WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

Детоксикация тяжелых металлов (кадмия) на примере Приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis

Автореферат кандидатской диссертации

 

На правах рукописи

Жуковская Авианна Фаязовна

 

 

детоксикация тяжелых металлов (кадмия) на примере приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis

 

03.02.08 – Экология

 

 

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

 

 

 

 

Владивосток - 2012


Работа выполнена в лаборатории морской экотоксикологии в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения Российской академии наук

 

Научный руководитель

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Челомин Виктор Павлович

Официальные оппоненты:

Санина Нина Михайловна

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры биохимии, микробиологии и биотехнологии

Школы естественных наук

ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет» (ДВФУ)

 

Подгурская Ольга Владимировна

кандидат биологических наук,

научный сотрудник лаборатории Физиологии.

ФГБУН Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского (ИБМ ДВО РАН)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина Российской академии наук

Защита состоится «15» июня 2012 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.056.02 при ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет» по адресу: 690091, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27, ауд. 435

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 690091, г. Владивосток,

ул. Октябрьская, 27, каб. 417, кафедра экологии ШЕН ДВФУ.

Факс (423) 245-94-09        E-mail: marineecology@rambler.ru, res-water@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет»

Автореферат разослан «15» мая 2012г

podpis

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук                                                                          Ю.А. Галышева


общая характеристика работы

Актуальность работы. Антропогенное воздействие на водоемы сопровождается поступлением в водную среду токсикантов различного происхождения и разного химического состава. Среди них токсины, образующиеся в результате жизнедеятельности организмов, таких как, например, сине-зеленые водоросли; пестициды, поверхностно-активные вещества и многие другие, в том числе и тяжелые металлы (ТМ. При изучении их влияния на организм морских беспозвоночных весьма существенным является вопрос о том, какие звенья системы метаболизма в организме гидробионтов обуславливают их резистентность в условиях интоксикации.

Среди морских беспозвоночных приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis способен извлекать и концентрировать в мягких тканях кадмий, без какого-либо видимого патологического эффекта, даже из чистых вод, в которых концентрации этого ТМ не превышают допустимого фона. Это уникальное свойство приморского гребешка свидетельствует о том, что двустворчатый моллюск M. yessoensis имеет хорошо развитые механизмы адаптации к высоким концентрациям кадмия в окружающей среде.

Существует общее мнение, что у организмов различного уровня организации в процессе эволюции сформировался механизм детоксикации ТМ, в основе которого лежит связывание и изоляция токсичных ионов металлов, препятствующее их взаимодействию с чувствительными биоструктурами клетки (Shelton et al., 1986; Fowler, 1992; Metian et al., 2008). При этом, основную роль в этом механизме осуществляют специальные белки (стресс-белки) – металлотионеины (МТ), которые были найдены во всех организмах, как в беспозвоночных, так и в позвоночных, включая млекопитающих (Klaverkamp, Duncan, 1987; Saito, 1995; Hansen et al., 1997; Vergani et al., 2005). Однако на сегодняшний деньмало известно о механизмах устойчивости приморского гребешка M. yessoensis к кадмию, опосредованных кадмий-связыващими белками.

Цель работы: исследовать основные биохимические механизмы адаптации приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию.

Задачи исследования:

1. Исследовать внутриклеточное распределение кадмия и идентифицировать Сd-связывающие белки в пищеварительной железе приморского гребешка M. yessoensis и некоторых видов двустворчатых моллюсков (Mytilustrossulus, Peronidiavenulosa, Mercenariastimpsoni).

2. Выявить влияние аккумуляции кадмия на изменение концентрации Cd-связывающих белков в клетках пищеварительной железы приморского гребешка Myessoensis и сравнить с другими представителями двустворчатых моллюсков (Mtrossulus, P. venulosa, M. stimpsoni).

3. Идентифицировать и охарактеризовать биохимические механизмы адаптации приморского гребешка M. yessoensis к кадмию.

4. Выявить особенности в механизмах адаптации к кадмию у годовалых и двухгодовалых особей приморского гребешка M. yessoensis.

Научная новизна работы: Впервые показано, что приморский гребешок M. yessoensis обладает уникальным механизмом адаптации к кадмию представленным двумя высокомолекулярными белками 72 и 43 кДа. Белок 72 кДа является гликопротеином. Впервые охарактеризованы биохимические механизмы адаптации неполовозрелых особей приморского гребешка к высоким концентрациям кадмия в окружающей среде. Впервые показана способность кадмий-связывающих белков приморского гребешка поглощать свободные радикалы.

Практическая значимость. Результаты исследования применимы для комплексного биологического мониторинга акваторий, т. е. оценки состояния биоты как результата антропогенного вмешательства. Результаты работы могут быть использованы профессорско-преподавательским составом ВУЗов РФ в специализированных лекционных циклах, рассматривающих вопросы биохимической адаптации и биохимической токсикологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. У приморского гребешка обнаружена высокоэффективная биохимическая система детоксикации тяжелых металлов, которая представлена комплексом кадмий-связывающих белков (72 и 43 кДа), центральное место среди которых принадлежит гликопротеину 72 кДа. Основной кадмий-связывающий белок 72 кДа является уникальным, не встречающимся в других представителях беспозвоночных. По характеристикам его можно отнести к МТ – подобным белкам.

