WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

Генотипирование серотипов вируса блютанга

Автореферат кандидатской диссертации

 

                                                                                                           На правах рукописи

 

Панферова Агнеса Владимировна

 

 

Генотипирование серотипов вируса блютанга

 

03.02.02  -  Вирусология

 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

 

 

 

Покров-2012

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук,

профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

 

Колбасов Денис Владимирович

 

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

(ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир)

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

(ФГУ ВПО МГАВМиБ, г. Москва)

 

Рыбаков Сергей Сергеевич

 

Ярыгина Елена Игоревна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ – ВНИВИ»), г. Казань.

Защита диссертации состоится «_24_» мая 2012 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: 8 (49243) 6-21-25.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « 19 » _апреля_ 2012 г.

Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru   и на официальном сайте ВАК России  www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

кандидат биологических наук

   

Е.А. Балашова

1 Общая характеристика работы

1.1 Актуальность темы. Блютанг – неконтагиозное трансмиссивное заболевание широкого спектра жвачных животных, передающееся кровососущими насекомыми из рода Culicoides ихарактеризующееся лихорадочным состоянием, воспалительно-некротическими поражениями ротовой полости, особенно языка, пищеварительного тракта, эпителия венчика и основы кожи копыт, а также дегенеративными изменениями скелетных мышц (Сюрин В.Н. c cоавт., 1998 г.). Болезнь представляет значительную социально-экономическую проблему в сфере международной торговли животными и продуктами животноводства.

Этиологическим агентом болезни является РНК-содержащий вирус, принадлежащий к роду Orbivirus семейства Reoviridae. Геном вируса блютанга (ВБ) состоит из 10 дцРНК. Наличие сегментированного генома предопределяет появление реассортантов, что, в свою очередь, может привести к возникновению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами. На данный момент известно о 26 серотипах ВБ (Maan et al., 2011).

До 1943 г. считалось, что распространение блютанга ограничено только африканским континентом, однако на настоящий момент известно, что он зарегистрирован на всех континентах мира. С 1998 г. в Европе были зафиксированы восемь серотипов: 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16.

Актуальность изучения блютанга для Российской Федерации (РФ) значительно возросла в 2006 г. с началом импорта племенного крупного рогатого скота (КРС) из стран Европейского Союза (ЕС), в том числе и из стран, неблагополучных на тот момент по блютангу – Германии и Голландии. За период с начала 2006 г. по июнь 2011 г. из стран ЕС было ввезено около 250 тысяч животных в хозяйства, расположенные по всей европейской территории РФ, а также на Урале и в Алтайском крае. Среди импортированного скота сотрудниками ВНИИВВиМ были обнаружены инфицированные ВБ животные, от которых выделили пять изолятов вируса 8 серотипа.

Известно, что изоляты вируса блютанга имеют чрезвычайно высокий уровень генетической гетерогенности и с помощью средств молекулярно-генетического анализа можно определить нуклеотип, серотип и в некоторых случаях дифференцировать вакцинный вирус от полевого (Maan et al., 2007). С помощью нуклеотидного секвенирования и филогенетического анализа определяют дополнительно и другие генетические характеристики, такие как топотип и квазитип, генотипируют реассортантные варианты вируса. Таким образом, с помощью средств молекулярно-генетического анализа в настоящее время возможно в течение 2-3 дней определить серотип и генетические характеристики вируса, его пространственное и временное распространение. Данные тесты чувствительны, специфичны и в случае идентификации серотипа вируса идеально согласуются с результатами методов вирус-нейтрализации. Указанные выше факты определяют актуальность выполненной работы.

1.2 Степень разработанности проблемы. Отечественные ученые (Снетков К.А. с соавт., 2002; Гаврилова Е.А. с соавт., 2009) разработали различные варианты ОТ-ПЦР для выявления генома ВБ, то есть определения серогрупповой принадлежности вируса. Однако не была изучена возможность определения серотиповой принадлежности и его генетической характеристики с помощью методов молекулярно-генетического анализа. 

Для идентификации серотипов ВБ иностранными учеными разработаны варианты ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза и в режиме реального времени (Mertens et al., 2007; Vandenbussche et al., 2009; Hoffmann et al., 2009). Для генетической характеристики определяют нуклеотидные последовательности отдельных участков и сегментов генома, в качестве комплексного анализа выполняют полногеномное секвенирование (Maan et al., 2007; Maan et al., 2008).

В России до настоящего времени не разработано средств, основанных на ОТ-ПЦР, позволяющих определить серотиповую принадлежность и дать генетическую характеристику ВБ.

1.3 Цель и задачи исследования. В соответствии с вышеизложенным, основная цель данных исследований заключалась в разработке средств идентификации эпизоотически значимых серотипов вируса блютанга и определении генетических характеристик изолятов вируса, выделенных на территории РФ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза для идентификации вируса блютанга эпизоотически значимых для РФ серотипов; 

2) подобрать серотип-специфические системы «олигонуклеотидные праймеры - зонд» и разработать на их основе мультиплексные варианты ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга эпизоотически значимых для РФсеротипов;

3) разработать внутренний и положительный контроли реакции для мультиплексных вариантов серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени и установить показатели аналитической специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости разработанных серотип-специфических ОТ-ПЦР;

4) подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для нуклеотидного секвенирования сегментов генома вируса блютанга и провести филогенетический анализ изолятов, выделенных на территории РФ.

