WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

Систематика актиномицетов рода Kribbella

Автореферат кандидатской диссертации

 

На правах рукописи

АВТУХ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

СИСТЕМАТИКА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА KRIBBELLA

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино -2012


Работа выполнена в отделе «Всероссийская коллекция микроорганизмов» Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель:            доктор биологических наук

Евтушенко Людмила Ивановна

Научный консультант:              доктор химических наук

Шашков Александр Степанович ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Официальные оппоненты:        Лысак Людмила Вячеславовна

доктор биологических наук ФГОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Факультет почвоведения, кафедра биологии почв, доцент

Капаруллина Елена Николаевна кандидат биологических наук ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, лаборатория радиоактивных изотопов, научный сотрудник

Ведущая организация:               ФГБУ «Научно-исследовательский институт

по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе» РАМН

Защита состоится «29» июня 2012 г. в 10— часов на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещён на сайтах http://vak.ed.gov.ru/ и http://www.ibpm.ra/.

Автореферат разослан «__ »   мая 2012 г.

oL*^w^__                   Доронина Н.В.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Представители порядка Actinomycetales(Stackebrandt etal. 1997) выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и большими размерами генома (до 12 млн. п.н.), разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки (Goodfellow etal., 1984; Gao & Gupta, 2012). Актиномицеты превосходят другие группы микроорганизмов по способности синтезировать биологические активные соединения (Anderson & Wellington, 2001). Вместе с тем, значительная часть этих уникальных бактерий с высоким биотехнологическим потенциалом остается неизученной или слабо исследованной в таксономическом аспекте.

К одной из таких групп относится род KribbellaPark etal., 1999 emend. Sohn etal. 2003, который в настоящее время включает 17 видов (www.bacterio.cict.fr). Согласно описанию, представители рода образуют фрагментирующийся вегетативный и воздушный мицелий, имеют тип I клеточной стенки (LL-диаминопимелиновая кислота, отсутствие дифференцирующих Сахаров), фосфолипиды типа РШ (фосфати-дилхолин в качестве диагностического компонента) и доминирующи менахинон МК-9(гІ4). Особенностью рода Kribbellaявляется высокое сходство видов по нук-леотидным последовательностям гена 16S рРНК (97,1-99,7/100%) (Kirbi etal, 2010; Cui etal, 2010; Xu etal, 2012). Этот факт и проблема разграничения близких ви-дов/геномовидов криббелл по традиционным фенотипическим признакам (общая для бактериальной систематики) являются одной из причин того, что система классификации организмов этого рода остается разработанной крайне слабо и не отражает их реального природного разнообразия.

Ключевую роль в развитии систематики актиномицетов в «домолекулярный» период сыграло изучение хемотаксономических признаков (структура пептидогли-кана, состав Сахаров клеточной стенки, тип менахинонов, фосфолипидов, жирных кислот) (Goodfellow, 1989). Отличия по этим признакам, наряду с обособленным филогенетическим положением организмов, являются определяющим фактором при обосновании выделения нового рода актиномицетов и в настоящее время (Stackebrandt, 2006). Результаты изучения тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов показали огромное разнообразие этих биополимеров и возможность использования их структур и структурных компонентов для дифференциации видов и групп видов внутри рода (Naumova etal, 2001; Потехина, 2005). Структуры других типов анионных полимеров установлены у представителей отдельных групп и не исследованы в таксономическом аспекте.

Белки и пептиды клетки, регистрируемые методом масс-спектрометрии с мат-рично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ МС) - другая группа биомолекул, которая в последние годы успешно используется при идентификации и классификации бактерий, преимущественно патогенных (Welker & Moore, 2011). Имеющиеся в литературе данные о МАЛДИ масс-спектрах актиномицетов весьма фрагментарны.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось таксономическое изучение актиномицетов рода Kribbella.

В задачи исследования входило: 1. Формирование рабочей коллекции штаммов рода Kribbella.

з


  1. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и gyrBи определение филогенетического положения организмов.
  2. Изучение культурально-морфологических, физиолого-биохимических и хемо-таксономических признаков штаммов рабочей коллекции.
  3. Определение состава гликополимеров клеточных стенок криббелл.
  4. Анализ МАЛДИ масс-спектров представители рода Kribbellaи выявление таксон-специфичных компонентов спектров.
  5. Определение видового состава изученных штаммов на основе принципов полифазной такономии и характеристика новых видов рода Kribbella.

7.  Оценка положения рода Kribbellaв системе высших таксонов бактерий.