2. На примере ранних возрастных групп показано, что неполовозрелые особи Myessoensis обладают хорошо развитой системой адаптации к тяжелым металлам (кадмию). Адаптация неполовозрелых особей приморского гребешка достигается за счет связывания металлов с белком не только 72 кДа и с белком 43 кДа, но и с белком с молекулярной массой 120 кДа, который характерен только для данной возрастной группы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток 2004г); 15-ом международном симпозиуме «Экология 2006» (Болгария 2006 г.); молодежных конференциях ТОИ ДВО РАН (Владивосток, 2008, 2009 гг.); IX и X Дальневосточных школах по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, 2005, 2006 гг.); 2-ой научной конференции стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водный организмов» (Республика Карелия, 2007 г.); международных научных конференциях «Физиомар 08» (Франция, Брест 2008г.), и на международной конференции «17th International Pectinid Workshop» (Испания, 2009 г), на семинарах лаборатории Морской экотоксикологии ТОИ ДВО РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 22 работы, в том числе 6 статей, две из них в ведущих рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах, состоит из введения, 5 глав и выводов, содержит 29 рисунков, 4 таблицы и список литературы, включающий 133 наименования, из которых 116 на иностранном языке.

Личный вклад. Автор лично принимал участие в лабораторных и полевых работах, где занимался отбором проб. Также автором была выполнена основная часть подготовки проб для биохимического анализа. Результаты, изложенные в диссертации, получены лично автором, либо на равных правах с соавторами. Все расчеты и интерпретация данных выполнены лично автором.

Благодарности. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю, д.б.н. В.П. Челомину за всестороннюю помощь в процессе работы над рукописью, искреннюю признательность всему коллективу лаборатории морской экотоксикологии, отдельная благодарность к.б.н. Н.Н. Бельчевой за неоценимый вклад в развитие и помощь в постановке методик. Отдельные слова благодарности автор приносит сотрудникам ИБМ ДВО РАН: сотруднику лаборатории физиологии, к.б.н. В.Я. Кавуну за сбор материала и помощь в сборе материала, сотруднику лаборатории фармакологии к.б.н. В.В. Кумейко за консультации и методическую помощь, также сотруднице  лаборатории сравнительной цитологии И.Ю. Петровой за неоценимую помощь в подготовке проб.

содержание работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен обзор токсикологических и биохимических аспектов аккумуляции кадмия. Дана краткая характеристика роли металлсвязывающих лигандов в механизме защиты организма против токсичности кадмия. Подробно освещены современные данные и обобщены полученные на сегодняшний день знания о МТ. Рассмотрены вопросы, касающиеся биохимии МТ, их классификация, эволюционные и функциональные аспекты.Особое внимание уделено экологическому состоянию Залива Петра Великого с точки зрения антропогенного загрязнения.

ГЛАВА 2 . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования послужил широко распространенный в зал. Петра Великого представитель класса двустворчатые моллюски (Bivalvia) вид - приморский гребешок Mizuhopectenyessoensis. Также в работе использованы широко распространенные в зал. Петра Великого массовые виды двустворчатых моллюсков (Mytilustrossulus, Peronidiavenulosa, Mercenariastimpsoni). Объекты исследований собраны водолазным способом как из экологически чистых акваторий, так и из мест испытывающих интенсивную антропогенную нагрузку.

Для проведения экспериментов по изучению видовых особенностей в адаптации к кадмию и исследования разнообразия Cd-связывающих белков в видах двустворчатых моллюсков животные были собраны в заливе Петра Великого из экологически чистых мест.

Для идентификации основного кадмий-связывающего компонента пищеварительной железы приморского гребешка особи данного вида были отобраны из акваторий с разной степенью загрязнения и, как следствие, разной степени нагрузки кадмием: из загрязненной акватории Амурского залива (Японское море) г. Владивостока вблизи нефтебазы (район первая речка), и из экологически чистой акватории залива Посьета Японского моря.

Для экспериментов по изучению возрастных особенностей системы адаптации к кадмию у приморского гребешка годовалые и двухгодовалые особи M. yessoensisбыли отобраны из экологически чистой акватории бухты Северная (Славянский Залив). Перед каждой серией опытов моллюски адаптировались в проточных аэрируемых аквариумах в течение 5-7 дней. После адаптации моллюски подвергались обработке CdCl2 (100-300 мкг/л) в течение недели с ежедневной сменой воды. Из всех экспериментальных групп отбирали по 5 особей моллюсков.

