WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Na/K-АТРазы И NMDA-РЕЦЕПТОРА В ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТКАХ МОЗЖЕЧКА

Автореферат кандидатской диссертации

 

московский государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

АККУРАТОВ Евгений Евгеньевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Na/K-АТРазы И NMDA-РЕЦЕПТОРА В ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТКАХ МОЗЖЕЧКА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2012


Работа   выполнена   на   кафедре   биохимии   биологического   факультета   Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова


Научный руководитель:


доктор биологических наук,

профессор

Болдырев Александр Александрович



Официальные оппоненты:


доктор физико-математических наук,

профессор Твердислов Всеволод Александрович


доктор биологических наук,

профессор

Гривенников Игорь Анатольевич


Ведущая организация:


Учреждение Российской Академии Наук

Институт Высшей Нервной Деятельности

и Нейрофизиологии РАН (Москва)


Защита состоится 19 марта 2012 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «__ » февраля 2012 г.


Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук


Медведева М.В.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Na/K-АТРаза является одним из ключевых ферментов эукариотических клеток. Она долгое время была известна как фермент, способный поддерживать градиент ионов Na и К+, однако в 90-е годы XX века было установлено, что Na/K-АТРаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого являются соединения класса кардиотонических стероидов (КТС) (Kometiani et al., 1998). Связывание Na/K-АТРазы с этими соединениями может регулировать экспрессию генов раннего и позднего ответов через активацию транскрипционных факторов (Xie et al., 1999). В литературе обсуждается, что данные процессы протекают без ингибирования ферментативной активности Na/K-АТРазы. Несмотря на довольно длительный период, прошедший с момента этого открытия, данных об участии Na/K-АТРазы в процессах сигнализации в нейрональных клетках известно очень мало, причем основные исследования ведутся с использованием кардиомиоцитов, почечного эпителия и фибробластов.

Na/K-АТРаза в нейрональной ткани поглощает огромное количество АТР - до 50% от общего уровня аденозинтрифосфата клетки, что связано с необходимостью восстанавливать исходное соотношение ионов Na и К после возбуждения нейрона. В нейрональных клетках а-субъединица Na/K-АТРазы представлена двумя изоформами -КТС-чувствительной аЗ-субъединицей и КТС-резистентной а1-субъединицей. В литературе активно обсуждается вопрос о том, каким образом разные изоформы способны вовлекаться в различные внутриклеточные сигнальные пути, а также ставится вопрос о наличии в тканях животных соединений класса кардиотонических стероидов и об их возможном синтезе de novo.

Недавно было показано, что белок агрин, участвующий в формировании нервно-мышечного синапса, способен специфически связываться с КТС-чувствительной аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы и вызывать эффекты, аналогичные действию КТС (Hilgenberg et al., 2006). Таким образом, был найден специфический «партнер» для КТС-чувствительной аЗ-субъединицы, которая представлена только в нейрональных клетках, что позволяет говорить о возможных путях регуляции именно КТС-чувствительной аЗ-субъединицы. Мутации в гене, который кодирует эту субъединицу, способны вызывать эпилепсию и паркинсонизм в моделях гетерозиготных мышей по данному гену (Clapcote et al., 2009).

В последнее время начали накапливаться данные о возможной взаимосвязи между Na/K-АТРазой и глутаматными рецепторами. Недавно показано, что связывание уабаина с Na/K-АТРазой может влиять на стабильность ионотропных рецепторов АМРА-класса в

1


нейронах (Zhang et al., 2009), а также блокировать активность глутаматных переносчиков GLT-1 и GLAST в клетках глии (Rose et al., 2009). Все это позволяет говорить о возможном участии Na/K-АТРазы в функционировании глутаматной системы. Кроме того, накапливаются данные о предпосылках взаимодействия Na/K-АТРазы и ионотропного рецептора NMDA-класса (NMDA - N-метил-Б-аспартат).

NMDA-рецепторы представляют собой ионотропные глутаматные рецепторы, которые участвуют в формировании синаптической пластичности и молекулярной памяти. Важным отличием NMDA-рецепторов от других ионотропных глутаматных рецепторов является то, что их канал проницаем не только для натрия и калия, но и для Са , который является вторичным мессенджером и способен модулировать ответ клетки в зависимости от внешнего сигнала.

