WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ДЕПОНИРОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ФОРМ ГРУШИ

Автореферат кандидатской диссертации

 

На правах рукописи

 

 

 

 

Ташматова Лариса Владимировна

 

 

Клональное микроразмножение

и депонирование перспективных

форм груши

 

Специальность 06.01.01 - общее земледелие

АВТОРЕФЕРАТ

 

диссертации на соискание ученой степени кандидата

сельскохозяйственных наук

 

 

Орёл – 2012

Диссертация выполнена в государственном научном учреждении

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции

плодовых культур Россельхозакадемии в 2001-2004 гг.

Научный руководитель:  доктор сельскохозяйственных наук, профессор

                                                              Высоцкий Валерий Александрович

Официальные оппоненты:            доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Корнацкий Сергей Аркадьевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений имени И. В. Мичурина

Защита диссертации состоится  6 марта 2012 года в 1430ч. на заседании диссертационного совета ДМ 220.052.01 в Орловском государственном аграрном университете по адресу: 302019 г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ОГАУ (г. Орел, Бульвар Победы 19)

Автореферат разослан « 3  » февраля 2012г. и размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» http://www.orelsau.ru и сайте ВАК при Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета ДМ 220.052.01.

Факс 8 (486-2) 43-13-01, e-mail: dissovet-orelsau@yandex.ru

Ученый секретарь диссертационного

  совета, доктор с.-х. наук, профессор                                       Степанова Л. П.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Груша является одной из важнейших плодовых культур средней полосы России. Однако в последние годы наблюдается резкое  сокращение площадей данной культуры. Главные причины такого положения связаны, в основном, с отсутствием высокозимостойких сдерживающих рост подвоев, плохой фитосанитарной обстановкой, недостатком посадочного материала современных сортов, отсутствием маточно-сортовых насаждений и технологий получения оздоровленного привойного материала. Решению этих проблем может помочь применение методов размножения in vitro, которые широко используются при размножении и оздоровлении  ягодных культур (Al Maanri, Duson,  Arnand, Mlgimal, 1986, Туровская, О. В. Стрыгина, 1990, Свириденко, Бурдалов, Дудченко, 1991, Семенас, Кухарчик, 2000). 

В связи ускорением темпов селекционного процесса по созданию новых генотипов, а также создания коллекций ценных форм растений важной задачей является разработка эффективных способов сохранения генетических ресурсов. Депонирование при пониженных положительных температурах  позволяет поддерживать жизнеспособность микрорастений в течение длительного времени. В результате этого на сравнительно небольшой площади можно разместить большое количество ценного генетического материала.

У ряда культур, в том числе и у груши, этапы укоренения и адаптации связаны с определенными трудностями. Так, при индукции ризогенеза отдельные генотипы образуют недоразвитую корневую систему либо не образуют вовсе и наблюдается массовая гибель микрорастений.  Особый интерес при решении проблем укоренения и адаптации к нестерильным условиям  представляет изучение эффективности методов иммуностимуляции и прививки  микропобегов  из культуры  invitro на сеянцы груши, выращенные в условиях invivo.

Цель и задачи исследований. Цель исследований – разработка эффективных приемов клонального микроразмножения и длительного депонирования пробирочных растений груши.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

  1. найти наилучший стерилизующий агент для груши;
  2. подобрать минеральную основу питательных сред;
  3. определить тип, концентрацию и сочетание регуляторов роста для каждого этапа культивирования;
  4. изучить способы адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям;
  5. изучить возможность прививки материалом invitro трудноукореняемых форм на семенные подвои;
  6. изучить состав сред и условия культивирования для длительного хранения пробирочных растений.

Научная новизна исследований

Впервые в условиях региона проведено детальное изучение  клонального микроразмножения сортов и форм груши различного генетического происхождения. Выявлены оптимальные способы стерилизации эксплантов груши. На всех этапах микроразмножения показано и обосновано влияние на рост и развитие микрорастений груши химического фактора и сортовых особенностей. С учетом этих факторов подобран оптимальный состав питательных сред для этапов введения в культуру, пролиферации и укоренения эксплантов груши. Прослежено изменение коэффициента размножения и развития груши в зависимости от концентраций БАП и от комбинаций ауксинов, цитокининов и гибберелловой кислоты (ГК). На этапе укоренения исследован процесс образования корней и  влияние  сортовых особенностей на интенсивность корнеобразования. На этапе адаптации к нестерильным условиям показана возможность применения препаратов группы элиситоров – Экост 1/3 и Эль-1, и их сочетания. Изучен процесс прививки микропобегов груши на семенные подвои в системе ускорения производства посадочного материала некоторых сортов и трудноукореняемых  форм груши. Впервые проведено изучение длительного депонирования эксплантов груши при пониженных температурах. Определены оптимальные сроки хранения и состав питательных сред для данного процесса, подобраны концентрации БАП и сахарозы.

Практическая значимость исследований

Создана теоретическая база для разработки технологии хранения и ускоренного получения оздоровленного посадочного материала груши.

Разработан способ депонирования сортов и форм груши invitro  в виде микропобегов для сохранения генетических коллекций.

Определены возможности использования микропобегов в качестве привойного материала для производства оздоровленных саженцев груши.

Разработан способ ускорения производства оздоровленного посадочного материала трудноразмножаемых сортов груши.

Определено влияние различных биологически активных веществ на  адаптацию растений груши при выводе из условий invitro и особенности их применения.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-методической конференции «Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве», Орел, 28-31 июля 2003, на научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения», Орел, 2-5 июля 2007 года, на международной научно-практической конференции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве», Москва, 22-23 июня 2011, на заседаниях лаборатории биотехнологии, отдела селекции семечковых культур, ученого совета ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, ученом совете ГНУ ВНИИСПК Россельхозакадемии.

Публикации.  По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в рецензированных изданиях, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации.  Диссертация изложена на 160 страницах, стоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследований, главы, содержащей результаты исследований и обсуждений, выводов, рекомендаций для практического использования, акта о внедрении в производство, списка литературы и приложений.

Работа содержит 35 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы состоит из 213 наименований, в том числе 84 – на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сортовая реакция эксплантов груши на обработку стерилизующими агентами на этапе введения культуру invitro и на минеральный состав  питательных сред на этапе введения культуру invitro и на этапе микроразмножения;

- ризогенез микропобегов груши в зависимости от минерального состава сред, типа индуктора корнеобразования и способа его аппликации;

- эффективность применения препаратов элиситорного действия при адаптации растений груши к нестерильным условиям;

-  технологические приемы получения посадочного материала груши методом микропрививки;

- оптимизация способов депонирования побегов груши в условиях минимального роста.

 

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2 Объекты, методика и условия проведения экспериментов

Исследования проводили на базе ГНУ ВНИИСПК в рамках программы фундаментальных и приоритетных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской федерации. Растительный материал для выполнения работы был предоставлен  сотрудниками лаборатории селекции груши и нетрадиционных семечковых культур доктором с.?х.­­­ наук Долматовым Е. А. и кандидатом с.-х. наук Сидоровым А. В.