1.4 Научная новизна результатов исследований.

Впервые в РФ разработаны:

- серотип-специфические ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза для идентификации ВБ 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов;

- мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации ВБ 1 и 8, 4 и 16 серотипов.

Впервые в РФ определены:

- нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома пяти изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от крупного рогатого скота, импортированного в 2007-2009 гг. в хозяйства Курской, Калининградской и Нижегородской областей РФ, генетические характеристики изолятов и проведен их филогенетический анализ;

- нуклеотидные последовательности 2, 3, 5, 6, 7, 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар, выделенного от овец во время вспышки заболевания 1993 г. в Республике Бурятия, генетические характеристики штамма и проведен его филогенетический анализ.

1.5 Практическая значимость работы

Проведен молекулярно-генетический анализ трех сегментов генома пяти изолятов ВБ 8 серотипа, выделенных от импортированного в РФ  крупного рогатого скота и шести сегментов генома ВБ штамма Тапхар 16 серотипа выделенного от овец при вспышке заболевания в 1993 г. в Республике Бурятия.

Разработаны «Методические положения по дифференциации 1, 2, 4, 8 и 16 серотипов вируса блютанга методом ОТ-ПЦР», которые  утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М. Смирновым 16.11.2011 г.

Разработаны «Методические положения по дифференциации 1-го, 4-го, 8-го и 16-го серотипов вируса блютанга методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», которые утверждены  академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М. Смирновым 10.11.2011 г. 

1.6 Основные положения, выносимые на защиту

1. Серотип-специфическая ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации - специфичный, чувствительный и воспроизводимый метод идентификации вируса блютанга 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов.

2. Мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени – специфичные, высокочувствительные и воспроизводимые методы идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов.

3. Нуклеотидные последовательности и результаты филогенетического анализа 2, 7 и 10 сегментов генома пяти изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от крупного рогатого скота, импортированного в РФ в 2008-2009 гг. и 2, 3, 5, 6, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар, выделенного от овец во время вспышки заболевания в 1993 г. в Республике Бурятия.

1.7 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились при участии сотрудников лаборатории Диагностики и Научно-экспериментального отдела ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

1.8 Апробация результатов работы. Основные результаты исследований по теме диссертации доложены на научной конференции  ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины», г. Покров, 2009 г.; на международной  научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП, г. Щелково, 2009 г.; ежегодном международном съезде представителей европейских референс-лабораторий по блютангу, г. Мадрид, Испания, 2010 г.; на международной конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную медицину» в ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир, 2010 г.; на международной конференции "Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС" Республика Беларусь, г. Минск, 2011 г.; на выездном заседании секции «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 30.09.2010 г.; на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2009-2011 гг.

1.9 Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть научных работ, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.10 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы разработки мер и средств предупреждения, диагностики и лечения, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований – генной инженерии, исследования генетических и негенетических взаимодействий клетки и вируса, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработки мер предупреждения, диагностики и лечения вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем, в диссертационной работе проведены исследования по разработке средств обнаружения и дифференциации эпизоотически значимых для РФ серотипов вируса блютанга на  основе различных вариантов ОТ-ПЦР, с использованием генно-инженерных конструкций, определение нуклеотидной последовательности сегментов генома и филогенетический анализ серотипов вируса блютанга, выделенных на территории  РФ. Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 5, 8, 10.

1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты и обсуждение собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 6 отечественных и 123 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 19 рисунками.

2 Собственные исследования

2.1 Материалы. Вирусы: референтные штаммы ВБ 24 серотипов (RSArrrr/1 - RSArrrr/24), инфекционная активность 6,0 lg ТЦД50/см3; референтный штамм ВБ 26 серотипа, инфекционная активность 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см3 (получены из референтной лаборатории по блютангу Института Здоровья животных, Пирбрайт, Великобритания); культуральный ВБ 8 серотипа изолят ФК/1-08 с инфекционной активностью 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см3; культуральный ВБ 8 серотипа изолят ФК/2-09, инфекционная активность 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см3; культуральный ВБ 8 серотипа изолят ФК/3-09, инфекционная активность 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см3; культуральный ВБ 8 серотипа изолят ФКл/4-09, инфекционная активность 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см3; культуральный ВБ, 8 серотипа изолят ФН/5-09, инфекционная активность 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см3; культуральный ВБ 16 серотипа штамм Тапхар, инфекционная активность 6,5 - 6,75 lg ТЦД50/см3.

Пробы крови, искусственно контаминированной ВБ и от экспериментально зараженных ВБ животных: использованы образцы крови КРС (нетели) и МРС (овцы, козы), контаминированной ВБ различных серотипов (1, 2, 4, 6, 8, 16, 24 серотипы), присланной из референтной лаборатории по блютангу Института Здоровья Животных Пирбрайт, Великобритания в рамках ежегодных международных сличительных испытаний по диагностике блютанга.