В литературе показано, что действие соединений класса кардиотонических стероидов приводит к проявлению экзайтотоксических эффектов глутамата (Stelmashook et al., 1999). Так как этот эффект снимается антагонистами NMDA-рецепторов, было выдвинуто предположение, что КТС способны влиять на функционирование NMDA-рецепторов. Было также показано, что активация NMDA-рецепторов может приводить к частичному ингибированию активности Na/K-АТРазы (Булыгина и соавт., 2003). Однако на сегодняшний день не установлено, способны ли они взаимодействовать между собой. Цель и задачи работы

Целью данной работы явилось выявление особенностей структурного и функционального взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:

1.   Исследовать  возможное  структурное  взаимодействие  и  ко-локализацию  Na/K-

АТРазы и NMDA-рецептора в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.

2.  Исследовать активацию Akt и ERK/4 киназ при действии различных концентраций

уабаина  и  оценить  возможное  участие  NMDA-рецептора  в  этих  сигнальных каскадах.

3.  Выявить механизмы «экзайтотоксического» действия глутамата на фоне действия

уабаина.

4.  Исследовать    процессы    долговременной    регуляции    NMDA-рецепторов    под

действием уабаина на клетки.

5.  Оценить  возможное  влияние NMDA-рецептора на активность Na/K-АТРазы  в

первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс и исследовать общие

механизмы этого процесса.

2


Научная новизна и практическая значимость работы

В этом исследовании впервые показано, что Na/K-АТРаза и NMDA-рецептор могут формировать функциональный комплекс, в котором способны принимать участие как КТС-чувствительная аЗ-субъединица, так и КТС-резистентная а 1-субъединица Na/K-АТРазы.

Показано, что кратковременное взаимодействие уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK Уг, а взаимодействие уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы - к активации Akt. NMDA-рецепторы не участвуют в данных сигнальных каскадах. Связывание уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к усилению функции NMDA-рецепторов за счет фосфорилирования тирозиновых остатков NR2B-субъединицы. Долговременное действие уабаина на аЗ-субъединицу Na/K-АТРазы приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. Был установлен механизм ингибирования Na/K-АТРазы при активации NMDA-рецепторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецептор в гранулярных клетках мозжечка является объектом сложной регуляции, и на его активность могут влиять как al-, так и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы. Полученные данные могут инициировать исследование причин, по которым недостаточность аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы приводит к дефициту деятельности мозга. Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009), XIII Международной конференции по АТРазам Р-типа, (Пасифик Гров, США, 2011). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2011). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ. Структура и объем диссертации

Работа изложена на 87 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 38 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 отечественных и зарубежных источников.

3


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Объектом исследования была выбрана первичная культура гранулярных клеток мозжечка, так как эта культура содержит функциональные NMDA-рецепторы, а также две изоформы а-субъединицы Na/K-АТРазы. Эти изоформы различаются по своей чувствительности к действию уабаина - аЗ-субъединица являются уабаин-чувствительной и связывается с уабаином в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1цМ, а а 1-субъединица является уабаин-резистентной и связывается с уабаином в диапазоне концентраций от 1 цМ до 1 мМ. Для приготовления первичной культуры гранулярных клеток мозжечка использовали 3-7 дневных крыс линии Wistar Kyoto. Крыс декапитировали, мозжечок измельчали и помещали на 20 минут в 0,05% раствор Трипсина-ЭДТА для разрушения межклеточных взаимодействий. Клетки промывали раствором Хенкса, затем диспергировали в свежей среде NBM (Neirobasal A-Medium) (Gibco, США) до получения однородной суспензии, которую центрифугировали 5 мин при 600g . Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме NBM , содержащем 2% Supplement В-27 (Gibco, США), 0,5 мМ GlutaMax (Gibco, США), 100 U/мл пенициллин/стрептомицин (Gibco, США) и 20 мМ КС1 (Sigma, США). Культивирование осуществляли в среде NBM в

о

СОг инкубаторе при 37 С, 5% СОг и относительной влажности 98%. На 3-4 сутки культивирования среду меняли, и в добавленную среду добавляли 5 цМ арабинозинмоноцитозида (Sigma, США) для остановки пролиферации глиальных клеток. Эксперименты ставили с клеточной культурой через 7-10 дней.

Для оценки внутриклеточного уровня Са использовали суспензию гранулярных клеток мозжечка крыс, которая подвергалась анализу непосредственно в день изоляции. Для этого 7-10 дневных крыс линии Wistar декапитировали, мозжечок измельчали на холоду и помещали в 2 мг/мл раствор коллагеназы (Wako, Япония), приготовленный на растворе Тироде (148 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 2 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, рН 7,4) для разрушения межнейронных контактов. Инкубацию с коллагеназой проводили в течение 30 мин при 32°С. Затем клеточную суспензию отмывали от коллагеназы в растворе Тироде, клетки суспендировали пастеровской пипеткой и фильтровали через тефлоновый фильтр с размером пор 53 мкм. Содержание клеток в суспензии определяли с помощью камеры Горяева. Перед инкубацией с различными веществами клетки оставляли на 30 мин при 37°С.

