WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

Автореферат кандидатской диссертации

 

На правах рукописи

ЩУКИН ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ГАЛОТОЛЕРАИТИОГО МЕТАИОТРОФА

METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z

03.01.04 Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино -2012


Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель:                                доктор биологических наук, профессор

Троценко Юрий Александрович

Официальные оппоненты:                             Дедыш Светлана Николаевна

доктор биологических наук ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, зав. лабораторией

Соляникова Инна Петровна

доктор биологических наук

ФГБУН Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,

старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино

Защита состоится « »____ 2012 г. в _j_ ч. на заседании Диссертационного совета

Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект

Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru./ и http://www.ibpm.ru./

Автореферат разослан «__ »________ 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук                                  с~-% oLov^^_^_^_Н.В.Доронина

2


Актуальность проблемы. Клеточная оболочка бактерий является важным фактором их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. У аэробных метанотрофов, использующих метан в качестве источника углерода и энергии, клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану (Гальченко, 2001; Троценко, Хмеленина, 2008). Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов несколько отличается по химическому составу от таковой других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием предельно восстановленного газообразного субстрата -метана. Так, в наружной мембране термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus Bath обнаружены специфические белки, в том числе мультигемовые цитохромы с типа, что указывает на окислительно-восстановительные процессы, происходящие на клеточной поверхности (Karlsen et al. 2008, 2011).

Интригующей особенностью ряда метанотрофов является наличие на внешней поверхности клеточной стенки упорядоченных гликопротеиновых S-слоев. У метанотрофов рода Methylomicrobium, включая галоалкалофилов Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. buryatense (штаммы 5В, 5G, 6G и 7G), а также негалофильного нейтрофила Mm. album BG8, S-слои представлены монослоем чашевидных структур, уложенных в гексагональной (рв) симметрии (Jeffries et al., 1987; Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001). Напротив, у Mc. capsulatus (штаммы 874 и Texas) S-слои имеют тетрагональную (рА) симметрию расположения белковых субъединиц (Тюрин с соавт., 1985; Сузина, Фихте, 1986). Однако функции этих структур у метанотрофов остаются не понятными. Уровень понимания истинной роли S-слоев у различных микроорганизмов в значительной степени зависит от расшифровки соответствующих генетических детерминант белковых компонентов и выяснении связи S-слоев с другими поверхностными белками микроорганизма.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - идентификация и первичная характеристика доминирующих поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Выделить основные поверхностные белки у Mm. alcaliphilum 20Z и определить нуклеотидные последовательности кодирующих их генов.
  2. Изучить возможную  связь  основных поверхностных белков  с  S-слоями или другими структурами клеточной оболочки.
  3. Выделить и охарактеризовать инсерционные мутанты Mm. alcaliphilum 20Z по поверхностным белкам, изучить основные свойства полученных мутантов.

3


Научная новизна. У Mm. alcaliphilum 20Z в составе ассоциированных с клеточной поверхностью белков найдены белки с м.м. 27 и 80 кДа, проявлявшие высокую гомологию (>50% идентичности) с поверхностными белками 'СогА' и 'СогВ' Methylomicrobium album BG8. Обнаружена локализация белка 'СогА' в основании чашевидных структур S-слоев и периплазматическая локализация 80-кДа белка, отнесенного к новому классу дигемовых цитохром с пероксидаз. Сконструированы инсерционные мутанты по генам 'согА' и 'согВ'. Постулирована роль 'СогА' в прикреплении S-слоев к клеточной поверхности метанотрофа. Мутант по гену 'согВ' рос на метане с высокой скоростью и имел более высокие активности ферментов окисления Сі-соединений по сравнению с родительским штаммом. Показана коэкспрессия белков 'СогА' и 'СогВ' при низком содержании меди в ростовой среде. Кроме 'СогА' и 'СогВ' при биотинилировании целых клеток метились а-субъединица метанолдегидрогеназы (МДГ) и 59-кДа белок, указывая на экспонирование на наружной поверхности клеточной стенки по крайней мере фрагментов этих белков. Полученные приоритетные данные по идентификации и характеристике поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z создают предпосылки дальнейших исследований их роли у галоалкалофильных метанотрофов.

