WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных

Автореферат докторской диссертации

 

На правах рукописи

 

 

ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

 

Идентификация и характеристика  биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов  животных

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

 

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

 

 

Москва - 2012          

 

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)

Научный консультант:  доктор биологических наук, профессор

Верховский Олег Анатольевич

Официальные оппоненты:      

Поляков Виктор Филиппович, доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, ведущий научный сотрудник

Булычева Татьяна Ивановна, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, заведующая лабораторией                                                    

Власова Наталья Никифоровна,   доктор биологических наук, старший научный сотрудник,  ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии, заведующая лабораторией                                                    

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет»

Защита состоится «_____»   __________2012 г. в ________ часов  на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии  по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект,24,к.1,ВИЭВ, тел. (495) 970-03-69.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии

Автореферат разослан «_____»  ______________ 2012 г.     

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                                

д.вет.н., профессор                                                                 А.Х. Найманов     

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

 

В основе научного прогресса лежит эволюция методических приемов, используемых для решения современных задач иммунологии. Внедрение новой методологии, совершенствование методов исследования – главный фактор повышения уровня знаний в области молекулярной биологии иммунного ответа, где ключевую роль играют антитела, рецепторы иммунокомпетентных клеток, межклеточные взаимодействия.

Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной кооперации трех основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008).  Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами (МкА), были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation – символом CD  и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных.  30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF),  при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат  общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000; Рабсон А. и др., 2006; Бурместер Г.-Р. И др., 2007 и др.).  IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин А.А., 1999; Давтян Т.К. и др.,2005; Сидорова Е.Б., 2006 и др.).

Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов  (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR – антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы  (Кирюхин А.В. и др., 2003;  Добротина Н.А. и др., 2005; Артюхов В.Г и др., 2006 и др.).

Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности,  механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их биологических свойств, а именно функциональных и рецепторных,  в процессах онто- и иммуногенеза являются перспективным направлением  для определения иммунологической эффективности  биологических  препаратов, создания новых безопасных вакцин – основы специфической профилактики болезней животных.

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан  комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (HainesD.M. и  WestK.H., 2005; Саидов М.З. и др., 2006; Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Этот и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель работы – разработка методологии идентификации белков суперсемейства иммуноглобулинов животных и характеристика их биологических свойств  в процессе фило-, онто- и иммуногенеза.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие  задачи:

1. Разработать способы получения и идентификации  иммуноглобулинов изотипов G, М, А  (IgG, IgM, IgA)   рогатого скота.

2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G,  А   в биологических жидкостях организма рогатого скота.

3. Усовершенствовать  методы изучения и оценки растворимых и мембраносвязанных  форм белков суперсемейства иммуноглобулинов.

4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к IgM.

5. Определить методические принципы оценки протективных свойств белков IgSF в процессе поствакцинального иммуногенеза.

6. Дать характеристику растворимым и мембраносвязанным формам Ig крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза.

7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»;  задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота  (Авторское свидетельство № 1560549 от 3.01.90 г. в соавторстве);

-  разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота   (Патент на изобретение № 2277421 от 5 апреля 2005 г. в соавторстве);

- разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (Патент на изобретение № 2288008 от 27 ноября 2006 г. в соавторстве);

- разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток  для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (Патент на изобретение № 2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в  крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.

Практическая значимость.  Систематизированы  экспериментальные данные  о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.

Разработаны в соавторстве и утверждены в установленном порядке:         

- «Набор компонентов  для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота  методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ № 9388-0039-00008064-96, 1996 г.;

- временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота  методом радиальной иммунодиффузии № 13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных» (Сибирское отделение РАСХН, Новосибирск, 2003 г.);

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина G в биологических жидкостях рогатого скота (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. протокол № 3);

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. протокол № 3).

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

-  методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол № 1) (авторы: Ю.Н.Федоров и И.Ю.Ездакова);    

- методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);

- методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом  иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю. Ездакова);

- методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня  иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.04.2010 г. протокол № 2) (авторы: И.Ю. Ездакова и Т.А.Чеботарева).

Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й  «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в  1998 г.,2008 г. и 2012 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных; «Звезда И.И.Мечникова» в 2010 г. за инновационное развитие и продвижение научного наследия И.И. Мечникова.

 

Апробация работыОсновные результаты работы доложены:

- на Всероссийской  научно-практической  конференции, посвященной  30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000);  Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008); Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); на 22-ой Международной ежегодной конференции Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Эгмонд, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), «Московские Мечниковские чтения» (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 научные работы, в том числе 15 работ в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных», 1 авторское свидетельство и 3 патента на изобретение.

Л.П.Дьяконову

 Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоя­тельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях.     Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методи­че­ской помощи д.б.н., профессору                         , д.вет.наук, профессору М.А. Сидорову, д.б.н., профессору О.А. Верховскому, к.б.н. Т.А Чеботаревой, научным сотрудникам ВИЭВ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 354 страницах компьютерного  текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения.

Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей и 53 рисунками. Список литературы включает 421 источник, из них  209   зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- получение препаратов для изучения и характеристики иммуноглобулинов крупного рогатого скота;

- совершенствование иммунологических методов исследования Т- лимфоцитов,  В- лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания растворимой и мембраносвязанной форм Ig  рогатого скота в различные периоды онтогенеза; 

 - функциональные и рецепторные свойства IgSF иммунокомпетентных клеток  млекопитающих, птиц и рыб в реакциях различного генеза.

Материалы и методы исследований

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко в период 1985-2011 гг. Общая схема исследований представлена на рис. 1.

 


Рис.1. Общая схема исследований

В качестве объектов исследования  использованы различные виды животных -  мыши линии BALB/c, гибриды  F1 (BALB/c х DBA/2)  и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, овцы,  SPF-куры, норки, серебряные караси.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг)  и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы, кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка»  и «Биссеровский»  Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о.Лисий. Образцы крови норок и кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ. Проведено более 5000 исследований образцов биологических жидкостей различных видов животных.

При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 («Щелковский биокомбинат»), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО «Ветзвероцентр»).

IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученных препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови  крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза  в полиакриламидном геле (ПААГ-ДСН) в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Иммуноблоттинг проводили в буферной системе H.Towbin et al. (1979).

Иммунизацию кроликов породы «Советская шиншилла»  с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским в нашей модификации.

Моноклональные антитела к IgM (Федоров Ю.Н., Сологуб В.К. и др., 1988) и IgA (Феоктистова Т.А. и др., 2003) рогатого скота получали по разработанной схеме  на основе методики P.S. Paul et al. (1985).

Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).

Концентрацию иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии – РИД (Manchini G. et al., 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Е-РО), теофиллиновом тесте  (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (А-РО)  (Лебедев К.А. и др.,1981).

Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcusaureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам.          Исследование  механизмов межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в  реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (РКВ) (Горбачева Л.Д. и др., 1981).

Тест-системы с использованием моноклональных антител основаны на «сэндвич»-варианте твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве конъюгатов использовали МкА 6В8 к IgA рогатого скота, меченные пероксидазой хрена. Изотипы Ig мышей определяли с помощью  биотин-антииммуноглобулинового и авидин-пероксидазного конъюгатов, согласно инструкции фирмы производителя (Sigma ImmunoChemicals). Результаты оценивали с помощью фотометра  «Multiskan MCC/340» по коэффициенту оптического поглощения (ОП 492). 

Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали лимфоцитотоксический тест (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток – ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию  непрямой иммунофлуоресценции – РНИФ  (Новикова М.С.,1990).

Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми мето­дами с исполь­зованием про­граммы Excel для Windows. Значение крите­рия достоверности оценивали по таблице вероятно­стей Стьюдента-Фи­шера в зависимости от объема анализи­руемого ма­териала. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

 

Результаты исследований

Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные – мембраносвязанные  ILT- рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Задачей первого этапа  работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IgG, IgM, IgA и лейкоцитов с ILT–рецепторами.

Выделение IgG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота

Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и  молозива крупного рогатого скота является IgG, для его получения использовали эти биологические жидкости. Для выделения IgG  использована ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка. Для десорбции Ig использовали повышение ионной силы элюирующего раствора с применением градиента концентрации  NaCl от 0,1 М до 0,4 М.

Осажденные ?-глобулины из сыворотки крови и молозива наносили на колонки с DEАЕ Sepharose 6B. В качестве элюирующего раствора использовали 0,02 М Tris-HCl, рН 7,2 с 0,1М, 0,15М,0,25М и 0,4М  NaCl.