4


Для первичной культуры гранулярных клеток мозжечка за 4 ч перед экспериментом меняли среду на среду Хенкса (Sigma, США), не содержащую сыворотки (т. н. «голодающая среда»). Затем клетки преинкубировали с лигандами, время инкубации и концентрации уабаина и NMDA варьировали в зависимости от задач эксперимента, остальные лиганды преинкубировали с клетками в течение 30 мин. После инкубации реакцию останавливали различными способами, в зависимости от далее используемого метода: для Western blotting и иммунопреципитации - промывание холодным раствором

9+                  9+

Хенкса без Са и Mg (Sigma, США), затем добавляли лизирующий буфер. Для определения ферментативных активностей реакцию останавливали пятикратным замораживанием - оттаиванием, для определения насосной функции Na/K-АТРазы клетки

9+                9+

троекратно промывали холодным раствором Хенкса без Са и Mg (Sigma, США), а затем добавляли холодную 5% трихлоруксусную кислоту (Sigma, США). Для проведения

9+                9+

иммуноцитохимических методов клетки промывали раствором Хенкса без Са    и Mg (Sigma, США) при комнатной температуре, а затем проводили иммуноцитохимическое окрашивание. Иммунопреципитирование

После приготовления лизатов измеряли концентрацию белка по методу Лоури, разводили RIP А буфером до 1 мг/мл, затем к 1 мл лизата добавляли 100 дл протеин- А-сефарозы   (Sigma,   США),   которую   предварительно   трижды   промывали   холодным

о

раствором Хенкса, и инкубировали в течение 3 ч при +4 С. Затем центрифугировали при 8000 g 1 мин, к отобранному супернатанту добавляли антитела на NR1- или NR2B-субъединицы  NMDA-рецептора   и   инкубировали   в   течение   ночи   при   +4 С.   После

о

окончания инкубации добавляли 100 дл протеин-А-сефарозу и инкубировали при +4 С в

9+               9+

течении 4 ч. Затем трехкратно отмывали холодным раствором Хенкса без Са    и Mg (Sigma, США) при помощи центрифугирования при 14000 g 30 сек и промывания осадка. К осадку добавляли двукратный объем буфера для образцов, инкубировали в течении 15

о                                                                                                                                                                                                                                                   о

мин при 55 С для анализа мембранных белков или в течение 5  мин при 95 С для определения фосфотирозина, после чего центрифугировали и использовали супернатант для анализа образцов методом Western blotting. Метод Western blotting

Вначале полученные образцы разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS, описанным Леммли. Затем производили перенос на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану в камере BioRad в течение 40 мин при силе тока 200 А. После электропереноса мембрану промывали в растворе TBST (TBS + 0,1% Твин-20), затем блокировали в растворе TBST с сухим молоком или БСА от

5


специфического связывания, затем после трехкратного отмывания в TBST инкубировали вначале с первичными антителами, разведенными на растворе TBST+блокатор, при +4°С в течение ночи, а затем после трехкратного промывания в TBST - со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, также разведенными в растворе TBST+блокатор. Связывание первичных антител детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью набора «Amersham™ ECL Plus Western Blotting Detection Reagents» (GE Healthcare Life Sciences, Германия). Определение активности Na/K-АТРазы

В нашей работе активность Na/K-АТРазы мы регистрировали двумя способами: при определении неорганического фосфата, образовавшегося в ходе ферментативной реакции, и при регистрации количества уабаин-зависимого поглощения клетками Rb . Для определения ферментативной активности Na/K-АТРазы инкубировали клетки с лигандами, затем останавливали реакцию, однократно промывая клетки холодным бескальциевым и безмагниевым раствором Хенкса, затем разрушали клеточные мембраны пятикратным замораживанием-оттаиванием. Затем после проведения ферментативной реакции для определения неорганического фосфата использовали метод Ратбуна и Бетлах, основанный на использовании хлористого олова в качестве восстановителя. Для определения насосной функции Na/K-АТРазы клетки инкубировали с лигандами, затем за 10 мин до остановки реакции добавляли 2,5 мМ RbCl и останавливали реакцию, 5 раз промывая в холодном бескальциевом и безмагниевом растворе Хенкса, затем лизировали клетки при помощи 5% трихлоруксусной кислоты. Далее центрифугировали при 10000 g 2 мин и в полученном супернатанте определяли количество ионов Rb при помощи атомно-абсорбционного спектрометра (Интерфотофизика, Россия). В полученном осадке определяли концентрацию белка, нормируя по белку полученные данные. Иммуноцитохимия

