WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]

НОВЫЙ ОТЕЧЕСТВЕННЫЙ АНТИГЕЛЬМИНТИК НА ОСНОВЕ БМК И АВЕРМЕКТИНОВ И ЕГО ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Автореферат кандидатской диссертации

 

На правах рукописи

 

 

МЕЛЬНИКОВА МАРИНА ЮРЬЕВНА

 

 

 

 

НОВЫЙ ОТЕЧЕСТВЕННЫЙ АНТИГЕЛЬМИНТИК

НА ОСНОВЕ БМК И АВЕРМЕКТИНОВ И ЕГО

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

 

03.02.11 – Паразитология

 

 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

 

 

 

 

 

 

Москва – 2012


Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт гельминтологии им. К.И.Скрябина» Россельхозакадемии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Новик Тамара Самуиловна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор

Малахова Екатерина Ивановна

Всероссийский НИИ гельминтологии

им. К.И.Скрябина, в.н.с. лаборатории

иммунологии

 

доктор биологических наук

Бондаренко Владимир Олегович

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации

лекарственных средств для животных

и кормов, в.н.с. отдела качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств для животных

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт

ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии

Защита состоится «23» мая 2012 года в «1430» часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.011.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И.Скрябина» (ВИГИС).

Адрес: 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС

Автореферат разослан «___» __________ 2012 г.

Ученый секретарь Совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций,

доктор биологических наук, профессор                                      Бережко В.К.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антигельминтики производные бензимидазолкарбаматов, несмотря на долголетнюю историю своего применения, продолжают занимать достойное место в ассортименте современных лекарственных средств. Причина заключается в высокой нематодоцидной эффективности соединений этого химического класса, а также в определенной активности против цестод и фасциол. Усовершенствование бензимидазолкарбаматов сво­дится, главным образом, не к синтезу новых производных, а к созданию разнообразных лекарственных форм, комбинированных препаратов и систем доставки.

БМК (метиловый эфир 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты) является не только ярким представителем данной химической группы, но и в определенной степени ее исходным соединением. Препарат и в настоящее время продолжают применять в качестве фунгицида. Хорошо известны его высокие антигельминтные свойства.

Как и большинство других бензимидазолкарбаматов, БМК оказывает выраженное эмбриотоксическое и тератогенное действие на многих лабораторных и сельскохозяйственных животных. В свое время в ВИГИСе имело место целое научное направление, целью которого была попытка модифицировать, точнее, отменить его эмбриотропное действие с сохранением антигель­минтной эффективности. Для этой цели использовались многие эндогенные соединения, соли металлов и бензимидазолы (Скира В.Н., 1986; Оробец В.А., 1989; Новик Т.С., 1992). Практическим выходом этого научного поиска было создание препарата кубен, который нарабатывался и выпускался опытно-производственным отделом ВИГИС.

К настоящему времени возникли новые возможности создания антигельминтика на основе БМК без указанного побочного эффекта. Благодаря предварительным данным (Мосин В.А., Новик Т.С. и др., 1999) стало реальным получить комбинацию БМК и авермектинов, не обладающую эмбриотропным действием, получившую название препарат БМК плюс.

Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным основной целью нашей работы было получение и детальная токсикологическая характеристика препарата на основе БМК и авермектинов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

• провести отбор авермектинов, наиболее эффективно снимающих эмбриотоксическое и тератогенное действие БМК;

• отработать способ получения препарата БМК плюс на основе БМК и авермектинов, показавших наилучшие результаты в скрининге, в лабораторных условиях;

• оценить токсические свойства препарата;

• изучить особенности фармакокинетики препарата;

• испытать его антигельминтные свойства.

Научная новизна. Получены новые данные по феномену отмены эмбриотоксического и тератогенного действия БМК под действием авермектинов; выдвинута и экспериментально обоснована гипотеза механизма данного эффекта. Определены авермектины, обеспечивающие наиболее оптимальное «снятие» побочного эффекта БМК, а также композиции с рациональным соотношением входящих в их состав компонентов. Установлены особенности фармакокинетики БМК и его влияния на митоз клеток костного мозга крыс и мышей при совместном введении с аверсектином С1. Оценены токсикологические параметры острого и подострого действия БМК плюс; выявлены высокие антигельминтные свойства препарата.

Практическая значимость работы. На основе исследований по отмене эмбриотропного действия БМК создан комбинированный препарат БМК плюс, имеющий реальную перспективу применения в ветеринарной практике. Способ приготовления препарата можно применить к другим производным бензимидазолкарбаматов и авермектинов. Апробирован и адаптирован «Метод анализа БМК и его метаболита 5-гидрокси-БМК в плазме крови на основе ВЭЖХ с УФ-детектированием» (одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 1 от 22 марта 2012 г.).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на отчетных научных конференциях ВИГИС (2009-2011); на научно-практических конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями животных» (г. Москва, 2010; 2011 гг.).

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом трехлетних научных исследований автора. Исследования по созданию, оценке токсических свойств и антигельминтной эффективности препарата БМК плюс проведены аспирантом самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Новик Т.С., которая оказывала научно-ме­то­дическую помощь в проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают не менее 80% материалов исследований аспиранта. Соавторы не возражают в использовании результатов совместных исследований (справки предоставлены в диссертационный совет).

Основные положения, выносимые на защиту:

• скрининг производных авермектинов в отношении предупреждения эмбриотоксического и тератогенного действия БМК;

• приготовление препарата БМК плюс;

• токсикологическая характеристика БМК плюс;

• особенности фармакокинетики и антимитотического действия БМК при совместном введении с аверсектином С1;

• антигельминтная эффективность БМК плюс при нематодозах и цестодозах овец.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 2 из них в рекомендованном ВАК РФ издании.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. В список литературы входят 80 отечественных и 166 иностранных источников. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 90 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Представлен анализ литературных данных по общей характеристике, токсическим и антигельминтным свойствам препаратов, относящихся к бензимидазолкарбаматам и авермектинам. Кроме того, приведена подборка данных по опыту снятия эмбриотоксичекого и тератогенного действия соединений различных химических классов, включая бензимидазолкарбаматы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в 2009-2012 гг. в лаборатории фармакологии, токсикологии и терапии, виварии ГНУ ВИГИС Россельхозакадемии и в частном хозяйстве ООО «Пригорское» Смоленской области.

Исследования выполняли в полном соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранении Российской Федерации № 708н от 23.08.2010). Эксперименты на животных проводили согласно правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986), и приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977.

Крыс и мышей получали из питомника «Филиал Андреевка ГУ НЦ биомедицинских исследований РАМН».

2.1.1. Схемы тератологических экспериментов

Скрининг производных авермектинов с целью предупреждения эмбриотоксического и тератогенного действия БМК. Настоящие исследования провели на 78 крысах-самках и 10 крысах-самцах.

Для установления точного срока беременности к самкам с массой тела 200-240 г, находящихся в стадии эструса и проэструса, подсаживали самцов массой 250-280 г в соотношении 4:1. На следующий день просматривали влагалищные мазки и при обнаружении в них сперматозоидов этот день принимали за 1 день беременности.

Отобранных беременных самок разделили на 13 групп по 6 крыс в каждой.

БМК и БМК в комбинации с авермектинами вводили на 9-12 дни беременности, когда у эмбрионов имеется наиболее высокая чувствительность к бензимидазолкарбаматам.