Научная новизна. Методами фазово-контрастной и электронной микроскопии

обнаружены ранее неизвестные для рода Kribbellaрепродуктивные формы (споран-гиеподобные структуры, состоящие из полиморфных клеток). В составе Сахаров клеточных стенок криббелл обнаружены мадуроза и рамноза, а также 2,3-ди-О-метил-а-галактоза, найденная у грамположительных бактерий впервые. Впервые у организмов рода Kribbellaопределён состав гликополимеров клеточной стенки. Обнаружены уникальные тейхулозоновые кислоты (с псевдаминовой кислотой в основной цепи), относящиеся к новому классу биогликанов, и новые структуры тейху-роновых кислот. Выявлены специфичные для криббелл фосфолипиды и компоненты МАЛДИ масс-спектров. Выявлено и охарактеризовано 10 новых видов и предложено дополненное описание рода Kribbella. Предложены новые семейства "Kribbella-сеае" и "Actinopolymorphaceae" в составе порядка "Propionibacteriales", а также изменение границ семейства Nocardioidaceae. Для новых и ревизованного семейств определены маркерные (сигнатурные) нуклеотиды гена 16S рРНК; в описания семейств включены фенотипические характеристики.

Практическая значимость. Создана коллекция охарактеризованных штаммов рода Kribbella, выделенных из почв разных регионов России, которые доступны широкому кругу специалистов для дальнейших исследований. Таксономические предложения и полученные данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК и gyrB, компонентах клеточных стенок, МАЛДИ масс-спектров и других фе-нотипических признаках представителей рода Kribbellaспособствуют усовершенствованию системы классификации бактерий, развитию экспресс-методов идентификации криббелл на уровне вида и могут быть полезны при решении ряда практических задач эко- и биотехнологии, а также вопросов, касающихся защиты интеллектуальной собственности на штаммы. Полученные результаты могут быть использованы для аннотации геномов, данных метагеномики и метапротеомики, при исследованиях в области биохимии и химии природных полимеров.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009 и 2010); Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2011).

4


Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 190 ссылок.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе были исследованы 38 штаммов нокардио-формных актиномицетов, выделенных из образцов почв и лиственного опада различных районов РФ и сохраняемых в рабочем фонде Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Штаммы выращивали при 28°С в течение 3-5 суток на пептонно-дрожжевом агаре (ПДА) (г/л): пептон - 5, дрожжевой экстракт - 3, глюкоза - 5, дигидрофосфат калия - 0,2, агар - 15, рН = 7,2, поддерживали на ПДА при 4°С и сохраняли в лиофилизованом виде.

Культуральные и морфологические признаки определяли после инкубирования штаммов на ПДА и ISP-средах (Гаузе с соавт., 1983) в течение 3, 7 и 14 суток. Морфологические характеристики изучали с помощью фазово-контрастной и электронной микроскопии.

Физиолого-биохимические признаки определяли по стандартным методикам (Методы общей бактериологии под ред. Герхардта, 1984; Методы почвенной микробиологии, 1980; Methods in Microbiology, 2011).

Хемотаксономические признаки. Культуры для анализов выращивали на пеп-тонно-дрожжевой среде и собирали на логарифмической фазе роста. Биомассу отмывали и осаждали центрифугированием. Липиды и менахиноны экстрагировали по ранее описанной методике (Collins etal, 1977). Менахиноны разделяли методом ТСХ, анализировали с использованием ВЭЖХ и масс-спектромет-рии. Полярные липиды определяли методом двумерной ТСХ (Minnikin etal, 1979). Состав жирных кислот изучали с помощью газовой хроматографии (Евтушенко и Зеленкова, 1989). Изомеры диаминоаминопимелиновой кислоты в гидролизатах клеток определяли методом ТСХ (Staneck & Roberts, 1974). Клеточную стенку получали методом дифференциального центрифугирования из сырого мицелия, разрушенного ультразвуком (Стрешинская с соавт., 1979). Аминокислотный состав клеточной стенки определяли на аминокислотном анализаторе ("Hitachi", Япония) после гидролиза (6N НС1, 12ч). Состав Сахаров в гидролизатах клеточных стенок анализировали методом бумажной хроматографии (Tul'skaya etal, 1991). Гликополимеры экстрагировали 10% ТХУ, выделяли методом гель-хроматографии и подвергали кислотному гидролизу. Состав полученных компонентов изучали методами препаративного электрофореза и бумажной хроматографии с использованием различных проявителей (Tul'skaya etal, 1991). Структуры гликополимеров определяли с использованием различных методов ЯМР-спектроскопии (Shashkov etal, 2001, 2009).

Для МАЛДИ масс-спектрометрии суспензию клеток в 50%-ном растворе ацето-нитрила, содержащего 2,5% ТФУ, обрабатывали ультразвуком (30 мин, 37°С) с рабочей частотой 35 кГц. В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидрокси-

5


коричную кислоту в 50%-ном водном растворе ацетонитрила. Масс-спектры регистрировали на приборе Autoflex II ("Braker", Германия) как описано (Plotnikova etal, 2011), и обрабатывали с использованием программ Flex analysis 2.2 и MALDI Biotyper 2.0 ("Braker Daltonic", Германия).