Пробы крови, отобранной на разных стадиях инфекционного процесса от экспериментально зараженных животных: КРС, МРС (штамм BTV-1 Spain, 1 серотип);  КРС, МРС (изолят «ФКл/4-09», 8 серотип); КРС, МРС (штамм BTV-4 Spain, 4 серотип); КРС (одновременное заражение ВБ 1 и 8 серотипов); пятнистых оленей, зараженных ВБ 16 серотипа, штамм Тапхар.

Животные: теленок чёрно-пёстрой породы, возраст 6 месяцев; пятнистые олени два самца и одна самка, возраст 1,0 - 1,5 года.

Культуры клеток: перевиваемые линии клеток почки африканской зеленой мартышки (CV-1 и Vero), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13), почки сайги (ПС), почки сибирского горного козерога (ПСГК).

Плазмида и бактериальные штаммы. Для клонирования использовали коммерческий набор Promega pGEM-T Еasy cloning kit (Promega, США), в качестве вектора для клонирования - плазмиду pGEM-T Еasy 3,015 kb. Клонирование проводили в генетически модифицированных клетках E. coli линии DH5(Invitrogen, США), DH5?™ F – ?80lacZ?M15 ?(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 ?– thi-1 gyrA96 relA1.

2.2 Методы. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Для выделения тотальной РНК из проб цельной крови, культур клеток, суспензии куриных эмбрионов и органов использовали гуанидин тиоционат-фенол-хлороформную экстракцию (Сhomczynski P. and Sacchi N., 1987) и коммерческий реагент Trizol LS (Invitrogen, США). Для быстрой экстракции нуклеиновых кислот использовали набор «Рибо-cорб» («Интерлабсервис») и методику нуклеосорбции на силикагеле, применяемую для рутинных исследований в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза. Для идентификации геномов ВБ различных серотипов использовали серотип-специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие различные по длине специфические последовательности 2 сегмента генома 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов.

Предварительную денатурацию 6 мкл дцРНК со специфическими праймерами (по 10 пмоль каждого) в объеме 10 мкл проводили при 98 ° С в течение 5 мин под слоем минерального масла. Обратную транскрипцию осуществляли в течение 60 мин при 42 ° С с использованием следующих компонентов: 2 мкл dNTPs (10 mM), 1 мкл (200 ед.) MMLV-ревертазы; 5 мкл 5х буфера для обратной транскрипции (250 mM Tris-HCl pH8,3; 375 mM KCl; 15 mM MgCl2, 50 mM DTT), деионизированной воды - до 30 мкл.

Смесь для амплификации: смесь праймеров (10 пмоль каждого) - 2,0 мкл dNTP (10 mМ) - 1 мкл, MgCl2 (25 mМ) - 1 мкл, 5Х буфер для ПЦР (Амплисенс Blue) - 10 мкл, Taq ДНК-полимераза - 0,5 мкл (2,5 ед.), кДНК (исследуемый образец) - 10 мкл, деионизированная вода - до 50 мкл.

Для амплификации длинных фрагментов, с целью дальнейшего нуклеотидного секвенирования использовали высокоточную ДНК-полимеразу V93Q pfu-sso7d. ПЦР проводили согласно инструкции производителя (ОДО «Праймтех», Минск, Беларусь).

Анализ ПЦР-продуктов. Анализ продуктов реакции осуществляли при помощи электрофореза в 1,5 – 2,0 % агарозном геле, содержащем 0,001 % бромистого этидия, при силе тока 50 мА и напряжении 170 В.

ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амлификации в режиме реального времени. В работе использовали технологию гибридизационных флуоресцентных зондов – TaqMan, основанную на детекции репортерной флуоресценции при гидролизе меченого зонда. Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали стандартную смесь: 5 мкл 5х буфера для ПЦР (50 mМ KCl 10 mМ трис-HCl pH8,4, ООО «КЭмБио»); 0,3 мкл dNTPs (10 mM); 2 мкл смеси праймеров (10 пмоль), 0,5 мкл МgCl2 (25 mM), 0,3 мкл зонда (10 пмоль), 0,15 мкл Таq-полимераза (5 ед/мкл), 10 мкл кДНК, объем реакционной смеси доводили до 25 мкл деионизированной водой.

Нуклеотидное секвенирование. Нуклеотидное секвенирование сегментов генома ВБ проводили с использованием специфичных олигонуклеотидных праймеров, подобранных отдельно для каждого сегмента, с учетом серотипа вируса и его генетических вариантов. Выделение специфических продуктов амплификации из агарозного геля или реакционной смеси осуществляли коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот «DNA purification kit» («Fermentas», Латвия), с последующей реамплификацией фрагментов при помощи  компонентов «BigDye v. 3.1. Terminator» («Applied Biosystems», США).

Молекулярное клонирование продуктов ПЦР. Очистку продуктов ПЦР, клонирование и скрининг рекомбинантных клонов осуществляли в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя набора Promega pGEM-T Easy kit (Promega, США).