На 20-й день беременности опытных и контрольных крыс подвергали эвтаназии; после лапаротомии извлекали матку и зародышей из плодовместилищ; регистрировали количество желтых тел беременности в обоих яичниках, мест имплантации; число живых, мертвых, резорбированных плодов; эмбрионы внимательно осматривали на наличие внешних аномалий развития; определяли массу (г) и краниокаудальный размер (см) плодов; определяли массу (г) и диаметр плаценты (см); определяли общую эмбриональную смертность, пред- и постимплантационную гибель.

Опыты по оценке препарата БМК плюс на эмбриотоксическое и тератогенное действие. Эксперименты провели на 60 беременных крысах-самках и 10 крысах-самцах.

Отбор беременных самок проводили, как описано выше.

БМК плюс вводили однократно в дозе 150 мг/кг по БМК в период 1-2; 9-12; 13-14 и 15-19 дни беременности.

Во избежание повторений исследование эмбрионального материала проводили, как описано выше.

В дополнении к этому плоды от каждой самки делили на две группы для исследования на наличие аномалий внутренних органов по методу Вильсона (J.Wilson, 1965) и костной системы после окрашивания по методу Доусона (A.B.Dawson, 1926) в обоих случаях в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР (А.П.Дыбан и др., 1970)

2.1.2. Методы приготовления композиций на основе БМК и аверсектина С1. Комбинированные композиции готовили с использованием глицерина (Glacon Chemie, Германия); поливинилпирролидона-1500 (ООО «АК Синтвита», Россия); полиэтиленоксида-400 (ООО «Завод синтанолов», Россия); полиэтиленоксида-1500 (ООО «Завод синтанолов», Россия), БМК (98%; Xiamen Fine Chemical Import&Export, CO LTD; Китай) и аверсектина С1 20% концентрата (НБЦ «Фармбиомед», Россия). Образцы готовили на лабораторной магнитной мешалке (ММ 2А, Чехия).

Порошковую композицию готовили с использованием БМК (98%; Xiamen Fine Chemical Import&Export, CO LTD; Китай), аверсектина С1 20% концентрата (НБЦ «Фармбиомед», Россия), ацетона («Химмед», Россия). Образец готовили на магнитной мешалке и  роторном испарителе («ДРТ-М», Россия).

2.1.3. Схемы экспериментов по оценке токсических свойств и фармакокинетики препарата БМК плюс

Изучение острой токсичности. Опыты по определению острой токсичности препарата БМК плюс проводили на 24 беспородных половозрелых крысах-самцах массой 180-200 г; 30 неполовозрелых крысах-самцах массой 100-120 г, а также 50 беспородных мышах-самцах массой 18-20 г.

Препарат вводили в виде водной суспензии на твине-80 однократно, перорально с помощью желудочного зонда в дозах 1000; 2000; 3000 и 5000 мг/кг крысам с массой 180-200 г; в дозах 750; 800; 825; 850 и 900 мг/кг крысам с массой 100-120 г и мышам в дозах 250; 500; 750; 1000 и 1500 мг/кг.

На каждую дозу было использовано соответственно по 6 крыс и 10 мышей. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток, при этом учитывали гибель, общее состояние, прием корма и воды, поведение и активность животных.

Для расчета средней смертельной дозы использовали метод Кербера (1931) и Миллера, Тейтнера (1944).

Изучение фармакокинетики БМК и его метаболита при введении крысам суспензии БМК и препарата БМК плюс. Анализ БМК и его основного метаболита 5-гидрокси-БМК проводили апробированным и адаптированным методом анализа на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с УФ-детектированием. Нижний предел определения 0,1 мкг/мл.

Исследование провели на 42 беспородных крысах-самцах массой 180-200 г.

Крыс разделили на 2 группы по 21 животному в каждой. Крысам группы 1 вводили один БМК в виде водной суспензии на твине 80 в дозе 300 мг/кг; крысы группы 2 получали препарат БМК плюс в виде водной суспензии в дозе 300 мг/кг по БМК. Оба препарата вводили крысам per os с помощью желудочного зонда.

Через 1; 2; 3; 4; 6; 9 и 24 часа после введения препаратов по 3 крысы на каждый срок подвергали эвтаназии дислокацией шейных позвонков и отбирали пробы крови, из которой готовили плазму.

В образцах плазмы крови определяли концентрацию БМК и его метаболита 5-гидрокси-БМК отработанным методом анализа (смотри выше).

До анализа образцы плазмы крови хранили при  -20 ?С.

Для расчетов фармакокинетических параметров был использован модельно-независимый метод с использованием программы «M-IND». Она позволяет проводить обработку данных «концентрация-время» в плазме/сыворотке крови при различных способах введения и рассчитывать системные параметры лекарственного вещества методом статистических моментов.

Определяли следующие фармакокинетические параметры: Сmax – максимальная концентрация активного соединения; tmax – время достижения максимальной концентрации; AUCt – площадь под кривой «концентрация активного соединения–время» в интервале времени от 0 до момента (t) отбора последней пробы плазмы крови; AUC? – площадь под кривой «концентрация активного соединения–время» в интервале времени от 0 до ?; Clpo – клиренс активного соединения; Kel – константа элиминации; MRT – среднее время удерживания активного соединения в организме; Vz – кинетический объем распределения.

Схемы опытов по оценке цитогенетического действия препарата БМК плюс. Для оценки влияния БМК плюс на клеточное деление и структуру хромосом в сравнении с БМК использовали анафазный и метафазный методы (C.E.Ford, J.L.Hamerton, 1956; Н.П.Бочков, Ю.С.Демин, Н.В.Лучник, 1972).

Первый опыт провели на 35 крысах-самцах массой 180-200 г и 35 мышах-самцах массой 18-20 г. БМК плюс и БМК вводили животным в виде водной суспензии на твине-80 перорально однократно в дозе 300 мг/кг (по БМК). Через 3; 6 и 24 часа крыс и мышей убивали дислокацией шейных позвонков.

Препараты костного мозга готовили по C.E.Ford, J.L.Hamerton (1956) и исследовали под микроскопом «Zeiss Optix» (Германия).

Регистрировали все стадии митоза, определяли митотический индекс и выражали в процентах.

Во втором опыте мышам-самцам массой 18-20 г БМК плюс и БМК вводили перорально однократно в виде водной суспензии в дозе 300 мг/кг (по БМК).

Выделение клеток костного мозга и приготовление препаратов проводили как описано в методической литературе (Н.П.Бочков, Ю.С.Демин, Н.В.Лучник, 1972).

Препараты исследовали под микроскопом Zeiss Axio Imager (Германия), оснащенным цифровой камерой Axio Cam MRm. Обработку изображений производили с помощью пакета программ анализа изображения Axio Vision, версия 4.6.3.

В основные регистрируемые показатели входило: число одиночных и парных фрагментов, ахроматических пробелов (гэпов) и расхождений по цент­ромере, число клеток с полной деструкцией хромосом.

Оценку результатов цитогенетического анализа проводили при сравнении количества клеток с хромосомными аберрациями в опытных и контрольных группах. Всего было проанализировано 200 стекол.

Опыт по оценке подострой токсичности препарата БМК плюс. Сформировали 4 опытных и 1 контрольную группы по 7 крыс массой 180-200 г в каждой.

В настоящем опыте использовали дозы, кратные установленному значению LD50, т. е. 2400 мг/кг (для взрослых крыс). Препарат БМК плюс вводили опытным крысам перорально в следующих дозах: группа 1 – 480 мг/кг (1/5 от LD50); группа 2 – 240 мг/кг (1/10 от LD50); группа 3 – 120 мг/кг (1/20 от LD50); группа 4 – 48 мг/кг (1/50 от LD50). Препарат вводили в виде водной суспензии с добавлением твина 80. Крысы группы 5 получали дистиллированную воду, и они служили контролем.