Для более полной характеристики рода Pyrus L. в качестве объектов исследований взяты сорта и формы селекции ГНУ ВНИИСПК и Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева, в происхождении которых участвовали 4 вида (P. communis L., P. ussuriensis Maxim., P. betulifolia Bunge, P. bretschneideri Rehd.), условно объединённые по происхождению на группы:

  1. P. communis L.: Орловская летняя, Восковка, сеянцы 1, 2, 4;
  2. P. communis L. ? P. ussuriensis Maxim.:

F2 – Лада;

F3 – Есенинская, Муратовская, 15-10-110;

F4 – Тютчевская, Аннушка

  1. P. ussuriensis Maxim. – Груша уссурийская
  2. P. betulifolia Bunge – Груша берёзолистная
  3. P. communis L. ? P. bretschneideri Rehd.: 40-4 (Бретфелпс-апомикт).

Для стерилизации эксплантов использовали растворы 0,1%-го мертиолата, 0,1%-й сулемы, 0,01%-го йода, а так же сочетание перекиси водорода и сулемы. Экспланты брали с однолетних побегов в период начала активного роста. Длительность субкультивирования – 3-4 недели. Учеты проводили по окончании данного срока.

Стерилизацию эксплантов проводили в 2 этапа: 1) промывка эксплантов под проточной водой в течение двух часов; 2) обработка 70% этанолом (5-10 секунд) и стерилизующим агентом в течение 8–10 минут с последующей промывкой в стерильной воде три раза по пять минут.

Стерилизацию перекисью водорода проводили по следующей схеме: промывка эксплантов под проточной водой в течение двух часов, обработка смесью 30% перекиси водорода и 96% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 секунд, обработка 0,1%-м раствором сулемы 8-10 минут с последующей промывкой в стерильной воде три раза по пять минут.  

На этапах введения и микроразмножения использовали среды Мурасиге-Скуга, Ли и де Фоссарда, Гамборга, Пиерика и Мак Коуна. На этапе пролиферации использовали концентрации БАП – 0,5 мг/л, 1,0 мг/л, 2,0 мг/л, 3,0 мг/л., сочетания БАП и ИМК, сочетания  БАП и ГК, и БАП, ИМК и гибберелловой кислоты (ГК).

Для этапа укоренения были апробированы все выше перечисленные питательные среды, а также среда Уайта и среда Мурасиге-Скуга с разбавленной вдвое минеральной основой.   

Были испытаны сочетания различных ауксинов (ИМК, ИУК, НУК) и способы их аппликации: введение в питательную среду, замачивание в стерильном спиртовом и водном растворах ИМК, обработка пудрой на основе талька с последующим переносом микропобегов на питательную среду без регуляторов роста.

Было испытано влияние препаратов элиситорного действия (Экост 1/3 и Эль-1) на приживаемость растений груши invitro в период адаптации к нестерильным условиям.  

Для изучения длительного хранения груши invitro использовали среду МС с разбавленной минеральной основой в 2, 4, 8 раз, пониженной концентрацией сахарозы в 2, 4, 8 раз, а также на фоне различных концентраций маннита (1; 2; 5 мг/л) и цитокинина (БАП – 0,1; 3; 5; 10 мг/л).

Форма хранения – единичные побеги.  

В экспериментах по разработке приемов микропрививки  в качестве привоя использовали побеги  сортов Лада и Тютчевская и гибрида 40-4, выращенные в условиях invitro. В качестве подвоя брали сеянцы груши, выращенные в нестерильных условиях. Способ прививки – в расщеп. Подвой брали в возрасте одного года, толщина которого не менее 3 мм в диаметре. Для лучшего срастания срезы подвоя обрабатывали антиоксидантами – аскорбиновой кислотой в концентрации 50 мг/л и диэтилдитиокарбоматом натрия (ДИЕКА) – 2 г/л, а так же ИМК  в концентрации 25 мг/л.

Статистическую обработку данных проводили по методикам Б. А. Доспехова (1985), В. А. Потапова и др. (1997) и Ф. А. Волкова (Высоцкий, 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3 Влияние режимов стерилизации на этапе введения эксплантов груши в стерильную культуру

Эффективность  освобождения  эксплантов от инфекции и их дальнейшее развитие зависят от типа стерилизующего агента, а также сортовых особенностей.

При введении в культуру эксплантов груши минимальный средний процент заражения был получен при использовании 0,1%-го раствора мертиолата и составил 5,7. Максимальный уровень инфицированности апексов отмечали при обработке меристем 0,01%-м раствором йода – 23,6%. При стерилизации смесью перекиси водорода и 96%-ного этанола с последующей обработкой 0,1%-м раствором сулемы заражение составило 8,3%. Использование 0,1%-го раствора сулемы дало 12,8% заражения.

Средняя приживаемость эксплантов колебалась от 57,6%  до 72,4%.   Устойчивостью к действию всех стерилизующих препаратов отличались экспланты сортов Лада, Тютчевская и Аннушка. Низкую жизнеспособность апексов независимо, от применяемого агента отмечали у подвоев Восковка и груши 1, вида уссурийская, сортов Муратовская и Есенинская, гибрида 15-11-110.

Применение    смеси перекиси водорода (30%) и 96%-ного этанола с последующей обработкой раствором сулемы (0,1%), а также 0,1%-го раствора мертиолата обеспечивает практически полное освобождение эксплантов от инфекционного начала и не вызывает некроза тканей, что дало возможность получить больше материала для  этапа микроразмножения.

4 Определение наилучшей минеральной основы сред на этапе

введения эксплантов груши в стерильную культуру

На этапе введения в культуру среды Мурасиге-Скуга (МС) и Пиерика оказались более эффективными для развития эксплантов большинства сортов и форм, где приживаемость  достигала 74,5% и 72,2% соответственно. На среде Ли и де Фоссарда приживаемость составила 68,4%. Данная среда вызывала также быстрое развитие апексов. Минимальное количество эксплантов выжило на среде Мак Коуна – 42,7%.

При подборе питательных сред были выявлены проявления генетических особенностей форм груши. Так, экспланты сортов Тютчевская, Аннушка, гибрида 15-10-110 и подвоя груша 4 отличались высоким уровнем  приживаемости практически на всех средах. Сорт Орловская летняя, подвои Восковка и груша 1, груша уссурийской  были избирательны к составу питательных сред. Так, у груши уссурийская только на среде МС был получен лучший результат – 41% развившихся апексов.  

Результаты проведенных экспериментов показывают, что на этапе введения в культуру следует использовать среды Мугасиге-Скуга, Пиерика и Ли и де Фоссарда с учетом требований различных генотипов к элементам питательной среды.  

