WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Состояние электронтранспортной цепи митохондрий и физиологические показатели животных и растительных организмов при действии стрессовых факторов и биологически активных соединений

Автореферат докторской диссертации

 

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ ИМ. Н.М. ЭМАНУЭЛЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ЖИГАЧЕВА ИРИНА ВАЛЕНТИНОВНА

СОСТОЯНИЕ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИИ

И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ   ЖИВОТНЫХ И

РАСТИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССОВЫХ

ФАКТОРОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.01.02 - биофизика (биологические науки)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2012


2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии

наук


Научный консультант:


Бурлакова Елена Борисовна, доктор биологических наук, профессор


Официальные оппоненты:        Дудник Людмила Борисовна, доктор

биологических наук, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Веселова Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, старший научный сотрудник кафедры биофизики Биологического факультета

Загоскина Наталья Викторовна, доктор биологических наук профессор, Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, Российской академии наук, заведующий группой фенольного метаболизма

Ведущая организация:   Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино-на-Оке М.О.

Защита состоится «10» октября 2012 в на заседании совета Д 002.039.001 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу 119334, г. Москва, ул. Косыгина 4, ИБХФ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук


Автореферат разослан «    »


2012 г.


Ученый секретарь

Диссертационного совета                                            Мазалецкая Л. И.


3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии, являясь одним из центральных звеньев энергетического обмена, играют особую роль в ответе организма на стрессовые воздействия. Стрессовые факторы увеличивают потребности клетки в энергетических ресурсах. Они вызывают перестройки структурно-функциональных характеристик митохондрий {Brand, М. D et al., 2004; SommerA.M. Det al., 2004; M. N. Laus et al, 2010; Грабельных О.И., 2005). В том случае, когда изменения в энергетике этих органелл не могут удовлетворить все возрастающие потребности клетки в энергетических ресурсах, наблюдается избыточная продукция АФК и нарушение биоэнергетических функций митохондрий. При этом антиоксидантная система клетки не в состоянии справиться с нарастающей чрезмерной продукцией АФК, что лежит в основе многих патологических состояний, таких как нейродегенеративные заболевания, диабет, кардиомиопатии, катаракта и ряд других заболеваний.

Нарушение биоэнергетических функции митохондрий может возникнуть при действии на организм токсических веществ (L. К Reed, et al., 2006; L.K.Reed, J.Carrolet al., 2008; О Mirro, F. et al., 1999). Особое внимание в настоящее время уделяют влиянию на организм нитрозаминов (НА) и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Эти вещества даже в микро количествах при хроническом воздействии могут инициировать ряд патологических процессов {HammondЕС, 1966; Хесина А.Я.и др., 1987; SolhaugА, 2004). Поэтому одной из важнейших научно-практических задач является поиск новых адсорбентов, эффективно удаляющих из отходящих газов промышленных предприятий ПАУ и НА. Решение этой проблемы возможно благодаря использованию митохондрий в качестве моделей для оценки эффективности очистки газо-воздушных смесей от этих токсикантов.

Более того, изучение влияния биологически активных веществ на энергетику митохондрий животного и растительного происхождения имеет большой научно-практический интерес, позволяющий проводить поиск новых препаратов, предотвращающих развитие патологических состояний и повышающих устойчивость организмов к стрессовым воздействиям.


4 Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было исследование взаимосвязи между функциональными характеристиками митохондрий и физиологическими показателями животных и растительных организмов при действии, как стрессовых факторов, так и биологически активных соединений в малых и сверхмалых дозах. Анализ соотношения между антиоксидантными свойствами биологически активных веществ (БАВ), влиянием их на функциональные характеристики митохондрий и на устойчивость живых организмов к изменяющимся факторам внешней среды, а также подбор наиболее эффективных концентраций БАВ, обеспечивающих повышение устойчивости растительных и животных организмов к стрессовым воздействиям.

Задачи исследования

  1. Изучение влияния некоторых биологически активных веществ (фенозана калия, анфена, регуляторов роста растений (РРР): мелафена, пирафена и амбиола) на интенсивности ПОЛ в широком диапазоне концентраций.
  2. Исследование влияния этих БАВ на энергетику митохондрий и устойчивость животных и растений к различным видам стресса.
  3. Изучение влияния недостаточного увлажнения, (комбинированного действия недостаточного увлажнения и умеренного охлаждения) и исследуемых РРР на жирнокислотный состав и энергетику митохондрий проростков гороха (Pisumsativum). Сопоставление этих показателей с физиологическими показателями (всхожестью семян, длиной побегов и корней проростков).
  4. Исследование влияния затравки животных полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) и нитрозаминами (НА), на функциональное состояние митохондрий печени. Сопоставление показателей функционального состояния митохондрий с иммунологическими ответами организма при длительном воздействии на организм ПАУ и НА.
  5. Поиск новых адсорбентов, эффективно поглощающих ПАУ и нитрозамины.

5 Научная новизна работы

Нашими исследованиями установлена взаимосвязь между функциональным состоянием митохондрий растительного и животного происхождений и устойчивостью организмов к стрессовым факторам. Стрессовые воздействия, активируя процессы ПОЛ, модифицируют клеточные мембраны и мембраны органелл и, в первую очередь митохондрий, что приводит к их дисфункции.

Антиоксиданты, снижая интенсивность ПОЛ, предотвращают изменения энергетики митохондрий и тем самым повышают устойчивость организмов к действию изменяющихся факторов внешней среды

Нами показано наличие тесной корреляция между антиоксидантными свойствами препаратов и защитой растений и животных от стрессовых воздействий, т.е. препараты, снижающие свободно-радикальные процессы, приводящие к активации ПОЛ, являются адаптогенами.

Установлено, что в основе устойчивости растений к недостаточному увлажнению, возможно, лежит изменение жирнокислотного состава мембран митохондрий. При этом впервые найдена четкая корреляция между увеличением содержания ненасыщенных жирных кислот с 18 и 20 углеродными атомами и устойчивостью проростков к недостаточному увлажнению. В основе такой устойчивости лежит предотвращение изменений в энергетике митохондрий, что особенно важно для прорастающих семян, нуждающихся в энергетических ресурсах.

Кроме того, изучено влияние микродоз ПАУ и НА на организм животных. Показано, что при длительном воздействии на организм низких концентраций ПАУ и НА снижается ряд иммунологических показателей и это снижение коррелирует с изменениями в энергетике митохондрий. Доказано, что в основе этих изменений лежит активация перекисного окисления липидов, обусловленная избыточной продукцией АФК в митохондриях.

Научно-практическое значение работы

1. Для исследования биологической активности химических и природных соединений нами разработана модель «старения» митохондрий, основанная на активации ПОЛ в результате длительного хранения митохондрий при комнатной температуре. Данная модель позволяет выявить наиболее эффективные концентрации биологически активных веществ.