Во всех случаях препарат вводили в течение 7 суток.

В течение всего опытного периода наблюдали за гибелью крыс, общим состоянием животных, приростом массы тела, видимыми физиологическими функциями.

В конце опыта (через 1 сутки после последнего введения) животных всех групп подвергали эвтаназии дислокацией шейных позвонков; отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических по­казателей; взвешивали основные органы для определения массовых коэффициентов; проводили макро- и микроскопическое исследование печени, легких, сердца, селезенки, головного мозга, почек, лимфатических узлов, желудка, тонкого и толстого кишечника.

Основные показатели периферической крови крыс определяли на гематологическом анализаторе «Abacus JuniorVet» (Diatron, Австрия); лейкоцитарную формулу – общепринятым методом.

Биохимические показатели крови определяли на анализаторе А-15/25 (BioSystems S.A., Испания).

Опыт по оценке антигельминтной эффективности препарата БМК плюс. Опыт провели в частном хозяйстве Смоленской области ООО «Пригорское». По результатам копроовоскопических исследований флотационным методом отобрали 20 овец романовской породы, спонтанно инвазированных гемонхами, нематодирами, мюллериями, мониезиями. Животных разделили на 4 равноценные группы. Обработку зараженных животных проводили следующим образом: овцам группы 1 вводили БМК в виде порошка в дозе 150 мг/кг; группы 2 – БМК в дозе 100 мг/кг; группы 3 – БМК в дозе

50 мг/кг; группы 4 – препарат БМК плюс в дозе 100 мг/кг; группы 5 – БМК плюс в дозе 25 мг/кг, и группа 6 служила контролем без обработки (во всех случаях дозы выражены по БМК).

Препараты вводили индивидуально из расчета массы тела.

Эффективность препаратов учитывали по результатам исследования проб фекалий овец через 14 суток после введения препаратов.

Расчет эффективности проводили по типу «контрольный тест» согласно «Руководству по оценке эффективности антгельминтиков у жвачных (крупного рогатого скота, овец, коз)», 1995. В период испытаний учитывали переносимость препаратов.

2.1.4. Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему

t-критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости.

Расчеты выполняли на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Exel 2010 (Microsoft Inc., USA).

 

 

 

 

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Скрининг авермектинов, снимающих эмбриотоксическое и тератогенное действие БМК

В таблице 1 приведены результаты тестирования ряда авермектинов и композиций на их основе.

Совместное введение БМК с указанными авермектинами в большинстве случаев приводило к снижению показателей гибели плодов; исключение составил универм, который, напротив, привел к усугублению эмбриотропного эффекта БМК, а именно к полной внутриутробной гибели плодов у всех крыс.

При введении БМК в комбинации с авермектинами ни в одном случае у эмбрионов не наблюдали аномалий развития.

Наилучшие результаты в отношении отмены отрицательного влияния БМК на эмбриогенез крыс показали авермектин В2а (в дозе 6,0 мг/кг); авермектин А1 (в дозе 1,9 мг/кг) (по отдельным показателям) и аверсектин С1 (в дозе 0,5 мг/кг).

2.2.2. Приготовление комбинированного препарата на основе БМК и авермектинов

Приведенные в разделе 2.2.1. данные представляют большой научный интерес, т.е. было убедительно продемонстрировано, что авермектины могут ослаблять или полностью предупреждать эмбриотоксическое и тератогенное действие классического представителя бензимидазолкарбаматов – БМК. Однако результаты экспериментов имеют и реальное практическое значение, поскольку на их основе можно приготовить комбинированный противопаразитарный препарат широкого спектра действия, не обладающий эмбриотропным действием. Основываясь на этой плодотворной идее, мы начали работу по созданию такого препарата; в качестве авермектинового компонента использовали аверсектин С1, показавший наилучшие результаты в скрининге и имеющий относительно простую технологию получения. При приготовлении препарата в лабораторных условиях использовали аверсектин С1 в виде 20% концентрата.

С учетом физико-химических свойств БМК и аверсектина С1 и информации по лекарственным формам на основе бензимидазолкарбаматов было понятно, что препарат должен быть предназначен для перорального введения.

Было приготовлено 6 образцов пасты, содержащей БМК и аверсектин С1.

Пасты готовили смешением и тщательным перемешиванием на лабораторной мешалке БМК, аверсектина С1 20% концентрата, глицерина, поливинилпирролидона, ПЭГа-400 и ПЭГа-1500 в соответствующих количествах (соотношение БМК к аверсектину С1 составляло 300:1, и оно основывалось на результатах скрининга).

Приготовленные образцы пасты тестировали на эмбриотоксическое и тератогенное действие; образцы вводили в дозе 150 мг/кг по БМК на 9-12 дни беременности.

Однако все испытанные композиции не дали ожидаемого результата. В частности, общая эмбриональная смертность колебалась в пределах от 19,25±0,25 до 81,16±11,16 по сравнению с 7,28±5,05% в контроле, и этот показатель


 

Таблица 1.

Влияние авермектинов на проявление эмбриотоксического действия БМК

Показатели

Конт­роль,

дистиллированная вода

БМК,

150 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

ивермектин 0,5 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

абамектин

2,0 мг/кг

БМК, 150 мг/кг

(дробно) +

абамектин 2,0 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

авермектин В2а 2,5 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

авермектин В2а 6,0 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

авермектин А1 1,9 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

авермектин А1 4,8 мг/кг

БМК, 150 мг/кг + аверсектин С1 0,25 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

аверсектин С1 0,5 мг/кг

БМК, 150 мг/кг +

аверсектин С1 0,25 мг/кг+

глицин

БМК, 150 мг/кг +

универм 250 мг/кг

Предимплантационаая гибель, %

6,72±

2,30

36,80±

5,53*

17,50±

6,01*

11,61±

2,58*

2,94±

0,51

20,00±

6,32*

10,00±

4,24

12,50±

11,69

14,71±

6,07

9,38±

5,15

3,03±

2,11

30,56±

7,68*

0

Постимплантационная гибель, %

3,60±

1,78

31,25±

5,32*

27,27±

7,04*

17,52±

3,05*

33,33±

8,08*

21,88±

6,54*

8,89±

4,02

14,29±

12,37

27,58±

7,66*

17,24±

6,68*

3,13±

2,14

12,00±

5,42*

100

Общая эмбриональная смертность, %

10,08±

2,77

56,58±

5,69*

40,00±

7,74*

27,10±

3,57*

35,29±

8,20*

37,50±

7,65*

18,00±

5,43

25,00±

15,31

38,24±

8,33*

25,00±

5,32*

6,06±

2,94

38,90±

8,13*

100

Число случаев полной внутриутробной гибели плодов

0

2

0

3

0

0

0

1

0

2

0

0

6

Масса плода, г

2,47±

0,02

1,75±

0,06*

2,35±

0,04

1,63±

0,02*

1,86±

0,03*

1,65±

0,04*

2,15±

0,03*

2,43±

0,02

2,24±

0,05*

2,85±

0,05

2,91±

0,05

2,15±

0,05*

-

Краниокаудальный размер плода, см

3,12±

0,02

2,63±

0,04*

3,08±

0,03

2,05±

0,02*

2,21±

0,02*

2,13±

0,03*

2,66±

0,03*

3,27±

0,06

2,78±

0,05*

3,25±

0,05

3,14±

0,04

2,94±

0,03*

-

Масса плаценты, г

0,51±

0,01

0,51±

0,02

0,57±

0,02

0,35±

0,01*

0,44±

0,02*

0,34±

0,02*

0,44±

0,01*

0,53±

0,03

0,52±

0,02

0,60±

0,02*

0,47±

0,01

0,41±

0,02*

-

Диаметр плаценты, см

1,47±

0,01

1,50±

0,03

1,57±

0,08

1,00±

0,01*

1,04±

0,02*

0,95±

0,02*

1,31±

0,01*

1,57±

0,03

1,34±

0,03*

1,53±

0,02

1,46±

0,01

1,45±

0,02*

-

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (Р ? 0,05)


не отличался от варианта опыта с введением одного БМК (47,23±5,33%). Кроме того, для каждой пасты имели место случаи полной внутриутробной гибели плодов.