Методом иммуноэлектрофореза  установлено, что IgG элюировался в первом белковом пике при 0,1 M NaCl, IgA во втором при 0,15 M NaCl, а IgM в третьем при  0,25 M NaCl. Элюаты концентрировали в ПЭГ 40000. Степень чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов проверяли методом  электрофореза в ПААГ-ДСН.

В результате проведения ионообменной хроматографии из  2 мл ?-глобулинов сыворотки крови   получали 1,0 мл  IgG с содержанием белка 10-15 мг/мл.

 

Разработка способа получения IgА из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота

Иммуноглобулины класса А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA  и незначительная его концентрация затрудняют его выделение   из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной.  

Для выделения sIgA сыворотку молозива животных  обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и  этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl). Для получения sIgA из носовых секретов крупного рогатого скота, данную биологическую жидкость в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин. и проводили диализ против 0,02 М Тris-HCl буфера рН 8,0, далее диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR.  Иммунохимическую чистоту sIgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.

Полученные иммунохимически чистые иммуноглобулины использованы для изготовления моноспецифических антисывороток к изотипам G и А крупного рогатого скота, необходимых при оценке уровня сывороточных Ig на первом уровне иммунологического мониторинга.

Иммунохимические свойства моноклональных антител к IgM и sIgA  рогатого скота

В результате проведенной работы по гибридизации клеток лимфоцитов иммунных  мышей  BALB/c с клетками миеломы  Sp 2/0 получены гибридомы-продуценты МкА  к   иммуноглобулинам классов  M и A крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено  и  протестировано  более  10000  первичных гибридных клеточных клонов. Получен набор асцитических  препаратов, с помощью иммуноблоттинга и различных серологических тестов дана иммунохимическая характеристика МкА.  Результаты проведенных исследований приведены в табл.1.

Таблица 1

Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM и IgА крупного рогатого скота и овец.

МкА

IgG

IgA

IgM

Тип эпитопа

Димер

Цепи

Пента

мер

Цепи

 

?

L

?

L

С2

-

-

-

-

+

-

-

конформационный

С4

-

-

-

-

+

-

-

конформационный

G9

-

-

-

-

+

-

-

конформационный

С11

-

-

-

-

+

+

-

линейный

В3

-

-

-

-

+

+

-

линейный

4G11

-

+

-

-

-

-

-

конформационный

1F8

-

+

+

-

-

-

-

линейный

7Е7

-

+

+

-

-

-

-

линейный

6B8

-

+

-

-

-

-

-

конформационный

Из данных, приведенных в табл.1 следует,  что МкА С 2, С4, G9,С11, В3 взаимодействуют только с IgM, не реагируя  IgG и IgА (Ездакова И.Ю., 1994), а МкА 4G11, 1F8, 7E7, 6B8 только с IgА (Феоктистова Т.А., 2003; Борзенко Е.В., 2005). По результатам иммуноблоттинга,  МкА клонов С2, С4 и G9 реагируют только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере антигенных детерминант  IgM, распознаваемыми полученными антителами. Моноклональные антитела клонов С11 и В3 взаимодействуют не только с нативной молекулой, но и с µ- цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА.

В результате проведенных исследований были отобраны клоны С2 и G9, продуцирующие МкА, которые взаимодействуют с нативной молекулой IgM и сохраняют титр в реакции диффузионной преципитации (1:32) после лиофилизации.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  МкА к IgM клонов С2 и G9 обладали преципитирующими свойствами, в то время как МкА к IgA только при сочетании нескольких МкА различных клонов, направленных к разным эпитопам.  Анализ иммунохимических свойств МкА показал, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа.

Для определения минимальных концентраций IgA в биологических жидкостях крупного рогатого скота оптимизированы условия постановки "сэндвич"-ИФА с использованием МкА. Испытаны сочетания    МкА,  где  одни  из них использовали в качестве иммобилизирующих    антител (клон 1Е8), а другие, конъюгированные с  пероксидазой (клон 6В8), для определения связанного антигена. В результате проведенных экспериментов подобран  вариант (МкА-1Е8/конъюгат-6В8), позволяющий идентифицировать  и  количественно определять уровень как мономерного  сывороточного  IgA,  так  и  sIgA  в   различных секретах (слезы, слюна, молозиво, молоко, носовые секреты).

Таким образом, результате проведенных исследований, на основе полученных МкА к IgM и IgA  рогатого скота были приготовлены реагенты для количественного определения иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА.

Разработка метода  идентификации Ig-рецепторов В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относят поверхностные иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену.  Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембраносвязанный мономер IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота, плотности распределения  sIg лимфоцитов крови у молодых и взрослых животных является перспективным направлением  исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза.  С использованием поли- и моноклональных антител к  иммуноглобулинам, возможно изучение локализации sIg клетки и определение количества  В-лимфоцитов.

Несмотря на очевидный интерес к данной теме (Murakami K. et al., 2004; Usui T., 2006 и др.), в доступной отечественной литературе очень мало  данных по исследованию sIg  лимфоцитов у крупного рогатого скота. Поверхность  является своеобразным «паспортом» клетки, по которому можно идентифицировать тип и функции лимфоцита. Основные мембранные молекулы, участвующие в распознавании антигенов, принадлежат к IgSF. Мембраносвязанные Ig и антитела образуют своеобразную систему иммунного контроля за клеточной мембраной лимфоцитов, являясь сигнальными молекулами, с помощью которых осуществляются основные адаптивные иммунные реакции организма. Следует отметить, что многие механизмы экспрессии sIg лимфоцитов, влияния внешних и внутренних факторов на формирование рецепторного профиля клетки мало изучены и до сих пор неизвестны. В связи с этим следующей частью первого этапа был поиск адекватного метода для изучения Ig-рецепторов клетки.

Известно, что иммуноглобулины в организме могут быть в мембраносвязанной, цитоплазматической (cIg) и секретируемой (Ig) формах,  которые являются также и  показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.

Для определения соотношения первых двух форм иммуноглобулинов В-клеток лимфоидных органов у интактных мышей был использован иммунопероксидазный метод.

В результате проведенных исследований было установлено, что относительное содержание клеток с sIg в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - IgМ, 27,5% - IgG и 20,5% - IgА в цитоплазматической форме, что подтверждает важную роль этого органа в синтезе антител. Зафиксировано 10,3% лимфоцитов с sIgM. В тимусе  обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% мононуклеарных клеток с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано  7,5% лимфоцитов с sIgМ, 7,1% -  sIgG и 6,3% - сIgА. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых  выявлены sIgG, являются В-клетками памяти. В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с sIgG. SIgG распределялся в клетках лимфатических узлов  следующим образом 5,0% - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3% - неравномерное распределение окраски, 5,2% - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм Ig-рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. Установлено,  что изотип G преобладает на мононуклеарных клетках лимфатических узлов. В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% клеток с sIgМ, 2,6% с sIgG и 3,8%  с  цитоплазматической формой IgА.  

На основе этой реакции был разработан иммуноцитохимический метод определения sIg В-клеток  крупного рогатого скота с использованием МкА к IgМ   и поликлональных антител к  IgG, IgА, полученных нами на первом этапе работы.

При обработке клеток 1%-ной лимонной кислотой, количество Ig на поверхности клетки значительно уменьшается Большая плотность экзогенных иммуноглобулинов на поверхности клетки обусловлена способностью молекул Ig к образованию поперечных сшивок. Fc?RII-рецептор В-лимфоцитов связывается только IgG и с довольно низким сродством (<107М-1). В кислой среде нековалентные взаимодействия между Fc-рецептором клетки и Fc-фрагментом антитела ослабевают, и экзогенные IgG диссоциируют с поверхности лимфоцита.  SIgМ ориентированы Fab-областью по направлению к внешней среде, тогда как Fc-фрагмент находится в контакте с клеточной поверхностью. Трансмембранный IgM содержит на С-концах тяжелых цепей домены, образованные гидрофобными аминокислотами, которые удерживают молекулу Ig на наружной поверхности мембраны.