5 Влияние минерального состава питательных сред

на микроразмножение груши

На коэффициент размножения побегов  груши оказали влияние два фактора – состав питательных сред и генотип. На контрольной среде Мурасиге-Скуга максимальный коэффициент размножения был получен у сортов Тютчевская (7,8), Орловская летняя (3,7) и у груши березолистной (5,3). На среде Ли и де Фоссарда высокая степень пролиферации отмечена у   сортов Лада (3,2), Тютчевская (7,2), гибрида 40-4 (3,7) и груши Березолистная (5,1). На среде Пиерика коэффициент размножения у подвоя груши 4 составил 4,2, у гибрида 15-10-110 – 4,8, у сорта Аннушка – 5,2 (табл. 1).  

На росте побегов груши в длину также сказались генетические особенности каждой формы. Так, у сорта Тютчевская, груши березолистной и у подвоя груша 4 на среде Гамборга была получена максимальная длина побегов. Среда Ли и де Фоссарда стимулировала рост побегов в длину у сортов Лада, Аннушка, Тютчевская, у груши березолистной, у груши 4 и  гибрида 15-10-110 (таб. 2).

Таблица 1 - Коэффициент размножения у эксплантов различных сортов и форм груши в зависимости от минерального состава питательных сред

Сорт,

форма

Питательная среда

Гамборга

Пиерика

Ли и де Фоссарда

Мак Коуна

Мурасиге-Скуга (контроль)

Тютчевская

6,6±1,3

6,7±1,1

7,2±2,7

4,2±0,4

7,8±1,9

Орловская летняя

3,1±0,3

3,0±0,3

3,0±0,4

2,1±0,3

3,7±0,6

Лада

3,2±0,3

2,6±0,2

3,2±0,3

2,2±0,4

2,4±0,4

 Аннушка

4,4±0,6

5,2±0,8

4,5±0,7

2,9±0,4

4,8±1,2

40-4

2,9±0,3

3,1±0,3

3,7±0,6

1,5±0,2

3,3±0,9

Груша березолистная

3,7±0,6

4,0±0,4

5,1±1,0

3,2±0,3

5,3±1,2

Груша 4

2,8±0,3

4,2±0,5

2,9±0,5

2,6±0,3

2,6±0,5

15-10-110

3,8±0,7

4,8±0,8

3,9±0,6

-*

2,8±0,7

НСР05=1,5 для гибрида 15-10-110 между средами.

Для других сортов и форм Fф<F05

* - здесь и далее отсутствие данных.

Таблица  2 - Длина побегов, сформированных эксплантами груши различных сортов и форм в зависимости от минерального состава питательных сред (мм).

Сорт,

форма

Питательная среда

Гамборга

Пиерика

Ли и де Фоссарда

Мак

Коуна

Мурасиге-Скуга (контроль)

Тютчевская

7,1±4,8

3,4±0,7

6,6±3,6

2,4±0,6

5,9±2,8

НСР05=3,3 для сорта Тютчевская между средами       

Орловская летняя

2,0±0,5

2,5±0,7

2,4±0,9

3,7±2,3

5,9±0,2

Лада

10,5±5,6

4,9±2,3

12,3±6,5

4,4±1,4

4,4±1,8

НСР05=5,3 для сорта Лада между средами    

Аннушка

4,4±1,3

3,8±0,8

5,6±2,7

2,1±0,5

5,5±2,8

40-4

3,6±2,8

3,6±,16

4,3±1,7

1,2±0,1

6,5±1,1

Груша березолистная

6,7±3,2

5,5±1,3

6,7±5,5

3,0±0,4

4,8±2,3

Груша 4

13,4±10,3

8,5±3,4

12,5±3,4

8,0±6,4

15,5±1,7

15-10-110

6,4±2,3

5,7±2,1

8,9±4,3

-*

4,9±4,2

НСР05=3,05 для гибрида 15-10-110. 

Для других сортов и форм НСР05 не вычисляли, т. к.  Fф<F05    

На среде МС рост побегов в длину был отмечен у сортов Орловская летняя, Аннушка, у гибрида 40-4 и  груши 4.

По количеству листьев на побег лучшие результаты показали среды Гамборга, Ли и де Фоссарда и МС. 

Таким образом, для большинства сортов и форм груши  среды  МС и Ли и де Фоссарда оказались оптимальными. На питательной среде  МС были получены  лучшие результаты по таким показателям, как коэффициент размножения и длина побегов у большинства форм груши. Эта среда была  пригодна для культивирования побегов без частых пересадок. Среды Пиерика и  Ли и де Фоссарда пригодна для культивирования форм груши с низким коэффициентом размножения (сорт Лада и гибрид 40-4, груша 4).        

6 Влияние  регуляторов роста  на характер развития 

эксплантов груши

6.1 Влияние различных концентраций 6-бензиламинопурина (БАП) на развитие эксплантов груши

У микропобегов сорта Тютчевская наибольшая способность к пролиферации проявилась при введении БАП в концентрации 2 мг/л и где коэффициент размножения составил 7,8. Низкий коэффициент размножения наблюдали при содержании цитокинина в концентрации 0,5 мг/л (не более 3,0). Концентрация БАП 2 мг/л способствовала росту побегов в длину. При  низком содержании БАП (0,5 мг/л) образовывались мелкие, хлоротичные побеги.  У побегов, выросших на средах с высокой концентрацией БАП (3 мг/л), часто наблюдали фасциации. Количество листьев аппарата колебалось  от 9,0 до 11,9 штук на побег.

Концентрация  БАП 0,5 мг/л у эксплантов сорта Аннушка вызывала слабую пролиферацию и активный рост каллуса, 1 мг/л стимулировала рост побегов в длину (до 6,5 мм).

Введение в состав питательной среды 2 мг/л БАП обеспечивало максимальный коэффициент размножения у сорта Орловская летняя – 3,7, а также рост побегов в длину (до 5,9 мм).   При концентрации регулятора роста 0,5; 1 и 3 мг/л хорошо развивался листовой аппарат.

У груши березолистной на средах Мурасиге-Скуга и Ли и де Фоссарда максимальный коэффициент размножения (5,3 и 5,1 соответственно) получили в присутствии в среде 2,0 мг/л БАП. Лучший рост побегов в длину отмечали при введении БАП 0,5 мг/л в состав среды  Ли и де Фоссарда. Длина побегов в среднем составил 9,8мм со средним количеством листьев – 15,5 шт. на микропобег.

У сорта Лада наибольший коэффициент размножения обеспечивала концентрация БАП 2 мг/л – 3,2. Лучший рост побегов в длину вызывало введение в среду БАП в количестве 1 и 2 мг/л (13,1 мм). При использовании концентрации 3 мг/л длина несколько снижалась до 12,8 мм. Хорошее развитие листьев наблюдали при всех концентрациях БАП. Количество листьев на побегах колебалось в среднем от 9,1 до 13,1 штук.

У гибрида 40-4 концентрация БАП  2 мг/л  отличалась образованием наибольшего количества адвентивных побегов. Использование этой концентрации способствовало росту побегов в длину. Количество листьев было практически одинаковым при всех используемых концентрациях и колебалось от 8,1 до 11,1 штук.