Затем мы перешли к приготовлению порошковой композиции на основе БМК и аверсектина С1, причем, содержание аверсектина С1 увеличили в 10 раз, и его соотношение к БМК составило 1:30. В скрининге композиция показала хорошие результаты (подробные данные по оценке эмбриотоксического и тератогенного действия приведены в разделе 2.2.3.). Она получила название препарат БМК плюс.

Краткая схема приготовления БМК плюс заключается в тщательном перемешивании компонентов, отгонке растворителя и высушивании продукта. Способ приготовления БМК плюс отличает простота, экономичность и количественный выход.

Препарат БМК плюс представляет собой порошок не совсем белого цвета, со специфическим запахом и горьким вкусом, смачиваемый водой.

Все наши дальнейшие исследования были посвящены детальной характеристике и испытаниям препарата БМК плюс.

2.2.3. Токсикологическая характеристика и фармакокинетика препарата БМК плюс

Острая токсичность. Опыты по определению параметров острой токсичности провели на беспородных крысах-самцах различного возраста и мышах-самцах. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Параметры острого токсического действия препарата БМК плюс

Вариант опыта

Параметры (мг/кг)

LD0

LD16

LD50

LD84

LD100

Половозрелые крысы

Неполовозрелые крысы

Мыши

1000

750

250

1250

775

525

2400

(1428?3372)

810

(786?834)

875

(698?1052)

3550

845

1225

5000

900

1500

Прокомментируем полученные данные. БМК плюс обладает различной токсичностью для крыс (половозрелых и неполовозрелых) и мышей. Он более токсичен для молодых животных по сравнению со взрослыми: LD50 в первом случае была примерно в 3 раза ниже 810 (786?834) мг/кг) и (2400 (1428?3372). Интересно отметить, что среднесмертельная доза БМК плюс для мышей находится примерно на уровне показателя для неполовозрелых крыс (875 (698?1052) и 810 (786?834) мг/кг). На наш взгляд, за эти эффекты ответственен авермектиновый компонент препарата. Различия в токсичности связаны с более интенсивным проникновением аверсектина С1 через несовершенный гемато-энцефалический барьер у неполовозрелых животных. Весьма вероятно, что препарат более токсичен для мышей по этой же причине, но уже в силу особенностей гемато-энцефалического барьера у этого вида животных.

Тем не менее, с учетом значений LD50 на всех моделях БМК плюс относится к 3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76).

Эмбриотоксическое и тератогенное действие. Как уже отмечалось выше, в скрининге БМК плюс не проявил эмбриотоксического и тератогенного действия. Однако это были сугубо предварительные исследования, где критерием было отсутствие данного побочного эффекта; результаты этих опытов помогли нам выбрать приемлемую для дальнейших экспериментов композицию. С учетом этого мы полагали необходимым провести более полную оценку препарата, результаты которой приводим в настоящем подразделе.

Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Оценка антенатального развития крыс при введении препарата БМК плюс в дозе 150 мг/кг (по БМК) (n=10; Р?0,05)

Показатели

Вариант опыта

БМК плюс

БМК

Контроль

(дистиллиро-

ванная вода)

1-2

9-12

13-14

15-19

9-12

Количество животных в группе

10

10

10

10

10

10

Предимплантационная гибель, %

4,92±2,67

5,37±2,12

5,35±2,69

4,27±2,26

5,23±2,37

5,50±3,45

Постимплантационная гибель, %

2,55±1,14

3,11±3,11

2,98±2,98

3,25±3,25

37,29±16,30*

2,08±2,08

Общая эмбриональная смертность, %

7,25±2,47

8,42±3,56

8,35±3,63

7,93±2,46

42,58±12,32*

7,78±3,44

Число случаев полной внутриутробной гибели плодов

4

Масса плода, г

2,56±0,05

2,55±0,05

2,53±0,05

2,55±0,05

2,00±0,09*

2,54±0,04

Краниокаудальный размер плода, см

3,18±0,05

3,24±0,05

3,15±0,03

3,22±0,03

2,67±0,06*

3,15±0,05

Масса плаценты, г

0,52±0,03

0,52±0,05

0,53±0,03

0,52±0,03

0,53±0,03

0,53±0,02

Диаметр плаценты, см

1,49±0,03

1,52±0,04

1,50±0,03

1,50±0,05

1,52±0,05

1,53±0,03

Число плодов с аномалиями развития, %

0

0

0

0

100

0

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (P?0,05)

Приведем небольшой комментарий.

Введение испытуемого препарата БМК плюс во все периоды эмбриогенеза не индуцировало повышенной гибели плодов. Так, например, при введении препарата на 1-2; 9-12; 13-14 и 15-19 дни беременности предимплантационная, постимплантационная и общая эмбриональная гибель составили соответственно 4,92±2,67, 2,55±1,14 и 7,25±2,47; 5,37±2,12, 3,11±3,11 и 8,42±3,56; 5,35±2,69, 2,98±2,98 и 8,35±3,63; 4,27±2,26, 3,25±3,25 и 7,93±2,46% по сравнению с контрольными значениями 5,50±3,45, 2,08±2,08 и 7,78±3,44%.

Препарат не оказал отрицательного влияния на массу и размеры плодов (таблица 3.). БМК плюс при введении во все периоды эмбриогенеза не индуцировал появления аномалий развития (внешних и внутренних) (таблица 3.). Испытуемый препарат не оказал отрицательного влияния на развитие скелета, т.к. длины зачатков окостенения основных костей не различались между опытом (БМК плюс) и контролем (дистиллированная вода).

Введение одного БМК привело к высокой гибели плодов на уровне 42,58±12,32% по сравнению с 7,78±3,44% в контроле. Имели место внешние и внутренние аномалии развития; были достоверно ниже длины участков окостенения основных костей.

Таким образом, суммируя данные настоящего раздела, можно придти к заключению, что БМК плюс в дозе 150 мг/кг не оказывает отрицательного влияния на эмбриональное развитие крыс при введении во все сроки эмбриогенеза, включая критические периоды.

Особенности фармакокинетики и биотрансформации БМК у крыс при самостоятельном введении и в составе комбинированного препарата БМК плюс. Научная работа не была бы полноценной, если бы мы не попытались понять причину способности авермектинов отменять эмбриотоксическое и тератогенное действие БМК. Одной из возможных гипотез могло быть так называемое межлекарственное взаимодействие на уровне фармакокинетики и биотрансформации.

В организме животных многих видов, в том числе и крыс, БМК гидроксилируется в 5 положении с образованием 5-гидрокси-БМК, который является продуктом детоксикации и быстро выводится из организма (P.B.C.Douch, 1973; J.A.Gardiner et al., 1968; 1975). С учетом этого обстоятельства отработали аналитический метод, ориентированный на оба продукта, т.е. БМК и 5-OH-БМК.