Для приготовления иммуноцитохимических образцов клетки выращивали на стеклах для иммуноцитохимии. После инкубации клеток с лигандами препараты промывали в бескальциевой и безмагниевом растворе Хенкса при комнатной температуре, затем фиксировали в растворе 3,7% формальдегида в течение 20 мин. Затем образцы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), далее в течение 15 мин инкубировали в 0,01% Tritone Х-100 для пермеабмилизации клеток. Затем трехкратно отмывали в PBS и блокировали образцы в 10% БСА в течении 30 мин. После этого добавляли первичные антитела и инкубировали при +4°С в течении ночи. Затем промывали 3 раза теплым PBS и инкубировали в течение 1 ч в темноте с раствором вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, на PBS. Затем трехкратно отмывали и заключали препараты в

6


среду мовиол (Sigma, США). Препараты анализировали на конфокальном микроскопе при помощи объектива с увеличением 63х. Данные обрабатывали в ImageJ. Проточная цитометрия

Данным методом  проводили детекцию  уровня  Са     в  суспензии  гранулярных клеток мозжечка. При анализе данных из общей популяции клеток выделяли клетки, по размерам соответствующие нейронам, таким образом выявляя изменение уровня Са только    в    нейрональных    клетках.     Для    измерения    уровня    Са       использовали флуоресцентный зонд Fluo-3-AM (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-М,М,№,№-тетрауксусной кислоты) (Sigma, США) (Хех = 488 нм, Хеш = 530 нм). К исследуемой суспензии клеток добавляли Fluo-3-AM (конечная концентрация 20 дМ) и инкубировали 30 мин в темноте при 37°С. Затем суспензию инкубировали с лигандами в течение заданного времени, после инкубации добавляли PI и через  1  мин проводили анализ флуоресценции методом проточной цитометрии. Отсекая мертвые клетки, анализировали изменение концентрации внутриклеточного Са   в популяции живых клеток. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «GraphPadPrism4». Достоверную значимость отличий в экспериментах Western blot проверяли с помощью одностороннего непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия Дунетта. Для статистической обработки результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали критерий Смирнова-Колмогорова (коэффициент D/S(n), который отражает достоверность различий двух гистограмм), а для результатов остальных экспериментов - t-критерий Стьюдента. Достоверность различий соответствовала р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс

Было показано, что наш объект - первичная культура гранулярных клеток мозжечка крыс - содержит как уабаин-чувствительную аЗ-субъединицу, так и уабаин-резистентную а 1-субъединицу Na/K-АТРазы, а также функционально активный NMDA-рецептор. Последнее обстоятельство было подтверждено наличием NR1- и NR2B-субъединиц, необходимых для формирования функционального комплекса NMDA-рецептора (см. рис. 1).

7


Рис. 1. Анализ образцов первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс. Показано наличие в исследуемых образцах al- и аЗ-субъединиц Na/K-АТРазы, а также NR1- и NR2B-субъединиц NMDA-рецептора.

Анализ структурного взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора

Na/K-АТРаза зачастую образует белок-белковые взаимодействия с другими мембранными и цитоплазматическими белками, влияя на их свойства. В литературе было показано, что при взаимодействии с соединениями класса кардиотонических стероидов Na/K-АТРаза способна активировать Src-киназу, которая непосредственно связана с а-субъединицей Na/K-АТРазы и путем структурных перегруппировок способна автофосфорилироваться и становиться активной (Tian et al, 2006). Судя по обилию литературных данных, такие реакции представляют собой общий принцип регуляции других белков при помощи ингибирования Na/K-АТРазы в нейрональной клетке.

В литературе также было показано, что связывание Na/K-АТРазы с уабаином таким же образом может влиять на функциональные свойства участников глутаматного обмена в нейрональной ткани, например, на ионотропные глутаматные АМРА-рецепторы в нейронах (Zhang et al, 2009) и на глутаматные переносчики GLT-1 и GLAST в глиальных клетках (Rose et al, 2009).

Нашей задачей было проанализировать возможное структурное взаимодействие между интересующими нас белками методом ко-иммунопреципитации. Для этого мы провели серию экспериментов, в которых инкубировали клетки первичной культуры гранулярных клеток мозжечка с 1 дМ уабаина, затем лизировали клетки и проводили иммунопреципитацию с антителами на NR1- или КК2В-субъединицы. Затем в пробах анализировали наличие al- и аЗ-субъединиц методом Western blotting. Указанная концентрация уабаина была выбрана как минимальная концентрация, которая способна связываться как с высокочувствительной аЗ-субъединицей, так и с низкочувствительной al-субъединицей. Для положительного контроля методом Western blotting использовали NR1- и КК2В-субъединицы, в качестве отрицательного контроля использовали лизат, проинкубированный только с протеин-А-сефарозой (рис. 2).