Генотипические характеристики и филогенетический анализ. Содержание ГЦ-пар в ДНК определяли методом тепловой денатурации (Marmur & Doty, 1962). ДНК-типирование проводили методом мультиплексного ПЦР с использованием праймеров (5'-ACCGGATACGACAACCGATT-3' и 5'-GGGTCCGTAAGGGTCCTAT-3'), специфичных для родов Kribbellaи Nocardioides(Cook & Meyers, 2003). Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали универсальные бактериальные прайме-ры 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'). Фрагменты гена gyrBамплифицировали с использованием праймеров KgyrB-F953 (5'-CSGTGCACACBTTCGCGAACG-3') и KgyrB-R1892 (5'-CCSAGRCCCTTGWAGCGCTGG-3') (Kirby etal, 2010). Последовательности нуклеотидов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA 5 (Tamura etal, 2011). Уровни сходства нуклео-тидных последовательностей определяли с помощью алгоритмов на сервере Ez-Тахоп (www.eztaxon.org; Chun etal, 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Формирование коллекции

По результатам ДНК-типирования из 38 штаммов были отобраны 15 потенциальных представителей рода Kribbella(табл. 1), которые были охарактеризованы на филогенетическом и фенотипическом уровне.

Таблица 1. Источники выделения изученных штаммов

Номер штамма

Источник выделения

1

ВКМ Ас-2500

Луговая почва, Мордовия

2

ВКМ Ас-2527

Каменистая почва, Северный Кавказ

3

ВКМАс-2538

Техногенная почва, п. Никель, Оренбургская обл.

4

ВКМ Ас-2539

Листва опада, г. Туапсе, Краснодарский край

5

ВКМ Ас-2540

Садовая почва, Мордовия

6

ВКМАс-2541

Погребённая почва, г. Волгоград

7

ВКМ Ас-2566

Почва, окрестность г. Воткинск, Удмуртия

8

ВКМ Ас-2568

Почва, пойма р. Оки, г. Пущино

9

ВКМ Ас-2569

Почва у ручья, п. Кизитажка, Оренбургская обл.

10

ВКМ Ас-2570

Луговая почва, Калужская обл.

11

ВКМАс-2571

Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.

12

ВКМ Ас-2572

Чернозём, Белгородская обл.

13

ВКМ Ас-2573

Луговая почва, Калужская обл.

14

ВКМ Ас-2574

Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.

15

ВКМ Ас-2575

Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.

2. Филогенетический анализ и генотипические признаки

Содержание ГЦ-пар в ДНК изученных штаммов составило 65-67 мол.%, что соответствует содержанию ГЦ-пар у описанных видов рода Kribbella.

Уровни сходства изолятов с типовыми штаммами видов криббелл - от 97,01% (доя ВКМ Ас-2527-^. jejuensis) до 99,70% (для ВКМ Ас-2540-^. hippodromi). Эти значения соответствуют показателям сходства между известными видами рода Krib-

7


bella(97,1-99,7/100%). ВКМ Ac-2527 с уровнем сходства 97,0-98,3% по отношению ко всем включённым в филогенетический анализ организмам занимал обособленное положение при всех алгортимах построения деревьев. Штаммы ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2571 и ВКМ Ас-2574 («группа ВКМ Ас-2566») имели идентичные последовательности. Другие пары наиболее близких изолятов имели 99,92% сходства (ВКМ Ас-2500 и ВКМ Ас-2568) и 99,72% (ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2572).

Филогенетическое положение изученных штаммов на основе анализа фрагмента гена gyrB(390 п.н., позиции 1010-1400) представлено на рис. 2.


0.1


ТС

ВКМ Ас-2500 ВКМ Ас-2568 - ВКМ Ас-2539

\KhbbellacatacumbaeDSM 19601' (FJ917358)

I— KhbbellayunnanensisDSM 15499і (EU434815)

KhbbellasancticallistiDSM 19602і (FJ917357)

KhbbellalupiniDSM 16683і (EU434811)

------------ KhbbellaalbaDSM 15500 і (EU434820)


 


w

Khbbella koreensis CIP 108301' (EU434810)

Khbbella ginsengisoli DSM 17941' (JF775846) I—Khbbella flavida CIP 107494і (gEU434809) Khbbella amoyensis XMU 1981 (JF520392)

ВКМ Ac-2538


 


!5~|__

89

4

99ІЕ

>*5 I BK M Ac-2572 , ВКМ Ac-2569 ВКМ Ac-2566 ВКМ Ac-2574

---- Khbbella swartbergensis DSM 173451 (EU434808)

г- BKM Ac-2540

Khbbella sandramycini DSM 156261 (EU434812)


t


BKM Ac-2573

-Khbbella jejuensis CIP 1085091 (EU434818)


r Khbbella hippodromi DSM 19227 і (EU434817)

рз j- Khbbella solani CIP 1085081 (EU434813)

89

el*

Khbbella antibiotica DSM 15501' (EU434819)

I BKM Ac-2570

lKhbbella aluminosa DSM 188241 (EU434807)

Khbbella karoonensis DSM 173441 (EU434816)

______________ Streptomyces avermitilis MA-46801 (BA000030)


Рис. 2. Филогенетическое положение штаммов рода Kribbellaна основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента (390 п.н.) гена gyrB] группировка по методу «ближнего соседа» ("neighbor-joining"). Масштаб - десять замен на каждые 100 нуклеотидов. Указаны значения статистической достоверности порядка ветвления для 1000 альтернативных деревьев (выше 50%).