Филогенетический анализ. Филогенетические деревья строили по общепринятому для анализа генома ВБ методу присоединения соседей, с использованием метода дистанционных матриц, с алгоритмом р-дистанций в программе MEGA5,0 с 500 бутстрэп-повторами.

Постановка ИФА. Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для выявления специфических VP7 антител вируса блютанга был выполнен с использованием набора сELISA (ID Vet, Франция) сотрудниками лаборатории Диагностики и Научно-экспериментального отдела ВНИИВВиМ согласно инструкции производителя.

3 Результаты собственных исследований

3.1 Разработка ОТ-ПЦР для идентификации вируса блютанга 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов. Для разработки применен метод ОТ-ПЦР, опубликованный Mertens с соавт. в 2007 г., который основан на использовании серотип-специфических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности 2 сегмента известных генетических вариантов каждого из вышеперечисленных серотипов вируса. Были выбраны пары олигонуклеотидных праймеров, фланкирующие наиболее специфический для каждого серотипа участок 2 сегмента генома ВБ, пригодные для последующего секвенирования. Размеры ПЦР-продуктов варьировали от 1334 до 2125 п.о.

В результате проведенных экспериментов  подобраны: состав реакционной смеси для синтеза кДНК, оптимальная температура для гибридизации пар специфических олигонуклеотидных праймеров и профили соответствующих реакций. Для определения аналитической специфичности каждой из разработанных реакций использовали РНК: ВБ референтных штаммов 24 серотипов, ВБ 26 серотипа изолята KUW2010/02, вируса АЧЛ 9 серотипа изолят Уттар-Прадеш, вируса ЭГБО 1 серотипа штамм Нью-Джерси, 2 серотипа штамм Альберта, 6 серотипа изолята TUR2007/01 и образцов биологического материала, содержащих интактные культуры клеток ВНК-21/13, Vero, ПСГК, кровь от интактных животных - КРС и МРС. В результате проведенных исследований установлено, что амплификация специфического фрагмента кДНК наблюдалась только в образцах, содержащих РНК ВБ 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов (рис.1). Таким образом, выбранные олигонуклеотидные праймеры обладали специфичностью, исключали перекрестные реакции с РНК других серотипов ВБ и РНК гетерологичных вирусов.

                          

Рис. 1 Электрофореграмма продуктов амплификации кДНК восьми серотипов ВБ в ПЦР с серотип-специфическими олигонуклеотидными праймерами

Примечание: М – маркер молекулярной массы ДНК (100 п.о. - 3000 п.о.);

Треки   1-24, 26 –  соответствуют номерам серотипов ВБ

Для определения аналитической чувствительности реакций готовили десятикратные разведения культурального вируса каждого из определяемых серотипов. Аналитическая чувствительность реакций для идентификации ВБ 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов составила 1,5 lg ТЦД50/см3, 2,0 lg ТЦД50/см3, 2,5 lg ТЦД50/см3, 2,0 lg ТЦД50/см3, 1,5 lg ТЦД50/см3, 2,0 lg ТЦД50/см3, 2,5 lg ТЦД50/см3 и 2,0 lg ТЦД50/см3, соответственно. С помощью разработанных серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза при последующем секвенировании и анализе нуклеотидных последовательностей возможно быстро и точно определить генетические характеристики изолятов вируса по сегменту 2.

3.2 Разработка мультиплексных вариантов серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов. С мая 2010 г. по ноябрь 2011 г. по данным МЭБ регистрировали вспышки ВБ 1, 4, 8 и 16 серотипов. С учетом эпизоотической ситуации разработаны мультиплексные варианты реакций для идентификации ВБ 1 и 8 серотипов в одной пробирке, 4 и 16 серотипов в одной пробирке. С этой целью проанализированы представленные в GenBank нуклеотидные последовательности 2 сегмента генома различных изолятов ВБ 1, 4, 8 и 16 серотипов, для их идентификации подобраны оригинальные системы «олигонуклеотидные праймеры - зонд». Кроме того, оба варианта содержат дополнительно систему «олигонуклеотидные праймеры - зонд» для обнаружения участка гена ?-актина, широко используемого в качестве эндогенного внутреннего контроля для оценки прохождения всех этапов реакции (Toussaint et al., 2007).

Таким образом, каждая реакционная смесь содержала три пары серотип-специфических олигонуклеотидных праймеров и три зонда, детекцию результатов вели по 3-м каналам: FAM, Orange и Red (рис. 2).

По результатам испытаний определены показатели аналитической специфичности, аналитической чувствительности, линейности и эффективности амплификации (табл.). В результате проведенных исследований установлено, что амплификация специфического фрагмента кДНК наблюдалась только в образцах, содержащих РНК ВБ 1, 4, 8, и 16 серотипов. Таким образом, подобранные оригинальные системы «серотип-специфические олигонуклеотидных праймеры – зонд» обладали специфичностью, исключали перекрестные реакции с РНК ВБ других серотипов и РНК гетерологичных вирусов.                                                                                                                       

  

  1.                                                           2)     