Принцип метода заключается в экстракции БМК и его метаболита из плазмы крови органическим растворителем и последующем определении высокоэффективной жидкостной хроматографией высокого давления при длине волны 280 нм. Нижний предел определения 0,1 мкг/мл.

Успешно решив методический аспект вопроса, мы перешли к непосредственному исследованию особенностей фармакокинетики БМК на крысах, которым его вводили в виде суспензии и в составе комбинированного препарата БМК плюс.

Основные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Динамика содержания БМК и 5-гидрокси-БМК в плазме крови крыс

после введения в виде суспензии и в составе препарата БМК плюс

Вари-ант опыта

Анали-зируемое соедине-ние

Время после введения препаратов (час)

Концентрация  (мкг/мл)

1

2

3

4

6

9

24

БМК

(сус-пензия)

БМК

5-гидро­кси-БМК

4,69±0,35

0,60±0,05

6,96±1,21

1,09±0,05

3,06±0,58

0,96±0,09

0,60±0,22

1,16±0,25

0

0,24±0,06

0

0,49±0,18

0

0

БМК плюс

БМК

5-гидро­кси-БМК

2,13±0,12

0,62±0,04

0,89±0,40

0,32±0,07

0,12±0,06

0,35±0,04

0,10±0,06

0,24±0,01

0,10±0,10

0,96±0,40

0

0,34±0,16

0

0,13±0,04

Как следует из приведенных в таблице данных, уже через 1 час после введения суспензии БМК крысам его содержание в плазме крови составило 4,69±0,35 мкг/мл. Максимальную концентрацию препарата установили на 2 часа, и она равнялась 6,96±1,21 мкг/мл. В дальнейшие периоды времени уровень БМК постепенно снижался и уже через 6 часов препарат в плазме крови крыс не обнаружили.

Перейдем к анализу результатов определения БМК после его введения в виде комбинированного препарата с аверсектином С1.

Максимальный уровень определили уже через 1 час после введения композиции (2,13±0,12 мкг/мл). В последующие сроки анализа содержание БМК снизилось, и спустя 9 часов препарат в плазме крови крыс не обнаружили.

В таблице 4 также приведены результаты определения концентрации основного метаболита БМК – гидроксилированного в 5-ом положении продукта. В данном случае при введении суспензии БМК концентрация метаболита в период 2-4 часов сохранялась примерно на одном уровне (1,09±0,05?1,16±0,25 мкг/мл). Через 6-9 часов, когда сам БМК уже не обнаруживали, 5-гидрокси-БМК еще находился в плазме крови крыс.

Несколько иная ситуация сложилась при введении крысам препарата БМК плюс. Максимальную концентрацию продукта определили уже через 1 час после введения препарата (0,62±0,04 мкг/мл) с подъемом на 6 часов (0,96±0,40 мкг/мл). Даже через 24 часа после введения БМК плюс (т.е. когда сам БМК уже отсутствовал) его гидроксилированная форма еще находилась в плазме крови (0,13±0,04 мкг/мл).

Полученные результаты позволяют отметить следующее: первое, концентрация БМК при введении препарата БМК плюс на все тестированные периоды была ниже по сравнению с вариантом опыта, когда вводили один БМК. В частности, максимальный уровень БМК в плазме крови крыс которым вводили комбинированный препарат, был примерно в 3,3 раза ниже. Второе, в случае препарата БМК плюс максимум отмечали через 1 час в отличие от 2 часов для суспензии БМК. Наконец третье, при введении препарата БМК плюс на фоне более низкой концентрации самого БМК относительное содержание 5-гидрокси-БМК было не только сравнимо, но и в некоторые периоды выше, чем при введении суспензии БМК.

Следующим этапом нашей работы был фармакокинетический анализ полученных данных, результаты которого приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Фармакокинетические параметры БМК и его метаболита 5-OH-БМК

в плазме крови крыс после однократного перорального введения

суспензии БМК и БМК плюс в дозе 300 мг/кг (по БМК) (n=3)

Параметры

Размерность

Исследуемый препарат

БМК

БМК плюс

Неизмененный БМК

5-OH-БМК

Неизмененный БМК

5-OH-БМК

AUCt

мкг/мл

16,13

5,08

3,39

8,09

AUC?

мкг/мл

16,14

5,24

3,47

9,36

Tmax

ч

2,00

4,00

1,00

6,00

Cmax

мкг/мл

6,96

1,16

2,13

0,96

Clpo

л/ч

18,59

-

86,89

-

Kel

ч-1

0,9192

0,4967

0,6344

0,0959

t?

ч

0,75

1,40

1,90

7,23

MRT

ч

2,15

3,50

1,75

12,05

Vz

л

20,23

-

136,30

-

Основные параметры, характеризующие биодоступность соединений, AUCt и AUC?, свидетельствуют о том, что биодоступность БМК в плазме крови была существенно выше при введении суспензии по сравнению с введением БМК плюс (16,13; 16,14 против 3,39; 3,47 мкг/мл?ч). В то же время биодоступность его основного метаболита в случае одного БМК была ниже (5,08; 5,24 против 8,09; 9,36 мкг/мл?ч). Фармакокинетический анализ подтвердил, что максимальная концентрация БМК при его введении в виде суспензии имеет место на 2 часа, в то время как при введении БМК плюс – несколько раньше, точнее через 1 час. В противоположность этому максимум продукта биотрансформации БМК наблюдали несколько позже при введении БМК плюс соответственно через 4 и 6 часов.

Расчет фармакокинетических параметров позволил интерпретировать и саму максимальную концентрацию обоих продуктов. Как уже отмечалось ранее, значение Cmax БМК было выше при введении суспензии по сравнению с вариантом опыта, когда вводили БМК плюс (6,96 по сравнению с 2,13 мкг/мл). Очень интересная ситуация складывается с концентрацией 5-OH-БМК. Максимальный уровень метаболита при введении одного БМК был выше (1,16 против 0,96 мкг/мл). Однако наиболее примечательным фактом является то, что в случае БМК плюс параметр MRT, характеризующий среднее время удерживания соединения в организме, был существенно выше (12,05 по сравнению с 3,50 ч).

Рассмотрим еще один фармакокинетический параметр Vz, кинетический объем распределения, и в данном случае имеется своего рода интрига. Поясним это положение. Значение Vz для БМК при введении суспензии существенно ниже по сравнению с БМК плюс. Это означает, что при введении комбинированного препарата БМК лучше проникает через биологические мембраны и в большей степени распределяется в периферических органах и тканях. Последнее несколько противоречит нашим представлениям о том, что более низкая концентрация БМК и является причиной отмены эмбриотропного действия соединения. Однако следует учитывать, что одновременно шла интенсивная биотрансформация БМК в продукт детоксикации, т.е. 5-OH-БМК, т.е. его выделение. Об этом свидетельствует более высокое значение клиренса Clpo (86,89 против 18,59 л/ч).

Последнее, что хотелось бы упомянуть при анализе фармакокинетических параметров, так это период полураспада. Значение t? БМК и 5-гидрокси-БМК при введении БМК плюс было выше по сравнению с суспензией одного БМК.

Таким образом, суммируя результаты настоящего раздела в целом, можно сделать следующие выводы. Имеются очевидные особенности фармакокинетики и метаболизма БМК при его введении в виде суспензии и в составе комбинированного препарата, которые, на наш взгляд, и объясняют предупреждение эмбриотропного действия бензимидазолкарбамата. Каким образом это повлияло на возникающие при этом феномене нарушения на клеточном уровне, мы попробуем выяснить в следующем разделе.