Для биохимических анализов была использована пищеварительная железа. Выделение и очистка кадмий-связывающего белка проводили согласно методике разработанной и хорошо зарекомендовавшей себя для выделения МТ и МТ-подобных белков из морских беспозвоночных (Roesijadi et. al., 1989; Tompson and Sutherland, 1992). Cd-связывающие белки, после очистки методом высокоскоростной проточной жидкостной хроматографии (FPLC-fast protein liquid chromatography) на колонке Superosa 12, подвергали ионно-обменной хроматографии (Mono Q 10/10) и денатурирующему электрофоретическому разделению по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, 1970) в SDS-полиакриламидном геле. Для определения концентрации белка использовали метод Лоури (Lowry et al., 1951). Для определения содержания GSH использовали модифицированный метод Элмана (Moron et al., 1979). Для определения качественного состава углеводов использовали метод газожидкостной хроматографии. Количественное содержание углеводов определяли фенол-серным методом. (Dubois et al., 1956). Аминокислотный состав белков определяли на аминокислотном анализаторе. Cодержание металлов в гомогенатах и отдельных белковых фракциях анализировали атомно-абсорбционной спектроскопией (Никаноров и др., 1985; Julshamn, Andersen, 1983). Оценка общей антирадикальной (АО) активности проводилась по способности образца ингибировать (восстанавливать) радикал-катион ABTS+ (Re Roberta et al., 1999). Значения антиоксидантной активности исследуемых образцов выражали как миллимолярную концентрацию тролокса на мг белка. Определение активности ферментов каталазы (ЕС 1.11.1.6)  и ГSH-редуктазы (ЕС 1.6.4.2) проводили согласно стандартным методикам (Regoli et al., 1995). Определения активности фермента супероксиддисмутазы (ЕС 1.15.1.1) проводили согласно стандартному методу (Paoletti, Aldinucci, 1986).

ГЛАВА 3. Сравнительное исследование Cd-связывающих белков некоторых видов двустворчатых моллюсков

Результаты экспериментов по количественному определению Cd-связывающих белков не выявили в моллюскахP. venulosa и M. stimpsoni, не подвергавшихся воздействию кадмия, металл-связывающих белков (рис. 1). Этот факт дает основание полагать, что в нормальном состоянии эти белки либо отсутствуют, либо их уровень чрезвычайно низок. В то же время, у контрольных моллюсков M. yessoensisи уM. trossulusприсутствие металл-связывающих белков достоверно регистрируется. После пребывания экспериментальных моллюсков (100 мкг Cd/л), уровень Cd-связывающих белков (Cd-CБ) у приморского гребешка в клетках пищеварительной железы увеличивается более чем в 3 раза, а у мидии тихоокеанской - в 7 раз. При этом белки, связывающие кадмий, обнаружены у P. venulosa, но не зарегистрированы в M. stimpsoni. Подобные результаты свидетельствуют о том, что у трех исследованных моллюсков (приморского гребешка, мидии и перонидии) в ответ на аккумуляцию кадмия индуцируется синтез металл-связывающих белков.

Рис. 1. Содержание Сd-связывающих белков в пищеварительной железе двустворчатых моллюсков

В результате эксперимента обнаружено, что в цитоплазматических белках пищеварительной железы моллюска M. yessoensis в распределении кадмия проявляются два ярко выраженных пика: в области высокомолекулярных белков (ВМБ) и в области белков с низкой молекулярной массой (НМБ). При этом важно отметить, что данные пики совпадают с максимумами содержания SH групп в белках. Из этого следует, что Cd концентрируется во фракциях белков, относительно обогащенных сульфгидрильными группами. Сопоставление с маркерами показало, что основной Cd-связывающий ВМБ имеет молекулярную массу порядка 60 кДа, а второй минорный пик - менее 3 кДа. Введение в гомогенат и элюирующий буфер восстанавливающего агента - дитиотриэтола (ДТТ) не оказало влияния на количественное распределение и хроматографическое поведение данных Cd-СБ. Из этого следует, что белок с молекулярной массой 60 кДа не является продуктом окислительной полимеризации низкомолекулярного белка.

При разделении цитоплазматических белков у M. trossulus выделяются три пика локализации связанного кадмия. Первый пик, содержащий небольшое количество Cd, элюируется из хроматографической колонки со свободным объемом, что позволяет нам отнести его к категории ВМБ с массой > 70 кДа. Второй пик, связывающий основное количество цитоплазматического кадмия, выходит из колонки с белками, имеющими молекулярный вес около 22 кДа. В области низкомолекулярных компонентов небольшой пик связанного кадмия сосредоточен во фракции белков с молекулярной массой менее 3 кДа. Введение в элюирующий буфер ДТТ оказывало влияние только на содержание кадмия в ВМБ. Учитывая это обстоятельство, можно предположить, что в этой фракции присутствует белок, образовавшийся в результате полимеризации Cd-связывающего белка 22 кДа. В отличие от ВМБ и НМБ, белковый пик 22 кДа выражен только в режиме регистрации при 254 нм, появляется у мидий в процессе аккумуляции кадмия и не выявляется в клетках пищеварительной железы у контрольных моллюсков. Таким образом, белок 22 кДа, по-видимому, выполняет основную роль в связывании кадмия у мидии тихоокеанской.

У дальневосточного представителя семейства теллинид P. venulosa металлсвязывающий белок обнаруживается только в ответ на поступление в организм кадмия. Для этого моллюска характерно присутствие в цитоплазматической фракции пищеварительной железы двух белковых зон, в которых локализуется кадмий. Первый пик, расположенный в зоне ВМБ, соответствует белкам с молекулярным весом порядка 70 кДа. Второй пик кадмия приходится на белки, имеющие диапазон молекулярных масс от 7 до 10 кДа.