Рис. 2 1) - результаты амплификации: А – участка 2 сегмента генома вируса блютанга 1 серотипа (канал FAM), 1 – анализ образцов крови теленка, инфицированного 1 серотипом ВБ; В – участка 2 сегмента генома ВБ 8 серотипа (канал Orange), 2 - анализ образцов крови теленка, инфицированного 8 серотипом ВБ; С – участка нуклеиновой последовательности гена бета-актина (канал Red), 3 - анализ образцов крови телят, инфицированных 1 и 8 серотипами ВБ. 2) - результаты амплификации: А – участка 2 сегмента генома ВБ 4 серотипа (канал FAM), 1 – анализ образцов крови теленка, инфицированного 4 серотипом ВБ; В – участка 2 сегмента генома ВБ 16 серотипа (канал Orange), 2 - анализ образцов крови пятнистого оленя, инфицированного 16 серотипом ВБ; С – участка нуклеиновой последовательности гена бета-актина (канал Red), 3 - анализ образцов крови теленка и пятнистого оленя, инфицированных 4 и 16 серотипами ВБ.                                                         

Таблица

n=3

Аналитическая чувствительность, линейность и эффективность амплификации серотип-специфических ОТ-ПЦР РВ в составе мультиплексных вариантов

мультиплексный вариант ОТ-ПЦР РВ

серотип

аналитическая чувствительность (lg ТЦД50/см3)

линейность (lg ТЦД50/см3)

эффективность амплификации, %

1/8/ВКО

1

0,5

0,5-6,5

99

8

0,5

0,5-6,5

99

4/16/ВКО

4

0,75

0,75-6,75

98

16

0,25

0,25-6,25

99

Согласно требованиям международных стандартов для более точной оценки воспроизводимости реакций в составе мультиплексов дополнительно рассчитаны показатели интра- и интеррановой воспроизводимости.

Интрарановая, интеррановая и общая рановая воспроизводимости каждой реакции в составе мультиплексов выражены в стандартных отклонениях (С.О.) и коэффициентах вариации (К.В.) для положительных образцов, сгруппированных в три группы по значению Сt. В целом, стандартные отклонения варьировали от 0,46 до 1,87 значения Ct и коэффициент вариации от 1,52 % до 4,78 %, соответственно.

Мультиплексные варианты реакций апробированы для проведения исследований на наиболее распространенных в РФ моделях амплификаторов: Rotor Gene 6000 (Corbet Research), IQ5 (BioRad), CFX96 (BioRad). Воспроизводимость результатов составила 100 %.

3.3 Разработка рекомбинантных положительных контролей для мультиплексных вариантов ОТ-ПЦР РВ для идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов. Одним из компонентов тестов, основанных на ПЦР, применяемых для идентификации генома вирусов, должен быть положительный контроль (ПК), который является индикатором качества проведения реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к ПК, являются специфичность, безопасность использования и длительный срок его хранения. В разрабатываемых тестах нового поколения в качестве ПК используют плазмидный вектор, в который встроена последовательность специфического участка генома вируса. Поэтому для использования в качестве положительного контроля в мультиплексных вариантах ОТ-ПЦР РВ для идентификации ВБ 1 и 8, 4 и 16 серотипов разработаны 4 рекомбинантные конструкции на основе вектора pGEM-T Еasy с использованием соответствующего набора pGEM-T Еasy cloning kit (Promega, США), несущие встройку участка 2 сегмента ВБ 1, 4, 8 и 16 серотипов (150 п.о., 94 п.о., 97 п.о. и 139 п.о., соответственно).

Из исходного препарата плазмид готовили серии десятикратных разведений. Для снижения риска контаминации при использовании рекомбинантных ПК было решено использовать наименьшее количество препарата, в реакции с которым, график накопления продуктов амплификации характеризовался четкой сигмоидной кривой. В результате серий проведенных экспериментов установлено, что при использовании 8 мкл препарата в разведении 10-8, количество копий рекомбинантной плазмиды составило: 53, 40, 48 и 32 на реакцию для идентификации ВБ 1, 4, 8 и 16 серотипов, соответственно.

3.4 Оценка разработанных мультиплексных вариантов ОТ-ПЦР РВ при исследовании клинического материала от экспериментально зараженных вирусом блютанга животных. Разработанные мультиплексные варианты для идентификации ВБ 1 и 8, 4 и 16 серотипов тестировали путем проведения исследований крови от инфицированных в эксперименте животных, что позволило оценить тесты в максимально приближенных к естественным условиях и в сравнении с серогруппспецифическим тестом, разработанным в 2010 г. Е.А. Гавриловой с соавт. В рамках проведенных экспериментов, исследовали образцы крови от телят и ягнят, зараженных ВБ 1, 4 и 8 серотипов; образцы крови от теленка, зараженного ВБ одновременно 1 и 8 серотипов и пробы крови оленей, зараженных ВБ 16 серотипа. По результатам проведенных исследований установлено, что мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР РВ не уступали в чувствительности серогрупп-специфическому тесту, имели аналогичные значения Сt и позволяли обнаружить геном ВБ каждого из серотипов, начиная с 3-х суток после заражения животных и на протяжении всего периода исследований: у ягнят до 56 - 74 дней; у телят до 63 - 110 дней, у оленей до 59 дней.