6

2.  Благодаря использованию модели «старения» митохондрий выявлено

протекторное действие препаратов фенозана калия и анфена в условиях

окислительного стресса. Подобраны эффективные концентрации этих

препаратов, оказывающих протекторный эффект в условиях гипоксии и

низкотемпературного стресса. Выявлены концентрации регуляторов роста

растений мелафена, пирафена и анфена, повышающие устойчивость

проростков гороха (Pisumsativum) к абиотическому стрессу (недостаточному

увлажнению и сочетанному действию недостаточного увлажнения и

умеренного охлаждения). Препарат мелафен проявлял протекторные

свойства в сверхнизких концентрациях (2 х 10"12 и 2х 10"18 - 2 х IO"21 М). В

настоящее время он прошел успешные полевые испытания и разрешен к

применению в сельскохозяйственной практике.

3.    Для токсикологических исследований (в частности для оценки

длительного действия микро количеств ПАУ и НА на организм) предложена

модель, основанная на регистрации интенсивности ПОЛ и изменения

функционального состояния митохондрий. На основании проведенных

исследований выявлено, что в основе патологических изменений,

возникающих при длительном воздействии на организм ПАУ и нитрозаминов,

лежат изменения энергетики митохондрий и иммунологической реактивности

организма, обусловленные активацией ПОЛ. Благодаря применению методов

оценки эффективности очистки газо-воздушных смесей создан и

запатентован (патент РФ № 2113810, выданный 27.06. 1998; патент РФ № №

2129913 , выданный 10.05 1999 г.) новый адсорбент, эффективно

поглощающий полициклические ароматические углеводороды и

нитрозамины. Поскольку ПАУ и нитрозамины являются канцерогенами,

адсорбент назван «Онкосорб» на цеолите.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изолированные митохондрии являются удобной моделью для

исследования влияния стрессовых факторов (в том числе и токсикантов) на

организм.

2.    Доказывается, что основным свойством адаптогенов является

снижение чрезмерной продукции АФК, а, следовательно, и снижение

интенсивности процессов перекисного окисления липидов в биологических

мембранах. Исходя из этих представлений,   разработана  модель «старения»


7

митохондрий и в эксперименте доказана перспективность использования данной модели для оценки адаптогенных свойств биологически активных соединений (препаратов для животных и регуляторов роста растений).

3.    В опытах по изучению жирнокислотного состава мембран

изолированных митохондрий растений установлено, что ненасыщенные

жирные кислоты с 18 и 20 углеродными атомами повышают устойчивость

растений к водному дефициту

4.  Благодаря использованию изолированных митохондрий в качестве

модели показано, что длительное воздействие ПАУ и НА даже в микро дозах

приводит к изменениям в энергетическом обмене и снижению

иммунологической реактивности организма.

  1. Длительное воздействие ПАУ и НА на организм приводит к активации перекисного окисления липидов, с чем, вероятно, связаны изменения в энергетическом и иммунологическом статусе организма.
  2. Адсорбент «Онкосорб» на цеолите удаляет из газо-воздушных смесей токсиканты, оказывающие негативное влияние на энергетический и иммунологический статус организма. При этом восстанавливается активность ферментов дыхательной цепи митохондрий и, как следствие, происходит восстановление функциональной активности лимфоцитов.

Реализация результатов исследования

  1. Опираясь на данные по активации ПОЛ в условиях стресса (Эмануэль ИМ., 1975; Обухова Л.К., Эмануэль ИМ., 1983; 12 Барабой В.А и др., 1997; Грабельных О.И., 2005), была разработана модель «старения» митохондрий для оценки адаптогенных свойств биологически активных веществ. Разрабатывая эту модель, мы предположили, что препараты в концентрациях снижающих интенсивность перекисного окисления липидов обладают свойствами адаптогенов
  2. На основании проведенных исследований разработаны тест-системы для оценки токсичности газо-воздушных смесей, основанные на влиянии «конденсатов» этих смесей на пролиферацию мононуклеаров периферической крови (МОПК).
  3. Совместно с сотрудниками Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН создан новый адсорбент («Онкосорб» на цеолите) для очистки газо-воздушных смесей от ПАУ и НА (патент РФ №

8

2113810, выданный 27.06. 1998;   патент РФ № 2129913 , выданный 10.05 1999 г)

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1993 г.; Москва, 1998 г.; Москва, 2006г.; Москва, 2010 г); Международной конференции «Reactive Oxygen and Nitrogen Species, Antioxidants and Human Health» (Смоленск, 2005; 2007; 2009); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.; 2008 г; 2009; 2010.;2011; 2012 г.); Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2007).; Международном симпозиуме «Физика и химия процессов, ориентированных на создание новых наукоемких технологий материалов и оборудования» (Московская область, Черноголовка, 2007); VI и VII Съезде общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007) и (Нижний Новгород, 2011); 2 International Symposium "Plant Growth Substances. Intercellular hormonal signaling and applying in agriculture" (Kyiv, 2007); Международном Междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине. ???+????7 & ???+????8» (Крым. Судак , 2007; 2008 г), на XVIII и XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007; Волгоград 2011); III Международной конференция «Сорбенты как фактор качества жизни» (Белгород, 2008); IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2008); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008); 49-th Intrnational Conference on the Biosience of Lipids (Maastricht, the Netherlands, 2008); V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009; 2012); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Московская область, Пущино, 2008; 2009; 2011); VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2009); International Scientific-practical interdisciplinary workspop & discussion scientific club "New Technologies in medicine and experimental biology (IW+SDC 09) (Сингапур, Бали, 2009) International symposium «MipTec 2009» (Basel, Switzerland, 2009); Vth International symposium «Design and synthesis of supramolecular architectures» (Казань,. 2009 г); 3d International Summer School «Supramolecular Systems in Chemistry and Biology»  (Lvov, Ukraine, 2010);   19th International  Symposium


9

"ECOLOGY & SAFETY" (Sunny Beach resort, Bulgaria,2010); Международной

научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и

прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010;

2011;2012);        XI Andrianov Conference "Organosilicon Compounds.    Syntesis,

Properties, Applications "(Москва, 2010); на Международном конгрессе по органической химии им. A.M. Бутлерова (Казань, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 25 статей, в рецензируемых российских журналах, входящих в перечень ВАК печатных работ и 20 статей, опубликованных в других журналах.

Структура диссертации.

Диссертация содержит 257 стр., 66 рисунков, 506 литературных ссылок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на митохондриях печени крыс и митохондриях, выделенных из запасающей паренхимы сахарной свеклы и из гипокотилей проростков гороха.

Выделение         митохондрий        печени         проводили        методом

дифференциального центрифугирования (Mokhova E.N., et al, 1976). Первое центрифугирование при 600 g в течение 10 минут, второе - при 9000 g , 10 минут. Осадок ресуспендировали в среде выделения. Соотношение ткань: среда - 1:0.25. Среда выделения: 0,25 М сахароза, 10 мМ HEPES, рН 7,4.