Таким образом, в результате экспериментов показано, что для массового размножения груши в культуре in vitro целесообразно использовать концентрацию БАП - 2 мг/л. Концентрация БАП 2 мг/л способствовала не только повышению степени пролиферации, но и росту побегов в длину (сорт Тютчевская, Орловская летняя, гибрид 40-4). Концентрация 6-БАП 1 мг/л также вызывала вытягивание побегов (сорта Аннушка, Лада).

6.2 Влияние сочетания 6-БАП и ИМК на развитие

и микроразмножение эксплантов груши

У сорта Тютчевская при введении в состав среды Мурасиге-Скуга сочетания БАП 3,0 мг/л и ИМК 0,05 мг/л наибольший коэффициент размножения составил 5,0. Сочетание БАП 0,5 мг/л и ИМК 0,2 мг/л позволило несколько повысить длину побегов в среднем до 6,3 мм (таб. 3).

Таблица 3 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на средах с

различным сочетанием концентраций БАП и ИМК на питательной среде МС

Сочетание

регуляторов роста

(мг/л)

Показатели развития

Коэффициент

размножения

Длина

побега, мм

Число

листьев, шт.

БАП 2

7,8±1,9

5,9±2,7

10,0±1,8

БАП 0,5+ИМК 0,05

2,9±0,4

3,3±2,1

8,3±6,1

БАП 0,5 + ИМК 0,2

3,3±0,3

6,3±3,2

10,0±5,3

БАП 1,0+ИМК 0,05

3,5±0,5

3,3±1,4

10,5±4,7

БАП 1,0+ИМК 0,2

3,7±0,5

4,0±2,3

9,8±3,3

БАП 2,0+ИМК 0,05

2,4±0,3

5,4±0,6

13,4±9,0

БАП 2,0+ИМК 0,2

3,6±0,4

5,2±0,5

10,7±5,2

БАП 3,0+ИМК 0,05

5,0±0,7

5,1±2,9

12,1±3,5

БАП 3,0+ИМК 0,2

4,4±0,5

3,4±0,9

11,1±1,8

НСР0,5

1,3

1,9

3,8

В присутствии в питательной среде БАП 2 мг/л и ИМК 0,05 мг/л в первых пассажах наблюдали слабое вытягивание побегов в длину. В четвертом и пятом пассажах у сорта Тютчевская встречались побеги длиной до 36 мм. Видимо, для того, чтобы получить побеги пригодные для укоренения на питательной среде с БАП и ИМК, необходимо проводить не менее четырех субкультивирований.  

У сорта Аннушка при всех вариантах концентраций БАП и ИМК коэффициент размножения был значительно ниже, чем в контрольном варианте. Однако добавление в среду БАП 1,0 мг/л и ИМК 0,2 мг/л способствовало росту побегов в длину, которая достигала в среднем 7,5 мм (табл. 4).

Таблица 4 - Развитие эксплантов груши сорта Аннушка на средах с

различным сочетанием концентраций БАП и ИМК на питательной среде МС

Сочетание

регуляторов роста

(мг/л)

Показатели развития

Коэффициент

размножения

Длина

побега, мм

Число

листьев, шт.

БАП 2 мг/л

4,8±1,2

5,5±2,9

8,8±2,2

БАП 0,5+ИМК 0,05

1,6±0,1

4,8±1,5

8,0±1,8

БАП 0,5+ИМК 0,2

2,0±0,4

5,7±0,8

5,4±0,8

БАП 1,0+ИМК 0,05

2,2±0,3

4,8±1,5

8,9±6,9

БАП 1,0+ИМК 0,2

2,7±0,3

7,5±1,0

9,3±3,9

БАП 2,0+ИМК 0,05

2,2±0,3

4,0±0,4

9,0±5,9

БАП 2,0+ИМК 0,2

2,8±0,3

3,1±1,4

6,2±3,6

БАП 3,0+ИМК 0,2

2,5±0,3

4,2±2,8

10,6±2,2

БАП 3,0+ИМК 0,05

2,1±0,2

3,5±1,5

8,4±2,3

НСР0,5

1,0

3,6

3,8

Хороший рост побегов наблюдали только в первых пассажах (до 14 мм). Растения были крепкие с темно-зелеными листьями. При последующих пассажах длина побегов снижалась до 4 мм.

Таким образом, сочетания БАП и ИМК малопригодно для культивирования  эксплантов.  Однако применение таких комбинаций регуляторов роста, как  БАП 1,0 мг/л ИМК 0,2 мг/л и БАП 0,5 мг/л ИМК 0,2 мг/л, возможно на этапе элонгации.

6.3 Влияние сочетания БАП и гибберелловой кислоты (ГК)

на развитие  эксплантов груши

При добавлении в среду Мурасиге-Скуга сочетания БАП и ГК коэффициент размножения также был ниже почти в два раза по сравнению с контрольным вариантом, но по длине побегов и количеству листьев получили лучшие результаты, что очень важно для укоренения микропобегов груши (табл. 5). Максимальная длина – 10,3 мм и максимальное число листьев отмечали при введении БАП 1,0 мг/л  + ГК 0,5 мг/л, что свидетельствует о возможности использования подобного сочетания на этапе элонгации.

Таблица 5 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на средах с

различным сочетанием концентраций БАП и ГК на питательной среде МС

Сочетание

регуляторов роста

(мг/л)

Показатели развития

Коэффициент

размножения

Длина

побега, мм.

Число

листьев, шт.

БАП 2,0 (контроль)

7,8 ±1,2

5,9±2,8

10,0±1,8

БАП 0,5 + ГК 0,1

1,8±0,1

6,5±5,7

12,3±8,0

БАП 0,5  + ГК 0,5

2,3±0,2

5,6±4,0

11,7±7,5

БАП 0,5  + ГК 2,0

2,7±0,3

8,2±7,5

13,3±7,5

БАП 1,0  + ГК 0,1

2,4±0,3

8,0±5,6

14,5±7,8

БАП 1,0  + ГК 0,5

3,2±0,3

10,3±0,9

15,6±6,4

БАП 1,0  + ГК 2,0

3,6±0,5

7,2±5,5

13,2±7,0

БАП 2,0  + ГК 0,1

2,5±0,3

7,0±0,6

14,8±7,7

БАП 2,0  + ГК 0,5

3,2±0,4

5,1±2,7

10,6±8,1

БАП 2,0  + ГК 2,0

4,4±0,6

6,2±0,9

12,0±7,3

НСР05

0,8

9,8

5,2

6.4 Влияние сочетания БАП, ГК и ИМК на развитие

эксплантов груши

Среди использованных сочетаний регуляторов роста наибольшую степень пролиферации (6,6) отмечали в присутствии в среде сочетания БАП 3,0 мг/л + ГК 2,0мг/л + ИМК 0,2 мг/л. Минимальная степень пролиферации проявилась при сочетании регуляторов роста БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л + ИМК 0,1 мг/л (3,3). На  рост побегов в длину существенное влияние оказало сочетание  БАП 1,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л. Данный вариант обеспечивал развитие длинных побегов, пригодных к укоренению. Средняя длина побегов в варианте составила 9,3 мм (табл. 6).  

