БП, мы не вызываем окончательный переход заболевания в симптомную стадию. Для этого вновь ввели аМПТ мышам на досимптомной стадии паркинсонизма, однако двигательную активность животных и уровень ДА и НА в их мозгу оценили не только через 4 часа после введения ингибитора ТГ, но и через 24 часа, а также на 7 день (Табл. 2,3,4). Кроме того, на 7 день дополнительно определили активность ТГ как мишени действия аМПТ (Рис. 6). Через 24 часа после введения аМПТ (и далее) все вышеописанные измененные показатели вернулись к исходным значениям.

Важно отметить, что начиная с 1969 года аМПТ успешно используется при лечении у людей заболеваний, в патогенезе которых отмечено повышенное образование ДА и НА (Bloemen et al., 2008). При этом известно, что у здоровых людей при однократном оральном приёме больших доз аМПТ (от 5.25 до 6.75 г) наблюдаются кратковременные экстрапирамидальные нарушения движений (гипокинезия, ригидность, тремор). Следовательно, дозы аМПТ в чуть меньшем диапазоне вышеуказанных могут быть приняты как предельно допустимые для использования в диагностических целях при проведении «провокационного теста» в клинике.

20


Следует также отметить, что для людей и животных показано полное восстановление всех ????-измененных показателей двигательной активности как по истечении периода действия ингибитора ТГ, так и при введении в организм в период действия аМПТ предшественника ДА - L-ДОФА (Moore, 1966; McCann et al., 1990). Из этого следует, что при проведении предложенного нами «провокационного теста» в клинике приём L-ДОФА людьми со скрытой формой БП вслед за появлением у них нарушений двигательной активности может снять необходимость ожидания прекращения действия аМПТ.

Таким образом, на экспериментальной модели досимптомной стадии БП у мышей успешно разработана принципиально новая, легко воспроизводимая и экономичная технология диагностики заболевания, протекающего в скрытой форме.

ВЫВОДЫ

1.     Охарактеризовано функциональное состояние нигростриатной ДА-

ергической системы у мышей при различной степени её деградации,

соответствующей досимптомной и симптомной стадиям БП у человека (дана

оценка скорости синтеза, выделения и обратного захвата ДА):

а)    в черной субстанции на обеих стадиях БП все функциональные

показатели соответствуют уровню в контроле за счет активации

сохранившихся тел ДА-ергических нейронов на фоне прогрессировать

деградации нигростриатной системы;

б)    в стриатуме на досимптомной стадии БП скорость

стимулированного выделения и обратного захвата ДА выше контроля, а на

симптомной стадии стимулированное выделение нейромедиатора снижается

при неизменной скорости его обратного захвата, что может приводить к

уменьшению содержания ДА в синаптической щели и к появлению

нарушений двигательной активности.

2.   Разработан метод диагностики БП на досимптомной стадии течения

заболевания:

а) на модели досимптомной стадии БП у мышей путем применения аМПТ  -  обратимого  ингибитора  тирозингидроксилазы,  спровоцировано

21


появление  моторных  симптомов  заболевания,  протекающего  в  скрытой форме;

б) показан кратковременный и обратимый эффект аМПТ на активность тирозингидроксилазы в сохранившихся ДА-ергических нейронах частично деградировавшей нигростриатной системы, а также на содержание катехоламинов в телах и терминалях нейронов и моторную активность животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах перечня ВАК:

  1. Хакимова Г.Р., Козина Е.А., Сапронова А.Я., Угрюмов М.В. Обратный захват дофамина в черной субстанции и в стриатуме на досимптомной и ранней симптомной стадиях паркинсонизма у мышей // Доклады Академии Наук. 2010. Т. 435(2). С. 272-274.
  2. Хакимова Г.Р., Козина Е.А., Сапронова А.Я., Угрюмов М.В. Выделение дофамина в черной субстанции и в стриатуме на досимптомной и ранней симптомной стадиях паркинсонизма у мышей // Нейрохимия. 2011. Т. 28(1). С. 42-48.
  3. Хакимова Г.Р., Козина Е.А., Сапронова А.Я., Угрюмов М.В. Синтез дофамина в нигростриатной системе на досимптомной и ранней симптомной стадиях паркинсонизма у мышей // Доклады Академии Наук. 2011. Т. 440(6). С. 847-849.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

аМПТ - альфа-метил-пара-тирозин,

L-ДОФА - 3,4-дигидроксифенилаланин,

БП - болезнь Паркинсона,

ДА - дофамин,

ДАА - декарбоксилаза ароматических L-аминокислот,

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин,

НА - норадреналин,

ТГ - тирозингидроксилаза,

ЧС - черная субстанция.

22

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.