Выделение митохондрий из 6-дневных эпикотилей проростков гороха

(Pisum sativum) или корнеплодов сахарной свеклы проводили по методу {Попов В.Н. и др., 2003) в нашей модификации. Эпикотили гороха длиной 3-6 см (20-25 г) или 25-30г. запасающей паренхимы сахарной свеклы гомогенизировали со 100 мл среды выделения, содержащей: 0,4 М сахарозу, 5 мМ ЭДТА, 20 мМ КН2Р04 (рН 8.0), 10 мМ КС1, 2 мМ дитиоэритрита и 0.1% БСА (свободный от жирных кислот). Гомогенат центрифугировали при 25000g в течение 5 мин. Второе центрифугирование - в течение 3 мин при 3000g. Осаждение митохондрий    проводили    в    течение     10    мин    при     llOOOg.     Осадок


10

ресуспендировали в 2-3 мл среды, содержащей: 0.4 М сахарозу, 20 мМ КН2Р04 (рН 7.4), 0.1% БСА, (свободный от жирных кислот), и вновь осаждали митохондрии при 1 lOOOg в течение 10 мин.

Скорости дыхания митохондрий из печени крыс, корнеплодов сахарной свеклы и проростков гороха регистрировали электродом типа Кларка, используя полярограф LP-7 (Чехия). Среда инкубации митохондрий печени содержала: 0.25 М сахарозу, 10 мМ трис-НС1, 2 мМ MgS04, 2 мМ КН2Р04, 10 мМ КС1 (рН 7.5) (28°С). Среда инкубации митохондрий сахарной свеклы и митохондрий из проростков гороха содержала: 0.4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-трис-буфер (рН 7.2), 5 мМ КН2Р04, 4 мМ MgCl2, 0.1% БСА (28°С).

Белок                   определяли                  биуретовым                  методом.

Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали флуоресцентным

методом {Fletcher B.I. et al, 1973). Липиды экстрагировали из 3-5 мг

митохондриального белка смесью хлороформ: метанол = 2:1 (по объему).

Соотношение митохондрии : смесь хлороформ-метанол = 1: 10. Митохондрии

гомогенизировали в течение 1 мин при температуре 10°С, затем к смеси

добавляли равный объем дистиллированной воды, быстро смешивали и

переносили в 12 мл центрифужные стаканы. (Промывание водой необходимо

для удаления флавиновых компонентов, имеющих максимум флуоресценции в

области 520 нм). Центрифугировали в течение 5 мин при 600 g. Отбирали 3 мл

нижнего (хлороформного) слоя и добавляли 0,3 мл метанола. Регистрацию

флуоресценции проводили в десятимиллиметровых кварцевых кюветах на

спектрофлуориметре         FluoroMax-HoribaYvon     GmbH     (Германия).     В

контрольную кювету добавляли 3 мл хлороформа, а затем 0,3 мл метанола. Длина волны возбуждения флуоресценции была 360 нм, испускания - 420-470 нм Результаты выражали в условных единицах флуоресценции пересчитанных на мг белка. Регистрацию спектров флуоресценции продуктов ПОЛ мы проводили на спектрофдлуориметре FluoroMax-HoribaYvon GmbH (Германия) Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ

Определение ТБК - активных продуктов в плазме крови и гомогенате ткани легких по реакции образующихся в процессе ПОЛ альдегидов с тиобарбитуровой кислотой по методу Коробейниковой Е.Н [1989]

Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) получали кислотным метанолизом суммарной фракции липидов мембран митохондрий [Carreau J.P., Dubacq J.P,   1979]     или методом  одностадийного  метилирования жирных


11

кислот, исключающего экстракцию липидов [Wang J. et.al, 2000]. Очистку метиловых эфиров жирных кислот проводили ТСХ на пластинах с силикагелем и элюировали гексаном. В качестве внутреннего стандарта использовали пентадекан.

Идентификацию МЭЖК проводили методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) и по величинам индексов удерживания [Golovina R.V., Kuzmenko Т.Е., 1977]. ГХ-МС осуществляли на хромато-масс-спектрометре Hewlett-Packard-6890 с масс-селективным детектором НР-5972. МЭЖК разделяли на капиллярной колонке HP-5MS (30 м ? 0.25 мм, слой фазы 0.25 мкм) при программировании температуры от 60 до 285 °С со скоростью 5°С/мин. Температура испарителя - 250°С, детектора - 280°С. Масс-спектры получали, в режиме электронного удара при ионизирующем напряжении 70 eV и скорости сканирования 1 сек на декаду масс в области 40-450 аем

Количественный анализ метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматографе «Кристалл 2000 М» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой SPB - 1 (50 м х 0.32 мм, слой неполярной фазы 0.25 мкм). Анализ гексановых растворов метиловых эфиров проводили при программировании температуры со скоростью 4°С / мин от 120° до 270 ° С (50 мин). Температура инжектора и детектора - 250° С. Скорость газа-носителя гелия составляла 1.5 мл/ мин. Анализировали по 2 мкл гексановых растворов. Количественное содержание МЭЖК в образцах рассчитывали по отношению площади пика соответствующей кислоты к сумме площадей пиков, соответствующим найденным метиловым эфирам ЖК.

Исследования проводили совместно с д.х.н. Мишариной Т.А., к.х.н. Трениной М.Б., к.х.н. Крикуновой Н.И

При исследовании влияния ПАУ и нитрозаминов на биологические показатели использовали искусственную газо-воздушную смесь, содержащую такое же количество ПАУ и НА, которое находится в воздухе промышленной зоны,  вблизи  оживленных  автомагистралей  и  в  накуренных  помещениях

(Khesina A. Ya., 1992; Хесина А.Я. и др., 1996; Заридзе Д.Г. с соавторами, 2002) (табл.1). Исследуемую газо-воздушную смесь либо не очищали, либо пропускали через 25мм слой адсорбента с объемной скоростью 19,8 л/час.


12

В эксперименте использовали три различных вида адсорбентов: 1-клиноптилолит (природный цеолит, имеющий следующий химический состав: (Са, Na2) [AlSi206]2-6H20); 2-Онкосорб - ?,?'- бис (3-триэтоксисилилпропил)-тиокарбамид; 3-цеолит (клиноптилолит), импрегнированный «Онкосорбом». Цеолит пропитывали раствором «Онкосорба» в этиловом спирте и подвергали термообработке в течение нескольких часов.

Таблица 1. Состав искусственной газо-воздушной смеси (нг/м ).

СОЕДИНЕН]

ИЯ

ПАУ

Количество

Нитрозамины

Количество

Пирен

5.40

НДМА

4.58

Бенз(а)пирен

5.50

НПИП

7.60

Бенз(е)пирен

6.30

НПИР

70.50

Перилен

1.70

НМОР

26.0

Дибенз(а,п)антрацен

1.00

НДЭА

18.0

Дибенз(а,с) антрацен

1.20

-

-

Дибенз(§,пД)перилен

5.00

-

-

Бензантрацен

1.10

-

-

«Конденсат» газо-воздушной смеси, необходимый для модельных исследований, получали пропусканием смеси через 100 мл физиологического раствора в течение 1 часа с объемной скоростью потока 19,8 л/час. Все полученные препараты «конденсатов» газо-воздушной смеси стерилизовали пропусканием через миллипоровые стерильные фильтры одноразового использования с диаметром пор 22мкм.