Научно-практическое значение. Результаты изучения поверхностных белков и кодирующих их генов у галоалкалофила 20Z представляют интерес для продукции целевых белков посредством гетерологичной экспрессии ввиду непатогенности метанотрофов, низкой протеазной активности и способности достигать высокой плотности клеток при культивировании на простых минеральных средах. Кроме того, определение поверхностных белков и их функций у метанотрофов с различными физиолого-биохимическими особенностями может привести к лучшему пониманию роли клеточной оболочки в адаптации этих бактерий к флуктуациям природных условий. Разработанный метод получения мутантов Mm. alcaliphilum 20Z перспективен в качестве эффективного инструмента при изучении функциональных генов/ферментов у метанотрофов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2007-2011гг), на I школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), на XIV международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на V и VII молодёжных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, 2011).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ГФУ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы     «Экстремофильные     и     экстремотолерантные      аэробные     метилотрофы»

4


(№ Госрегистрации 01.20.0403398), поддержана грантами РФФИ (08-04-01732-а, 10-04-01224-а) и госконрактами № 4.749.11.0111, № 02.740.11.0296.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 4 тезисов.

Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Дуде В.И., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Серебряковой М.Е., к.б.н. Зиганшину Р.А., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Бесчастному А.П., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего _ ссылки, из них _ на русском и _ на английском языках, содержит _ таблиц и _ рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили чистые культуры облигатных метанотрофов Mm. alcaliphilum 20Z иМс. capsulatus Bath из коллекции ВКМ (№ В-2133, № В-2116). Метанотрофные бактерии выращивали на минеральной среде «П» в атмосфере СН4 и воздуха (1:1) (Гальченко и др., 1986). Для выращивания Mm. alcaliphilum 20Z в среду дополнительно вносили Na-карбонатный буфер и 3% NaCl (Хмеленина с соавт., 1997). Escherichia coli S17-1, Top Stab 10, BL21(DE3) выращивали при 37°C на жидкой или агаризованной средах "LB", добавляя при необходимости хлорамфеникол, канамицин, гентамицин и/или ампициллин.

Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом (Marmur, 1961). Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию проводили согласно протоколам (Sambrook, Russell, 2001). Тотальную РНК выделяли модифицированным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Последовательности ДНК и белков анализировали с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI® Advance v.9.0. Для выравнивания аминокислотных последовательностей использовали программу ClustalX (vl.62b). Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura et al., 2007).

Идентификация и выделение основных поверхностных белков. Клетки штамма 20Z обрабатывали флуоресцентным реагентом дансилхлоридом, который реагирует со свободными аминогруппами аминокислот и не проникает через внешнюю мембрану   (Walker,   1994).   Поверхностные   белки   идентифицировали  в   УФ   после

5


разделения тотальных клеточных белков ДСН-ПААГ электрофорезом. Для дополнительной идентификации и препаративной наработки поверхностных белков клетки обрабатывали биотиновым зондом, биотинилированные полипептиды собирали на магнитные частицы, покрытые стрептавидином (Karlsen et al., 2005). Масс-спектрометрический анализ полипептидов выполнен к.б.н. Р.А. Зиганшиным (ФГУ Институт биоорганической химии РАН, г. Москва).

Получение инсерционных мутантов по генам 'согА' и 'согВ'. Процедура включала амплификацию нуклеотидных последовательностей двух плеч инактивируемого гена, клонирование полученных ПНР-продуктов в плазмиду pK18mob, содержащую ген устойчивости к канамицину (Schafer, 1994), и клонирование в эту плазмиду гена устойчивости к гентамицину aaCl между клонированными плечами. Для конъюгации со штаммом 20Z использовали штамм-донор Е. coli S17-l/pK18mob:L7-L2.aaC7. Конъюганты отбирали по устойчивости к гентамицину и чувствительности к канамицину.

Цитобиохимические исследования. Ультраструктуру клеток метанотрофов изучали с помощью электронного микроскопа JEOL JEM 100В (Япония). Приготовление ультратонких срезов и просмотр препаратов в электронном микроскопе проводили в лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН совместно с к.б.н. Сузиной Н.Е.

Клонирование и экспрессия генов. Ген 'согВ' амплифицировали из геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z, клонировали в вектор рЕТ22Ь и экспрессировали в клетках Е. coli BL21(DE3). Рекомбинантный 'CorB'-His6-tag выделяли и очищали из клеток Е. coli с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni -NTA-агарозой, согласно протоколу фирмы "Quiagen" (Германия). Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу белка определяли электрофорезом в ДСН-ПААГ (Laemmli, 1970).