Таблица 6 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на средах с различным сочетанием концентраций БАП, ГК, ИМК

Сочетание регуляторов роста (мг/л)

Показатели развития

Коэффициент

размножения

Длина

побега, мм

Число

листьев, шт.

БАП 2,0

7,8±1,2

5,9±2,8

10,0±1,8

БАП 1,0 +ГК 0,1+ИМК 0,05

3,8±0,2

6,2±1,2

12,1±2,0

БАП 1,0+ГК 0,5+ИМК 0,1

3,3±0,2

6,3±0,8

12,8±2,0

БАП 1,0+ГК 2,0+ИМК 0,2

4,5±0,3

9,3±1,8

13,3±2,4

БАП 2,0+ГК 0,1+ИМК 0,05

5,2±0,3

5,4±1,0

10,4±1,8

БАП 2,0+ГК 0,5+ИМК 0,1

5,4±0,9

8,4±1,7

11,5±2,1

БАП 2,0+ГК 2,0+ИМК 0,2

4,5±0,4

6,1±1,3

12,0±2,3

БАП 3,0+ГК 0,5+ИМК 0,1

5,6±0,8

8,6±1,6

10,0±2,1

БАП 3,0+ГК 2,0+ИМК 0,2

6,6±0,4

7,4±1,7

10,0±2,0

Таким образом, введение в среду БАП+ГК+ИМК не привело к увеличению коэффициента размножения (по сравнению с контрольным вариантом), но сочетание  БАП 1,0+ГК 2,0+ИМК 0,2 можно использовать на стадии элонгации.

7 Определение минеральной основы питательной среды

для этапа укоренения

Известно, что на процесс укоренения оказывает влияние состав питательной среды и сортовые особенности растений.

Испытанные пять форм груши отличались по ризогенной способности. Наибольшая частота корнеобразования была отмечена для побегов   груши сорта Тютчевская. На всех испытанных средах, кроме среды Гамборга,  побеги данного сорта образовывали корни (табл. 7). У единичных растений наблюдали рост корней первого порядка. На питательной среде Ли и де Фоссарда отмечали интенсивное образование каллусной ткани.

Таблица 7 - Интенсивность образования корней у экспланов груши 

на питательных средах с различным минеральным составом

Варианты

Показатели

Тютчевская

Лада

Аннуш­ка

1/2 МС

Число эксплантов

16

28

30

%   укоренения

12,5

21,4

20

Среднее число корней, шт.

2,7±1,3

0,8 ±0,5

0,3 ±0,02

Средняя длина корня, мм

5,6±3,4

2,2 ±1,7

1,8±0,7

Ли и де

Фоссарда

Число эксплантов

25

25

*

%   укоренения

16,7

0

*

Среднее число корней, шт.

0,3±0,04

0

*

Средняя длина корня, мм

3,9 ±1,0

0

*

Уайта

Число эксплантов

32

29

*

%   укоренения

15,6

0

*

Среднее число корней, шт.

0,5±0,1

0

*

Средняя длина корня, мм

1,8 ±0,9

0

*

Гамборга

Число эксплантов

9

12

*

%   укоренения

0

0

*

МС 0 мг/л ИМК,  после среды Ли и де Фоссарда

Число эксплантов

36

25

*

%   укоренения

0

0

*

* - нет данных

Максимальное количество укоренившихся побегов сорта Тютчевская было получено на среде Ли и де Фоссарда.   По количеству корней на одно растение и по длине корней лучшей оказалась среда МС, разбавленная вдвое минеральной основой.

У сорта Лада образование корней отмечали лишь на среде МС, разбавленной вдвое. Средний процент укоренения составил 21,4. У подвоя груша 4 и вида груша березолистная ни в одном из предложенных вариантов сред укоренения не отмечали

На всех испытанных средах у всех форм груши  отмечали гибель укорененных и неукорененных  побегов, которая начиналась с  апикального некроза.

Поэтому оптимальным сроком культивирования микропобегов на питательной среде для укоренения было четыре недели. Появление корней начинается через 1 – 3 недели и если в этот срок корни не образовывались, то происходило подсыхание среды и некроз тканей экспланта.   

8 Определение типа, концентрации и способов аппликации

препаратов с ауксиновой активностью на ризогенез микрорастений

В результате  экспериментов было установлено, что у побегов сорта Тютчевская наибольшую ризогенную активность вызывало введение в среду НУК в концентрации 1,0 мг/л. Средний процент укоренения составил 66,7. В основании побегов наблюдали рост небольшого количества  каллуса. Образование максимального количества корней на одно растение вызывало введение в состав питательной среды 1,0 мл/л ИМК (2,7 шт.) и 0,5 мг/л НУК (2,9 шт.). Рост наиболее длинных корней отмечали в присутствии в среде 0,5 мг/л НУК, длина которых составила в среднем 16,2 мм. При добавлении сочетания ИМК и ИУК по 0,5 мг/л средняя длина корней достигала  21,2 мм. Введение сочетания НУК и ИУК (по 0,5 мг/л) приводило к образованию корней первого порядка. Введение ИУК в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л укоренения побегов не стимулировало.

При изучении способов аппликации лучшие результаты были получены при обработке микрорастений груши сорта Тютчевская ИМК-содержащей пудрой. Замачивание в спиртовом растворе ИМК (50 мг/л) в течение 10 секунд не приводило к  образованию корней.

У сорта Лада при всех испытанных способах индукции образования корней наибольшее среднее количество укоренившихся побегов получили при введении в питательную среду сочетания ИМК и ИУК в концентрации 0,5 мг/л - 48,6%. Введение в среду тех же препаратов в концентрации 1,0 мг/л образования корней не вызывало. При замачивании микропобегов груши в растворах ИМК и после обработки ауксинсодержащей пудрой процент укоренения был ниже и колебался от 1,5 до 29,4.

У подвоя груша 4 из восьми вариантов стимуляторов корнеобразования и четырех способов аппликации наибольший процент укоренения (41,2%) дало введение в питательную среду 1,0 мг/л НУК. В этом же варианте образовывалось наибольшее количество корней – 2,1 штук и самые длинные корни – до 7,7 мм.

У груши березолистной укоренения не наблюдали ни в одном из испытанных вариантов.

Замачивание микропобегов сорта Орловская летняя в спиртовом растворе ИМК в течение 10 секунд обеспечивало корнеобразование в 52,9% случаев.

Таким образом, из всех испытанных способов стимуляции корнеобразования наиболее существенное влияние на интенсивность ризогнеза оказали введение  в питательную среду НУК (1,0 мг/л) и ИМК (1,0 мг/л), а также сочетаний ИМК и НУК (по 0,5 мг/л), НУК и ИУК (по 0,5 мг/л), ИМК и ИУК (по1,0 мг/л). Процесс замачивания в водном растворе ИМК и обработка ауксинпудрой также положительно сказались на процессе укоренения.   