Для оценки эффективности поглощения токсикантов проводили химический анализ газо-воздушной смеси, прошедшей через слой адсорбентов.

Содержание ПАУ определяли в бензольном элюате конденсата газовоздушной смеси методом тонкослойной хроматографии с незакрепленным слоем окиси алюминия 2-ой степени по Брокману в системе гексан-бензол (3:1). После развития хроматограммы выделяли 4 зоны под УФ лампой и в полученных фракциях идентифицировали ПАУ на спектрофотометре при температуре жидкого азота.

Для  определения летучих НА смесь  пропускали через жидкостные ловушки   с   цитратно-фосфатным   буфером   (рН   4,5),   содержащим   20мМ


13

аскорбиновой кислоты. Поглотительный раствор экстрагировали двухлористым метиленом, отделяли воду и экстрагировали 2М NaOH, доводили до объема 5 мл на водяной бане в токе азота. Анализировали на газовом хроматографе «Цвет» с детектором термальной энергии TEA 502А (США), специфическим для НА. Колонки стеклянные 2,5 м х 4 мм, заполненные CaRbowax 20М + 2% КОН. . Температура колонки - 150°С, испарителя - 225°С, пиролизатора - 470°С. Скорость газа-носителя аргона 40 мл/мин.

Исследование содержания ПАУ и НА в воздухе промышленной зоны, получение искусственной газо-воздушной смеси и изучение адсорбции ПА У и НА из этой смеси проводили в сотрудничестве с   к.х.н. Кривошеевой Л.В.

В экспериментах по оценке влияния ПАУ и НА на биологические показатели были использованы крысы-самцы линии Вистар с исходной массой тела 90-100 г. Животных разделили на 5 групп: 1 - контрольные животные; 2 - крысы, затравливаемые искусственной газо-воздушной смесью; 3 - крысы, затравливаемые искусственной газо-воздушной смесью, прошедшей через слой цеолита; 4 - крысы, затравливаемые искусственной газо-воздушной смесью, прошедшей через слой «Онкосорба»; 5 - крысы, затравливаемые искусственной газо-воздушной смесью, прошедшей через слой цеолита, импрегнированного «Онкосорбом». Затравку животных 2-5 групп осуществляли в камере объемом 10 л, куда подавалась газо-воздушная смесь. В камеру помещали по 4-5 животных, где они находились в течение 40 сек. Через каждые 30-40 мин процедура повторялась. Количество повторов 5.

Мононуклеары периферической крови человека (МНПК) выделяли в градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1,077), дважды отмывали средой Игла. Культивировали МНПК в среде RPMI-1640 (Sigma), содержащей L-глутамин (300мкг|мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Calbiochem") в 96 луночных планшетах ("Limbro"). К 50 мл МНПК (2млн/мл) добавляли 50 мкл Т-клеточного митогена фитогемагглютинина (ФГА) в конечной концентрации 10мкг/мл и 100 мкл «конденсата» газо-воздушной смеси в конечных концентрациях 1мкг/мл; 10 мкг/мл; 100 мкг/мл; 1000 мкг/мл или физиологический раствор в соответствующих разведениях.

Культивирование проводили в течение 72 часов в С02 инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СОг. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку добавляли 1 мкКи Н-тимидина. Затем содержимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры ("Flow") с использованием прибора «Харвестер»


14

(Flow). После высыхания фильтры помещали во флаконы со сцинтилляционной

жидкостью, состоящей из толуола с добавлением на 1л 4 г 2,5-

динитрофенилоксазола и 0,1 г 1,4-ди-5-фенилоксазолилбензола. Уровень

включения        Н-тимидина   в    лимфоциты    определяли    на   счетчике    ?-

сцинтилляций            ?-Trac.      Исследование      проводили      совместно      с

к.б.н. М.М. Литейной и д.б.н. М.Ф. Никоновой.

Реакцию антителообразования в селезенке в модификации Cunningham (Натвич Дж. Б и др., 1980) исследовали спустя 3 и 6 месяцев от начала затравки крыс искусственной газо-воздушной смесью. В исследуемые сроки животных иммунизировали эритроцитами барана и на пятые сутки подсчитывали число клеток в селезенке и число антителобразкющих клеток (АОК) в пересчете на селезенку крыс. Работу по исследованию реакции антителообразования проводили совместно с аспиранткой Государственного научного центра Института иммунологии  Минздрава РФ  Булановой Б.Г.

У экспериментальных животных цитохимически определяли энзимограмму лейкоцитов периферической крови. Активность а-глицерофосфатдегидрогеназы (ГФДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) лимфоцитов определяли по Нарциссову (Нарциссов Р.П., 1999), заменяя пара нитротетразолий фиолетовый на пара нитротетразолий синий (Кондрашова М.Н., 2009). Работа проводилась совместно с бывшим сотрудником Российского национального исследовательского медицинского университета им. И.И. Пирогова - к.б.н. Власовой М.Б.

В ткани печени исследуемых групп животных измеряли амплитуду сигналов ЭПР с g-фактором 2,25 (цитохром Р-450) и с g-фактором 1,94, обусловленным железосерными белками, локализованными в электрон-транспортных цепях митохондрий. Измерения проводили на ЭПР спектрометре фирмы "Bruker" (Германия), при 77° К. Амплитуду сигналов ЭПР относили к весу образца и сравнивали с аналогичными параметрами контрольной группы животных. Исследование проводилось в сотрудничестве с к.б.н. Пахомовым В.Ю.

Протекторную активность препаратов исследовали, используя модели:

1. Модель гипобарической гипоксии - белых мышей (самцы, вес 25 г.) помещали в стеклянную барокамеру, соединенную с вакуумным насосом и создавали в камере разряжение, соответствующее высоте 11.5 тысяч метров над уровнем моря. Скорость подъема 100 м/сек.


15

2.   Модель цитотоксической гипоксии. Мышам внутрибрюшинно

вводили азид натрия в дозе 20 мг/кг.

  1. Модель гемической гипоксии. Мышам внутрибрюшинно вводили нитрит натрия в дозе 250 мг/кг.
  2. Модель сочетанного действия низкотемпературного стресса и мышечной нагрузки. Мышам привязывали 500 мг грузики и помещали в ванну с температурой 2°С.

5.        Мод ель острого алкогольного отравления. Мышам подкожно

вводили этанол в дозе 140 мг/кг.

Всем опытным животным за 45 минут до воздействия внутрибрюшинно вводили исследуемый препарат в выбранной дозе.

Исследование стрессовых воздействий и регулятора роста растений мелафена проводили на проростках гороха. Семена гороха проращивали следующим образом: в контрольной группе семена промывали водой с мылом и 0,01% раствором KM11O4 и замачивали в воде в течение 60 мин., в опытной группе семена замачивали в 2 х 10"10 -2 х IO"18 М растворе мелафена. Спустя 1 сутки половину семян контрольной группы и половину семян, обработанных мелафеном, переносили на сухую фильтровальную бумагу в открытые кюветы. Через 2 суток «засухи» семена помещали в закрытые кюветы с периодически увлажняемой фильтровальной бумагой, где они находились в течение последующих дней. На 5 день подсчитывали число проросших семян и выделяли митохондрии.