Таким образом, в ИПО с использованием МкА к IgM, определяли  sIgM-клетки, а при обработке поликлональными антисыворотками – лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулины G,A изотипов. Используемые в работе антисыворотки к IgG и  sIgA крупного рогатого скота, представляют собой набор антител ко всем антигенным детерминантам Ig, в том числе, и к эпитопам легких цепей, которые у всех изотипов иммуноглобулинов являются идентичными. Поэтому при добавлении к лимфоцитам данных антител, происходит их взаимодействие со всеми изотипами Ig, находящимися на поверхности клетки. Поликлональные антитела, образовавшие иммунные комплексы с sIg различных изотипов, в том числе и с sIgМ, распределяются диффузно по всей мембране клетки. С другой стороны, моноклональные антитела к  IgM, полученные к одной антигенной детерминанте, соответственно,  взаимодействуют только с ней и, поэтому  специфическое окрашивание не так интенсивно, как при использовании поликлональных антисывороток.

Представленные данные свидетельствуют о том, что все изотипы иммуноглобулинов (M,G,A) экспрессируются на поверхности клеток крови крупного рогатого скота.

В результате проведенных исследований установлено, что количество sIgM-клеток в  крови телят в возрасте одного месяца составляет 16,6%, у коров в возрасте 5-7 лет  – 22,8%. Уровень клеток с мембраносвязанными  IgG и IgA в крови коров находится в пределах 10,7% -12,9%.

Вторым этапом нашей работы было определение методических принципов оценки биологических (функционально-рецепторных) свойств IgSF в процессе поствакцинального иммунного ответа на модели мышей.

 

Динамика рецепторной активности лимфоцитов в процессе иммунного ответа (invivo и  invitro)

Известно, что при кратковременной инкубации  лимфоцитов с антигеном, к которому сенсибилизированы данные лимфоциты,  происходит увеличение или уменьшение количества розеткообразующих клеток и, соответственно, изменяется число поверхностных  рецепторов лимфоцитов (Лебедев К.А. и др.,1981). Метод стимуляции лимфоцитов in vitro (А-РО-нагрузочный тест)   использован для оценки динамики уровня ILT-рецепторов лимфоцитов и макрофагов под действием вакцины в процессе иммуногенеза    и  определения индекса сдвига, показывающего  активность лимфоцитов.

Опытной группе мышей вводили вакцинe против рожи свиней из штамма ВР-2, контрольной - физиологический раствор (ФР). Одну часть мононуклеарных клеток, полученных от этих групп мышей, инкубировали с вакциной, вторую –  с ФР в течение 30 мин. при t 37оС.  Исследования проводили на 2-е, 7-е, 14-е  и  20-е   сутки  иммунного ответа.

В результате проведенных экспериментов установлено, что введение вакцины обуславливает  повышение количества Т- и В-клеток  в тимусе и  селезенке на протяжении всего срока исследования.     На 2-е, 7-е и  14-е сутки после иммунизации розеткообразующая активность лимфоцитов возрастает с 30,0% до 66,6% после инкубации с вакциной. На 20-е сутки - инкубация лимфоцитов с вакциной не стимулирует розеткообразование, а наоборот, приводит к его угнетению (с антигеном 20,0%, без антигена – 55,0%).  Лимфоциты мышей контрольной группы не были активированы и  короткая инкубация с антигеном in vitro не привела к изменению уровня Т- и В-лимфоцитов (ИС=1,0).

Как видно из данных таблицы 2, функциональная активность иммуноцитов наиболее выражена на 7-е сутки иммунного ответа (ИС=3,3-1,9).   

Величина индекса стимуляции на 20-е сутки иммуногенеза ниже 1,0. Действие вакцины снизило адгезивные свойства тимоцитов и спленоцитов. Возможно, второй антигенный сигнал (инкубация in vitro) усилил процесс слущивания адгезивных молекул с поверхности иммунокомпетентных клеток, что характерно для завершающего этапа  иммуногенеза.

Таблица 2

Динамика показателей индекса стимуляции (ИС) в нагрузочном тесте с  вакциной (реакция антигенного розеткообразования) против рожи свиней из штамма ВР-2.

Показатели

Сутки иммунного ответа

0

2

7

14

20

Тимоциты

0,4±0,02

2,2±0,2*

2,5±0,2*

1,6±0,3*

0,4±0,02

Т-клетки

селезенки

1,0±0,03

1,2±0,2

1,9±0,3*

1,5±0,1*

0,7±0,03

В-клетки

селезенки

1,0±0,03

1,9±0,3

3,3±0,5*

1,3±0,1

0,3±0,01

     Примечание:  * - p< 0,05, n=100.

Установлено, что иммуномодулирующее влияние  вакцины in vitro на активированные   лимфоциты выражается  в изменении количества ILT-рецепторов на поверхности Т- и В-клеток. Исходя из сравнительного анализа результатов исследования опытной и контрольной групп животных, можно сделать заключение, что 30-минутного воздействия вакцины  на интактные лимфоциты недостаточно для изменения количества CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту комплемента на поверхности клеток (ИС=1,0). Аналогичная обработка лимфоцитов, иммунизированных животных, существенно изменяет рецепторную активность клеток (ИС>1,0).      Полученные показатели индекса стимуляции,  позволяют характеризовать влияние вакцины на лимфоциты, так значения ИС>1,0    свидетельствует о иммуностимуляции, а значения ИС< 1,0 о снижении интенсивности иммунной реакции.

Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Для характеристики функционально-рецепторных свойств мембраносвязанных IgSF  в процессе поствакцинального иммунного ответа определяли рецепторную активность Т-клеток и  АПК (перитонеальные макрофаги). Т-лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные – многорецепторные (МРОК) - и неполные – малорецепторные (мРОК). В качестве модельных антигенов использовали вакцины бактериальной (производственная вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2)  и вирусной (ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней - опытная серия, ВИЭВ) этиологии. Результаты приведены в табл.3.

Таблица 3

Показатели реакции контактного взаимодействия  в процессе

поствакцинального иммунного ответа

Группы

животных

Сутки иммунного ответа

0

1

2

3

7

10

14

21

1 (Т/ПМ)

26,0

±0,5

52,0

±0,7

70,3

±1,0

200,7

±12,0

21,0

±0,3

40,1

±0,4

21,0

±0,8

20,0

±0,7

2 (Т/ПМ)

30,5

±0,9

34,8

±0,32

212,3

±30,4

70,7

±0,91

56,1

±0,3

260,3

±35,9

125,5

±15,8

26,2

±0,4

Примечание: p< 0,05, n=100, Т/ПМ - число  адгезированных тимоцитов на поверхности 100 макрофагов. 1 группа – животные, иммунизированные ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, 2 группа – животные, иммунизированные производственной вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

По данным таблицы 3 видно, что повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов зарегистрировано на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-и сутки после введения противовирусной вакцины, что обусловлено различными  путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов макрофагами.

Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул  МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в  первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2-е сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдалось резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, которая сопровождалась морфологическими и биохимическими изменениями клеток.

В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10–14-е сутки) обусловлен  выполнением макрофагами роли эффекторных клеток.

В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено  значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75%, контроль – 15%), число которых  на 2-е сутки снижается вдвое (рис.2).

На 7-е сутки поствакцинального иммунного ответа,  уровень МРОК возрастает  в лимфатических узлах (50,2%, контроль – 11%) и тимусе (60,0%, контроль – 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных CD2-молекул играет важную роль не только в межклеточной кооперации при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала  Т-лимфоциту.  В тимусе  высокий уровень экспрессии CD2-рецепторов сохраняется до 14-ти суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).

Таким образом, увеличение количества CD2-рецепторов,  вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.

Рис. 2.Динамика содержания высокоаффинных Т-клеток (МРОК) в лимфоидных органах мышей после иммунизации вакциной против рожи свиней

В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на противовирусную вакцину сопровождается увеличением экспрессии CD2-рецепторов на Т-клетках  только в костном мозге на 14-е сутки после вакцинации. Это подтверждает  различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены (Жаданов А.И. и др. // Ветеринария.-2000; Ездакова И.Ю. и др.// Цитология.- 2001).

Анализ полученных результатов показал, что при увеличении экспрессии ILT-рецепторов лимфоцитов на 1-е, 7-е, 14-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов была на уровне контроля. На 2-е и 10-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-и – противовирусной, значительно повышалось число тимоцитов на поверхности ПМ. Обратная зависимость между периодами функциональной активности лимфоцитов и макрофагов в иммуногенезе, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами  иммунной системы.