3.5 Филогенетический анализ изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от импортированного в РФ крупного рогатого скота. За период 2008 - 2011 гг. сотрудниками лаборатории Диагностики ВНИИВВиМ Вялых И.В. и Федоровым Г.П. от импортированного КРС выделены, паспортизированы и заложены в коллекцию микроорганизмов ВНИИВВиМ пять изолятов вируса блютанга: ФК/1-08, ФК/2-09, ФК/3-09, ФКл/4-09, ФН/5-09 (Вялых И.В. с соавт., 2010 г.).

С целью проведения нуклеотидного секвенирования выбраны 2, 7 и 10 сегменты ВБ. Для получения ПЦР-продуктов подобраны три пары олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют перекрывающиеся области нуклеотидной последовательности 2 сегмента, две пары олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют перекрывающиеся области нуклеотидной последовательности 7 сегмента и одна пара праймеров для амплификации 10 сегмента. В соответствии с длиной амплифицируемой ДНК использовали стандартные протоколы и профили реакций для амплификации длинных продуктов.

В результате филогенетического анализа пяти изолятов (ФК/1-08, ФК/2-09, ФК/3-09, ФКл/4-09, ФН/5-09) установлено, что по участку сегмента 2 длиной в 2867 п.о. (в позиции 41 - 2909 нт) они на 100 % гомологичны между собой и на 100 % гомологичны участку 2 сегмента штамма NET2008 (идентификационный номер в GenBank FJ183375), выделенному в Нидерландах в 2008 году. Нуклеотидные последовательности 7 сегмента в 1156 п.о. (позиция 1-1156 нт) изолятов на 100 % гомологичны между собой и на 99,91 % гомологичны нуклеотидным последовательностям сегмента 7 изолятов NET2007/01 (GQ506457), NET2008(FJ183380), NET2006/04 (AM498057), NET2008/06 (GQ506484), относительно которых имеют замену в позиции 986 – А/G. Нуклеотидные последовательности 10 сегмента в 803 п.о. (позиция 1-803 нт) на 100 % гомологичны между собой и на 100 % гомологичны нуклеотидным последовательностям 10 сегмента штаммов и изолятов, опубликованных в базе GenBank.

Таким образом, филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2, 7 и 10 сегментов генома изолятов ВБ 8 серотипа, выделенных от импортированного крупного рогатого скота, показал, что все изоляты по трем сегментам идентичны между собой и гомологичны европейскому варианту вируса, представляющему западный топотип ВБ 8 серотипа.

3.6 Филогенетический анализ вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар. Штамм Тапхар вируса блютанга 16 серотипа выделен при вспышке болезни среди овец  в Республике Бурятия в 1993 г. (Вишняков И.Ф. с соавт., 1995 г.). По данным литературы, 16 серотип представлен  ограниченным количеством изолятов и поэтому в базе данных GenBank опубликовано небольшое  количество нуклеотидных последовательностей сегментов его генома. В связи с этим получение наиболее  полной генетической характеристики отечественного штамма Тапхар представляло большой научный интерес. C этой целью было принято решение о проведении генетического анализа 6 сегментов: 2, 3, 5, 6, 7 и 10.  Для выполнения нуклеотидного секвенирования в соответствии с длиной сегмента и его вариабельностью для каждого подобраны специфические пары олигонуклеотидных праймеров.

В результате сравнительного анализа с нуклеотидными последовательностями 2 сегмента штаммов и изолятов ВБ, представленных в базе данных GenBank, установлено, что последовательность 2 сегмента ВБ штамма Тапхар имеет 100 %  гомологии со штаммом SAD2004/04 (AM773700), выделенным в 2004 г. на о. Сардиния (Италия) и изолятом 243277 (DQ191259), выделенным в Израиле. При сравнении с нуклеотидной последовательностью 2 сегмента  штамма BN96/16 (Китай, 1996 г.) штамм Тапхар имеет 2 замены в позиции 301 - G/C (Тапхар/BN96/16) и в позиции 1408 – А/G (Тапхар/BN96/16).

Нуклеотидная последовательность 3 сегмента штамма Тапхар на 99,96 % гомологична 3 сегменту референтного штамма RSArrrr/16 и штамму BN96/16, выделенному в 1996 г. в Китае. Полученная последовательность штамма Тапхар содержит замены в позиции 1565 – T/C (Тапхар, RSArrrr/BN96/16) и в позиции 2588 – Т/А (Тапхар, BN96/16/RSArrrr) и относится к группе восточного кластера. При сравнении штамма Тапхар с другими изолятами/штаммами ВБ, нуклеотидные последовательности которых представлены в GenBank, он имеет более 81,09 % гомологии.

На основании анализа нуклеотидных последовательностей сегмента 5 штамма Тапхар установлено, что он принадлежит к восточному топотипу, и имеет 100 % гомологии по данному сегменту с изолятом ISR2001/18, 99,94 % - с изолятом SAD2004/04 и 97,15 % гомологии относительно изолятов западного топотипа. При сравнении 5 сегмента штамма Тапхар с аналогичным  штамма BN96/16, выделенным в 1996 г. в Китае он имеет 2 замены в позициях 137 – А/G (Тапхар/BN96/16) и 817 - А/G (Тапхар/BN96/16).