Замачивание семян гороха при исследовании сочетанного влияния

недостаточного увлажнения и умеренного охлаждения проводили таким же

образом, как описано выше. Спустя 2 суток половину проростков,

обработанных мелафеном, переносили на сухую фильтровальную бумагу в

открытые кюветы, где они находились при 10-14°С в течение двух суток

(«Засуха+холод+мелафен»).       Вторая    половина    семян,    обработанных

мелафеном, и половина контрольных семян в течение этого же времени находилась в закрытых кюветах с периодически увлажняемой фильтровальной бумагой при 14°С («Холод» и «Холод+мелафен»). Через двое суток все проростки переносили в помещение с температурой воздуха 22°С, и помещали в закрытые кюветы с периодически увлажняемой бумагой. Контрольная группа проростков в течение всего эксперимента находилась при температуре 22°С. На 6-й день подсчитывали число проросших семян и выделяли митохондрии. Проращивание семян гороха проводили совместно с д.б.н. Шугаевым А.Г., к.б.н. Генерозовой И.П.


16

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили путем определения средних арифметических и стандартных ошибок, а также достоверности разницы между вариантами на уровне значимости Р.<0,05. Коэффициенты корреляции рассчитывали с помощью статистического пакета прикладных программ Statistica Version 6 for Windows .

В эксперименте использовали реактивы следующих фирм: карбонат калия, метанол, хлороформ (Merck, Германия), гексан (Рапгеас, Испания), хлористый ацетил (Acros, Бельгия), сахароза, Трис, FCCP ротенон, антимицин А, аскорбат, ТМФД малат, глутамат, сукцинат (Sigma, США), БСА (свободный от жирных KH^OT)(Sigma,CIIIA), HEPES (МР Biomedicals, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Разработка модели для поиска действующих концентраций биологически активных веществ, предотвращающих развитие патологических состояний при стрессовых воздействиях.

Различные стрессовые факторы, такие как токсические вещества, гипоксия, низкотемпературный стресс приводят к нарушению биоэнергетических функций митохондрий и избыточной продукции АФК, лежащей в основе развития патологических процессов (KirkinezosI. G, MoraesС. Т., 2001; Тодоров КН., 2007). Мы предположили, что препараты, обладающие антиоксидантной активностью, вероятно, будут предупреждать дисфункцию митохондрий при стрессовых воздействиях. Для проверки этого предположения нами была разработана модель «старения» митохондрий, приводящая к активации ПОЛ. Для увеличения генерации АФК митохондриями их на 15 мин помещали в 0,5 мл среды, содержащей 70мМ КС1, 10 мМ HEPES и 1мМ КН2Р04, рН 7,4 (рис. 1).

Инкубация митохондрий в гипотоническом растворе КС1 вызывала слабое набухание митохондрий, что согласуется с данными EarnshawМ. J., TrueloveВ., 1968. Чтобы усилить этот эффект мы ввели в среду инкубации неорганический фосфат, также вызывающий набухание митохондрий и активирующий образование АФК {MyronD.Ret al., 1971; KowaltowskiA.J.et al, 1996; Aronis A. et al, 2004; O'Rourke В., 2007). Митохондрии контрольной группы помещали в среду, содержащую 70мМ КС1, 10 мМ HEPES, 1мМ КН2Р04,  рН  7,4  и  тот  час  же  экстрагировали  липиды.  В  этой  модели


17

«старение» не зависело ни от времени года (т.е. от гормонального статуса животных), ни от их диеты.


110000С 100000С 90000С 80000С 70000С 60000С 50000С 40000С 30000С 20000С 10000С


  1. contri
  2. cont2 -agingl -aging2

¦та—та—та—та—та—т—та—та—та—таг

Lenth of waves in nm


Рис 1. Влияние «старения» на интенсивность ПОЛ. По оси абсцисс - длина волны в нм; по оси ординат - интенсивность флуоресценции в относительных единицах.   1 и 2 - «старение»; 3 и 4- контроль.

Известно, что пространственно-затрудненные фенолы в большинстве

случаев обладают антиоксидантными свойствами (Эмануэль Н.М., Липчина

Л.П. , 1958). В связи с этим в качестве объектов исследования был выбраны

препараты, являющиеся пространственно-затрудненными фенолами.

Препараты, синтезированные сотрудниками Института биохимической

физики им. Н.М. Эмануэля РАН, фенозан калия (калиевая соль 2,6-ди-трет-

бутил-4-гидроксифенил-пропионовой       кислоты)                   и       «Анфен»

( 1 -ацетиламидо)-1 -(3,5-ди-третбутил-4-гидроксибензил)-малонат налщя)(А.А.Володъкин, Г.Е.Заиков, 2006; В.В.Ершов и др. ,1973).

Их добавляли в среду инкубации митохондрий печени. Инкубация митохондрий в солевой среде вызывала 2-кратное увеличение интенсивности флуоресценции продуктов ПОЛ. Введение препарата фенозана калия в среду инкубации митохондрий приводило к снижению флуоресценции продуктов ПОЛ, и это снижение зависело от концентрации фенозана калия в среде инкубации. Препарат в концентрации IO"5; IO"6 и 10"7М оказывал слабое воздействие на интенсивность перекисного окисления липидов. В концентрациях 10" - 10" и 10" - 10" М фенозан калия снижал интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ до контрольного уровня (рис.2).

200000    -------------------------------------------------------------------------------------------------------------

О           I                  I                  I                  I                  I                  I                 I                  I                  I                  I                  I                  I

О                      6                       3                     12                    17                    22

'9 [стенозан  калия   ]

Рис. 2. Интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ при введении различных концентраций фенозана калия в среду инкубации митохондрий печени крыс. По оси ординат интенсивность флуоресценции, по оси абсцисс - концентрация фенозана калия в М.1-«старение»; 2- контроль.

Полученные данные показали, что наиболее эффективное использование препарата возможно в концентрационном интервале 10"9-10"14М. Введение крысам препарата в концентрации 10"14М уже через 1 час после введения приводило к увеличению содержания ненасыщенных и снижению содержания насыщенных жирных кислот в мембранах митохондрий печени (таблица 2).

Содержание стеариновой кислоты уменьшалось в 1,3 раза, пальмитиновой - в 1,5 раза. В это же время содержание линолевой и линоленовой кислот увеличивалось в 1,2; 3,6 раза соответственно. В результате отношение ненасыщенных кислот к насыщенным (коэффициент К{) возрастало с 1,27±0,10 до 2,16±0,06. Соотношение же суммарного содержания ненасыщенных жирных кислот с 18 углеродными атомами к стеариновой кислоте (коэффициент К2) возрастало в 1,7 раз.