Показатели эволюционных расстояний между изученными штаммами и описанными видами рода Kribbella, равные 0,031-0,121 (87,6-96,1% сходства фрагментов гена gyrB), выше минимальных значений между близкими описанными видами:


0,008 (К. ginsengisoli-K. koreensis), 0,013 (К. solani-K. antibiotica) и 0,015 (К. solani-K. hippodromi). Значения расстояний между более удаленными известными видами -от 0,028 до 0,128. Минимальные показатели эволюционных расстояний между изученными штаммами, равные 0,008 и 0,018 (99,4 и 98,1% сходства фрагментов гена gyrB), выявлены для пар штаммов ВКМ Ас-2566-ВКМ Ас-2574 (100% сходства по гену 16S рРНК) и ВКМ Ас-2500-ВКМ Ас-2568 (99,9% сходства по гену 16S рРНК). Показатели расстояний между ВКМ Ас-2569 и штаммами ВКМ Ас-2566 и ВКМ Ас-2574 - 0,038 и 0,036.

3. Культурально-морфологические признаки

На всех ISP-средах цвет колоний изученных штаммов бесцветный или слегка желтоватый, растворимые пигменты отсутствовали. Колонии на ранних стадиях роста плотные или пастообразные, складчатые, иногда гладкие, матовые, обычно вросшие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на ряде сред в течение 5-7 суток. Тонкие разветвлённые вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы (рис. За). Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов криббелл.



Рис. 3. Морфология клеток штамма ВКМ Ас-2538. Световая (а, б) и электронная (в) микроскопия.

У ряда штаммов при росте на жидкой и агаризованных средах наблюдались клетки сферической и угловатой формы (рис. За). Штаммы ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541 формировали спорангиеподобные структуры (рис. 36, Зв), достигавшие 4 мкм в диаметре в свежевыделенных культурах. Электронно-микроскопическое изучение срезов этих структур выявило наличие плотных конгломератов полиморфных клеток, делящихся септами в продольном и поперечном направлениях (рис. Зв). При помещении в жидкую среду клетки прорастали, образуя гифы. Подобная морфология и способы репродукции свойственны ряду актиномицетов {Geodermatophilus, Modestobacterи др.), но не были ранее описаны для представителей рода Kribbella.

4. Физиолого-биохимические признаки

Все штаммы росли в аэробных условиях при 28°С и концентрации NaCl ниже 4%, не росли при 7% NaCl, а также при температурах 6 и 50°С. Почти все штаммы были способны расти при рН 5-11 и не росли при рН 4. Все или большинство штаммов использовали в качестве единственного источника углерода различные моно- и

9


дисахариды, несколько слабее был рост на полиолах. Не росли на метаноле в качестве источника углерода. Несколько штаммов росли на среде без добавления источников углерода, а также в микроаэрофильных условиях на среде с глюкозой. Все штаммы были каталазоположительные, разжижали желатин (табл. 4, стр. 16).

5. Хемотаксономические признаки

Все штаммы содержали в клеточной стенке LL-диаминопимелиновую кислоту и глицин (тип пептидогликан АЗу; Shleifer & Kandler, 1972), а также маннозу и галактозу в разных количествах. У одиннадцати штаммов обнаружена глюкоза, у ВКМ Ас-2527 - рамноза. Шесть штаммов содержали мадурозу и редкий сахар 2,3-ди-О-метилгалактозу, ранее найденный в составе липополисахарида фотосинтези-рующих бактерий (Weckesser etah, 1979). Доминирующий менахинон у всех штаммов - МК-9(Н4). В составе фосфолипидов обнаружены фосфатидилхолин, фосфати-дилинозит, фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин (тип фосфолипидов РШ), а также неидентифицированный полярный липид L1 и 2-5 минорных компонентов (гликолипиды, фосфолипиды и липиды) (рис. 4).

Ас -256 6

ші

Ас -256 9

1

Ac-2500

.yjipn.i «',.

L1   •

PL1

L*

"$***   PL.

DPG    g»

W         G1

DPG ¦¦*• PL1

•»      .04*o,

G4    р, у PG фPL2

• G1 PG0   PL2

PG#

РС |><;::

РС#               1 G2 * L2

PC#   G3

»    ^ L2

"

PI   |ф

« *

i

1

.

At2S27

¦ЩКЯШ

Ас-2538

f

Ac-257 2

И

L1 „

*       * PL1 DPG                      G1

DP

с A**PL1

U1

кф

L3  |      § G1

PG#

PG  •        PL2

PC fe               * G2 ^^ L2

PI ^

PC Д. ^ G3

PC }       G3 ^   L2

«

*''*

-

Рис. 4. Состав полярных липидов представителей изученных штаммов рода Kribbella.