В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь (табл.4) между показателями Т-клеток в тимусе и крови (r=0,62),

Таблица 4

Коэффициенты корреляции показателей реакции розеткообразования в процессе иммунного ответа (r)

Источники клеток

Тимус

Костный мозг

Лимфатические узлы

Селе-

зенка

Кровь

Макро-

фаги

Тимус

-

0,07

0,63

0,4

0,62

-0,32

Костный мозг

0,07

-

0,65

-0,61

-0,04

-0,44

Лимфатические узлы

0,63

0,65

-

-0,03

0,36

-0,64

Селезенка

0,4

-0,61

-0,03

-

0,39

0,45

Кровь

0,62

-0,04

0,36

0,39

-

0,37

Макрофаги

-0,32

-0,44

-0,64

0,45

0,37

-

тимуса и лимфатических узлов (r=0,63), костного мозга и лимфатических узлов (r=0,65). Сопряженность между данными параметрами объясняется развитием иммуногенеза, а именно введение антигена служит началом цепных иммунных реакций, где важную роль играет CD2-рецепторная активность Т-клеток костного мозга, тимуса и лимфатических узлов.

Значительное повышение уровня многорецепторных клеток  в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на  контакт с АПК, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. Корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (r=0,65) свидетельствует о прямой зависимости  рецепторной активности лимфоцитов первичных и вторичных лимфоидных органов в процессе иммунного ответа. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии CD2-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифичных лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию. Корреляционный анализ иммунологических данных показал прямую связь между CD2-рецепторной активностью активированных Т-клеток лимфатических узлов, тимуса и костного мозга и обратную зависимость между функциональной активностью перитонеальных макрофагов и Т-лимфоцитов лимфатических узлов в процессе иммунного ответа.

Анализ результатов проведенных экспериментов позволил нам сформулировать два методических принципа. Это принцип дифференцированного подхода к оценке иммунологических показателей в зависимости от определенного этапа развития иммуногенеза (обратная зависимость между показателями функциональной активности ПМ и Т-клеток на 1-е,7-е сутки иммунного ответа) и принцип основных ориентиров (положительная корреляция между числом тимоцитов и лимфоцитов крови) для определения состояния иммунной системы животных.

Следующим этапом нашей работы была функционально-рецепторная характеристика IgSF в крови рогатого скота с помощью разработанных методов и полученных нами препаратов поли- и моноклональных антител.

Корреляция уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови крупного рогатого скота

Антитела к различным антигенным детерминантам являются растворимыми формами мембранных иммуноглобулинов. Таким образом, антитела в разной степени - гомологи антигенсвязывающих участков клеточного рецептора В-лимфоцита.

Уровень Ig в биологических жидкостях организма имеет важное прогностическое значение при вакцинации стельных коров, так у животных с низкими показателями возможен неадекватный иммунный ответ, проявляющийся в отсутствии формирования специфических протективных антител, которые обеспечивают защиту новорожденных телят.

В оценке функциональных возможностей иммунной системы играют важную роль корреляционные взаимосвязи. (Михайленко А.А. и др.,2000).  Положительная корреляция уровней ранних (IgM) и поздних  (IgG) иммуноглобулинов, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей как в норме, так и при различных физиологических состояниях, в том числе при плодоношении.

Результаты наших исследований представлены в таблице 5.

Таблица 5

Коэффициенты корреляции уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови стельных и нестельных   коров

Показатели

Нестельные

коровы (n=15)

Стельные

коровы (n=15)

IgG/IgM

0,24

0,49

IgM/IgA

0,35

0,51

IgG/IgA

0,07

0,76

Как видно из данных таблицы 5, корреляционные взаимосвязи между различными изотипами иммуноглобулинов  в сыворотке крови нестельных коров  являются слабо положительными (r=0,24-0,35). Отсутствие корреляции (r=0,07) между  показателями IgG и IgA косвенно подтверждает данные об относительной независимости системного и местного иммунитета у нестельных коров.

В соответствии с представленными результатами, следует отметить, что принцип мозаичности функционирования органов и систем организма, подтверждается деятельностью  иммунной системы: многочисленные структурные компоненты,  которой при каком-либо воздействии на нее  функционируют не одновременно. С повышением специфической нагрузки -   возрастает  количество компонентов, участвующих в реализации ее функций; при снижении - число активно функционирующих элементов иммунной системы сокращается (Михайленко А.А.,2000).  Указанный принцип реализован в наших экспериментах. Динамика коэффициентов корреляции  IgG /IgM   с 0,24 до 0,49  и  IgА /IgM с 0,35 до 0,51 показывает тенденцию к усилению взаимосвязи иммунологических показателей с увеличением срока стельности. Корреляция  между показателями циркулирующего IgG и местно секретируемого IgА (r=0,76) характеризует высокую степень сопряженности этих классов иммуноглобулинов  у стельных коров.

Анализ взаимосвязи основных изотипов иммуноглобулинов в  крови овец в онтогенезе

Для оценки состояния иммунной системы (ИС)  определяют количественные и функциональные  показатели ее структурных компонентов. Но значения этих показателей,  ввиду индивидуальной вариабельности,  не всегда отражают нормальное состояние иммунной системы. Так уровень Ig у животных подвержен значительным колебаниям,  обусловленным возрастом, полом, генетическими особенностями, внешними факторами, различными периодами онтогенеза, например,  периодом плодоношения и лактации. Вместе с тем, различные компоненты ИС могут компенсировать функции друг друга, изменяя тем самым значения показателей, соответствующих статистическому определению нормального состояния иммунной системы.

По нашему мнению, для адекватной оценки иммунного статуса животных, а также механизма формирования поствакцинального иммунного ответа,  необходимо использовать как традиционное определение  нормы, так и корреляционный анализ взаимосвязей между показателями уровня IgSF. Одной из основных характеристик состояния иммунной системы является концентрация Ig в крови. Положительная корреляция уровней сывороточных иммуноглобулинов классов G и M, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей при различных физиологических состояниях организма.

На примере определения коэффициента корреляции между количественными показателями Ig  обосновывается диагностический критерий для оценки состояния иммунной системы у овец. В эксперименте использовали образцы крови и носовых секретов овец. При проведении эксперимента животные были разделены на две группы, сформированных по принципу аналогов. Первая группа состояла из овец (№1-5)  романовской породы в возрасте 5 лет. Вторая  группа (№6-10)  из овец в период 4-5 мес. суягности и последующей лактации. В третью группу (n=5) вошли ягнята, родившиеся от овец второй группы. Образцы крови и носовых секретов брали однократно в середине месяца в течение 10 мес. у овец и 6 мес. у ягнят. У животных определяли количество иммуноглобулинов M, G, A  в сыворотке крови и концентрацию IgA в носовом секрете методом РИД.

В результате проведенных исследований в первой группе животных отмечалась положительная корреляционная связь между показателями концентрации иммуноглобулинов изотипов G и М (r=0,29), М и А (r=0,1) слабой силы, а между IgG  и IgA – средней силы (r=0,5). Слабая связь также наблюдалась между уровнями IgM в сыворотке крови и секреторного IgA  (sIgA) в носовом секрете. Слабая отрицательная корреляция установлена между количеством  сывороточных IgG  и IgA,  и уровнем sIgA.

Изучение спектра основных изотипов сывороточных иммуноглобулинов в первой группе овец подтверждает их взаимосвязь в процессе функционирования. Отсутствие корреляции между уровнями IgA в сыворотке крови и носовом секрете, как в первой, так и во второй группе животных, показывает относительную независимость системного и местного иммунитета.

Вторая группа животных представлена овцами в период поздней суягности и лактации. Как видно из данных таблицы 6, корреляция между показателями сывороточных иммуноглобулинов не отличаются от коэффициентов корреляции у овец первой группы. Таким образом, зависимость между количественными показателями циркулирующих  Ig  изотипов G, M и A у клинически здоровых животных, в том числе в  период суягности и лактации,  выражается положительным значением коэффициента корреляции и является основным ориентиром в оценке состояния иммунной системы.

Однако, коррелятивная связь между сывороточными Ig и секреторными IgA отсутствует у животных первой группы, а у овец второй группы коэффициент корреляции между IgM  и sIgA (r=0,49±0,02) свидетельствует о средней степени сопряженности этих показателей.