8


WB: al-субъединица

кДа                                                    ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ

^"^        КОН     УАБ     КОН     УАБ     КОНТРОЛЬ

но--ттш •».««

IP:NR1 IP:NR2B А

WB: аЗ-субъедиыица

тт                                                ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ

«VV1       КОН     УАБ    КОН     УАБ       КОНТРОЛЬ

WB: NRl-субъединица

КД<1                  КОН     УАБ     КОН     УАБ

IP:NR1 IP:NR2B В

WB: ЫВ2В-субъединица

кДа

КОН     УАБ     КОН     УАБ

180    _                .,-*—•-»

IP:NR1 IP:NR2B Б

IP:IMR1 IP;NR2B Г

Рис. 2. Детекция al- (А) и аЗ-субъединиц (Б) Na/K-АТРазы методом Western blotting (WB) после проведения иммуннопреципитации (IP) с NR1- или КК2В-субъединицами NMDA-рецептора. В качестве положительного контроля мы детектировали NR1- (В) и NR2B-субъединицы (Г) NMDA-рецептора. «кон» - контроль, «уаб» - уабаин.

Из представленных данных видно, что обе изоформы а-субъединицы способны ко-иммунопреципитировать с NMDA-рецептором. Интересный факт заключается в том, что в наших условиях было показано возможное участие в процессах внутриклеточной сигнализации в нейронах как уабаин-чувствительной аЗ-субъединицы, так и уабаин-резистентной al-субъединицы. Это может служить основанием для предположения о том, что обе субъединицы способны участвовать в механизмах регуляции глутаматного обмена, хотя и различными способами. Действие специфического ингибитора Na/K-АТРазы - уабаина не выявило изменений в количестве молекул NMDA-рецептора, иммунопреципитирующих вместе с а-субъединицами Na/K-АТРазы. Это обстоятельство свидетельствует, что белок связывается с интересующим нас рецептором вне зависимости от своего конформационного состояния (Е1 или Е2).

Однако использование данного метода не является доказательством непосредственного взаимодействия между двумя белками, так как проведение иммунопреципитации способно «вытаскивать» целый пул других белковых молекул, особенно когда они находятся в солюбилизированном состоянии. Поэтому для анализа возможной ко-локализации между а-субъединицами Na/K-АТРазы и NMDA-рецептором была произведена серия экспериментов, в которой мы инкубировали препараты с уабаином, затем проводили фиксацию клеток и последующее иммуноцитохимическое окрашивание на NR1-субъединицы NMDA-рецепторов (Alexa Fluor 488) и а-субъединицы Na/K-АТРазы (Alexa Fluor 546). Анализ препаратов производили на конфокальном микроскопе.

9


На полученных после иммуноцитохимического окрашивания картинах видно, что как а 1-субъединица Na/K-АТРазы и NR1-субъединица NMDA-рецептора, так и аЗ-субъединица Na/K-АТРазы и NR1-субъединица NMDA-рецептора локализованы в одних и тех же частях тела клетки и аксональных отростков. Суммируя данные, полученные двумя различными методическими подходами, мы можем сделать вывод о том, что Na/K-АТРаза и NMDA-рецепторы ко-локализованы в нейрональных клетках и способны формировать комплексы, исследование функциональных свойств которых стало нашей следующей задачей.

Влияние   уабаина   на   активацию   сигнальных   каскадов   при   кратковременной инкубации

На кардиомиоцитах и на фибробластах было показано, что действие уабаина способно приводить к активации митоген-активируемой киназы ERK Уг (Kometiani et al., 1998), а также протеинкиназы В (Akt) (Zhou et al., 2001). Активация ERK Уг и Akt происходит по независимым сигнальным путям - если активация ERK Уг происходит при помощи активации Src-киназы, с последующей активацией рецептора эпидермального ростового фактора (EGFR), то Akt активируется по Src-независимому пути при помощи белок-белковых взаимодействий а-субъединицы Na/K-АТРазы с фосфоинозитол-3-киназой, которые и являются механизмом запуска сигнального каскада, приводящего к активации в том числе и Akt.