Влияние БМК и препарата БМК плюс на митоз клеток костного мозга у крыс и мышей. Известно, что антимитотическое действие бензимидазолкарбаматов лежит в основе эмбриотропного эффекта соединений этого класса. Само антимитотическое действие бензимидазолкарбаматов является результатом нарушения структуры и функций митотического веретена за счет ингибирования полимеризации тубулина в микротубулы (P.A.Friedman, E.Platzer, 1978; C.M.Ireland et al., 1979; J.P.Laclette, G.Guerri, C.Zetina, 1980 и многие другие). C другой стороны, эффективность и токсичность препаратов, как правило, зависит от их концентрации в области молекул-мишеней. Таким образом, с учетом установленных различий в содержании неизмененного БМК и 5-гидрокси-БМК следует ожидать существенных изменений в отношении влияния БМК плюс на митоз.

Антимитотическое действие испытуемого препарата в сравнении с самим БМК и контролем оценивали на двух лабораторных моделях крысах и мышах в дозе 300 мг/кг по БМК.

В таблице 6 приведены данные по влиянию БМК на показатели митотической активности клеток костного мозга крыс при его различном введении.

Таблица 6.

Влияние БМК и препарата БМК плюс в дозе 300 мг/кг (по БМК)

на митоз клеток костного мозга крыс (n=5; P?0,5)

Вариант опыта

Митотический индекс, %

Количество отдельных стадий митоза, %

Профаза

Метафаза

Анафаза

Телофаза

Контроль

1,08±0,65

11,19±8,17

37,97±7,81

27,12±7,86

23,73±8,04

БМК 3 часа

2,89±1,00

7,90±5,29

76,29±2,68*

9,42±5,25

6,38±5,33

БМК 6 часов

2,99±1,08

10,56±5,12

72,14±2,86*

9,38±5,15

7,92±5,20

БМК 24 часа

2,67±1,02

11,11±5,47

72,73±3,03*

9,09±5,53

7,07±5,59

БМК плюс 3 часа

0,89±0,59

11,43±8,95

48,98±7,22

21,43±8,95

18,16±9,68

БМК плюс 6 часов

0,89±0,59

11,43±8,95

48,98±7,22

21,43±8,95

18,16±9,68

БМК плюс 24 часа

0,83±0,57

19,57±9,35

38,04±8,21

23,91±9,09

18,48±9,41

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (P?0,05)

Выделим основные моменты. Введение одного БМК привело к достоверному увеличению относительного количества метафаз и снижению доли других стадий митоза. Так, например, число метафаз через 3; 6 и 24 часа после введения суспензии БМК составило соответственно 76,29±2,68; 72,14±2,86 и 72,73±3,03% против 37,97±7,81% в контроле. Также имело место повышение митотического индекса за счет остановки клеточного деления на стадии метафазы.

Иная ситуация сложилась при введении препарата БМК плюс. В данном случае относительное количество метафаз на все периоды исследования, т.е. 3; 6 и 24 часа, составило соответственно 48,98±7,22; 48,98±7,22 и 38,04±8,21% против контрольного значения 37,97±7,81%.

В таблице 7 приведены результаты по оценке антимитотического действия БМК и БМК плюс на мышах.

Рассматривая полученные данные, можно придти к заключению об их идентичности с результатами исследований на крысах. То есть, суспензия БМК привела к достоверному повышению относительного количества метафаз, которое свидетельствовало об остановке клеточного деления на стадии метафазы и накоплении метафаз. Так, например, через 3; 6 и 24 часа после введения одного БМК количество метафаз равнялось 75,68±3,63; 81,91±2,44 и 80,08±2,82%. Кроме того, уменьшилось количество других стадий митоза (таблица 7). Причем, интересно отметить, что максимальный ингибирующий эффект наблюдали на 6 часов, в то время, как у крыс – через 3 часа после введения препарата; кроме того, действие препарата у мышей было несколько еще более выраженным.

Таблица 7.

Влияние БМК и препарата БМК плюс в дозе 300 мг/кг (по БМК)

на митоз клеток костного мозга мышей (n=5; P?0,05)

Вариант

опыта

Митотический индекс, %

Количество отдельных стадий митоза, %

Профаза

Метафаза

Анафаза

Телофаза

Контроль

0,75±0,55

27,91±9,16

37,21±8,54

17,44±9,80

17,44±9,80

БМК 3 часа

1,62±0,80

8,65±7,03

75,68±3,63*

9,19±7,01

6,49±5,92

БМК 6 часов

2,66±1,02

6,25±5,55

81,91±2,44*

7,57±5,52

4,28±5,61

БМК 24 часа

2,23±1,37

7,57±6,07

80,08±2,82*

7,97±6,06

4,38±6,15

БМК плюс 3 часа

0,71±0,53

20,78±10,14

38,96±8,44

18,18±10,31

22,08±10,06

БМК плюс 6 часов

0,97±0,62

25,0±8,33

35,19±7,75

23,15±8,44

16,67±2,15

БМК плюс 24 часа

0,98±0,62

20,56±8,62

35,51±7,76

20,56±8,62

23,36±8,46

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (P?0,05)

После введения БМК плюс показатели митотической активности популяции клеток костного мозга на все периоды не отличались от контрольных значений.

Таким образом, БМК плюс в отличие от самого БМК не оказывает отрицательного влияния на клеточное деление на двух видах лабораторных животных.

С антимитотическим эффектом бензимидазолкарбаматов непосредственно связано их цитогенетическое действие.

С учетом этих данных мы провели дальнейшие, более развернутые исследования с использованием метафазного метода анализа, позволяющего детектировать хромосомные нарушения.

БМК в виде суспензии и препарата БМК плюс вводили однократно перорально мышам в обоих случаях в дозе 300 мг/кг по БМК.

Как следует из приведенных данных, введение одного БМК привело к достоверному повышению числа аберрантных метафаз (таблица 8). В абсолютном значении из 300 анализированных метафаз 88 имело нарушения; в процентном выражении доля аберрантных метафаз составила 29,33±2,63 против 8,67±1,62% в контроле (P?0,05).

С другой стороны, при введении препарата БМК плюс число аберрантных метафаз не отличалось статистически значимым образом от контроля (10,33±1,76 по сравнению с 8,67±1,62% в контроле).

Данные последующей таблицы 9 помогут нам понять, какие конкретно нарушения хромосом имели место при введении испытуемых препаратов.

Таблица 8.

Оценка цитогенетического действия в популяции клеток костного мозга мышей через 6 часов после введения БМК и БМК плюс

в дозе 300 мг/кг (n=3; P?0,05)

Вариант

опыта

Число анализированных метафаз

Число метафаз с нарушениями

Абсолютное

количество, %

Относительное количество, %

БМК

300

88

29,33±2,63

t=6,69*

БМК плюс

300

31

10,33±1,76

t=0,69

Контроль

300

26

8,67±1,62

* Различие по данному показателю статистики достоверно между опытной и контрольной группами (P?0,05 при tкритическом=1,96)

Таблица 9.