9 Адаптация   пробирочных растений груши к нестерильным

условиям

С целью повышения приживаемости пробирочных растений  груши invitro в нестерильных условиях изучали влияние двух препаратов элиситорного действия – Эль-1 (аналог эмистима) и Экост 1/3.  Контролем служили адаптация микрорастений без элиситоров (табл. 8).

Таблица 8 - Приживаемость микрорастений груши на этапе адаптации (%)

Форма

Элиситоры

Без элиситоров (контроль)

Эль-1

Эль-1+Экост 1/3

Тютчевская

43,7

37,5

26,6

Лада

25,0

*

20,0

Орловская летняя

15,3

*

10,0

Груша 4

53,8

69,2

0

Fф>F01                   

* - нет данных

Показано, что у сорта Тютчевская наибольшая приживаемость растений в нестерильных условиях была при  внесении в субстрат препаратом Эль-1 - 43,7%.  Контрольный вариант показал наименьшую приживаемость – 26,6%.

У подвоя груша 4 при совместном воздействии элиситоров успешно адаптировались к нестерильным условиям наибольшее число растений - 69,2%, в то время как в контрольном варианте не прижилось ни одного растения.

У сортов Лада и Орловская летняя препарат Эль-1 оказал положительное влияние на адаптацию растений in vitro к нестерильным условиям.

В результате эксперимента были получены корнесобственные растения груши изучаемых сортов и форм.

Таким образом, применение иммуностимулирующих препаратов на этапе адаптации оказало положительное влияние, повысив выход адаптированных растений груши и тем самым увеличив выход посадочного материала.

10 Метод микропрививки в процессе клонального

микроразмножения груши

Для повышения выхода растений груши в процессе клонального микроразмножения был использован метод микропрививки. Для лучшего срастания привоя и  подвоя срезы последнего обрабатывали растворами аскорбиновой кислоты (50 мг/л), ДИЕКА (2 г/л) и ИМК (5 мг/л). У сорта Тютчевская при обработке срезов подвоя аскорбиновой кислотой наблюдали максимальную приживаемость прививки – 91,7% (табл. 9).

У сорта Лада при использовании  раствора аскорбиновой  кислоты (50 мг/л) выход жизнеспособных растений был выше в два с лишним раза  по сравнению с этапом адаптации – 55%.

При использовании микропрививки у гибрида 40-4 наибольший выход растений (65%) получили при обработке срезов подвоев раствором аскорбиновой  кислоты.

Признаком срастания привоя и подвоя было начало роста привоя. В течение месяца формировались побеги длиной до 2-4 см. Полученные растения высаживали в весенние теплицы.  

Таблица  9 - Выход растений при различных способах выращивания (%)

Сорт, форма

Микропрививка

Адаптация укорененных

invitro

микропобегов

Обработка срезов аскорбиной кислотой

Обработка

срезов

ИМК

Обработка

срезов

ДИЕКА

Тютчевская

91,7

83,3

80,0

43,7

Лада

55,0

10,0

*

25,0

40-4

65,0

20,0

*

0

Fсорта>F01                  Fпрививки>F05

* - нет данных

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность применения метода микропрививки на груше. С помощью этого метода можно получить жизнеспособные растения тех форм, которые плохо укоренялись и проходили этап адаптации (например, гибрид 40-4).

11 Депонирование изолированных микропобегов груши in vitro

Влияние концентрации минерального состава питательной среды. При изучении влияния концентрации минерального состава среды Мурасиге-Скуга было показано, что максимальный срок хранения у сорта Тютчевская – шесть месяцев обеспечивали среды с разбавленной минеральной основой в 4 и 8 раз. Минимальный срок – 5 месяцев на среде, разбавленной в 2 раза. В процессе хранения микропобегов пролиферации не наблюдали.  После хранения микропобеги высаживали на среду Мурасиге-Скуга стандартного минерального состава и культивировали в течение четырех недель в условиях свекомнаты, где получили коэффициент размножения 5,9. Растения были жизнеспособны.

У побегов груши березолистной максимальный срок хранения составил 16 месяцев на среде с разбавленной в 4 раза минеральной основой. В процессе депонирования коэффициент размножения составил 7,3. Минимальный срок хранения 5 месяцев при разбавлении минеральной основы в два раза. Микропобеги также пролиферировали и коэффициент размножения составил 4,1. После пересадки в условия светокомнаты растения были способны к дальнейшему развитию. У этиолированных побегов отмечали некроз тканей, однако у  основания образовывались дополнительные побеги, и коэффициент размножения достигал 2,6.

У сорта Аннушка наибольший срок хранения побегов 6 месяцев отмечен на средах с разбавленной минеральной основой в 4 и 8 раза. Первые признаки хлороза появились уже через 2 месяца. Пролиферации во время хранения не было. После пересадки на обычную среду Мурасиге-Скуга в условия свекомнаты растения остались жизнеспособны и продолжали образовывать дополнительные побеги. Максимальный коэффициент размножения был у тех растений, которые хранили 6 месяцев на среде с разбавленной в 4 раза минеральной основой.  

У гибрида 40-4 максимальный срок хранения (4 месяца) зарегестрирован на среде Мурасиге-Скуга с разбавленной в 2 раза минеральной основой. Затем у микропобегов начинался некроз тканей. Изъятые из хранения растения высаживали на среды Мурасиге-Скуга и Ли и де Фоссарда. Развитие растений на среде Ли и де Фоссарда было более интенсивным, особенно со среды с разбавленным в 4 раза минеральным составом.  

Исследования показали различную реакцию микропобегов груши изучаемых сортов и форм во время депонирования на уменьшение концентрации макро- и микросолей. Однако, при культивировании в условиях светокомнаты все они были способны к дальнейшему развитию.

Действие различных концентраций сахарозы на процесс хранения микропобегов груши.  При хранении микропобегов сорта Тютчевская на среде МС с уменьшенным содержанием сахарозы, пролиферации побегов не было отмечено в течение всего периода хранения (5 месяцев). После пересадки на среду МС с обычным минеральным составом наблюдали дальнейшее развитие. Наибольший коэффициент размножения при этом составил 5,7 (табл. 10).

Таким образом, снижение концентрации сахарозы в питательной среде МС можно использовать как один из способов депонирования побегов груши.

Таблица 10 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская в условиях

светокомнаты после  депонирования на среде МС с  уменьшенным

количеством сахарозы

Срок

хранения

Показатели

развития

Разбавление минеральной основы

В 2 раза

В 4 раза

В 8 раз

3 месяца

Коэффициент

размножения

3,9±0,6

5,7±2,1

3,7±1,6

Длина побега, мм

10,4±3,2

4,9±1,2

9,0±0,5

Число листьев, шт.