Фосфорилирование Akt и ERK 1/2


+    +  +

кДа

50-

60-

44-42-


контр     5нин   Юыин   15нин   20ыин


тубулин pAkt

pERK1/2


%


1|дМуабаин


I    I контроль ? 5 мин

I__ I 10 мин

H 15 мин I 20 мин


Рис. 3. Фосфорилирование Akt и ERK Уг под действием 1 цМ уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А - пример типичного эксперимента, Б -количественные данные. По оси ординат - процент выявляемых белков. * - соответствует достоверному различию от контроля с р<0,05.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что al- и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы по-разному вовлечены в клеточный сигналинг в клетках нейробластомы SK-N-AS:  связывание аЗ-субъединицы с уабаином через  180 мин инкубации приводило к

10


фосфорилированию ERK Уг, а аналогичное действие на а 1-субъединицу Na/K-АТРазы за то же время не приводило к фосфорилированию ERK Уг. Первой нашей задачей стало исследовать, протекают ли схожие процессы на нашей модели первичной культуры нейрональных клеток мозжечка. Для этого была построена временная зависимость уровня фосфорилирования ERK Уг и Akt при действии 1 дМ уабаина (см. рис. 3).

Из полученных данных видно, что уровень фосфорилирования для ERK Уг увеличивается и достигает своего максимума через 10 мин инкубации, затем до 20 мин инкубации уровень фосфорилированной формы не изменяется. Для Akt показано, что максимум активации наблюдается к 15 мин, затем происходит уменьшение сигнала. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что действие малых концентраций уабаина на клетки приводит к активации клеточных сигнальных каскадов, приводящих к активации протеинкиназы В (Akt) и стресс-активируемой МАР-киназы ERK Уг, что позволяет говорить о сходстве внутриклеточных процессов с клетками других тканей (кардиомиоциты, фибробласты). Для проведения дальнейших экспериментов было выбрано время 10 минут, так как, исходя из полученных результатов, на 10 мин приходится максимум фосфорилирования ERK Уг киназы и при этом наблюдается статистически достоверное изменение фосфорилирования Akt.

Для установления того, какие изоформы фермента способны играть роль в данных процессах, мы провели измерение концентрационной зависимости активации Akt и ERK Уг (см. рис. 4). Из полученных данных видно, что ERK Уг киназа активируется при действии на первичную культуру уабаином в наномолярных концентрациях, максимум достигается при концентрации 10 нМ, а затем идет снижение уровня фосфорилирования, и при концентрации 10 дМ фосфорилирования вообще не наблюдается. Это позволяет предположить, что активация ERK Уг киназы происходит при взаимодействии с уабаином уабаин-чувствительной аЗ-субъединицы, а при связывании уабаина с обеими субъединицами фосфорилирование снижается, достигая при 10 дМ контрольного значения.

Изменения уровня фосфорилирования Akt при низких концентрациях уабаина (1-10 нМ) не выявлено, однако начиная с концентрации 100 нМ происходит нарастание уровня фосфорилирования Akt, которое достигает максимума при 1 дМ, что позволяет утверждать: активация Akt может быть обусловлена связыванием уабаина с уабаин-резистентной al-субъединицей.

11


Фосфорилирование Akt и ERK 1/2


ifla

50— I

60—

44 — 42—


кон     1hM      10hM 100hM   1цМ   10цМ


тубулин pAkt

pERK1/2


10 мин


^3   контроль

?     1 нМ

?    10 нМ

Н    100 нМ

¦    1{iM

?     10(iM


Рис. 4. Фосфор илирование Akt и ERK Уг под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А - пример типичного эксперимента, Б - количественные данные. По оси ординат - процент выявляемых белков. * - соответствует достоверному различию от контроля с р<0,05, ** - с р<0,01.


Исходя из полученных результатов, мы считаем, что в нейронах эти процессы скорее всего также являются независимыми друг от друга и за них «ответственны» различные а-субъединицы Na/K-АТРазы: если за активацию сигнального каскада, приводящего к активации ERK Уг, ответственна аЗ-субъединица, то к активации сигнального каскада, вызывающего активацию Akt, приводит взаимодействие уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы.

В нашей лаборатории ранее было показано, что преинкубация нейрональных клеток с D-AP5 (являющегося специфическим антагонистом NMDA-рецепторов) снижает активацию ERK Уг при долговременной инкубации клеток (180 мин) с различными концентрациями уабаина. Нашей задачей стало оценить, участвуют ли NMDA-рецепторы в передаче сигнала с Na/K-АТРазы на Akt и ERK Уг. Для этого мы инкубировали наши клетки с 1 дМ уабаином в течение 10 мин, так как в этих условиях мы ранее наблюдали статистически достоверную активацию этих киназ (см. рис. 5).