Состав жирных кислоты изученных штаммов характерен для рода Kribbella. Преобладали anteiso-\5:0 (19,1-40,4%) и iso-\6.0 (11,0-35,2%) кислоты. У всех изученных штаммов также обнаружены кислоты, которые ранее отмечались у большинства [/5*0-15:0 (3,6-14,5%)] или отдельных видов рода [anteiso-\7:0 (5,5-17,1%), «о-17:0 (3,6-13,2%), «о-17:1 (4,0-12,2%), iso-U:0 (0,9-8,8%), 16:0 (0,7-3,0%) и 16:1ю7с« (0,2-3,0%)]. У штаммов ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541 обнаружены в минорных количествах 2-ОН-«о-17:0 и 11Ме-18:1 кислоты, у ВКМ Ас-

10


2570 - 10Ме-17:0. По процентному содержанию доминирующих типов жирных кислот и их гомологов среди изученных штаммов выделялись штаммы ВКМ Ас-2527 и ВКМ Ас-2538, у которых преобладали изо-разветвленные кислоты iso-\4:0, iso-\6.0 и «0-18:0 (в сумме), и восемь штаммов (ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2568, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2572, ВКМ Ас-2573, ВКМ Ас-2574 и ВКМ Ас-2575), у которых доминировали антеизо-разветвленные кислоты anteiso-\5:0 и anteiso-\7:0.

6. Гликополимеры клеточных стенок

Наряду с пептидогликаном, клеточные стенки всех изученных штаммов содержали нейтральный гликополимер (разветвлённый маннан), а также по два или три разных по структуре анионных полимера (табл. 2), в числе которых тейхоевая кислота (ТК), две тейхуроновые (ТУК-1 и ТУК-2) и три тейхулозоновые кислоты (ТУЛК-1, ТУЛК-2 и ТУЛК-3).

Таблица 2. Гликополимеры клеточных стенок изученных штаммов

Штаммы

Нейтральный полимер

Анионные полимеры

ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2570, ВКМ Ас-2571, ВКМ Ас-2573

ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2574

ВКМ Ас-2539

ВКМАс-2541

ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2568 и ВКМ Ас-2575

ВКМ Ас-2527

ВКМ Ас-2572

Маннан Маннан Маннан Маннан Маннан Маннан Маннан

ТК, ТУК-1

ТУК-1

ТУК-2

ТУЛК-1

ТУЛК-2

ТУЛК-3

ТУК-2, ТУЛК-2

Полимерная цепь маннана (более 20 повторяющихся звеньев) образована а-1,6-связанными остатками маннопиранозы, замещённых в положении 2 терминальными остатками а-маннопиранозы. Полимер такой структуры найден у прокариот впервые. Наличие разветвлённого маннана в клеточных стенках всех изученных штаммов и маннозы у большинства известных видов криббелл (отсутствует у К. gin-gengisoli, К. hippodromiи К. lupini), позволяют полагать, что этот полимер может являться хемотаксономическим маркером рода Kribbella.

Тейхоевая кислота - 1,3-поли(глицерофосфат), частично замещённый Р-глюко-зой, найдена в препаратах клеточных стенок четырёх изученных штаммов. Подобный полимер ранее обнаружен в клеточных стенках ряда актиномицетов и других групп грамм-положительных бактерий.

Тейхуроновые кислоты найдены у десяти изученных штаммов и представлены двумя структурами, неизвестными ранее:

^4)-P-D-Man/?2,3NAcA-(1^6)-a-D-Glcp2,3NAc-(l^             (ТУК-1)

^4)-P-D-Man^NAcA-(1^6)-a-D-Glcp2,3NAc,40Ac-(l^    (ТУК-2)

В основной цепи тейхулозоновых кислот, обнаруженных у шести штаммов, присутствуют остатки сиалоподобного кислого моносахарида - 5,7-диацил-амидо-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глиг/е/?о-Р-Ь-АШнно-нонулозоновой кислоты (Р-псевдамино-вой кислоты, (З-Pse), ацилированные по N7 остатками 4-гидрокси-бутирата (Ви), которые гликозилированы по 04 остатком Pse или другим моносахаридом, входящим наряду с Pse в основную цепь полимера. Гидроксильная группа при С4 Pse обычно замещена остатками моносахаридов: 3-О-метил-а-галактозы (a-Gal/?30Me), 2,3-ди-

п


О-метил-а-галактозы (a-Gal/?2,3 ОМе) или L-рамнозы (P-L-Rha/?). Длина цепей полимеров примерно 30-40 сахарных остатков в цепи с (З-Pse и Р-галактозой. Повторяющееся звено ТУЛК-1:

ТУЛК-3  отличается от ТУЛК-2  наличием  остатков  P-L-Rha/? (наряду  с Gal/?30Me и a-Gal/?2,30Me) в положении 4 остатков Pse.

Новый класс гликополимеров с альдулозоновыми кислотами в основной цепи, названный «тейхулозоновыми кислотами» (Knirel, 2009), был открыт сравнительно недавно (Shaskov etal, 2000). Тейхулозоновые кислоты обнаружены пока только в клеточных стенках ряда актиномицетов (Shaskov etal, 2000; 2002; Тульская с соавт., 2007а, 2011). Во всех описанных ранее случаях эти полимеры содержали 3-дезокси-В-глиг/е/?о-О-г<2ш/<7720-нон-2-улозоновую кислоту (Kdn). Тейхулозоновые кислоты с псевдаминовой кислотой найдены впервые. Производные псевдаминовой кислоты обнаружены ранее в составе липополисахаридов грамотрицательных бактерий (Knirel etal, 2003; Schoenhofen etal, 2006; Vimr etal, 2004).