Включение       СН4      суспензиями      клеток      измеряли      на      жидкостном

сцинтилляционном спектрометре LS-30 «Beckman» (США) в смеси, содержащей 2,5-дифенилоксазола и 1, 2-бис-(5-фенилоксазолил-2)бензола в 1 л толуола (Sokolov, Trotsenko, 1995).

Выделение и анализ осмопротекторов. Низкомолекулярные органические соединения - потенциальные осмопротекторы, экстрагировали из клеток метанолом. Количество сахарозы оценивали с антроновым реактивом в модификации (Hendel, 1968). Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ («LKB», Швеция) (Ешинимаев с соавт., 2007).

6


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Детекция и выделение основных поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z

Для идентификации основных поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z клетки обрабатывали флуоресцентным реагентом дансилхлоридом (Walker, 1994). После разрушения клеток нагреванием в денатурирующем буфере проводили ДСН-ПААГ электрофорез тотальных белков. В УФ были выявлены четыре белковые полосы м.м. 27, 59, 67 и 80 кДа (рис. 1а). Окрашивание гелей Кумасси G-250 подтвердило, что эти белки являются мажорными в спектре тотальных клеточных белков (рис. 16).

Для  выделения  и идентификации поверхностных  белков  использовали  метод

биотинилирования.     Клетки    обрабатывали    биотиновым    зондом,     затем    белки

Для подтверждения поверхностной локализации 59-кДа белка суспензии клеток обрабатывали трипсином. В течение первых 30 мин после добавления трипсина относительное количество 59-кДа белка значительно снижалось, при этом количество остальных белков не изменялось. Через 2 ч содержание 59-кДа белка достигало исходного уровня (рис. 29). Следовательно 59-кДа белок доминирует в спектре тотальных клеточных белков штамма 20Z и локализован на поверхности клетки, что согласуется с возможным участием данного белка в формировании стенок чашевидных структур.


59кЛа

Рис. 29. Белковые профили клеток штамма 20Z до и после обработки трипсином клеток. Время обработки: 1-контроль, без обработки; 2-30 мин; 3 - 1 ч; 4 - 2 ч.


23


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимой предпосылкой успешного выяснения функций S-слоев у микроорганизмов является идентификация основных поверхностных белков и кодирующих их генов. В данной работе идентификацию и выделение поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z проводили с использованием дансилирования и биотинилирования. Благодаря этим подходам нам удалось определить и наработать в препаративных количествах белки, экспонированные на наружной поверхности клеточной стенки, в числе которых доминируют белки S-слоев. В итоге были обнаружены четыре мажорных, ассоциированных с клеточной поверхностью белка: 27, 59, 67 и 80 кДа.

Нами установлено, что поверхностный 27-кДа белок полностью идентичный белку 'СогА', ранее обнаруженному у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8, кодируется у Mm. alcaliphilum 20Z геном MEALZv4_2831. Методами иммунно-цитобиохимии с использованием антител к очищенному белку впервые продемонстрировано, что 'СогА' локализован в основании чашевидных структур S-слоев и ответственен за связывание S-слоев с наружной мембраной метанотрофа. С помощью полученного инсерционного мутанта доказана необходимость белка 'СогА' для роста клеток на метане, но не на метаноле, что, наряду с экспрессией этого белка при понижении содержания меди в среде, указывает на его важную роль в процессе окисления СН4 с участием медь-зависимой ММО. Проведенный нами Blast анализ выявил уникальность белка 'СогА' для метанотрофов, образующих S-слои, что косвенно подтверждает гипотезу о возможной функции 'СогА' в качестве элемента специфической транспортной системы ионов меди, например, в случае экранирования S-слоями доставки и транспортировки этого катиона посредством других переносчиков (например, сидерофором - метанобактином).