Анализ нуклеотидных последовательностей 6 сегмента показал, что  штамм Тапхар имеет 100 % гомологии с вакцинным штаммом RSAvvvv/16 и  референтным штаммом RSArrrr/16 16 серотипа, соответственно группируется в нуклеотип В. По отношению к 6 сегменту штамма BN96/16 (JN671911) он имеет 1 замену в позиции 758 – А/Т (Тапхар/BN96/16).

7 сегмент штамма Тапхар имеет 100 % гомологии с 7 сегментом штамма BN96/16. При сравнении с нуклеотидной последовательностью 7 сегмента ВБ референтного штамма из Южной Африки  RSArrrr/16 штамм Тапхар имел одну замену в позиции 485 – А/G (Тапхар/RSArrrr/16).

10 сегмент штамма Тапхар имеет 100 % гомологии с аналогичным сегментом вакцинного штамма ВБ из Южной Африки (идентификационный номер в GenBank AY775164). При сравнении со штаммом из Китая BN96/16 штамм Тапхар имеет 2 замены в нуклеотидной последовательности: в позиции 394 - А/G и в позиции 667 - C/A  (Тапхар/BN96/16).

Таким образом, в результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей шести сегментов генома ВБ штамма Тапхар, было установлено, что он имеет наибольший уровень гомологии с изолятом SAD2004/04, выделенным в 2004 г на о. Сардиния (Италия). По данным литературы все изоляты (SAD2004/01 - SAD2004/24), выделенные во время  вспышки в 2004 г. на о. Сардиния, были идентичны между собой и гомологичны вакцинному штамму RSAvvvv/16 16 серотипа, который использовали в составе аттенуированной вакцины при проведении вакцинации в 2004 г. (Savini et al., 2008). Известно, что вакцинный штамм 16 серотипа получен из референтного штамма, выделенного в Западном Пакистане в 1960 г. (Howell et al., 1970). Установлено, что вспышка болезни в Италии не была вызвана восточными изолятами вируса блютанга, циркулирующими в Греции и Турции.

4 Выводы

1. Разработанные серотип-специфические ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза для идентификации вируса блютанга 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов являются специфичными и воспроизводимыми методами с аналитической чувствительностью 1,5 - 2,5 lg  ТЦД50/см3 .

2. Разработанные мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов, включающие внутренний и положительный контроли являются специфичными, воспроизводимыми и экспрессными методами с аналитической чувствительностью 0,25 - 0,75 lg ТЦД50/см3.

3. Для генотипирования изолятов вируса блютанга, выделенных на территории РФ, подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям 2, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 8 серотипа и 2, 3, 5, 6, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа.

4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2, 7 и 10 сегментов генома пяти изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от крупного рогатого скота, импортированного в РФ в 2008-2009 гг., показал, что изоляты по указанным сегментам идентичны между собой и гомологичны европейскому варианту вируса, представляющему западный топотип 8 серотипа.

5. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2, 3, 5, 6, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар, выделенного от овец во время вспышки заболевания в 1993 г. в Республике Бурятия, показал, что штамм Тапхар генетически родственен изоляту 16 серотипа, выделенному в Западном Пакистане в 1960 г.

5 Практические предложения

Нуклеотидные последовательности сегментов генома ВБ изолятов, выделенных на территории РФ, могут быть использованы для определения генетических характеристик и формирования международных баз данных в молекулярной эпизоотологии.

Специфические оригинальные олигонуклеотидные праймеры для определения нуклеотидных последовательностей сегментов генома вируса блютанга 8 и 16 серотипов, проведения генетической характеристики изолятов ВБ и создания генетических паспортов рекомендуются для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

«Методические положения по дифференциации 1, 2, 4, 8 и 16 серотипов вируса блютанга методом ОТ-ПЦР», утвержденные академиком - секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии А.М. Смирновым 16.11.2011 г.

«Методические положения по дифференциации 1-го, 4-го, 8-го и 16-го серотипов вируса блютанга методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком - секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии А.М. Смирновым 10.11.2011 г. предлагаются для практики при идентификации некоторых серотипов вируса блютанга.

  1. Список использованной литературы

1. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // ВНИТИБП.- Москва, 1998.- С.928.

2. Выделение вируса блютанга от импортированного крупного рогатого скота / И.В. Вялых, Г.П. Фёдоров, И.В. Ногина, В.В. Куриннов, М.Б. Новикова // Ветеринария. – 2010. - №8. - С. 23-26.

3. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец / И.Ф. Вишняков, А.А. Стрижаков, М.Б.Новикова, А.В.Луницин, В.В. Куриннов, Г.М. Карпов, В.И. Балышева, К.С. Волокитина // Ветеринария. – 1995. - №4. – С.20-25.

4. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации вирусов КЛО и ЭГБО / К.А. Снетков, Н.Н. Власов, С.Ж. Цыбанов, А.А. Стрижаков, А.Ю. Чичикин // Генодиагностика инфекционных заболеваний: материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Москва, 2002. – С.366-368.