Спектр структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга

через 6 часов после введения БМК и БМК плюс (n=3; P?0,05)

Вари-

ант опыта

Спектр нарушений

Расхождение по центромере (абсолютное количество/относительное количество,  %)

Фрагменты

ГЭПы (абсолютное количество/отно­сительное количество, %)

Хромосомные (абсолютное количество/относительное количество,  %)

Хроматидные (абсолютное количество/относительное количество,  %)

БМК

42

14,00±2,00

t=4,17*

34

11,33±1,83

t=3,60*

0

7

2,33±0,87

t=2,15*

БМК плюс

21

7,00±1,47

t=1,42

18

6,00±1,37

t=1,33

0

2

0,67±0,47

t=0,60

Контроль

13

4,33±1,18

11

3,67±1,09

0

1

0,33±0,33

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (P?0,05 при tкритическом = 1,96)

Основные детектированные нарушения выражались в расхождении по центромере и наличии хромосомных фрагментов. Так, при введении БМК количество метафаз с указанными аномалиями составило в процентном выражении (14,00±2,00; 11,33±1,83 в сравнении с 4,33±1,18; 3,67±1,09% в контроле; P?0,05). Количество ГЭПов было относительно небольшим, но оно было статистически достоверно выше по сравнению с контролем (2,33±0,87 против 0,33±0,33%).

Таким образом, подводя итог данным, приведенным в настоящем подразделе, можно отметить следующее. Введение суспензии БМК приводит к выраженному нарушению митоза, которое проявляется в остановке клеточного деления на стадии метафазы, а также индукции структурных нарушений хромосом. В отличие от этого препарат БМК плюс подобными эффектами не обладает.

Подострая токсичность препарата БМК плюс. Несмотря на то, что, вероятнее всего, БМК плюс будет рекомендован в качестве противопаразитарного препарата при однократном-двукратном применении, для более полной характеристики будущего лекарственного средства провели оценку его токсических свойств при повторных введениях.

БМК вводили крысам в течение 7 суток в дозах, кратных установленному значению LD50 для взрослых крыс: 1/5; 1/10; 1/20 и 1/50 (или 480; 240; 120 и 48 мг/кг).

Отметим наиболее важные факты, установленные в ходе опыта. В группе крыс, которым БМК плюс вводили в самой высокой дозе, т.е. 480 мг/кг, примерно после двух введений появились признаки интоксикации (из которых особо можно выделить угнетение, тремор, судороги, отказ от корма). При дальнейшем введении препарата в данной опытной группе к концу опыта пало 5 из 7 крыс.

Более низкая доза 240 мг/кг также вызывала у крыс аналогичные симптомы интоксикации, которые появились несколько позднее, на 4 сутки и выраженность которых была слабее; к концу опыта в данной группе пало 1 из 7 животных.

Следует отметить, что за описанные симптомы отравления ответственен аверсектин С1, поскольку они являются характерными для авермектинов.

На графике приведены результаты мониторинга прироста массы тела у опытных крыс в сравнении с контролем.

При введении препарата в дозах 480 и 240 мг/кг относительный привес массы тела был достоверно ниже по сравнению с контролем, и более того, масса тела опытных крыс была ниже по сравнению с исходным периодом. Дозы 120 и 48 мг/кг не оказали статистически значимого влияния на динамику прироста массы тела (рис. 1).

Рис.1. Динамика прироста массы тела крыс при введении

препарата БМК плюс в четырех дозах

В настоящем опыте оценили влияние БМК плюс на значения массовых коэффициентов органов. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение испытуемого препарата в двух верхних дозах 480 и 240 мг/кг привело к статистически достоверному повышению массового коэффициента почек (8,52 и 7,70±0,29 по сравнению с 6,50±0,10 в контроле). Две другие тестированные дозы (120 и 48 мг/кг) не оказали статистически значимого влияния на относительную массу всех органов, включенных в анализ.

Токсическое действие препарата оценили также по его влиянию на гематологические показатели; результаты приведены в таблице 10.

Таблица 10.

Гематологические показатели у крыс после перорального введения

препарата БМК плюс в четырех дозах в течение 7 суток (n = 7; Р?0,05)

г

р

у

п

п

ы

Показатель

Доза, мг/кг, среднее значение ± средняя арифметическая ошибка (М±m), t-критерий

480

240

120

48

 

Контроль

(дистиллированная вода)

1

Гематокрит (%)

 

50,85**

45,18±0,90

t=0,43

43,49±0,41

t=1,52

45,20±0,50

t=0,61

44,69±0,61

2

Гемоглобин (г/л)

 

161,50**

143,83±2,95

t=1,43

136,57±1,27

t=0,64

143,14±1,97

t=1,55

138,29±2,13

3

Эритроциты (1012/л)

9,76**

8,34±0,22

t=0,85

7,80±0,15

t=1,32

8,05±0,17

t=0,24

8,10±0,14

4

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (пг)

16,60**

17,27±0,11

t=1,21

17,54±0,25

t=1,64

17,37±0,26

t=1,11

17,07±0,10

5

Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (%)

31,75**

31,85±0,34

t=2,17

31,41±0,06

t=2,01

31,66±0,21

t=2,25

30,96±0,20

6

Средний объем эритроцита (мкм3)

52,25**

54,23±0,81

t=0,99

55,83±0,83

t=0,63

56,30±0,95

t=0,98

55,19±0,44

7

Показатель анизоцитоза эритроцитов (%)

15,35**

14,77±0,21

t=1,00

14,36±0,22

t=0,58

14,56±0,09

t=0,27

14,51±0,11

8

Лейкоциты (109/л)

2,65**

10,12±1,13

t=2,39*

11,67±0,83

t=1,72

13,36±1,05

t=0,51

14,19±1,08

9

Тромбоциты (109/л)

825,50**

845,83±78,75

t=0,23

748,57±3,93

t=1,77

641,43±84,87

t=1,94

826,57±25,35

Лейкоцитарная формула (%)

10

Палочкоядерные нейтрофилы

1,00**

2,50±0,89

t=0,05

1,29±0,42

t=1,0

2,00±0,76

t=0,32

2,43±0,97

11

Сегментоядерные нейтрофилы

69,50**

62,67±7,23

t=3,24*

32,57±3,56

t=0,21

28,29±1,84

t=1,09

33,86±4,36

12

Эозинофилы

0**

0,50±0,34

t=0,93

0,29±0,18

t=0,57

0,57±0,30

t=1,20

0,14±0,14

13

Моноциты

6,0**

4,83±1,11

t=0,22

6,14±0,83

t=0,83

5,71±0,47

t=0,60

5,14±0,74

14

Лимфоциты

23,50**

29,50±6,79

t=3,16*

59,71±4,51

t=0,17

63,43±6,15

t=0,58

58,43±5,18

* Р?0,05 при tкритическом =2,18

** среднее по двум значениям (для 2 крыс, оставшихся в группе к концу опыта)

Отметим статистически значимые изменения. К ним относятся снижение числа лейкоцитов в дозах 480 и 240 мг/кг (2,65 и 10,12±1,13 против 14,19±1,08 (109/л) в контроле). Кроме того имело место изменение лейкоцитарной формулы с уменьшением относительного числа лимфоцитов и повышением количества сегментоядерных нейтрофилов (таблица 10).

Кратко об изменениях биохимических показателей, имевших место при введении препарата БМК плюс. Отметим отклонения, которые были общими для доз препарата 480 и 240 мг/кг. В данном случае имело место снижение активности альфа-амилазы (272,50 и 343,50±17,74 по сравнению с 457,86±23,07 Е/л в контроле) и снижение уровня глюкозы (2,57 и 3,92±0,40 против контрольного значения 6,31±0,18 ммоль/л).

Дозы испытуемого препарата 120 и 48 мг/кг не оказали влияния на тестированные биохимические показатели крови.