В распределении кадмия среди цитоплазматических белков у M. stimpsoni выявлены две зоны, в которых локализован клеточный кадмий. Первая - минорная, расположенная во фракции ВМБ, элюируется, как и у предыдущих моллюсков, со свободным объемом и соответствует белкам с молекулярной массой около 70 кДа. Другая зона, в которой сосредоточен, практически, весь цитоплазматический Cd, локализована в области компонентов с молекулярным весом не более 3 кДа. В отличие от ВМБ, этот Cd-связывающий низкомолекулярный компонент обогащен SH группами и имеет очень низкое поглощение при 280 нм. Таким образом, в отличие от гребешка, мидии и перонидии у мерценарии основным Cd-связывающим компонентом пищеварительной железы является низкомолекулярный тиол, предположительно глутатион (ГSH).

ГЛАВА 4. Идентификация и характеристика двух высокомолекулярных кадмий-связывающих белков приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis

Результаты показали, что 70% всего аккумулированного пищеварительной железой кадмия содержится в цитоплазматической фракции (фракция А), при этом, на долю этой же фракции приходится более 90% всего белка. После многоэтапного фракционирования (температурное осаждение, осаждение органическим растворителем), доля кадмия во фракции D (фракция, полученная после 80% ацетонного осаждения) составляет более 50%, а доля белка составляет от 15 до 20% от всего белка, находящегося в цитоплазме клетки.

Фракцию D, ресуспендированную в 0.02 М Tris-HCl буфере pH 8.5, разделили методом FPLC. Получено два кадмий-содержащих пика (Рис. 2), соответствующих высокомолекулярным белкам. Основная часть кадмия локализуется в первом и втором элюированном пике (пик 1 и пик 2) у гребешков из экологически чистой акватории, тогда как у животных из района нефтебазы кадмий локализуется в пике 1 (Табл. 1).

Рис. 2. Хроматографический профиль фракции D пищеварительной железы приморского гребешка Myessoensis из акваторий с различным содержанием кадмия в среде

 

залив Посьета (фоновый район)       район Первая речка (загрязненный район)

Таблица 1. Cравнение распределения кадмия (мкг) в фракциях 80% ацетонного осадка элюированных FPLC в приморском гребешке M. yessoensis

НАЗВАНИЕ ПРОБЫ

Cd, мкг

Zn, мкг

Cu, мкг

Фоновый район

Загрязненный район

Фоновый район

Загрязнен-ный район

Фоновый район

Загрязнен-ный район

Пик 1

0.11±0.05

3.4±0.21

0.18±0.012

0.2±0.01

0.05±0.0027

0.1±0.089

Пик 2

0.11±0.03

0.32±0.021

0.13±0.014

0.03±0.0013

0.04±0.0015

0.03±0.002

Пик 3

0.01±0.002

0.1±0.01

-

0.07±0.0036

-

0.02±0.0013

Согласно полученным результатам белок, соответствующий пику 1 является основным кадмий-связывающим белком, и способен связывать кадмий в экологически неблагоприятном районе до 30 раз больше, чем в экологически чистой акватории. Белок, соответствующий пику 2, также связывает кадмий, но в меньшем количестве (0.32 мкг) и способен аккумулировать кадмий в значительно меньшей степени. Пик 3 не рассматривался как основной кадмий-связывающий белок, из-за незначительного сродства к кадмию (0.01 мкг). Однако исследование содержания кадмия в пике 3 в гребешках из загрязненной акватории показало, что количество кадмия в пике 3 увеличилось в 10 раз, что значительно выше, чем в пике 2 (в 3 раза). Из чего можно сделать предположение, что существует пул низкомолекулярных компонентов в области 10 кДа, которые, возможно, являются кадмий-связывающими лигандами, принимающими участие в связывании кадмия при возникновении стрессовой ситуации в окружающей среде, когда концентрации кадмия в морской воде превышают допустимые нормы.

Анализ содержания микроэлементов показал, что кроме кадмия, в полученных белках содержатся и такие физиологически важные металлы, как Cu и Zn. Соотношение Cd:Zn:Cu в пике 1 и пике 2, а, следовательно, можно предполагать и в кадмий-связывающих белках, составляет 2:3.5:1 и 3:3:1 для гребешков из зал. Посьет. Для гребешков из района нефтебазы это же соотношение в пике 1 составляет 34:2:1, а в пике 2 соотношение Cd:Zn:Cu составляет 5:3.5:1.

Соотношение адсорбции в кадмий-содержащих белках при ? 254 и ? 280 нм составляет около 2, что существенно ниже, чем это же соотношения для классических МТ.