5. Сравнительная оценка вариантов ПЦР-анализа для выявления генома вируса блютанга / Е.А. Гаврилова, Д.В. Колбасов, А.С. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2009. – С. 83-87.

6. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S.Rao, H. Attoui and P.P.C. Mertens // J. Gen. Virol. – 2007. – Vol.88. – P. 621–630.

7. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two

different genomic segments / J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq // J. Virol. Methods. – 2007. – Vol.140. – P.115-123.

8. Complete Genome Characterisation of a Novel 26th Bluetongue Virus Serotype from Kuwait / S. Maan, N.S. Maan, K. Nomikou, E. Veronesi, K. Bachanek-Bankowska // PLoS ONE. – 2011. – N.6-10. - e26147.

9. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1: Description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11 / F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq // Transbound. Emerg. Dis. – 2009. – Vol.56, N.9-10. – P.346-354.

10. Hoffmann, B. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Speci?cally Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ B. Hoffmann, M. Eschbaumer and M. Beer // J. of Clinical  Microbiology. – 2009. – Vol.47, N.9. – P.2992-2994.

11. Sequence analysis of bluetongue virus serotype 8 from the Netherlands 2006 and comparison to other European strains/ S. Maan, N. S. Maan, N. Ross-smith, C. A. Batten, A. E. Shaw, S. J. Anthony, A. R. Samuel, K. E. Darpel, E. Veronesi, C. A. L. Oura, K. P. Singh, K. Nomikou, A. C. Potgieter, H. Attoui, E. van Rooij, P. van Rijn, K. D. Clercq, F. Vandenbussche, S. Zientara, E. Bre?ard, C. Sailleau, M. Beer, B. Hoffman, P. S. Mellor and P. P. C. Mertens // Virology. – 2008. -  Vol.377. – P.308–318.

12. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi//Anal. Biochem. – 1987. - Vol.162, N.1. – P.156-159.

13. Vaccines against bluetongue in Europe/ G. Savini, N.J. MacLachlan, J.M. Sanchez-Vizcaino and S. Zientara // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. – 2008. – N.31. – P.101–120.

14. Howell, P.G. The application of improved techniques to the identification of strains of bluetongue virus / P.G. Howell, N.A. Kumm and M.J. Botha// Onderstepoort J. Vet. Res. – 1970. – Vol.37. – P.59–66.

7 Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Вялых, И.В. Продолжительность виремии и выявления генома вируса блютанга при экспериментальном заражении овцы/ И.В. Вялых, А.В. Панферова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2009. - С. 87-90.
  2. Сравнительная оценка различных методов выделения РНК из проб крови крупного рогатого скота для выявления генома вируса блютанга методом ОТ-ПЦР / Е.А.Гаврилова, А.В. Панферова, А.С. Малоголовкин, А.Г. Шендрик //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной научно-практической конференции. - Щелково, 2009. – С.328-332.
  3. Панферова, А.В. Разработка препаратов и тест-систем для диагностики блютанга / А.В. Панферова,С.Ж Цыбанов., Д.В.Колбасов // Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС: материалы Международной    научно-практической   конференции. – Минск, 2011. – С.172-179.
  4. Применение диагностических тест-систем для выявления генома вируса блютанга методом ПЦР в мониторинговых исследованиях / А.В. Панферова, А.С. Малоголовкин, Е.А. Гаврилова, О.Л. Колбасова // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной научно-практической  конференции. - Щелково, 2009. - С.301-306. 
  5. Monitoring and surveillance of bluetongue in the Russian Federation / A. Panferova,E. Gavrilova, A. Malogolovkin, S. Tsybanov, D. Kolbasov // 4th Annual meeting Epizone «Bridges to the Future».- Saint-Malo, 2010. – Р. 189

6.  Экспериментальное воспроизведение инфекции у крупного рогатого скота, зараженного вирусом блютанга 1-го и 8-го серотипов / А.В.Панферова, А.С. Малоголовкин, А.В. Луницин, Н.К. Бобровская, Н.В. Малоголовкина, С.Ж. Цыбанов, Д.В.Колбасов //Ветеринария и кормление. – 2010. - № 11. – С. 22-23.

8 Список сокращений

АЧЛ – африканская чума лошадей

ВБ – вирус блютанга

BHK – культура клеток почки золотистого хомячка

дцРНК – двухцепочечная рибонуклеиновая кислота

dNTP – дезоксинуклеотид трифосфаты

ед/мкл – единиц в микролитре

ИФА – иммуноферментный анализ

кДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

КРС – крупный рогатый скот

МРС – мелкий рогатый скот

МЭБ – международное эпизоотологическое бюро

н.п. –  нуклеотидная последовательность

нт - нуклеотид

об/мин – обороты в минуту

ПК – положительный контроль

ОТ – обратная транскрипция

ОТ-ПЦР – обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР РВ – обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени

ПС – культура клеток почки сайги

ПСГК – культура клеток почки сибирского горного козерога

п.о. – пар оснований

РНК – рибонуклеиновая кислота

ТЦД – тканевая цитопатическая доза

ЭГБО – эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Владимирской области

Тираж _80_ экз.

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.