Было проведено макро- и микроскопическое исследование органов крыс. При введении препарата в самой верхней дозе отмечали патологические изменения в печени (полнокровие центральных вен и вен портальных трактов); легких (сладжи эритроцитов); сердце (очаговый межуточный отек; кровоизлияния, нарушения микроциркуляции крови в виде стазов); головном мозге (периваскулярный и перицеллюлярный отек). Судя по изменениям в желудке (нарушения микроциркуляции крови в виде стазов, сладжи эритроцитов) и тонком кишечнике (периваскулярные кровоизлияния в подслизис­том слое, кровоизлияния в просвет), препарат оказывал раздражающее действие на слизистые пищеварительного тракта при повторных введениях. Введение БМК плюс в дозе 240 мг/кг вызывало описанные изменения только в головном мозге, желудке и тонком кишечнике; в дозе 120 мг/кг – только в головном мозге. Наконец, все анализированные органы крыс, получавших БМК плюс в дозе 48 мг/кг, были типичного гистологического строения.

С учетом данных по гибели крыс, динамике прироста массы тела, результатов определения массовых коэффициентов органов, гематологических и биохимических показателей, макро- и микроскопического исследования органов дозы БМК плюс 480 и 240 мг/кг являются токсическими, доза 120 мг/кг – пороговой и доза 48 мг/кг – недействующей.

Антигельминтная эффективность препарата БМК плюс на овцах. Большой объем других исследований, таких как отбор авермектинов, приготовление препарата, тщательная токсикологическая характеристика БМК плюс, по сути дела, исключил возможность проведения больших экспериментов по оценке противопаразитарной активности препарата. Тем не менее, мы провели небольшой опыт, который также заслуживает внимания.

Опыт провели в частном хозяйстве Смоленской области ООО «Пригорское». Во всех случаях дозы выражали по БМК.

Введение препарата БМК плюс в дозах 100 и 25 мг/кг обеспечивало 100% эффективность при гемонхозе овец. БМК был эффективен лишь на 60% только в дозе 150 мг/кг, интенсивность инвазии при этом составила 3,60±3,12 экз./животное.

Введение препарата БМК плюс в дозах 100 и 25 мг/кг привело к полному освобождению овец от нематодир. Эффективность чистого БМК в самой высокой дозе, составляющей 150 мг/кг, равнялась 60%; препарат был неэффективным в более низких дозах 50 и 100 мг/кг массы тела.

Эффективность испытуемого препарата БМК плюс при мюллериозе овец в дозах 100 и 25 мг/кг в обоих случаях составила 100%. БМК был существенно менее эффективным (ЭЭ=20% в дозе 150 мг/кг).

Высокая эффективность против нематод не вызывает удивления, поскольку в состав БМК плюс входят два эффективных нематодоцида, и общее действие может быть результатом аддитивного или синергического эффекта. Однако, на наш взгляд, мы столкнулись с более интересным явлением, которое, конечно, нужно еще тщательно исследовать.

Препарат БМК плюс проявил 100% эффективность против мониезий в дозах 100 и 25 мг/кг. БМК «сработал» на 100% только в дозе 150 мг/кг. В дозе 100 мг/кг БМК обеспечил 80% эффективность, а в дозе 50 мг/кг он вообще не был активен против мониезий.

Возможно, что снижение терапевтических доз при нематодозах и, тем более при мониезиозе, происходит за счет того, что авермектиновый компонент усиливает проникающую способность БМК и прохождение через биологические мембраны.

Очень важным наблюдением является тот факт, что БМК плюс хорошо переносился овцами в указанных дозах, и отсутствовали какие-либо признаки интоксикации.

Выводы

1. Проведен скрининг ряда производных авермектинов и композиций на их основе в отношении отмены эмбриотоксического и тератогенного действия БМК в дозах 0,25-250 мг/кг. Наилучшие результаты показали авермектин В2а (в дозе 6 мг/кг); авермектин А1 (в дозе 1,9 мг/кг) и аверсектин С1 (в дозе 0,5 мг/кг).

2. Приготовлен комбинированный препарат БМК плюс в виде порошка, в котором соотношение БМК к аверсектину С1 составляет 30:1.

3. LD50 препарата БМК плюс для взрослых и неполовозрелых крыс составляет соответственно 2400 (1428?3372) и 810 (786?834) мг/кг; значение среднесмертельной дозы для мышей равно 875 (698±1052) мг/кг. Препарат относится к 3 классу опасности согласно гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76.

4. При введении БМК плюс в дозе 150 мг/кг (по БМК) беременным крысам на 1-2; 9-12; 13-14 и 15-19 дни эмбриогенеза препарат в отличие от самого БМК не проявляет эмбриотоксического и тератогенного действия

5. Апробирован и адаптирован метод анализа БМК и его основного метаболита в плазме крови на основе ВЭЖХ с УФ-детектированием; нижний предел определения для обоих продуктов составляет 0,1 мкг/мл.

6. Установлены особенности фармакокинетики и биотрансформации препарата БМК плюс по сравнению с суспензией БМК, заключающиеся в более низкой биодоступности неизмененного БМК в плазме крови, усилении его превращения в неактивный метаболит и более быстром удалении БМК из биофазы.

7. При введении крысам и мышам в дозе 300 мг/кг БМК плюс в отличие от самого БМК не оказывает отрицательного влияния на митоз и генетический аппарат клеток костного мозга.

8. Оценена токсичность БМК плюс в условиях субхронического опыта при пероральном введении в дозах 480; 240; 120 и 48 мг/кг (соответственно 1/5; 1/10; 1/20 и 1/50 от LD50, установленной в остром опыте на взрослых крысах). С учетом результатов определения динамики прироста массы тела, массовых коэффициентов органов, гематологических и биохимических показателей, макро- и микроскопического исследования органов дозы 480 и 240 мг/кг являются токсическими, доза 120 мг/кг – пороговой и доза 48 мг/кг – недействующей.

9. БМК плюс проявил 100% эффективность в дозе 25 мг/кг (по БМК) против гемонхов, нематодир, мюллерий и мониезий у овец в отличие от самого БМК, который был эффективен в более высоких дозах 100-150 мг/кг.

Практические предложения

1. Адаптированный и отработанный метод определения БМК и его метаболита 5-гидрокси-БМК на основе жидкостной хроматографии высокого давления рекомендуется применять для анализа указанных продуктов.

2. Способ получения БМК плюс в лабораторных условиях можно использовать для приготовления препаратов на основе других бензимидазолкарбаматов и авермектинов.

3. Материалы диссертационной работы могут быть использованы для чтения лекций по дисциплине «Паразитология» в высших учебных заведениях, на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, при подготовке соответствующих инструкций, приказов, нормативных документов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мельникова М.Ю. Предупреждение эмбриотропного действия БМК под действием авермектинов/Мельникова М.Ю., Дриняев В.А., Мосин В.А.//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». – М. – 2010. – Вып. № 11. – С. 281-284.

2. Мельникова М.Ю. Изучение острой токсичности комбинированного препарата на основе БМК и аверсектина С1//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». – М.  – 2011. – Вып. № 12. – С. 299-300.

3. Мельникова М.Ю. Субхроническая токсичность препарата БМК плюс//Российский паразитологический журнал. – 2011. – № 4. – С. 118-122.

4. Мельникова М.Ю. Динамика содержания БМК и его основного метаболита в плазме крови при его введении отдельно и в составе комбинированного препарата БМК плюс/Мельникова М.Ю., Новик Т.С., Авчук С.В., Тер-Симонян В.Г.//Рос­сийский паразитологический журнал. – 2011. – № 4. – С. 123-124.

 
Авторефераты по темам  >>  Разные специальности - [часть 1]  [часть 2]



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.