В дальнейшем, идентифицированные гель-хроматографией кадмий-связывающие белки были разделены ионообменной-хроматографией (Рис. 3). Идентифицированы два белка, которые и являются ранее полученными белками гель-хроматографией. Таким образом, после многоэтапного фракционирования (температурная обработка, осаждение органическим растворителем) получена достаточно чистая фракция, содержащая два кадмий-связывающих белка. Дальнейшую идентификацию белков проводили SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле. Было получено две полосы, которые соответствуют полипептидам с массой 72 и 43 кДа (Рис. 4). Для анализа на аминокислотный состав взяли белок соответствующий пику 1. Результаты показали, что в составе молекулы обнаружены ароматические аминокислоты, такие как тирозин (1.57), фенилаланин (3.91), основные аминокислоты гистидин (0.87), аргинин (3.69). Интересным является тот факт, что в составе молекулы обнаружен цистеин (4.72), однако основными аминокислотами являются глутаминовая и аспарагиновая кислоты.


Рис. 3. Ионно-обменная хроматография основных кадмий-связывающих белков приморского гребешка M. yessoensis

Рис. 4. Молекулярная масса Cd-связывающих белков приморского гребешка M. yessoensis. 1-стандарты,

2- проба 10 мкл, 3- проба 20 мкл


В кадмий-связывающем белке были обнаружены углеводы, на долю которых приходится до 35-40 % общей массы, что свидетельствует о том, что исследуемая молекула – гликопротеин. Качественный анализ углеводного состава Cd-связывающего белка позволил выявить в молекуле следующие моносахара: манноза, глюкоза, фукоза и ксилоза в сравнимых количествах и в меньшей степени рамноза и арабиноза, а также аминопроизводные моносахаров глюкозамин и галактозамин, и частично метилированные гексозамины.

ГЛАВА 5. Биохимические особенности разновозрастных групп приморского гребешка Mizuhopectenyessoensis в адаптации к кадмию

В пищеварительной железе у контрольной группы годовалых особей приморского гребешка 80% всего аккумулированного кадмия содержится в цитоплазматической фракции (фракция А), при этом на 1 мг белка приходится около 0.03 мкг кадмия. После многоэтапного фракционирования (температурное осаждение, осаждение органическим растворителем), доля цитоплазматического кадмия во фракции (фракция D), полученной после 80%-ного ацетонного осаждения составляет 8%. Также показано, что на 1 мг белка приходится до 0.5 мкг кадмия. У особей, находящихся в условиях повышенного содержания кадмия в среде в цитоплазматической фракции пищеварительной железы содержится только 50% аккумулированного кадмия. При этом на 1 мг белка приходится около 0.3 мкг кадмия. На долю 80%-ного ацетонного осадка приходится до 50% всего кадмия, содержащегося в цитоплазме, что составляет 15 мкг кадмия на 1 мг белка.

Анализ содержания микроэлементов показал, что кроме кадмия пищеварительная железа годовалых особей содержит и такие физиологически важные металлы, как Cu и Zn. При этом на долю термостабильных, устойчивых к органическим растворителям белков приходится значительная доля цинка. Соотношение Cd:Zn:Cu фракции D составляет 1:3:1. Эксперимент по аккумуляции кадмия показал изменение в соотношении кадмия, цинка и меди (14:4:1), по сравнению с контролем (Рис. 5). Однако необходимо отметить, что у гребешков после инкубации с кадмием, количество цинка в исследуемых белках фракции D также увеличивается, что, по-видимому, связано с интенсивной индукцией пула белков в ответ на повышенное содержание кадмия в окружающей среде.



А                                                                                           В

Рис. 5. Субклеточное распределение Cd, Zn Cu в пищеварительной железе контрольной (А) и экспериментальной (В) групп годовалых особей приморского гребешка M. yessoensis

Во фракции D идентифицированы три кадмий-содержащих пика, соответствующих белкам с высоким молекулярным весом в области 120 кДа, 72 кДа и 43 кДа. Найдено, что все три идентифицированных белка связывают кадмий, как в контрольной, так и в экспериментальной группах исследуемых моллюсков (Рис. 6). Получено, что в естественных условиях в годовалых особях M. yessoensisкадмий связывается главным образом с белком 43 кДа (9 мкг). Однако в особях, подвергнутых обработке кадмием, происходит перераспределение токсичного кадмия с белка 43 кДа (0.6 мкг) на белок 120 кДа (6 мкг). Интересно, что белок с молекулярным весом 72 кДа не менял своего сродства к кадмию вне зависимости от условий эксперимента.

Изучение АО свойств показало значительное различие в значениях как между кадмий-связывающими белками в контрольных моллюсках, так и при сравнении контрольной группы с экспериментальной группой гребешков (Рис. 7). В естественной среде обитания кадмий-связывающие белки связывают аккумулированный кадмий и имеют следующие показатели АО: для белка 120 кДа – 86 ммоль Тролокса/мг белка, для белка 72 кДа - 114 ммоль Тролокса/мг белка и для белка 43 кДа – 109 ммоль Тролокса/мг белка. В экспериментальных условиях для этих же белков значения АО изменились (Рис. 7 В): для белка 120 кДа – 50 ммоль Тролокса/мг белка, для белка 72 кДа - 124 ммоль Тролокса/мг белка и для белка 43 кДа – 72 ммоль Тролокса/мг белка. Наибольшей АО активностью в пищеварительной железе приморского гребешка обладает кадмий-связывающий белок 72 кДа как при фоновом, так и при высоком содержании кадмия в среде. Интересно, что в условиях нагрузки кадмием этот белок не принимает участия в аккумуляции этого металла, и доля связанного кадмия с белком сравнима с контролем. Получено так же, что после инкубации с кадмием кадмий-связывающие белки, принимающие основное участие в связывании кадмия (120 кДа и 43 кДа) имеют более низкие значение АО активности по сравнению с контролем. Отмечено, что кадмий-связывающий белок 120 кДа обладает более низкими показателем АО активности в обоих условиях эксперимента.