7. МАЛДИ масс-спектры

Анализ МАЛДИ масс-спектров 15 изученных штаммов показал, что спектры имели до 40 пиков и значительно различались по числу и составу компонентов. Дендрограмма, отражающая сходство штаммов по МАЛДИ масс-спектрам, представлена на рис. 5.

Штаммы ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2569 и ВКМ Ас-2574 с идентичными нуклео-тидными последовательностями гена 16S рРНК имели 23 одинаковых компонента масс-спектра и формировали общий кластер, в то время как штамм ВКМ Ас-2571 значительно отличался от них по составу спектра (всего пять общих пиков с этой группой) и занимал обособленное положение на дендрограмме (рис. 5, 6).

12

Масс-спектры штаммов ВКМ Ас-2500 и ВКМ Ас-2568 (99,9% сходства по нук-леотидным последовательностям гена 16S рРНК, содержали 13 общих компонентов. Спектры штаммов ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541, кластерирующихся вместе, имели десять общих пиков. Спектры остальных штаммов содержали от пяти до десяти общих пиков. У всех изученных штаммов выявлены четыре общих пика (m/z= 4372, 5200, 5543, 5577 Да) разной интенсивности, которые могут являться хе-мотаксономическими маркерами рода Kribbella.

8. Видовой состав изученных штаммов

Из полученных результатов следует, что изученные штаммы и описанные виды рода Kribbellaимеют более 97% сходства генов 16S рРНК (1400 п.н.). Для отнесения штаммов к новому виду при таких уровнях сходства требуется в общем случае ДНК-ДНК гибридизация (Stackebrandt etal, 2002; Tindal etal, 2010). Однако для видов рода Kribbellaбыло показано, что уровень сходства ДНК хорошо согласуется с показателями эволюционного расстояния, определённого по фрагментам гена gyrBдлиной 1108 и 390 п.н. (позиции 292-1400 и 1010-1400) (Kirbi etal, 2010; Cui etal. 2010; Xu etal, 2012). При этом значения эволюционных расстояний для большинства видов, вычисленных по фрагменту 390 п.н., равны или выше 0,028 даже при уровнях сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК более 99%. Для трёх пар видов эти показатели ещё ниже (0,008; 0,013; 0,015) (рис. 7а).

Минимальные показатели эволюционных расстояний {gyrB) между изученными штаммами и описанными видами рода Kribbellaпри любых значениях сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК не ниже 0,031 (рис. 76). Вышеизложенные данные, а также значительные отличия от известных видов по феноти-пическим признакам, в том числе, по составу Сахаров и гликополимеров клеточных стенок, свидетельствуют о том, что все изученные штаммы, для которых определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена gyrB, относятся к нескольким новым видам рода Kribbella.

Представителями шести новых видов являются штаммы ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2570 и ВКМ Ас-2572, эволюционные расстояния между которыми находятся в интервале от 0,044 до 0,097 (табл. 3). Эти штаммы отличаются также на фетотипическом уровне (табл. 4).

Новый вид представляет собой и штамм ВКМ Ас-2538, близкий к ВКМ Ас-2572 по нуклеотидным последовательностям фрагментов генов 16S рРНК (99,7%) и gyrB(эволюционное расстояние 0,026), но отличающийся от него по морфологии (образует спорангиеподобные структуры), хемотаксономическим признакам (наличию тейхуроновой кислоты, МАЛДИ масс-спектру, составу жирных кислот и полярных липидов) и ряду физиолого-биохимических характеристик (табл. 4).

К новым видам безусловно относятся штаммы ВКМ Ас-2527 и ВКМ Ас-2541, для которых отсутствуют данные по гену gyrB. Штамм ВКМ Ас-2527 наиболее удален от других представителей рода по данным анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (97,0-98,3% сходства; рис. 1) и выделяется наличием в клеточной стенке ТУЛК-3 (гетерополимер с нерегулярной структурой и рамнозой при С4 Pse). От большинства изученных изолятов он отличается минорным количеством маннана, составом жирных кислот (доминируют изо-разветвленные насыщенные wo-14:0 и wo-16:0 - 40%) и рядом других признаков (табл. 4).

Штамм ВКМ Ас-2541, наиболее близкий по гену 16S рРНК к ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2572 и К. sandramycini(99,4, 99,3 и 98,9% сходства), отличается от них и других штаммов криббелл наличием в клеточной стенке мадурозы, 2,3-ди-О-метил-а-гала-ктозы и ТУЛК-1 (с регулярной структурой); от большинства других изученных организмов - морфологией, относительно бедным спектром полярных липидов, способностью расти на среде без источника углерода и при 42°С.

Штамм ВКМ Ас-2575, представитель ещё одного нового вида, наиболее близок к К. albaи К. koreensisпо нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (99,4% и 99,2% сходства). Отличается от них и других описанных видов рода присутствием в клеточной стенке мадурозы и 2,3-ди-О-метил-а-галактозы и, следовательно, иной структурой или типом гликополимеров. От других близких организмов (К. catacum-bae, ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2500; 99,0-99,1% сходства 16S рРНК) отличается медленным ростом, составом анионных полимеров и липидов, МАЛДИ масс-спектром и физиолого-биохимическими характеристиками.