Таблица 6

Коэффициенты корреляции между количественными показателями  иммуноглобулинов в  крови и носовых секретах у овец (n=10) (Ездакова И.Ю., Степнова С.Н. //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2010)

IgG/IgM

IgG/IgA

IgM/IgA

IgG/sIgA

IgM/sIgA

IgA/sIgA

1

0,33

0,48

0,09

0,2

0,24

-0,29

2

0,35

0,42

-0,17

-0,09

0,37

-0,5

3

0,28

0,4

-0,03

-0,16

0,5

0,15

4

0,32

0,69

0,31

-0,46

0,12

-0,05

5

0,18

0,53

0,3

-0,42

-0,25

-0,36

M±m

0,29*±0,02

0,5*±0,05

0,1

-0,186

0,196

-0,21

6

0,65

0,59

0,32

0,35

0,5

0,07

7

0,14

0,15

-0,08

0,17

0,37

-0,03

8

0,33

0,47

-0,32

0,07

0,46

0,06

9

0,54

0,53

0,14

-0,15

0,54

-0,007

10

0,3

0,55

0,23

-0,12

0,59

-0,13

M±m

0,39*±0,16

0,46*±0,12

0,06

0,06

0,49*±0,02

-0,0074

Примечание. * -  p<0,05   

Появление коррелятивной связи  данных показателей  перед родами и в течение лактации, свидетельствует о большем функциональном напряжении иммунной системы в этот период за счет необходимости включения большего количества ее структурных компонентов. В лактационный период данные Ig передаются с молозивом и молоком новорожденному ягненку и являются первым иммунным барьером на пути проникновения антигена в  организм. SIgA и sIgМ присутствуют на поверхности слизистых оболочек, блокируя первую фазу адгезии энтеропатогенных бактерий к энтероцитам, маскируя поверхностные рецепторы этих клеток. Данные иммуноглобулины являются протективными изотипами иммунной системы слизистых оболочек.  Колостральные, абсорбированные IgA и IgМ поступают в системную циркуляцию новорожденных, способствуют нейтрализации бактериальных энтеротоксинов и энтеротропных вирусов и оказывают агглютинирующее действие на большое количество энтеропатогенных микроорганизмов.

По нашему мнению, средняя степень сопряженности показателей IgM в сыворотке крови и sIgA в носовом секрете у овец в период лактации подтверждает их важную роль в защите молодого организма от широко распространенных патогенов в первые 6 месяцев жизни.

В таблице 7 представлены данные о корреляции уровней основных изотипов иммуноглобулинов у ягнят в первые 6 месяцев жизни, полученных от овец второй группы.

Таблица 7

Коэффициенты корреляции между количественными показателями  иммуноглобулинов в  крови и носовых секретах у ягнят (Там же).

IgG/IgM

IgG/IgA

IgM/IgA

IgG/sIgA

IgM/sIgA

IgA/sIgA

1

0,56

0,25

-0,1

-0,5

-0,29

-0,6

2

0,74

-0,06

0,7

-0,4

0,87

0,5

3

0,72

0,04

0,41

-0,5

0,2

-0,48

4

0,83

0,8

0,9

-0,29

0,3

-0,5

5

0,5

0,8

0,9

-0,5

-0,8

-0,4

M±m

0,67*±0,1

0,37

0,56

-0,44*±0,09

0,06

-0,3

Примечание. * -  p<0,05   

В результате проведенных исследований, установлена положительная корреляция между уровнями IgG и IgM (r=0,67), что подтверждает принцип основных ориентиров, являющийся обязательным условием адекватного функционирования иммунной системы. Отсутствие данной корреляции или смена ее направленности показывает неустойчивое состояние ИС и возможность ее функционального срыва.

Различные по направленности и величине коэффициенты корреляции между уровнями IgG и IgA,   IgM и IgA,  IgM и sIgA, IgA и sIgA свидетельствуют о нестабильности иммунной системы у молодых животных в данный период. Это может быть связано с механизмами индивидуального процесса развития и формирования иммунитета.  Отрицательная корреляция между концентрациями  IgG в сыворотке крови и секреторного IgА показывает относительную независимость системного иммунитета и иммунной системы слизистых оболочек.

На основании корреляционного анализа параметров основных изотипов иммуноглобулинов у клинически здоровых животных  на различных этапах онтогенеза показана устойчивая корреляция между IgG и IgМ у всех исследуемых групп животных. Этот показатель  (r - IgG/IgМ) может служить основным ориентиром для оценки здоровья животного и качества иммунопрофилактики, так как изменение направленности корреляции между IgM-антителами первичного и IgG-антителами вторичного иммунного ответа является признаком нарушения иммунореактивности организма.

Представленные данные позволяют наметить перспективные пути в направлении поиска новых устойчивых корреляционных взаимосвязей между иммунологическими показателями с целью понимания механизмов, регулирующих работу иммунной системы животных.

Формы локализации  Ig-рецепторов В-лимфоцитов  в крови  коров и овец

В онтогенезе дифференцировка Т- и В-клеток сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия cIgM на поверхность клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезе.  Модуляция  количества sIg или  блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно sIg связывают антиген на поверхности В-лимфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам.

Исследование форм локализации sIg представляет теоретический и практический интерес (Новиков В.В.,2007).  Анализ литературных данных по изучению sIg клеток показал, что под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов,  изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о  способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита. (Артюхов В.Г.и др.,2006). Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. Поверхностные Ig,  взаимодействуя с антигеном  посредством эндоцитоза,  включают его в цитоплазматический компартмент, где он подвергается деградации. Известно, что sIgM присутствует на мембране практически всех субпопуляций В-клеток, но с различной плотностью, играющей важную роль в дифференциации клеток (Сидорова Е.В.,2006).   Так негативная и позитивная селекция В-лимфоцитов зависят от плотности  антигенных рецепторов на клеточной поверхности.   Следует отметить, что многие механизмы экспрессии sIg лимфоцитов, влияния внешних и внутренних факторов на формирование рецепторного профиля клетки остаются недостаточно изученными. В рамках исследования механизмов клеточной активации в процессе онтогенеза изучены формы локализации sIg на поверхности В-клеток. Для этого  использовали ИПО лимфоцитов крови коров   черно-пестрой породы и овец. 

В результате проведенных исследований нами установлено, что  В-клетки в крови коров с окрашенной мембраной  в форме «петч»/эндоцитоз составляют  68,9±3,9%, «петч» (неравномерное распределение sIg по периметру клетки) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение sIg по периметру клетки) – 10,5±3,3%, «кэп» - 5,6±1,9%. («кэппинг»- эффект- скопление sIg на одном из полюсов клетки) (рис.5).

а

 

б

 г

г

 

в

     

 Рис.5. Различные формы распределения поверхностных иммуноглобулинов по периферии В-лимфоцитов крупного рогатого скота:

 а -  «кэп , б- «петч»/ эндоцитоз, в – «петч», г – «шеддинг»

б

 

а

                                                                                              

 

 

 

в

  


Рис.6. Иммунопероксидазное окрашивание В-лимфоцитов  крови  овец,:

 а – локализация Ig-рецепторов в форме  «пэтч»; б – локализация Ig-рецепторов  в форме  «кэп», в  - цитоплазматическая форма IgIg).

а

 

в

  Следовательно, можно сделать вывод, что петч-эндоцитоз, а именно, перераспределение Ig -рецепторов в мембране  с их погружением в цитоплазму  клетки,  является основным механизмом  контроля  поверхности В-лимфоцитов, т.е. таким образом, происходит считывание информации о микроокружении клетки.

В опытах по изучению sIg у  овец (n=6)  в возрасте 1 года,  в крови обнаружены  В-клетки  с цитоплазматическими Ig (рис.6-в). Эти клетки не окрашиваются по периметру клетки, т.е. мембраносвязанные иммуноглобулины отсутствуют. Вероятно, что сIg-клетки являются плазматическими клетками, секретирующими IgG.

  Таким образом, установлено, что в крови овец в возрасте одного года присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки.

SIgM-клетки и IgM-антитела  в развитии иммунной системы у телят

       Важной задачей наших исследований являлось изучение механизмов  формирования иммунного ответа в организме животных. IgM являются первыми Ig, появляющимися в цитоплазме В-клетки (?-цепи) в процессе дифференцировки, и в сыворотке крови как антитела первичного иммунного ответа. Для определения  sIgM-клеток и IgM-антител у телят в возрасте 1 мес. в ИПО и РИД использовали МкА к IgM крупного рогатого скота. Этот период в жизни телят является критическим, так как количество материнских Ig является небольшим, а синтез собственных ещё не достигает нормального уровня. В связи с чем, возникает предрасположение к воздействию патогенных микроорганизмов и неблагоприятных факторов внешней среды.            Концентрация IgM в сыворотке крови телят составляла -  0,93±0,2 мг/мл,  IgG - 12,3±5,7 мг/мл,   IgA - 0,44±0,1 мг/мл. Количественные показатели  В-системы на фоне нормальной фагоцитарной активности (42,4%)  свидетельствуют о том, что иммунная система телят в возрасте 1 месяца окончательно не сформирована и поэтому внешнее воздействие на организм может вызвать  функциональный дисбаланс, что особенно негативно может проявиться у телят с  пониженным содержанием Ig.