Нашей  следующей задачей  стало  выяснение того,  какая  изоформа  фермента

ингибируется при действии NMDA.  Для этого нами были проведены эксперименты,

позволяющие построить кривую ингибирования Na/K-АТРазы уабаином,    полученную

19


при помощи «ферментативного» подхода после пятикратного замораживания-оттаивания клеток, и оценить влияние на ход кривой преинкубации клеток с NMDA или с NMDA+D-АР5, проведенной до стадии разрушения клеток (см. рис. 15).

Из литературы известно, что уабаин-чувствительная аЗ-субъединица Na/K-АТРазы ингибируется при действии на нее уабаина в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1 дМ. Из рис. 17 видно, что действие NMDA (как индивидуальное, так и совместно с D-AP5) не приводит к существенному изменению активности аЗ -субъединицы, - в обоих случаях она составляет 30-35% от общей активности Na/K-АТРазы в контрольных образцах. Уабаин-резистентная al-изоформа ингибируется в диапазоне концентраций от 1 дМ до 1 мМ. Из полученного графика видно, что в контроле активность этой субъединицы составляла 70% от активности Na/K-АТРазы в контроле, при инкубации клеток с NMDA она снижается до 25% от общей активности фермента в контроле (снизив, таким образом, свою активность на 45% по сравнению с активностью а 1-субъединицы в контроле). При этом D-AP5 предотвращает действие NMDA, и активность а 1-субъединицы составляет до 70% от общей активности Na/K-АТРазы (то есть величину, примерно равную той, что имелась в контроле).

Таким образом, нами был сделан вывод, что инкубация клеток с NMDA приводит к ингибированию а 1-субъединицы и этот процесс опосредован входом ионов Са при открытии ионного канала NMDA-рецептора и активации протеинкиназы С, способной фосфорилировать а 1-субъединицу Na/K-АТРазы и приводить к снижению ее активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До 50% АТР всей клетки тратит для своей работы Na/K-АТРаза в нервной ткани. Одной из функций, выполняемой Na/K-АТРазой в гранулярных клетках мозжечка крысы, является регуляция работы NMDA-рецепторов. Действие кардиотонических стероидов, которые были найдены в мозге, способно влиять на функциональные свойства NMDA-рецептора через две изоформы а-субъединицы Na/K-АТРазы. Если взаимодействие уабаина с уабаин-чувствительной аЗ-субъединицей приводит к долговременной регуляции NMDA-рецептора и вызывает уменьшение молекул NMDA-рецептора в нейрональных клетках, то связывание уабаина с уабаин-резистентной а 1-субъединицей приводит к кратковременной регуляции NMDA-рецептора и приводит к тирозиновому фосфорилированию NR2-cy6beflHHH4bi и усилению функции NMDA-рецептора. В свою очередь, активация NMDA-рецепторов приводит к ингибированию а 1-субъединицы Na/K-АТРазы. Общая схема полученных результатов представлена на рис. 16.

20


В последние годы в различных лабораториях независимо было показано, что Na/K-АТРаза играет ключевую роль в поддержании внутриклеточных сигнальных процессов в нейрональных клетках. Так, мутации в аЗ-субъединице приводили к развитию эпилепсии у мышей. Недавние исследования выявили, что агрин (белок, синтезирующийся исключительно в ЦНС) способен специфически связываться с аЗ-субъединицей, вызывая при этом те же эффекты, что и уабаин (Hilgenberg et al., 2006).

Чаще всего в литературе обсуждается вопрос о том, что взаимодействие уабаина с Na/K-АТРазой может включать различные сигнальные пути в нервной клетке. При этом упор в обсуждении делается на то, какие факторы являются специфическими или неспецифическими сигнальными молекулами для этого фермента (КТС, белки-партнеры или, возможно, неблагоприятные условия, например, недостаток АТР). Реже обращаетсявнимание на вероятность обратных взаимоотношений - невозможность развития сигнальных механизмов в нейроне в условиях активной Na/K-АТРазы. Этот аспект открывает совершенно новую страницу в изучении функции данного фермента и еще требует своего осмысления.

Рис. 16. Общая схема полученных результатов. Темными стрелками обозначено действие уабаина, светлыми - действие NMDA.

21

Так или иначе, результаты, полученные в нашей работе, представляются существенными для теоретической нейрохимии, так как они свидетельствуют о том, что организм способен через Na/K-АТРазу регулировать работу NMDA-рецепторов, играющих ключевую роль в синаптической пластичности и молекулярной памяти.