Рис. 6. Распределение кадмия среди кадмий-связывающих белков пищеварительной железы годовалых особей приморского гребешка M. yessoensis


 


А                                                                                           В

Рис. 7. Соотношение между содержанием кадмия и антиоксидантной активностью в кадмий-связывающих белках пищеварительной железы годовалых особей приморского гребешка

M. yessoensis, А – контрольная группа, В - после обработки кадмием (CdCl2, 300 мкг/л)

Таким образом, впервые исследована способность годовалых особей приморского гребешка M. yessoensis к аккумуляции кадмия в природных популяциях и лабораторных условиях. Результаты данного исследования продемонстрировали, что годовалые особи приморского гребешка M. yessoensis способны накапливать в пищеварительной железе кадмий вне зависимости от условий эксперимента. Кроме того, в данном исследовании идентифицированы три высокомолекулярных термостабильных устойчивых к органическим растворителям белковых компонента в пищеварительной железе, участвующих в связывании кадмия (120 кДа, 72 кДа и 43 кДа).

Исследование механизмов адаптации у двухгодовалых особей приморского гребешка показало отличие в распределении и накоплении кадмия среди цитоплазматических белков от результатов, полученных для годовалых гребешков того же вида. Обнаружено, что в пищеварительной железе контрольной группы приморского гребешка около 30% кадмия содержится в цитоплазматической фракции, при этом на 1 мг белка приходится 0.07 мкг кадмия. Доля цитоплазматического кадмия во фракции D составляет около 5%, на 1 мг белка приходится 0,02 мкг Cd. У особей, находящихся в условиях повышенного содержания кадмия в среде в цитоплазматической фракции пищеварительной железы содержится около 70% кадмия, что свидетельствует о роли цитоплазматических белков в аккумуляции кадмия в ткани пищеварительной железы у приморского гребешка. При этом на 1 мг белка приходится 0.5 мкг кадмия, что соответствует годовалым гребешкам (0.3 мкг Cd на 1 мг белка). На долю 80% ацетонного осадка приходится только 6% всего кадмия, содержащегося в цитоплазме, что составляет 0.15 мкг кадмия на 1 мг белка.

Кроме кадмия, пищеварительная железа двухлетних особей M. yessoensis содержит Cu и Zn. Соотношение Cd:Zn:Cu во цитоплазме составляет 2:2:1. На долю термостабильных, устойчивых к органическим растворителям белков приходится значительная доля кадмия и соотношение Cd:Zn:Cu составляет 4:1:1. Эксперимент по аккумуляции кадмия показал изменение в соотношении металлов. Так в цитоплазме соотношение Cd:Zn:Cu составляет 7:3:1, а во фракции D – 37:1:1 (Рис. 8).



А                                                                    В

Рис. 8. Субклеточное распределение Cd, Zn, Cu в пищеварительной железе контрольной (А) и экспериментальной (В) групп двулетних особей приморского гребешка M. yessoensis

Дальнейшее исследование показало, что фракция D, двух исследуемых групп гребешков содержит три кадмий-связывающих пика, соответствующих белкам с высоким молекулярным весом в области 120 кДа, 72 кДа и 43 кДа, что соответствует результатам подобного эксперимента у годовалых особей M. yessoensis. Найдено, что не все три идентифицированных белка связывают токсичный кадмий. В контрольной и в экспериментальной группах исследуемых двухгодовалых моллюсков основную роль в связывании кадмия принимает белок 72 кДа. Белок 120 кДа не участвует в связывании кадмия ни в одной из исследуемых групп. Незначительная часть кадмия связывается с белком 43 кДа в экспериментальной группе животных (Рис. 9). Таким образом, роль белков 120 кДа и 43 кДа теряется, начиная с двухлетнего возраста, т.е. вероятнее, что с наступлением половозрелости у данного вида функция связывания кадмия у белка 120 кДа исчезает совсем уже с двухлетнего возраста. Тогда как к 5-7 летнему возрасту, функция связывания кадмия у белка с молекулярной массой 43 кДа элиминируется и белок принимает незначительную роль в связывании кадмия.

Рис. 9. Распределение кадмия (мкг) среди кадмий-связывающих белков пищеварительной железы двухгодовалых особей приморского гребешка M. yessoensis

Изучение АО свойств кадмий-связывающих белков двухгодовалых гребешков показало, что в среде с фоновым содержанием кадмия только два из трех обнаруженных белков, обладают антирадикальной активностью и имеют следующие значения: для белка 72 кДа - 114 ммоль Тролокса/мг белка и для белка 43 кДа – 109 ммоль Тролокса/мг белка. В экспериментальных условиях у белка 120 кДа значение антирадикальной активности резко поднимается до 59 ммоль Тролокса/мг белка. Значение АО активности для белка 43 кДа понижается с 114 до 53 ммоль Тролокса/мг белка (Рис. 10). Наибольшей АО активностью в пищеварительной железе двухгодовалых особей обладает кадмий-связывающий белок 43 кДа, но основным белком, связывающим кадмий, является белок 72 кДа. Белок 72 кДа обладает АО активностью вне зависимости от уровня кадмия в окружающей среде, т.е. в отличие от годовалых особей приморского гребешка в условиях нагрузки кадмием этот белок не принимает участия в АО защите клетки. Белок 120 кДа нельзя считать кадмий-связывающим для двухгодовалых особей, однако необходимо учитывать его роль в АО защите клетки.