80-кДа белок (ОРС MEALZv4_2832), обладающий перекись-разлагающей активностью, идентифицирован нами как дигемовая цитохром с пероксидаза нового класса. Наибольшую гомологию этот белок проявлял с поверхностным белком 'СогВ' Mm. album BG8(Karlsen et al., 2010). Нами доказана периплазматическая локализация дигемовой цитохром с пероксидазы у Mm. alcaliphilum 20Z. Пространственная близость 'СогА' и 'СогВ' на клеточной поверхности, наряду с коэкспрессией данного тандема белков, подразумевает их совместное участие в гомеостазе ионов меди у Mm. alcaliphilum 20Z. Не исключено, что цитохром с пероксидаза окисляет ключевую аминокислоту белка 'СогА' (триптофан), от модификации которой зависит связывание ионов меди, как в случае гомолога этого белка (МорЕ) из Мс. capsulatus Bath (Karlsen et al., 2011). Данное предположение основано на присутствии в 'СогА' Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8 консервативных аминокислот - аналогов, формирующих сайты связывания меди (гистидин-132, гистидин-203 и триптофан-130) у Мс. capsulatus Bath.

24


Кроме того, постулировано, что в формировании S-слоев Mm. alcaliphilum 20Z участвует 59-кДа белок, доминирующий в спектре поверхностных белков. В геноме Mm. alcaliphilum 20Z идентифицирован ген данного белка, который предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны (outer membrane protein, ОМР) I типа, гомологичный представителям семейства TolC. Белки этого семейства участвуют в адаптации бактерий к различным стрессам и неблагоприятным условиям. В частности, о возможном участии TolC в формировании S-слоев косвенно свидетельствует присутствие соответствующего гомолога у Mm. album BG8 (ZP08486741.1).

Таким образом, определение у метанотрофов первичной аминокислотной последовательности интегральных поверхностных белков, а также белковые компоненты S-слоев, идентификация соответствующих генов и выяснение условий их экспрессии позволит уточнить представление о белковом комплексе наружной клеточной мембраны - сурфацеоме (Karlsen et al., 2011). Дальнейшие исследования белков сурфацеома метанотрофов представляют несомненный интерес для конструирования новых систем гетерологичной экспрессии целевых пептидов, экспонируемых на поверхности рекомбинантных бактерий.

ВЫВОДЫ

  1. Из клеточных оболочек галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z впервые выделены поверхностные белки с молекулярными массами 27, 59, 67 и 80 кДа, определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Установлено, что белок с м.м. 67 кДа является большой субъединицей метанолдегидрогеназы. Поверхностный белок с м.м. 59-кДа предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны I типа.
  2. Иммуноцитохимическими и электронно-микроскопическими методами доказана локализация белка 'СогА' с м.м. 27 кДа в основании чашевидных структур S-слоёв. Показано, что 80-кДа белок локализован в периплазме и идентифицирован как дигемовая цитохром с пероксидаза нового семейства 'СогВ'.
  3. Впервые получен мутант с инактивированным геном 'согА', не способный расти на метане и лишенный S-слоёв при росте на метаноле. Мутация в гене 'согВ', кодирующем цитохром с пероксидазу, сопровождалась повышенной скоростью роста клеток на метане и высокими активностями ферментов Сі- окисления.
  4. Обнаружена котранскрипция генов, кодирующих 'СогА' и 'СогВ', в виде одной бицистронной мРНК в условиях низкого содержания меди в среде культивирования.

25


Список публикаций по теме диссертации Статьи:

  1. Хмеленина В.Н., Щукин В.Н., Решетников А.С., Мустахимов И.П., Сузина Н.Е., Ешинимаев Б.Ц., Троценко Ю.А. Структурно-функциональные особенности метанотрофов гиперсоленых и щелочных водоемов. Микробиология. 2010. Т. 79. № 4. С. 498-508.
  2. Щукин В.Н., Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Первичная характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Микробиология. 2011. Т. 80. №5. С. 595-605.

Тезисы докладов:

1.  Щукин В.Н. Поверхностные белки гало(алкало)фильного метанотрофа

Methylomicrobium alcaliphilum20Z: выделение и характеристика. I

Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-

биологов "Симбиоз Россия 2008". 6-10 июля 2008 г., Казань.

  1. Щукин В.Н., Ешинимаев Б.Ц. Мутант гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектный по синтезу поверхностного перекись-разлагающего белка. V Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН, 26-27 октября 2009г.
  2. Щукин В.Н. Первичная характеристика мутанта по синтезу поверхностного перекись-разлагающего белка у гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. 14 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущине 2010г.
  3. Щукин В.Н. Первичная характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. VII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН, 24-26 октября 2011г.

26

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.