В результате  проведенных исследований были идентифицированы  sIgM- и сIgM-клетки, что свидетельствует о присутствии в крови телят в возрасте одного месяца В-клеток на разных стадиях дифференцировки.

С целью повышения диагностической значимости иммунологических показателей, определяли их корреляционные взаимосвязи. Коэффициент корреляции между количественными показателями IgG и IgМ составлял 0,67, IgG/ IgА – 0,75,  IgА/IgМ – 0,78, что подтверждает методический принцип основных ориентиров (положительная корреляция IgG /IgМ).

Изучение различных форм IgM и других представителей суперсемейства Ig представляет значительный интерес для понимания эволюционного становления иммунной системы. Молекулы  IgM появляются первыми из Ig в фило-,онто- и иммуногенезе,  и являются матрицей по которой строятся другие изотипы иммуноглобулинов по мере развития иммунной системы.

Динамика  Ig и ILT-рецепторных клеток  у стельных коров

Несмотря на достижения в области иммунологии репродукции, многие аспекты этой важной проблемы изучены не в полной мере, например,  каким образом иммунная система перестраивается, предотвращая иммунологический конфликт при беременности. Оценка показателей иммунного статуса стельных коров имеет важное значение в своевременной коррекции естественной резистентности организма, в связи с определенной иммуносупрессией иммунной системы.  У коров с низкими показателями иммунного статуса в этот период возрастает риск рождения нежизнеспособных телят. На этом основании изучение количественной динамики параметров иммунной системы стельных коров представляет значительный интерес  для характеристики взаимодействия между плацентой и иммунной системой, разработки практических приемов коррекции воспроизводительной функции животных.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что у коров в период от 3-4 мес. до 5-6 мес. стельности повышается как относительное (от 24,8% до 34,6%), так и абсолютное количество (от 0,9х109/л до 1,7х109/л) розеткообразующих клеток в крови. Данная тенденция наблюдается также в контрольной группе, но  является менее  выраженной (табл.8).

Таблица 8

Динамика иммунологических показателей у стельных коров

Показатели

Группы животных

1

2

Контроль - 1

Контроль - 2

Т-клетки

%

абс.(х109/л)

 

24,8±2,1

0,9±0,3

 

34,6±3,5

1,68±0,5

 

22,5±2,1

0,67±0,2

 

24,7±3,2

0,97±0,3

В-лимфоциты

%

абс.(х109/л)

 

26,8±4,5

1,0±0,2

 

29,2±1,9

1,5±0,3

 

25,3±2,6

0,97±0,5

 

26,2±2,0

1,0±0,7

IgM  мг/мл

2,3±0,4

3,5±0,5

2,3±0,1

3,1±0,4

IgGмг/мл

21,6±1,0

26,0±1,6

19,7±2,2

20,7±3,3

IgAмг/мл

0,75±0,3

0,8±0,2

1,0±0,5

1,3±0,6

Примечание.   p< 0,05. 1 – группа коров со сроком стельности 3-4 мес., 2  - группа  коров со сроком стельности 5-6 мес. Контроль 1 и 2 – средние показатели  нестельных коров с интервалом 2 мес.

Известно, что молекула CD2 экспрессируется не только на Т-клетках, но и на НК-клетках. Супрессия специфического иммунного ответа матери компенсируется усилением естественного, врожденного иммунитета, в частности увеличивается количество натуральных киллеров.

Одновременно в РНИФ зарегистрировано незначительное повышение относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов (sIgМ-клеток) с 26,8% до 29,2%, связанное с увеличением концентрации IgG в сыворотке крови, которые путем транссудации поступают в молочную железу и постнатально с молозивом передаются теленку.    

Иммунная толерантность при беременности обусловлена  продукцией блокирующих антител, вызывающих модуляцию иммунного ответа. Клеточные рецепторы для IgG – Fc?R, экспрессируют макрофаги, НК-клетки, некоторые Т-клетки и нейтрофилы. Мономерный IgG связываясь с Fc-рецепторами  иммунокомпетентных клеток может изменять их биологическую активность. Возможно, увеличение в крови стельных коров уровня IgG обусловлено выполнением им функции  антител, участвующих в супрессии иммунного ответа  на антигены плода.

Как видно из данных таблицы 9, корреляционные взаимосвязи между различными изотипами иммуноглобулинов  в сыворотках крови нестельных коров  являются слабо положительными (r=0,3-0,5).

Таблица 9

Корреляция иммунологических показателей в сыворотке крови стельных   коров

Показатели

Стельность

3-4 мес.

Стельность

5-6 мес.

Контроль

Т-клетки/В-клетки

0,64

0,84

0,5

IgG/IgM

0,27

0,73

0,3

IgM/IgA

0,25

0,56

0,4

IgG/IgA

0,3

0,71

0,47

Примечание. р<0,01 при сравнении показателей стельных коров

Низкая степень сопряженности между  показателями IgG и IgA косвенно подтверждает относительную независимость системного и местного иммунитета. При исследовании в динамике смена слабой корреляционной связи на сильную свидетельствует о возрастании функциональной активности иммунокомпетентных клеток (r=0,64> r=0,84) и, соответственно,  уровня иммуноглобулинов (r=0,27 > r=0,73).

Повышение степени сопряженности между показателями иммунной системы в 5-6 мес. стельности подтверждает большое функциональное напряжение иммунной системы у стельных коров по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об активизации  клеточных и гуморальных звеньев иммунитета в период плодоношения.

В результате проведенных исследований было установлено увеличение количества  Т- и В-клеток и уровня IgG в сыворотке крови  коров второй половины стельности по сравнению с  данными показателями у коров со сроком стельности 3-4 месяца.

Заключительным этапом нашей работы было изучение биологических свойств IgSF у животных с различным строением иммунной системы.

Функциональные свойства иммунокомпетентных ILT-рецепторных клеток  у различных видов животных

  Эволюционное развитие IgSF-рецепторов началось с возникновения шаперонов бактериальных клеток, имеющих Ig-fold (складчатое) строение, Thy-1  и Р0 - молекул прокариот и одноклеточных эукариот. Многие из этих белков представляют собой различные полимеры, в которых гомологичные Ig-структуры разных цепей взаимодействуют между собой. Каждая такая структура кодируется отдельным экзоном. По-видимому, данное семейство генов ведет свое происхождение от гена, кодирующего одну гомологичную структуру, похожую на Thy-1 или ?2-микроглобулин. Новые члены семейства возникали путем дупликаций экзонов, генов и генных сегментов, кодирующих иммуноглобулиновые молекулы. Эти молекулы обеспечивали межклеточную адгезию посредством гомофильного взаимодействия. В процессе эволюции многоклеточных произошел переход от гомофильного межклеточного взаимодействия к более совершенному гетерофильному взаимодействию для распознавания чужеродных агентов (Галактионов В.Г.,2004).     

Контактное взаимодействие иммунокомпетентных клеток посредством рецепторов является первым этапом в осуществлении антигенспецифических реакций. Кооперация  клеток друг с другом определяется «адгезивным кодом», то есть  определенным для каждой клетки набором мембранных белков. Определение этих белков для каждого клона лейкоцитов позволит понять механизмы ранней дифференцировки, филогенетической связи макрофагов, Т- и В-клеток в процессе становления иммунной системы. Поверхностные Ig-молекулы клеток являются чувствительной системой, реагирующей на изменения в макро- и микроокружении организма. В результате изучения и осмысления механизмов их многообразия и модуляции, возможно  создание  эффективных и безопасных препаратов против постоянно изменяющих свои поверхностные антигены патогенных микроорганизмов.

 Изучая феномен розеткообразования у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы – костистые рыбы, птицы, млекопитающие, было показано, что их лимфоциты обладают рецепторами к эритроцитам барана. Несмотря на то, что у этих видов животных структура иммунной системы различна, основные клеточные и молекулярные компоненты врожденного иммунитета достаточно консервативны.

В табл. 10 представлены результаты исследований, проведенных  в лаборатории иммунологии ВИЭВ в период  2000-2008 гг.