Помимо перечисленных, к новым видам (подвидам) могут быть отнесены и некоторые другие исследованные нами штаммы, в частности, ВКМ Ас-2573 и представители «группы ВКМ Ас-2566», отличные от других организмов по генам gyrB, МАЛДИ масс-спектрам и фенотипическим признакам.

9. Дополнение описания рода Kribbella

На основании полученных данных предложено дополненное описание рода KribbellaPark etal. 1999 emend. Sohn etal. 2003, включающее новые признаки рода.

Ряд организмов образует спорангиеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, формирующихся пуём деления септами в продольном и поперечном направлениях. В составе Сахаров клеточных стенок ряда видов присутствуют мадуроза, 2,3-ди-О-метил-а-галактоза и L-рамноза. Клеточные стенки содержат нейтральный гликополимер (разветвлённый маннан). Анионные полимеры различных видов представлены тейхулозоновыми кислотами (с Р-псевдаминовой кислотой в основной цепи) или тейхуроновыми кислотами (с производными Р-маннопиранозидов уроновых кислот) и 1,3-поли(глице-рофосфат)ом. Виды рода содержат дополнительно от двух до пяти минорных полярных липидов (гликолипиды, фосфолипиды и неидентифицированные соединения). МАЛДИ масс-спектры включают четыре компонента (m/z= 4372, 5200, 5543, 5577 Да) разной интенсивности, характерные для большинства видов рода.

10. Ревизия семейства Nocardioidaceae

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК организмов порядка "Propionibacteriales" (Ludwig et al., 2011), включающего род Kribbella, показал, что представители семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al., 1985, 1990 emend. Rainey et al., 1997 emend. Zhi et al., 2009 образуют три кластера, которые находятся примерно на равном филогенетическом расстоянии друг от друга и от кластера семейства Propionibacteriaceae (рис. 8). Каждый кластер имеет уникальный набор сигнатурных нуклеотидов гена 16S рРНК (табл. 5). Представители кластеров, для которых секвенированы полные геномы (Nocardioides sp. JS614 и Kribbella flavida DSM 17836), отличаются также по их размеру (4,99 и 7,58 Mb) и числу генов,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По приблизительным оценкам, число видов прокариотных микроорганизмов, обитающих на Земле, составляет около 10-10 . Принято считать, что организмы пока неописанных видов составляют значительную часть «некультивируемых» в лабораторных условиях, а также являются компонентами слабо изученных (экстремальных) экосистем и микробных сообществ, ассоциированных с высшими организмами. Результаты проведённых исследований продемонстрировали, что множество новых видов можно обнаружить и среди известных групп относительно легко культивируемых почвенных актиномицетов, имеющих высокий уровень сходства генов 16S рРНК (более 99%) с описанными видами. Метод МАЛДИ масс-спектро-метрии позволяет выявить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов.

На примере изучения филогенетически близких актиномицетов рода Kribbellaпоказано, что такие организмы могут обладать уникальными свойствами, неизвестными ранее как для генетически близких описанных видов, так и прокариот в целом. При этом виды, обнаруженные в одном почвенном образце, зачастую различались между собой значительно больше, чем организмы, выделенные из почв географически удалённых районов.

В работе получены новые данные о морфологических структурах, физиолого-биохимических свойствах и составе компонентов клетки и клеточной стенки (моно-сахаров, гликополимеров, фосфолипидов) актинобактерий рода Kribbella. В клеточных оболочках представителей новых видов обнаружены биополимеры с ранее неизвестными структурами - тейхолузоновые кислоты с псевдаминовой кислотой в основной цепи и тейхуроновые кислоты с производными маннопиранозидов уроно-вой кислоты и редким диаминосахаром. Клеточные стенки всех изученных штаммов содержали маннозу и нейтральный полимер - маннан необычной структуры, обнаруженный у прокариот впервые. На основании полученных в данной работе данных предложена усовершенствованная структура высших таксонов, включающих род Kribbella, а также фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.

Результаты изучения бактерий рода Kribbella, часто ассоциированных с растениями, могут быть полезны для выявления элементов естественной системы, понимания закономерностей функционирования и эволюции популяций, сообществ микроорганизмов и экосистем, для аннотации геномов и данных метагеномики и мета-протеомики, а также при исследовании разнообразия природных биополимеров.

ВЫВОДЫ

1. Проведено таксономическое исследование 15 филогенетически близких штаммов рода KribbellaPark etal. 1999 emend. Sohn etal. 2003, выделенных из почв различных регионов России. На основании анализа гено- и фенотипических характеристик установлено, что изученные штаммы представляют собой не менее 10 новых видов. Эволюционные расстояния между изученными организмами и типовыми штаммами описанных видов (0,031-0,121), определённые по фрагменту гена gyrB, выше минимальных показателей расстояний между известными видами.