19

Таблица 2. Жирнокислотный состав мембран митохондрий печени крыс при введении 10"14М фенозана калия (представлены результаты шести опытов).

Группа

Относительное содержание жирных кислот в %.

16:0

16:1

18:0

18:1

18:2

Контроль

24,6±0,7

2,5±0,1

18,9±0,3

11,4±0,3

15,0±0,4

Фенозан калия 1 час после инъекции

16,5±0,3

1,4±0,1

14,6±0,5

8,9±0,1

18,5±0Д

Фенозан калия

3 часа после

инъекции

18,4±0,3

2,2±0,6

14,5±0,7

6,9±1,0

26,5±1,7

Группа

Относительное содержание жирных кислот в %.

18:3

20:4

Неидент ифициро ван-ные

Ki

К2

Контроль

4,1±1,3

22,0±0,7

1,5±0,20

1,27±0,10

1,67±0,30

Фенозан калия 1 час после инъекции

14,8±0,2

23,6±0,2

1,7±0,10

2,16±0,06

2,90±0Д0

Фенозан калия 3 часа после инъекции

12,2±0,9

18,0±0,5

1,3±0,5

2,00±0,01

3,20±0,40

Сходные изменения жирнокислотного состава мембран наблюдались при адаптации животных к холоду {Спиридонова В.А. и др., 1982). Через 3 часа в суммарной фракции липидов мембран митохондрий процентное содержание насыщенных жирных кислот остается сниженным, а ненасыщенных даже несколько растет.

В следующей серии опытов исследовали влияние фенозана калия на энергетику митохондрий печени крыс, находящихся в условиях гипобарической гипоксии. В барокамере создавали разряжение, соответствующее высоте 9,0 тысяч метров над уровнем моря. «Подъем» проводили в первую минут до 5 тыс. м., а в каждую последующую еще на одну тысячу метров (Время нахождения крыс «на высоте» 9,0 тысяч метров над уровнем моря -5,0 минут).

Гипобарическая гипоксия (ГГ) приводила к 25% снижению максимальных скоростей окисления NAD-зависимых субстратов. При этом уменьшалась и эффективность окислительного фосфорилирования:


20

дыхательный контроль по Чансу снижался с 3,51±0,04 до 2,27±0,03.. Введение крысам IO"14 М фенозана калия за 45 минут до воздействия предотвращало изменения в функциональных характеристиках митохондрий печени. Изменения структурно-функциональных характеристик митохондрий отражались и на физиологических показателях   (таблица. 3).

Таблица 3.   Протекторная активность фенозана калия

Воздействие

Измеряемый параметр

Контроль

Фенозан калия 1014 м

Подъем на высоту 11.5 тыс. м

(гипобарическая гипоксия)

Время жизни в минутах % выживших

4.0±1.1

20%

15.0±2.8

50%

Инъекция азида натрия 20 мг/кг

(цитотоксическая гипоксия)

Время жизни в минутах % выживших

3.0±0.6 0%

11.0±1.1

50%

Инъекция нитрита натрия 250 мг/кг (гемическая гипоксия)

Время жизни в минутах % выживших

15.1±2.5

20%

53.5±3.0 60%

Плавание с грузом при 2°С (низкотемпературный стресс в сочетании с мышечной нагрузкой)

Время жизни в минутах % выживших

3.2±0.6 0%

14.3±2.4 0%

В этой дозе препарат в 3,5-4,5 раз увеличивал продолжительность жизни и на 20-30% повышал выживаемость животных в условиях гипоксии и низкотемпературного стресса.

Аналогичные результаты были получены для другого синтетического антиоксиданта Анфена. Введение 10"6М и 10"13М Анфена в солевую среду инкубации митохондрий приводило к снижению интенсивности перекисного

1 ?

окисления липидов. При этом препарат в концентрации 10" М оказался даже более эффективным, чем в концентрации 10"6М (рис.3).

Изучение влияния препарата на перекисное окисление липидов провели и на целых животных, подвергнутых стрессу. В качестве стрессового

22

Исследования устойчивости животных к стрессовым воздействиям показали, что и другой синтетический антиоксидант - Анфен в концентрациях IO"6 М и IO"13 М повышает выживаемость животных в условиях гипоксии и острого алкогольного отравления. При этом продолжительность жизни животных в условиях гипоксии возрастала в 1,8-4,5 раза и в 3,9 раза - в условиях острого алкогольного отравления, а выживаемость животных увеличивалась на 12-40% (таблица 4).

Таблица 4.   Протекторная активность анфена.

Воздействие

Измеряемый параметр

Контроль

Анфен в М

1013

IO"6

Инъекция азида натрия 20 мг/кг

Время жизни в

минутах

% выживших

2,3±0.5 (10) 0%

10,5±0,8 (10) 30%

5,2±1,2 (10) 40%

Инъекция нитрита натрия 250 мг/кг

Время жизни в

минутах

% выживших

20,5±3,1 (10) 0%

38,6±5,3 (10) 20%

35,7±6,4 (10) 15%

инъекция этанола 140 мг/кг

Время жизни в минутах

% выживших

35,4±6,1 (10) 0%

100,4±26,3 (10) 20%

137,4±31,1 (10) 12%

2. Поиск эффективных концентраций биологически активных веществ, повышающих устойчивость растений к абиотическому стрессу

Предположение, что основным свойством препаратов - адаптогенов является снижение чрезмерной продукции АФК, а, следовательно, и снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов в биологических мембранах и главным образом в мембранах митохондрий было проверено нами на препаратах, оказывающих влияние на рост и развитие растений, т.е. на регуляторах роста растений.

В       эксперименте    использовали    синтезированный    в    Институте

биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН препарат «Амбиол» -производное 5 -гидроксибензимидазола (2-метил-4-диметиламинометил-бензилимидазол-5-ол-дигидрохлорид), обладающий антиоксидантными свойствами {Кузнецов Ю.В., 2006). Исследовали также синтезированные в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова РАН, Казанского Научного центра   препарат «Мелафен» ( меламиновая соль бис


23

(оксиметил)-фосфиновой кислоты) и «Пирафен» (соль бис (оксиметил)-фосфиновой кислоты 2,4,6-триаминопиримидина) (Фаттахов СТ., Лосева Н.Лидр.,2004)

3. Влияние мелафена пирафена и амбиола на энергетику митохондрий печени и митохондрий, выделенных из запасающей

паренхимы сахарной свеклы.

Повышение устойчивости растений к стрессовым воздействиям и активация ростовых процессов требуют значительных энергетических затрат, которые напрямую связаны с активацией энергетического обмена и в первую очередь с изменением энергетики митохондрий. Дыхательная цепь митохондрий растений и животных имеет сходную организацию, основные различия касаются CN-резистентного переноса электронов и строения NADH-дегидрогеназного участка дыхательной цепи {Шугаев А.Г., 1991). В связи с этим, исследования влияния препарата проводили как на митохондриях печени крыс, так и на митохондриях из корнеплодов сахарной свеклы.