10,1±4,8

9,6±1,6

7,8±0,6

5 месяца

Коэффициент

размножения

5,2±1,0

4,5±1,0

5,2±1,8

Длина побега, мм

8,2±1,1

5,1±3,4

4,7±1,0

Число листьев, шт.

9,1±3,8

9,6±2,8

9,7±2,1

Реакция микропобегов груши на замену сахарозы маннитом. Наибольший срок хранения (14 месяцев) у сорта Тютчевская был отмечен при добавлении маннита в концентрации 3 г/л. При концентрации 1 г/л наблюдали 100% обводненность побегов, поэтому все растения изъяли из хранения через 3 месяца. После пересадки на среду Мурасиге-Скуга в условия светокомнаты наблюдали низкий коэффициент размножения. Образовывались неодномерные, тонкие и нежизнеспособные побеги.

У груши березолистная микрорастения были изъяты из хранения в два этапа – в 6 месяцев, когда начался некроз и в 14 месяцев при содержании маннита 5 г/л. В процессе хранения пролиферации не наблюдали, но растения остались зелеными. При культивировании в светокомнате у тех микропобегов, которые депонировали 6 месяцев отмечали пробуждение латеральных почек. Те, что изъяли из хранения через 14 месяцев, погибли. Эксперименты показали, что использование маннита вместо сахарозы вызывает гибель побегов груши, как во время хранения, так и во время выращивания в культивационной комнате. 

Депонирование груши при различных концентрациях БАП.  При хранении побегов груши invitroмаксимальный срок хранения у сорта Тютчевская (14 месяцев) отмечали при введении в среду 3,0 мг/л и 10,0 мг/л БАП. Минимальный период хранения – 4 месяца, при концентрации 0,1 мг/л. В процессе депонирования  побеги образовывали дополнительные почки и побеги. Отмечено, что чем выше концентрация цитокинина, тем больше образовывалось дополнительных побегов. После хранения растения высаживали на среду Мурасиге-Скуга в светокомнату. Через месяц культивирования после депонирования побеги продолжали расти и были способны к дальнейшему развитию. Наибольший коэффициент размножения отмечен у побегов, хранившихся на среде с 5,0 мг/л БАП в течение 13 месяцев – 4,0. Отмечали также образование побегов пригодных к укоренению, длина которых достигала в среднем 16,8 мм (табл.11).  

Микропобеги груши березолистной хранили на среде МС, содержащей 10 мг/л БАП   в течение 14 месяцев (табл. 12).        

Таблица 11 -  Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на питательной среде МС после  депонирования МС с различной концентрацией БАП

Варианта

депонирования

Показатели развития

Коэффициент

размножения

Длина побега,

мм

Число листьев, шт.

3 мг/л БАП 

14 месяцев

хранения

3,0±0,2

16,8±1,1

15,8±4,8

5 мг/л БАП        

13 месяцев

хранения

4,0±0,7

14,1±4,0

14,5±3,8

10 мг/л БАП      

14 месяцев

хранения

2,7±0,5

15,0±2,1

15,5±3,4

Таблица 12 - Развитие эксплантов груши сорта березолистная  в период

хранения на питательных средах с различной концентрацией БАП

Варианты

Показатели

Коэффициент

размножения

Длина побега, мм

Число листьев, шт.

10 мг/л БАП

5 месяцев

хранения

4,0±0,2

4,2±1,1

11,6±4,0

10 мг/л БАП

14 месяцев

хранения

7,3±3,2

20,0±7,8

17,8±5,2

Восстановление развития побегов груши после хранения у этой формы было чрезвычайно медленно.

Срок хранения побегов сорта Лада  на среде МС, содержащей 5 мг/л БАП - 6 месяцев. Пролиферации не наблюдали. Для дальнейшего развития их пересаживали на среду Ли и де Фоссарда с добавлением 2 мг/л БАП. Растения успешно развивались, давая адвентивные побеги. Коэффициент размножения составил 2,7.

Таким образом, в результате исследований показано, что хранение микрорастений груши при пониженной положительной температуре возможно. Растения в большинстве своем остаются жизнеспособными и могут быть использованы для дальнейшего микроразмножения. Необходимым условием остается индивидуальный подбор условий хранения, т. к. каждый генотип по-разному реагировал на состав питательной среды.   Для депонирования лучше использовать среды с повышенным содержанием цитокинина и с разбавленной минеральной основой. При создании коллекций груши можно чередовать депонирование в холодильных камерах и культивирование в условиях светокомнаты. 

 

10 Экономическая эффективность

Расчёт экономической эффективности производства посадочного материала груши проводили путем сравнения двух методов: обычная схема in vitro, включающая в себя все этапы клонального микроразмножения и метод микропрививки, где экспланты груши прошли всего два этапа - введения и микроразмножения, а затем микропобеги были привиты на семенные подвои, выращенные в нестерильных условиях.

В первом случае выход полноценных растений груши зависел от коэффициента размножения, % укоренившихся и адаптированных растений.

Во втором случае выход растений зависел от коэффициента размножения и от успешного срастания привоя и подвоя.

Метод микропрививки является более трудоемким, но требует меньше материальных затрат, обеспечивает окупаемость через 1 год и 3 месяца (табл. 13). В результате использования микропрививки значительно увеличивается прибыль (в 4,2 раза).

Как показали расчёты,  технология выращивания  посадочного материала груши с помощью метода микропрививки более выгодна, так как рентабельность производства повысилась на 51,9%.


Таблица 13 - Расчет экономической эффективности получения посадочного материала груши при использовании двух методов из расчета на 1000 штук

Статьи затрат

Растения, полученные по стандартной

методике in vitro

Растения, полученные

с помощью

микропрививки

Реактивы

1302

1026

Зарплата

25620

33420

Начисления на зарплату  35,3%

9043

11797

Электроэнергия

10000

8000

Отопление

5700

5700

Ящики

360

360

Пленка полиэтиленовая

800

800

Стаканы, 200 мл.

1300

1300

Вода

10

10

Подвой, привой

-

14700

Амортизация и ремонт

основных  средств

4200

4200

Накладные расходы   10%

5833

6661

Итого затрат

641668

87974

Выход растительного

материала (шт.)

473

917

Себестоимость 1 растения (руб.)

135,66

95,94

Цена реализации (руб.)

135,66

95,94

Сумма выручки (руб.)

80410

155890

Прибыль (руб.)

16242

67916

Рентабельность (%)

25,3

77,2

Окупаемость

4 года

1,3 года

 


ВЫВОДЫ

 1. В результате проведенных исследований показана принципиальная возможность клонального микроразмножения груши перспективных сортов, гибридов, подвоев и дикого вида груши березолистная.

2. В процессе клонального микроразмножения груши продемонстрировано превалирующее влияние особенностей генотипа для каждого этапа клонального микроразмножения (введение, пролиферация, укоренение).