20


  1. Впервые у нокардиоформных актиномицетов рода Kribbellaобнаружены споран-гиеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, образующихся путем деления септами в продольном и поперечном направлениях.
  2. В составе Сахаров клеточных стенок криббелл впервые найдены мадуроза, L-рам-ноза и редкий сахар 2,3-ди-О-метил-а-галактоза; выявлены значимые отличия видов по составу жирных кислот и полярных липидов.
  3. У всех изученных штаммов рода Kribbella(впервые у прокариот) обнаружен нейтральный гликополимер, состоящий из а-1,6-связанных остатков маннопиранозы с а-маннопиранозой в терминальном положении. Анионные гликополимеры представлены ранее неизвестными тейхулозоновыми кислотами, в состав которых входит сиалоподобный кислый моносахарид - псевдаминовая кислота, и тейхуроновы-ми кислотами, содержащими производные маннопиранозидов уроновои кислоты и диаминоглюкозы. У ряда штаммов найден 1,3-поли(глицерофосфат), замещённый глюкозой.
  4. Показано, что метод МАЛДИ масс-спектрометрии позволяет обнаружить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов рода Kribbella. Анализ МАЛДИ масс-спектров выявил наличие общих для всех штаммов компонентов {mlz= 4372, 5200, 5543 и 5577 Да), которые являются хемо-таксономическими маркерами рода.

6.   На основании полученных данных предложено дополненное описание рода

Kribbella. Предложны два новых семейства в составе порядка "Propionibacteriales" -

"Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae", ревизован состав семейства Nocardioida-

сеае. Определены наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16S рРНК и предложены

фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность коллегам за помощь и консультации при выполнении работы на различных её этапах и соавторам публикаций: к.б.н. Л.М. Барышниковой, к.б.н. Е.В. Арискиной, к.б.н. Б.П. Баскунову, Н.Г. Винокуровой, к.б.н. Л.В. Дорофеевой, к.х.н. Н.Ф. Зеленковой, к.б.н. А.Е. Китовой, В.Я. Лы-санской, Н.В. Присяжной, к.б.н. Н.Е. Сузиной (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН); д.б.н. Е.М. Тульской и к.б.н. Г.М. Стре-шинской (Биологический факультет МГУ); к.х.н. С.Н. Сенченковой (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН).

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственные контракты № 16.518.11.7035 и№ 16.552.11.7050).

21


СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

  1. Shashkov A.S., Tul'skaya Е.М., Streshinskaya G.M., Senchenkova S.N., Avtukh A.N., Evtushenko L.I. New cell wall glycopolymers of the representatives of the genus Kribbella II Carb. Res. 2009. V. 344. № 8. P. 2255-2262.
  2. Tul'skaya E.M., Streshinskaya G.M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Avtukh A.N., Baryshnikova L.M., Evtushenko L.I. Novel teichulosonic acid from cell walls of some representatives of the genus Kribbella II Carb. Res. 2011. V. 346. № 12. P. 2045-2051.
  3. Автух A.H., Винокурова Н.Г., Арискина E.B., Дорофеева Л.В., Барышникова Л.М. Состав полярных липидов как хемотаксономический маркер видов рода KribbellaIIВестник Уральской медицинской академической науки. 2011. № 4/1. С. 71.

Тезисы докладов и сообщений

    • Автух А.Н., Присяжная Н.В., Василюк Н.В., Шашков А.С., Винокурова Н.Г., Ха-саева Ф.М., Барышникова Л.М. Видовое разнообразие актиномицетов рода KribbellaIIСборник тезисов Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, октябрь, 2009. С. 3.
    • Автух А.Н., Барышникова Л.М., Тульская Е.М., Шашков А.С., Евтушенко Л.И. Физиолого-биохимические и хемотаксономические характеристики актиномицетов рода KribbellaIIМатериалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва, декабрь, 2009.
    • Автух А.Н., Присяжная Н.В., Малошицкая О.А., Барышникова Л.М., Евтушенко Л.И. Характеристика актинобактерий рода Kribbellaс использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии // Сборник тезисов 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, апрель, 2010. Т. 2. С. 209.
    • Автух А.Н., Винокурова Н.Г., Зеленкова Н.Ф., Арискина Е.В., Тульская Е.М., Шашков А.С., Барышникова Л.М. Филогенетические и хемотаксономические характеристики новых актиномицетов рода KribbellaIIСборник тезисов Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, октябрь, 2010. С. 3.
    • Автух А.Н., Барышникова Л.М., Евтушенко Л.И. Факультативные автотрофы -представители новых актиномицетов рода KribbellaIIМатериалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы». Памяти академика РАН Е.Н. Кондратьевой. Москва, декабрь, 2010.
    • Тульская Е.М., Стрешинская Г.М., Шашков А.С., Сенченкова С.Н., Автух А.Н., Присяжная Н.В., Арискина Е.В., Барышникова Л.М. Гликополимеры клеточных стенок как хемотаксономические маркеры актиномицетов рода KribbellaIIСборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Химия и биохимия углеводов». Саратов, сентябрь, 2011.
     
    Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.