выводы

  1. Методами ко-иммунопреципитации и иммуноцитохимии показано структурное взаимодействие между al- и аЗ-субъединицами Na/K-АТРазы и NMDA-рецептором.
  2. Показано, что связывание уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK Уг, а связывание уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации Akt. NMDA-рецепторы не принимают участие в данных процессах.
  3. Показано, что инкубация клеток с 1 цМ уабаина приводит к фосфорилированию NR2B-субъединицы NMDA-рецептора и усилению функции NMDA-рецептора, обеспечивающему увеличение входа Са2+ в нейрональную клетку.
  4. Долговременная инкубация (более 1 ч) гранулярных клеток мозжечка с низкими концентрациями уабаина ведет к деградации NMD А-рецепторов, что отражает участие аЗ -субъединицы Na/K-АТРазы в регуляции стабильности NMDА-рецепторов.
  5. Показано, что активация NMDА-рецепторов в гранулярных клетках ведет к ингибированию а 1-субъединицы Na/K-АТРазы через увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и активацию протеинкиназы С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

  1. Аккуратов Е.Е., Карпова Л.В., Болдырев А.А. (2008). Значение конформационного состояния Na/K-АТФазы для ее устойчивости к окислению. Нейрохимия 25(1-2), 146-149.
  2. Карпова Л.В., Аккуратов ЕЕ., Булыгина Е.Р., Болдырев А.А. (2008). Уабаин-чувствительная и уабаин-резистентная изоформы Na,K-ATPa3bi гранулярных клеток мозжечка регулирует активность МАР-киназы. Биол. мембраны 25(2): 131-136.
  3. Карпова Л.В., Аккуратов Е.Е., Бродская О.М., Болдырев А.А. (2010). Na-насос и внутриклеточные сигнальные механизмы. Биофизика 55 (6), 1022-1029.

Тезисы докладов

  1. Boldyrev A.A., Bulygina E.R., Karpova L.V., Akkuratov Е.Е. (2007). Involvement of different conformers of the neuronal Na,K-pump in cell signaling. 7th Int. Conf. on AAA proteins. England. Poster 10.
  2. Аккуратов Е.Е. (2008). Исследование функционального взаимодействия между NMDA-рецепторами   и   Na/K-АТРазой   в   нейронах   мозжечка.    Тезисы   докладов

22


Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, с. 28.

  1. Akkuratov Е.Е., Karpova L.V., Boldyrev A.A. (2008). К- and Na- conformers of Na/K-ATPase demonstrate different stability toward oxidation. Abstract of the 12th International ATPase Conference "Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease", August 2008, Aarhus, Denmark, p. 123.
  2. Akkuratov E.E., Karpova L.V., Boldyrev A.A. (2009). Rat brain Na,K-ATPase is a sensor of oxidative stress. 2nd Int. Workshop on expression, structure and function of membrane proteins, September 20-24, 2009, Florence, Italy, p. 93.
  3. Akkuratov E„ Karpova L., Liu L., Boldyrev A. (2011). Functional interaction between Na/K-ATPase and NMDA-receptor. Abstract of the 13th International ATPase Conference "Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine", September 2011, Pacific Grove, USA, p. 157.
  4. Wu J., Akkuratov E Gable M., Miller C, Liu L. (2011). Ouabain-induced Src-indendent PI3K/Akt pathway in mouse embryonic fibroblast cells. Abstract of the 13th International ATPase Conference "Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine", September 2011, Pacific Grove, USA, p. 156.
  5. Boldyrev A., Brodskaya O., Akkuratov E., Karpova L. (2011). Na/K-pump and cell signaling. Abstract of the 13th International ATPase Conference "Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine", September 2011, Pacific Grove, USA, p. 47.

23


СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Bersier MG et al., (2008). Neurochem. Res., 33(1): 66-72.
  2. Clapcote SJ et al., (2009). Proc. Natl. AcadSci USA, 106(33): 14085-14090.
  3. Hilgenberg LG et al., (2006). Cell, 125(2): 359-369.
  4. Kometiani, P. et al., (1998). J. Biol. Chem., 273: 15249-15256.
  5. Rose EM et al., (2009). J. Neurosci., 29(25): 8143-8155.
  6. Salter MW, Kalia LV. (2004). Nat. Rev. Neurosci., 5(4): 317-328.
  7. Stelmashook E.V. et al., (1999). FEBSLetters, 456: 41-44.
  8. Tian J et al., (2006) Mol. Biol. Cell, 17(1): 317-326.
  9. Xie, Z. et al., (1999). J.Biol.Chem., 274: 19323-19328.
  10. Zhang D etal., (2009). J Neurosci., 29(14): 4498-4511.
  11. Zhou, X. et al., (2001). Biochem. Biophys. Res. Commun., 285: 46-51.
  12. Булыгина E.P. и соавт., (2002). Биохимия, 67, 1209-1214.
  13. Лопина О.Д. (2001). Биохимия, 66 (10): 1122-1131

24

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.