3. Применение в качестве стерилизующего агента смеси перекиси водорода (30%) и 96% этанола с последующей обработкой 0,1%-м раствором сулемы, а также 0,1% раствора  мертиолата практически полностью исключает контаминацию, не вызывая некроза тканей. 

4. На этапе введения в стерильную культуру для большинства испытанных форм груши наиболее эффективными оказались среды Мурасиге-Скуга и Пиерика.

5. Питательные среды Мурасиге-Скуга и Ли и де Фоссарда на этапе микроразмножения обеспечивают максимальную степень пролиферации   и наилучший рост микрорастений большинства  формы груши. 

6. Для повышения коэффициента размножения неоходимо использовать концентрацию БАП 2 мг/л (для сортов Тютчевская, Орловская летняя,  Аннушка, гибрида 40-4, груши березолистная) и 3 мг/л (для сорта Лада). Концентрация БАП 1 мг/л способствует росту побегов в длину. Поэтому данное количество цитокинина можно использовать на этапе элонгации. 

7. Присутствие в питательной среде на этапе элонгации сочетаний регуляторов роста: 1,0 мг/л БАП + 0,2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л БАП + 2,0 мг/л ГК, 3,0 мг/л БАП + 0,5 мг/л ГК +0,1мг/л ИМК, 1,0 мг/л БАП + 2,0 мг/л ГК + 0,2 мг/л ИМК усиливает рост побегов в длину.

8. Укореняемость побегов испытанных форм груши  варьирует в зависимости от генотипа, состава питательной среды, типа индуктора ризогенеза и способа его аппликации:

- наибольшей укореняемостью побегов характеризуются сорта Тютчевская и Лада, Орловская летняя, подвой груша 4;

- оптимальной для этапа укоренения  является питательная среда МС, разбавленная в два раза по минеральному составу;

- введение в среду НУК (1 мг/л) и сочетания  ауксинов 0,5 мг/л НУК+0,5 мг/л ИУК, 0,5 мг/л ИМК+0,5 мг/л ИУК, а также обработка ИМК-содержащей пудрой и кратковременное замачивание в спиртовом растворе ИМК (50 мг/л) способствует повышению частоты укоренения.

9. Использование иммуностимулирующих веществ (Эль-1 и Экост 1/3) способствует повышению приживаемости  микрорастений груши в нестерильных условиях до 69,2% по сравнению с контролем.

10. Применение метода микропрививки побегов груши invitro на семенные подвои значительно повышает выход растений трудноукореняющихся и неукореняющихся в процессе клонального микроразмножения форм груши, тем самым повышая эффективность данного процесса.

11. Микропобеги груши березолистная характеризуются наибольшим сроком хранения при пониженных положительных температурах – 14 месяцев при замене сахарозы на манит в концентрации 5 г/л и 16 месяцев на среде МС,  разбавленной в 4 раза по минеральному составу.

12. После хранения растения большинства испытанных форм остаются жизнеспособными и в условиях invitro возобновляют рост и пролиферацию побегов. 

 

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА

1. Разработанные приемы клонального микроразмножения сортов и форм груши могут быть применены для производства посадочного материала этой культуры.

Для введения в культуру in vitro и размножения эксплантов груши рекомендуется использовать среды Мурасиге-Скуга, Ли и де Фоссарда и Пиерика. Где для усиления пролиферации побегов груши необходимо использовать БАП в концентрации 2,0 мг/л и 3,0 мг/л. А для получения побегов груши пригодных для укоренения использовать концентрации БАП 1,0 мг/л и 2,0 мг/л, а так же сочетания регуляторов роста БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л и БАП 1,0 мг/л + ГК 2,0мг/л + ИМК 0,2 мг/л.

2. В качестве индукторов корнеобразования рекомендуется использовать введение в состав среды МС с разбавленной в два раза минеральной основой НУК (1, 0 мг/л) и ИМК (1, 0 мг/л) и замачивание микропобегов груши в спиртовом растворе ИМК (50 мг/л) в течение 10 сек.

При адаптации груши рекомендуется обрабатывать субстрат препаратом Эль-1. Для увеличения выхода посадочного материала неукореняющихся или плохоукореняющихся в процессе клонального микроразмножения сортов и форм применять метод микропрививки на семенной подвой с обработкой срезов последних раствором аскорбиновой кислоты (50 мг/л). 

3. Для длительного хранения микропобегов сортов и форм груши (14 месяцев) рекомендуется использовать  способ депонирования при  температуре +3…5°С с использованием среды МС, разбавленной в четыре раза по минеральному составу и среду МС, содержащую 10 мг/л БАП.

12. Список опубликованных работ

1. Ломовская, Л. В. Особенности клонального микроразмножения сортов и перспективных форм груши / Л. В. Ломовская // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве : материалы к междунар. науч.-метод. конф. (Орел, 28-31 июля 2003 г.) – Орел: ВНИИСПК, 2003. – С. 204-205.

2. Ломовская, Л. В. Методы оздоровления и размножения перспективных форм груши in vitro / Л. В. Ломовская // Достижения науки и техники АПК.  – М., 2004. - №3 . ­­- С. 13-15.

3.  Ломовская, Л. В. Особенности размножения перспективных форм груши в культуре in vitro / Л. В. Ломовская // Селекция и сортовая агротехника плодовых культур:  сб. науч. тр. – Орел, 2004. - С. 107-113.

4. Ташматова, Л. В. Методы культуры in vitro при размножении и депонировании форм груши / Л. В. Ташматова // Садiвництво : мiжвiдомчий тематичний науковий збiрник. – Киiв.: СЕРЖ, 2005. - Вип. 57. – С. 205-212.

5. Ташматова, Л. В. Депонирование груши in vitro / Л. В. Ташматова // Актуальные проблемы садоводства России и пути их решения : материалы всерос. науч.-метод. конф. молодых ученых (Орел, 2-5 июня 2007 г.). – Орел: ВНИИСПК, 2007. – С.310-313.

6. Ташматова, Л. В. Возможность клонального микроразмножения и депонирования сортов и форм груши. / Л. В. Ташматова, В. А Высоцкий  // Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. работ ГНУ ВСТИСП. - М.: ВСТИСП, 2008. – Т. XVIII. – С. 385-389.

7. Ташматова, Л. В. Способ прививки груши микропобегами in vitro / Л. В. Ташматова, В. Е. Джафарова // Совершенствование сортимента и технологий возделывания плодовых культур :  сб. науч. тр.  – Орел: ВНИИСПК, 2010. - С.228-229.

8. Ташматова, Л. В. Длительное сохранение пробирочных растений груши / Л. В. Ташматова // Садiвництво. – Киiв.: СЕРЖ, 2011 – Вип. 64.  (в печати)

9. Ташматова, Л. В. Размножение и депонирование груши в условиях in vitro /Л. В. Ташматова // Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. работ – М.: ВСТИСП, 2011. – Т. XXVI. – С. 130-137.  


Издательство ВНИИСПК, 2012. Орловская обл., Орловский р-н, д. Жилина

Заказ №28. Тираж 100 экз.

  

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.