Введение регуляторов роста растений мелафена, пирафена или амбиола в среду инкубации приводило к изменению энергетики как митохондрий из печени крыс, так и митохондрий, выделенных из корнеплодов сахарной свеклы.


27

На рис. 10 представлены данные по влиянию мелафена на скорости окисления глутамата + маната митохондриями печени крыс и митохондриями, выделенными из запасающей паренхимы сахарной свеклы. Видно, что мелафен в концентрациях 2* 10"5; 2*10"14-2?10"17 и 2*10"22М снижал максимальные скорости окисления NAD-зависимых субстратов митохондриями печени крыс и митохондриями, выделенными из корнеплодов сахарной свеклы. При этом величина дыхательного контроля по Чансу падала с 2,45±0,01 до 1,85±0,02 (концентрация мелафена 2*IO"15 М) (митохондрии печени) и с 2,30±0,01 до 1,71±0,02 (2х10"16М) (митохондрии запасающей паренхимы корнеплодов сахарной свеклы). Наиболее эффективными являлись концентрации препарата 2х10"12М, 2х10"18 - 2?10"21 М. Мелафен в этих концентрациях повышал скорости окисления NAD-зависимых субстратов в дыхательной цепи митохондрий печени наЮ-35% в присутствии АДФ и на 40% в присутствии разобщителя. Величина дыхательного контроля по Чансу при этом возрастала с 2,30±0,01 до 2,95±0,03 (2*W12М) и 3,45±0,02 (2?10~18?) .

-??? печ ен и


 


мх свекл ы


IO   11   12   12   14   15   16   17   IS   19   21   22

2 х I g [ М ел а фe н ]

Рис.10. Максимальные скорости окисления NAD-зависимых субстратов при введении в среду инкубации митохондрий различных концентраций мелафена.

Отметим, что рост величины дыхательного контроля по Чансу при окислении NAD-зависимых субстратов обусловлен уже отмеченным увеличением скоростей окисления субстратов митохондриями печени в присутствии АДФ (в состоянии 3 по Чансу) с 50,1±1,6 до 58,2±1,0 и 72,5±4,3 нмоль Ог/мг белка мин. Препарат также стимулировал скорости окисления сукцината митохондриями печени крыс, повышая и эффективность окислительного фосфорилирования (величина дыхательного контроля    при


28

окислении сукцината возрастала с 2,80±0,05 до 3,30±0,09 (2* IO"12 М) и 3,45±0,02(2х10"18М).

В дыхательной цепи митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы скорости окисления NAD-зависимых субстратов в присутствии АДФ возрастали на 14 - 20%, а величина дыхательного контроля по Чансу увеличивалась с 2,30±0,10 до 2,95±0,20 (2?10~18 и 2?10~21?). Необходимо подчеркнуть, что препарат во всех исследуемых концентрациях не влиял ни на максимальные скорости, ни на величину дыхательного контроля по Чансу при окислении сукцината.

Стимулируя рост активности NAD-зависимых дегидрогеназ, мелафен, по-видимому, способствует активации энергетических процессов в клетке и обеспечивает высокую энергию прорастания семян. Существенное влияние на активацию энергетических процессов в клетке оказывало и влияние препарата на скорости переноса электронов на конечном цитохромоксидазном участке дыхательной цепи митохондрий как растительного, так и животного происхождения. Так, введение мелафена в среду инкубации митохондрий печени увеличивало скорости окисления аскорбата в присутствии ТМФД (?,?,?',?'-тетраметил-п-фенилендиамина) с 82,4±1,2 до 105,1±1,4 нмоль Ог/мг белка мин. Препарат еще сильнее стимулировал транспорт электронов на цитохромоксидазном участке дыхательной цепи митохондрий сахарной свеклы. В этом случае скорости окисления возрастали на 12-15% (рис.11).

700

Таблица 5. Влияние недостаточного увлажнения на

жирнокислотный состав мембран проростков гороха.

(Относительные проценты). (Результаты 8 экспериментов).

Соединение

Контроль

Контр+мел

НУ

НУ+мел

12:0

0,34±0,03

0,34 ±0,01

0,94±0,30

0,34±0,20

14:0

0,68+0,03

0,64+0,02

0,67±0,20

0,69+0,20

16:1?7

0,36±0,25

0,36+0,004

0,47±0,13

0,42+0,005

16:0

18,64±0,75

18,63±0,05

20,74±0,11

18,96±0,5

17:0

0,45±0,50

0,78+0,12

0,66±0,10

0,45+0,16

18:2 ?6

50,71±0,80

50,74±0,4

45,22±0,10

50,65±0,01

18:3 ?3

11,3±0,02

10,67±0,01

9,18±0,30

10,81±0,09

18:1 ?9

5,27+0,40

5,25±0,37

6,77±0,20

5,22+0,01

18:1 ?7

0,81+0,10

0,79+0,24

0,61±0,03

0,73+0,05

18:0

4,10+0,18

4,14+0,32

5,83±0,38

4,10+0,15

20:2 ?6

0,82±0,01

0,80±0,02

0,30±0,50

0,82±0,1

20:1 ? 9

2,22±0,01

2,79±0,01

1,57±0,50

2,60±0,3

20:1 ?7

1,45±0,01

1,00±0,01

1,14±0,10

1,52±0,01

20:0

1,23±0,03

1,32±0,03

2,50±0,22

1,30±0,05

22:0

1,23±0,11

1,20±0,03

2,52±0,20

1,04±0,05

24:0

0,37±0,02

0,55±0,005

0,98±0,10

0,35±0,10

Индекс ненасыщенности С18

1,41±0,04

1,40±0,04

1,25±0,02

1,40±0,01

Хненасыщ С20/С20:0

3,65±0,03

3,48±0,03

1.20±0,16

3,80±0,30

(20:2 ?6) х 2+20:1 ? 9 + 20:1?7/20:0

4,31±0,01

4,08±0,01

1,32±0,09

4,43±0,08

Хненасыщенные/насыщен-ные жирные кислоты

2,70±0.19

2,62±0.09

1,87±0.20

2,67±0.11

Условные обозначения: НУ - недостаточное увлажнение; НУ+мел- обработка семян мелафеном в условиях недостаточного увлажнения.

При    этом    содержание    линолевой    кислоты    снижалось    на    11%, линоленовой - на 29%. Содержание стеариновой кислоты возрастало на 41%,


33

что вело к снижению соотношения Ci8 ненасыщенных жирных кислот к стеариновой кислоте с 16,61 ±0,30 до 10,59 ±0,20. Аналогичные изменения в жирнокислотном составе происходили в мембранах митохондрий кукурузы, клетках картофеля, мембранах из листьев Arabidopsis thaliana и абрикоса в условиях водного дефицита (A. Leone et al, 1996; Guo Yun-ping, Li Jia-rui , 2002; Макаренко СП.с соавторами, 2003; A. Gigon et al, 2003; Junior R. R.M et al, 2008). При этом авторы отмечали значительное снижение содержания линолевой и линоленовой кислот и увеличение содержания стеариновой кислоты в мембранах.