Таблица 10

Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов в крови  здоровых животных (M±m)

Вид животных

В-лимфоциты,

%

Т-лимфоциты, %

Общее количество

CD4-

хелперы

CD8-

цитотоксические

Норки, n=80

10,5±0,8

52,0±2,1

33,0±1,5

19,0±1,0

Куры, n=50

23,3±1,5

38,0±2,1

12,2±0,6

10,4±0,8

Рыбы, n=100

14,0±1,5

35,1±0,6

18,0±0,2

14,5±0,8

Примечание:    p<0,05

Как видно из данных табл. 10, количественные соотношения клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами, такими как CD2, CD4, CD8 (Т-клетки), CD19 (В-клетки) у данных видов животных одинаковы: Т-клеток > В-клеток; Т-хелперов больше, чем цитотоксических лимфоцитов. Это доказывает функционально-рецепторный консерватизм Ig-подобных рецепторов лимфоцитов у различных видов животных.

Анализ способности к розеткообразованию у исследуемых видов животных показывает различие рецепторной активности В-клеток. Это обусловлено тем, что В-система иммунитета в процессе эволюции развивалась позже Т-системы. У млекопитающих, птиц и рыб есть тимус – центральный орган иммунной системы, место дифференцировки Т-клеток до зрелых форм. Увеличение иммунорегуляторного индекса (соотношение CD4 Т-хелперов  к цитотоксическим CD8 Т-клеткам) от 1,3 у рыб и 1,2 у птиц до 1,7 у норок показывает различие в процессах дифференцировки Т-лимфоцитов, основанное на структурных особенностях  тимуса.

Возможно, что CD2-рецепторы, как адгезивные молекулы, появляются одними из первых в процессе филогенеза иммунокомпетентных клеток позвоночных животных. Еще П.Эрлих впервые указал на отсутствие видовой специфичности рецепторов у животных различных видов. А, по мнению В.Г.Галактионова, филогенез клеток иммунной системы строится на рецепторной и функциональной общности клеток, участвующих в эволюционном процессе, в котором на пути от НК-клеток к Т-лимфоцитам сохранилось несколько общих рецепторов, указывающих на филогенетическую связь между этими клетками, в частности CD2.

Заключение. В настоящее время не вызывает сомнений определяющее значение белков суперсемейства иммуноглобулинов в развитии адаптивного иммунитета, основанного на врожденных механизмах защиты от инфекций. Иммунная система, как система специфического распознавания чужеродных структур, на ранних этапах эволюции начала свое становление с появлением иммуноглобулиноподобных доменов, стабилизированных дисульфидными связями. Именно из этой молекулярной, конформационной структуры, свойственной только членам суперсемейства иммуноглобулинов, построены клеточные рецепторы, ответственные за распознавание антигена, а межклеточная кооперация с участием IgSF является ведущим фактором в развитии иммунных реакций, обуславливающих функционирование иммунной системы, распознавание и деструкцию структур, зондирующих защитные возможности организма. Проведенные исследования показали, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембраносвязанными и  растворимыми  формами Ig.  Определив модуляцию IgSF в онто- и иммуногенезе и консерватизм в филогенезе была показана возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы. В результате проведенных исследований было установлено, что ILT-рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток  определяет их функциональную активность и роль в иммунных реакциях различного генеза.

ВЫВОДЫ

1. Получены препараты для идентификации иммуноглобулинов и усовершенствованы методы количественного определения и характеристики растворимых и мембраносвязанных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов животных.

2. Разработаны способы получения иммуноглобулинов  A (sIgA) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных и унифицирована технология изготовления и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам  крупного и мелкого рогатого скота. 

3. В реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием МкА- G9 к IgM установлено, что число В-клеток в  крови крупного рогатого скота составляет 0,97х109кл/л - 1,0х109кл/л (25,3%-26,2%). 

4. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с моно- и поликлональными антителами. Установлено, что sIg В-клеток крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме  «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.

5. Методом иммунопероксидазного окрашивания определено содержание sIgM-клеток в крови телят 30-дневного возраста, которое составляет 16,6% - 19,2%. Установлено, что в крови телят (возраст 1 мес.) и овец  (возраст 1 год) присутствуют В-клетки с цитоплазматической формой  IgМ.

6. Показано, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа.

7. Установлено, что воздействие invitroвакцины против рожи свиней  на интактные лимфоциты мышей не оказывает значительного влияния на количество CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту комплемента на поверхности клеток. Аналогичное воздействие на лимфоциты вакцинированных животных, приводит к повышению уровня экспрессии  Ig-подобных рецепторов иммуноцитов, при этом индекс стимуляции равен 2,5-3,3 (в контроле 1,0). Двойной антигенный сигнал (invivo и invitro) усиливает экспрессию иммуноглобулиноподобных рецепторов в первые 14 суток иммунного ответа, когда в организме сохраняется достаточное количество активированных лимфоцитов.

8. Определено, что иммунизация мышей вакциной против рожи свиней приводит к образованию многорецепторных  Т-клеток в первые сутки в костном мозге, а в последующие - в тимусе; при использовании противовирусной вакцины аналогичные лимфоциты обнаружены  в костном мозге на 14-е сутки. Показана ведущая роль костного мозга в индукции CD2-рецепторной активности Т-клеток в первые сутки поствакцинального иммунного ответа.

9. Установлена  обратная зависимость между показателями функциональной активности перитонеальных макрофагов и Т-клеток лимфоидных органов у мышей в процессе иммунного ответа. Максимальные показатели ПМ зарегистрированы на 2-10 сутки (212,3±30,4 и 260,3±35,9 тимоцитов/100 макрофагов соответственно, в контроле – 26,0±0,5), а Т-клеток – на 1-е (костный мозг - 75%  - контроль – 15%) 7-е  (тимус - 60,0%, контроль – 27,0%) и 14-е сутки (лимфатические узлы – 75%, контроль – 20,0%) после введения вакцины против рожи свиней.

10. Показано, что вторичный иммунный ответ на введение Т-независимого антигена 2 типа (ТН-2) характеризуется  увеличением количества В-клеток костного мозга и селезенки.  Установлено увеличение количества IgG1 в селезенке, что  подтверждает участие Т-клеточных факторов в ТН-2-иммуногенезе.

11. Предложен диагностический алгоритм для изучения эффективности иммунотропных препаратов на модели лабораторных мышей, включающий следующие показатели: положительная корреляция (>0,7) между розеткообразующей активностью клеток крови и лимфатических узлов,  содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов; отрицательная корреляция (> –0,7) между нейтрофилами и Т-клетками тимуса. Разработанная схема позволяет определять уровень корреляционной связи по трем соотношениям, характеризующим сбалансированность иммунной системы.

12. Определено повышение концентрации IgG с 21,6±1,0 мг/мл до 26,06±1,6 мг/мл и количества sIgM-клеток  с 26,8±4,5% до 29,2±1,9% у коров в период 3-6 мес. стельности. Смена слабой корреляционной связи на сильную свидетельствует о возрастании функциональной активности иммунокомпетентных клеток (r=0,64> r=0,84) и, соответственно,  уровня Ig (r=0,27 > r=0,73).

13. Установлена филогенетически детерминированная рецепторная и функциональная общность CD2-рецепторных клеток у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы и отличающихся строением иммунной системы. Подтверждено, что основным механизмом иммунитета у костистых рыб являются фагоцитарные реакции.

14. Показано, что белки суперсемейства иммуноглобулинов  в мембраносвязанной  и растворимых формах (CD2, CD4, CD8, CD19, sIg,  антитела) определяют функциональную активность лейкоцитов животных  и играют ведущую роль в адаптивном иммунитете.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен комплексный методический подход к оценке Т- и В-клеточных звеньев иммунной системы крупного рогатого скота и лабораторных животных на основе определения функционально-рецепторных свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов,  который может быть использован для определения  эффективности вакцинных и иммунотропных препаратов,  используемых в ветеринарной практике. 

Для научно-исследовательских учреждений предложена технология получения препаратов для оценки уровня IgG и IgА в биологических жидкостях рогатого скота.

С целью повышения специфичности реакции,  для количественного определения IgА методом РИД, следует использовать стандарт из гомологичного субстрата в связи с полиморфизмом данного изотипа.

Для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота рекомендуем РНИФ с использованием моноклональных антител к IgM.

Метод ИПО c поли- и моноклональными антителами к Ig может быть использован для определения форм распределения Ig-рецепторов на мембране клетки, что дает возможность изучения молекулярных аспектов иммуногенеза у животных.