                        А                                                                                           В

Рис. 10. Соотношение между содержанием кадмия и антиоксидантной активностью в кадмий-связывающих белках пищеварительной железы двухгодовалых особей приморского гребешка M. yessoensis, А – контрольная группа, В - после обработки кадмием (CdCl2, 300 мкг/л)



выводы

1. Найдено, что среди исследованных видов двустворчатых моллюсков наиболее высокое сродство к кадмию присуще Сd-связывающим белкам пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis. Mytilus trossulus и Peronidiavenulosa способны аккумулировать кадмий за счет белков МТ-типа. Mercenaria stimpsoni не аккумулирует кадмий и Cd-связывающие белки в пищеварительной железе не выявлены.

2. Распределение кадмия среди термостабильных цитоплазматических белков в приморском гребешке M. yessoensis показывает, что этот металл связывается с высокомолекулярными белками (72 и 43 кДа). Основным Cd-связывающим белком является гликопротеин с молекулярной массой 72 кДа, который по своим биохимическим характеристикам существенно отличается от металлотионеинов и известных металлотионеин - подобных белков.

3. Установлено, что Cd-связывающие белки пищеварительной железы приморского гребешка M. yessoensis вне зависимости от возраста связывают и физиологически важные металлы Zn и Cu. При этом в особях приморского гребешка из экологически чистой акватории основной металл, связанный с исследуемыми белками - цинк. При повышенном содержании кадмия в окружающей среде происходит перераспределение металлов в кадмий-связывающих белках. Основным связанным металлом становится кадмий.

4. Обнаружено, что Cd-связывающие белки пищеварительной железы приморского гребешка M. yessoensis способны поглощать кислородные радикалы, а, следовательно, являются одним из компонентов антиоксидантной защиты в приморском гребешке.

5. Показано, что в неполовозрелых особях приморского гребешка M. yessoensis присутствуют три высокомолекулярных белка, участвующих в связывании кадмия (120 кДа, 72 кДа и 43 кДа). Белок 120 кДа характерен только для данной возрастной группы. Однако функция связывания кадмия элиминируется уже у двухгодовалых особей как в условиях повышенной нагрузки кадмием, так и в благоприятных условиях обитания вида.

список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

  1.             Жуковская А.Ф., Бельчева Н.Н., Челомин В.П. Идентификация  и частичная характеристика двух высокомолекулярных кадмий-связывающих белков приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Вестник МГОУ, 2011. Серия «Естественные науки». №3. C. 36–42.
  2.             Nina N. Belcheva, Maxim V. Zakhartsev, Nadezhda V. Dovzhenko, Avianna F. Zhukovskaya, Victor Ya. Kavun, Victor P. Chelomin. Anthropogenic Pollution Stimulates Oxidative Stress in Soft Tissues of Mussel Crenomytilus grayanus (Dunker1853) // Ocean Sci. J. 2011. Vol. 46. №2. P. 85–94.

Статьи, опубликованные в других периодических изданиях и монографиях

  1.            Слободенюк А.Ф. (Жуковская А.Ф.)., Бельчева Н. Н., Челомин В.П. Сравнительное исследование Cd-связывающих белков некоторых видов двустворчатых моллюсков. «Scientific articles. Ecology 2006». Science Invest Burgas, Bulgaria. 2006. P. 19-28.
  2.             Avianna F. Slobodenyuk, Nina N. Belcheva, V.P. Chelomin. Comparative study of Cd-binding proteins of different species of BIVALVES. Интернет журнал Electronic Journal “International Research Publication”, Bulgaria. 2006.
  3.             Н.Н. Бельчева, А.Ф. Жуковская, В.П. Челомин. Биохимические маркеры в оценке загрязнения залива Петра Великого. II. Ферменты биотрансформации как индикаторы загрязнения органическими ксенобиотиками. Современное состояние и тенденции изменения природной среды залива Петра Великого Японского моря / Отв. ред. д.г.-м.н. А.С. Астахов, к.г.н. В.Б. Лобанов, М.: ГЕОС, 2008. С. 156 - 176.
  4.             Н.Н. Бельчева, Н.В. Довженко, В.Я. Кавун, А.Ф. Жуковская, А.Ф. Силина, В.П. Челомин. Биохимические маркеры в оценке загрязнения залива Петра Великого. I. Влияние тяжелых металлов на процессы окислительного стресса. Современное состояние и тенденции изменения природной среды залива Петра Великого Японского моря / Отв. ред. д.г.-м.н. А.С. Астахов, к.г.н. В.Б. Лобанов, М.: Геос. 2008. С.139-157.
  5.             А.Ф. Жуковская, В.П. Челомин. Особенности механизма адаптации годовалых особей приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию / Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том 1. Экологическая физиология и биохимия водных организмов. 2010. Сборник научных статей. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. С. 49-55.