Для оценки  состояния здоровья крупного рогато скота  рекомендуем использовать  индексные показатели и корреляционный анализ, которые  более адекватно отражают состояние иммунной системы, чем отдельные его параметры, и что в значительной мере повысит диагностическую ценность иммунологического мониторинга.

Разработанные методы могут быть использованы для оценки иммунного статуса животных, в том числе морских млекопитающих, в рамках программ по оценке здоровья популяций  животных, обитающих в естественных условиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Монографии, патенты РФ, методические рекомендации

1. Ездакова И.Ю. Рецепторы иммунного узнавания у животных /И.Ю.Ездакова. – М.:Компания Спутник+, 2008.- 88 с.: ил.; Библиогр.:с.72-73.-500 экз.- ISBN 978-5-364-01149-7.

2. А.с. 1560549 СССР. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота / Ю.Н.Федоров, В.К.Сологуб, Т.А. Феоктистова, И.Ю. Ездакова и др.- №4229427; заявл.15.04.87; опубл.  3.01.90.

3. Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных: методические рекомендации /П.Н.Смирнов, М.И.Гулюкин, Ю.Н.Федоров,… И.Ю. Ездакова… и др.- Россельхозакадемия, Сиб. отд-ние, ГНУ ИЭВС и ДВ, ГНУ ВИЭВ, ФГОУ НРИПК АПК МСХ РФ, НГАУ. -  Новосибирск, 2003 .-32 с.

4. Пат. 2277421 Российская Федерация, МПК А61К 35/12, А61К 35/20. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота / Ю.Н.Федоров, И.Ю. Ездакова, Т.А.Чеботарева; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005109539/15; заявл.05.04.05; опубл. 10.06.06, Бюл.№16.-5с.

5.  Пат. 2288008 Российская Федерация, МПК А61К 39/395, А61К 35/12. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных / Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005109538/15; заявл.05.04.05; опубл. 27.11.06, Бюл.№33.-4с.

6. Федоров Ю.Н. Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных / Ю.Н.Федоров, И.Ю. Ездакова //Сборник «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины».-2008.-4.- С. 144-158

7.  Пат. 2293330 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ определения антител/ И.Ю.Ездакова; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005120538/15; заявл.04.07.05; опубл. 10.02.07, Бюл.№4.-5с.

8. Ездакова И.Ю. Методические рекомендации. Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом  иммунофлуоресценции / И.Ю.Ездакова // Сборник «Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел».-2011.-С.107-111.

9. Ездакова И.Ю. Методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) / И.Ю.Ездакова // Сборник «Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел».-2011.-С.111-116.

10. Ездакова И.Ю. Методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня  иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец / И.Ю.Ездакова, Т.А. Чеботарева // Сборник «Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел».-2011.-С.101-107.

Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

11. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом «вестерн-блоттинга»/ О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова, И.Ю.Ездакова и др.  // Сельскохозяйственная биология. – 1993.- № 6.- С. 135-141.

12. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / О.А. Верховский, Ю.Н.Федоров, В.К.Сологуб, Т.А.Феоктистова, И.П. Федорова, И.Ю.Ездакова // Сельскохозяйственная биология.- 1995.-№ 4.-С. 94-99.

13. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. /А.И. Жаданов, И.Ю. Ездакова, О.А. Верховский, Ю.Н. Федоров // Ветеринария.-2000.- №11.- С.22-26.

14. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Ю.Н. Федоров, О.А.Верховский, А.И.Жаданов, И.Ю.Ездакова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2000.-№ 5.-С. 42-44.

15. Ездакова И.Ю. Динамика количества  Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа / И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, А.И. Жаданов // Цитология.- 2001.- Т. 43.- № 9-. С. 858.

16. Количественное определение иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии / И.Ю. Ездакова, Е.В.Борзенко, Т.А.Феоктистова, Ю.Н. Федоров// Сельскохозяйственная биология.- 2002.-№ 2.-С. 118-122.

17. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентные клетки серебряного карася /И.Ю.Ездакова, М.Н. Борисова, Л.П. Дьяконов //Ветеринария.-2005.-№ 12.-С. 28-31.

18.Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (Carassius auratus gibelio)/ И.Ю.Ездакова, М.Н. Борисова // Ветеринарная патология.-2007.-№ 2.- С. 205-207.

19. Ездакова И.Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров/ И.Ю.Ездакова //Ветеринарная патология.- 2007.-№ 2.-С. 148-151.

20. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих – новое направление экологической иммунологии / И.Ю.Ездакова, О.В.Соколова// Веткорм.-2008.-№ 4.- С. 14-15.

21. Ездакова И.Ю. Динамика розеткообразующих клеток кур  в онтогенезе / И.Ю. Ездакова, О.М.Чуйко, Е.О. Чадина  //Ветеринарная патология.-2008.-№ 2.-С. 62-64.

22. Ездакова И.Ю. Локализация  IgМ в В-клетках периферической крови крупного рогатого скота/ И.Ю.Ездакова// Аллергология и иммунология.- 2008.- Т. 9.- № 3.-С. 274.

23. Ездакова И.Ю. Корреляционный анализ иммунологических показателей при введении иммунотропных препаратов / И.Ю.Ездакова// Веткорм.-2009.-№2.-С.18-19.

24. Ездакова И.Ю. Динамика sIgM-клеток и IgM-антител в периферической крови коров в период плодоношения / И.Ю.Ездакова// Аллергология и иммунология.- 2009.- Т. 10.- № 2.-С. 295.

25. Ездакова И.Ю. Взаимосвязи  между  основными изотипами иммуноглобулинов у овец/ И.Ю.Ездакова, С.Н.Степнова //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.-2010.-№5.-С.44-47 (Russian agricultural science.-2010.- Vol.36.-№5).

Статьи в других периодических изданиях, в материалах конференций и сборниках научных трудов

26. Иммуноферментный метод количественного определения IgA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота / Т.А.Феоктистова, И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, Е.В.Борзенко // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. – Щелково: ВНИиТИБП.- 2000. - C. 279-281.                                      

27. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Е.В.Борзенко, И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т. 73.- С. 217-221.

28. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, И.В.Третьякова  // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т.73.- С. 200-204.

29.  Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Т.А.Феоктистова, Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, В.К.Сологуб// Труды ВИЭВ.-2003.- Т. 73.- С. 197-200.

30. Ездакова И.Ю. Динамика показателей клеточного иммунитета при введении препаратов с иммунотропной активностью / И.Ю.Ездакова, И.В.Третьякова// Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина.- М: МГАВМиБ.-2004.-С. 190-194.

31.  Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. /И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, А.Ю.Ханис, Г.И.Боряев // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч.тр.- Щелково:ВНИиТИБП .-2004.- С. 47-52.

32. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /И.Ю.Ездакова// «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 472-474.

33. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / И.Ю.Ездакова // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 475-477.

34. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / И.Ю.Ездакова // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар.- 2006.- С. 400-403.

35. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / И.Ю.Ездакова // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. – Щелково: ВНИиТИБП.-2006.- С. 157-160.

36. Ездакова И.Ю. Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / И.Ю.Ездакова, В.В.Субботин// «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. – Щелково: ВНИиТИБП.-2006.- С. 182-187.

37. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / И.Ю.Ездакова  // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 1.-С. 11-12.

38. Ездакова И.Ю. Определение показателей В-системы иммунитета телят/ И.Ю.Ездакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 10-11.

39. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / И.Ю.Ездакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 11-13.

40. The cross-reactivity of the blood serum albumens from Steller sea lion pups (EUMETOPIAS JUBATUS) / I.Yu.Ezdakova., O. V. Sokolova, T. E. Denisenko, V. N. Burkanov // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.-Egmond aan Zee:ECS- 2008.- P. 191-192.

41. Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / И.Ю.Ездакова  //«Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.- 2008.- С. 329-332.

42. Ездакова И.Ю. Динамика адгезивной активности перитонеальных макрофагов мышей при вакцинации/ И.Ю.Ездакова//  Труды ВИЭВ.- 2009.- Т. 75.- С. 235-238

43. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность клеток крови рыб семейства карповых /И.Ю. Ездакова, Л.П. Дьяконов // Труды ВИЭВ.- 2009.- Т. 75.- С. 239-241

44. Ездакова И.Ю. Актуальные направления ветеринарной иммунологии / И.Ю.Ездакова// Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр. - М:ВИЭВ.-2011.-С.243-245.

 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.