Работы, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных конференций

  1.             А.Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.), Н. Н. Бельчева. Биохимическая характеристика основного кадмий-связывающего белка пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов научной конференции, посвященной 40-летию Тихоокеанского института биоорганической химии. Владивосток: ДВО РАН, 2004. С. 63.
  2.             А.Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.), Н.Н. Бельчева. Идентификация и выяснение некоторых свойств кадмий-связывающего компонента из пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // VII Региональная конференция по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов, молодых преподавателей и сотрудников вузов и научных организаций Дальнего востока России. Тезисы докладов. Владивосток: Изд-во Дальневосточного Государственного Университета, 2004.
  3. А.Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.), В.П. Челомин, С.В. Томшич, Н.Н. Бельчева. Углеводный и аминокислотный состав нового Cd-связывающего гликопротеида из пищеварительной железы приморского  гребешка Mizuhopecten yessoensis // IX Дальневосточная школа по актуальным проблемам химии и биологии. 2005.
  4. Довженко Н.В., Бельчева Н.Н., Челомин В.П., Столетняя, Слободенюк А.Ф. (Жуковская А.Ф.), А.В Пономарев О.В Возрастная изменчивость компонентов антиоксидантной системы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Современные проблемы водной токсикологии. Тезисы докладов международной конференции. Борок, 2005 . С. 36-37.
  5. А. Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.), В.П. Челомин, Н.Н. Бельчева, В.В. Кумейко. Особенности внутриклеточного распределения кадмия в клетках пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // X Международная молодежная Школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. МЭС ТИБОХ, Владивосток 2006.
  6. А. Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.), В.П. Челомин, Н.Н. Бельчева. Участие высокомолекулярных металлсвязывающих белков в аккумуляции кадмия в пищеварительной железе приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Океанологические исследования. Тезисы докладов конференции молодых ученых океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН. Владивосток: ТОИ ДВО РАН, 2007. С. 126.
  7. Слободенюк А.Ф. (Жуковская А.Ф.)., Челомин В.П., Бельчева Н.Н, Кумейко В.В. Исследование механизмов аккумуляции и детоксикации кадмия у приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia) // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Материалы 2-ой научной конференции с участием стран СНГ. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. С. 143-144.
  8. Жуковская А.Ф., Челомин В.П., Бельчева Н.Н. Механизмы адаптации приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию // Океанологические исследования. Тез. III конф. молодых ученых ТОИ ДВО РАН: Владивосток: ТОИ ДВО РАН, 2008. С. 79.
  9. Avianna F. Zhukovskaya, Viktor P. Chelomin, Nina N. Belcheva. Adaptation biochemical mechanisms to cadmium in the far eastern scallop Mizuhopecten yessoensis // Physiomar 08: abstr. Brest, France. 2008. P 86.
  10. Avianna F. Zhukovskaya, Nina N. Belcheva, Viktor P. Chelomin. The role of high molecular weight proteins in response to cadmium in the scallop // Beyond observations to achieving understanding and forecasting North Pacific: Forward to the FUTURE: abstr. PICES 17th Annual Meeting. Dalian. 2008. P. 27.
  11. Довженко Н.В., Бельчева Н.Н., Жуковская А.Ф. Возрастные изменения биохимических показателей в тканях жабр и пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Инновации в науке и образовании. Мат. VI Межд. Науч. Конф. Калининград, 2008. С. 125-127.
  12. А.Ф. Жуковская, Н.Н. Бельчева, В.П. Челомин. Исследование механизма адаптации к кадмию у разновозрастных групп приморского гребешка // Океанологические исследования. Тез. IV конф. молодых ученых ТОИ ДВО РАН. Владивосток: ТОИ ДВО РАН, 2009. С. 79.
  13. Avianna F. Zhukovskaya, Nina N. Belcheva, Viktor P. Chelomin. Cadmium accumulation and Cd-binding proteins in the scallop Mizuhopecten yessoensis // 17th International Pectinid Workshop: abstr. Spain 2009. P. 76-77.
  14. А.Ф. Жуковская, Н.Н. Бельчева, Е.Е. Солодова, В.П. Челомин. Особенности механизма адаптации годовалых особей приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. 3-я Международная конференция.  Петрозаводск, 2010. С. 59.
  15. А.Ф. Жуковская, Н.Н. Бельчева, В.П. Челомин. Биохимические особенности разновозрастных групп приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к адаптации к кадмию // Современные проблемы гидроэкологии. IV Международная научная конференция, посвященная памяти профессора Г.Г. Винберга. Санкт-Петербург, 2010. С. 66.

 

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Специальность: 03.02.08 - экология

Подписано к печати 05.04.2012 г. Формат 60х84/16

Объем 1,0 уч.-изд.-л. Тираж 100 экз.   Заказ №. 106

Отпечатано с авторского оригинал-макета

в ТОИ ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Балтийская, 43

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.