Недостаточное увлажнение приводило также к снижению соотношения ненасыщенных к насыщенным жирным кислотам с 20 углеродными атомами, что, вероятно, ведет к повышению ригидности мембран. Эти изменения, возможно, влекут за собой и изменение липид-белковых взаимодействий, следовательно, и активности связанных с мембранами ферментов. Действительно, недостаточное увлажнение имело следствием снижение максимальных скоростей окисления NAD-зависимых субстратов. Скорости окисления глутамата+малат в присутствии разобщителя (FCCP) падали с 70,0+4,6 до 48,9+3,2 нг атом кислорода/мг белка х мин и величина дыхательного контроля по Чансу снижалась с 2,27+0,01 до 1,70+0,02 (таблица 6)·

Таблица 6. Скорости окисления пары глутамат+малат митохондриями

проростков гороха в условиях недостаточного увлажнения и при обработке семян мелафеном (Скорости окисления представлены в виде

нг атом кислорода/мг белка х мин).

Группа

Vo

v3

v4

v3/v4

Vfccp

Vrcn

Контроль

20,0+1,5 (10)

68,0+4.1 (10)

30,0+2.0 (10)

2,27+0,01 (10)

70,0+4.6 (10)

20,1+1.5 (10)

Недостаточное увлажнение

12,0+2,0 (10)

48,6+3.0 (10)

40,2+1.0 (10)

1,70+0,02 (10)

48,9+3.2 (10)

18,3+2.0 (10)

Недостаточное увлажнение + обработка семян мелафеном

19,8+3,0 (10)

66,0+2.4 (10)

27,5+1.3 (10)

2,40+ 0,02 (10)

75,3+5.2 (10)

18,9+1.2 (10)

Состав среды инкубации см. методы. Дополнительные добавки:   5 мМ малат, 10 мМ глутамат, 125 мкМ АДФ, 0,5 мкМ FCCP (карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон). Vo - скорости окисления субстратов; -скорости окисления субстратов в присутствии АДФ; V4 - скорости окисления в состоянии покоя.


34

Падение максимальных скоростей окисления NAD-зависимых субстратов в условиях недостаточного увлажнения может быть связано со снижением скоростей транспорта электронов на конечном цитохромоксидазном участке дыхательной цепи. В связи с этим мы исследовали влияние недостаточного увлажнения и обработки семян гороха мелафеном на скорости окисления пары аскорбата +ТМФД (?,?,?',?'-тетраметил-я-фенилендиамина).

Из таблицы 7 видно, что в этих условиях скорости окисления аскорбата в присутствии ТМФД ферментами дыхательной цепи митохондрий ниже контрольных значений почти на 40%.

Таблица 7. Влияние обработки семян гороха мелафеном на скорости

окисления пары аскорбат+ТМФД митохондриями, выделенными из 6

дневных проростков. (Скорости окисления даны в нг атом

кислорода/мг белка х мин)

Группа

Vo

Добавки

ТМФД 200 ??

ТМФД 400 ??

ТМФД 800??

Контроль

8.0±0.3

(5)

250.0±10

(5)

336.ОШ.0

(5)

500.0±32 (5)

Недостаточное увлажнение

5.0±0.2 (8)

175.0±25 (8)

240.0±21 (8)

356.0±32 (8)

Недостаточное увлажнение + обработка семян мелафеном

7.0±0.4 (6)

242.0±15 (6)

346.0±17 (6)

498.0±36 (6)

Состав среды инкубации см. методы. Дополнительные добавки: 10 мМ аскорбат, 60 ?? ротенон, 5 ?? антимицин А, 0,5 ?? FCCP (карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон); рН 7,4.

Таким образом, снижение коэффициента ненасыщенности жирных

кислот с 18 и 20 углеродными атомами в мембранах митохондрий приводило к

снижению скоростей окисления NAD-зависимых субстратов и снижению

эффективности окислительного фосфорилирования. Обработка семян

мелафеном предотвращала вызванные недостатком влаги изменения

эффективности окислительного фосфорилирования. Кроме того, такая

предобработка    восстанавливала    скорости    окисления            NAD-зависимых

субстратов в присутствии ADP или FCCP до контрольных значений.


35

Описанные изменения в энергетике митохондрий, по-видимому, связаны с физико-химическим состоянием мембран этих органелл. В результате обработки семян гороха мелафеном жирнокислотный состав мембран митохондрий, проростков выращенных в условиях недостаточного увлажнения, не отличался от жирнокислотного состава мембран митохондрий контрольной группы растений (таблица 5).

На основании приведенных данных можно прийти к заключению, что рост содержания ненасыщенных жирных кислот, в частности Ci8 и С2о кислот в мембранах растительных тканей приводит к повышению устойчивости растений к недостаточному увлажнению. Действительно, между коэффициентом ненасыщенности Cis жирных кислот в мембранах митохондрий (^ненасыщенные Ci8 жирные кислоты/С^о) и максимальными скоростями окисления NAD-зависимых субстратов наблюдается корреляция с коэффициентом г =0,76489 . Еще более тесная корреляция(г =0,96370) наблюдалась между коэффициентом ненасыщенности Сго кислот в мембранах митохондрий и максимальными скоростями окисления NAD-зависимых субстратов.

Антистрессовые свойства препаратов отразились и на физиологических показателях. Как видно из рисунка 15, обработка семян гороха мелафеном или пирафеном приводила к стимуляции роста корней в условиях недостаточного увлажнения в 5 и 1,75 раз соответственно.

6. Поиск эффективных адсорбентов для улавливания ПАУ и НА

Длительное действие на организм полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и нитрозаминов (НА) сопровождается дисфункцией митохондрий (L. К Reed, et al, 2006, 2008), что приводит к развитию ряда патологических состояний (HammondЕС, 1966; Хесина А.Я. и др., 1987,1996; Заридзе Д.Г. 2002; SolhaugА, 2004). В связи с этим проблема очистки воздушного бассейна от ПАУ и НА чрезвычайно актуальна. Для улавливания органических и неорганических соединений наиболее распространен в промышленности асорбционно-каталитический метод (Дубалъская Э.Н., 1990). Однако, при очистке отходящих газов этим методом, в них все еще содержатся летучие нитрозамины (НА) и полициклические ароматические


38

углеводороды (ПАУ). В настоящее время одними из самых дешевых и эффективных фильтров является фильтры, содержащие в качестве адсорбента природный цеолит (Батенков В.А., 2002), который после дегидратации представляет собой микропористую «губку» с объемом пор до 50% каркаса. Одной из целей работы являлось повышение эффективности улавливания ПАУ и НА природным цеолитом. Для этого цеолит обрабатывали другим адсорбентом - Онкосорбом - ?,?'- бис (3-триэтоксисилилпропил)-тиокарбамидом.

Изолированные митохондрии печени крыс, затравливаемых исследуемыми газо-воздушными смесями, использовали в качестве тест системы для оценки токсичности этих смесей. Как видно из таблицы 8, все используемые в эксперименте адсорбенты эффективно снижали содержание ПАУ и НА в искусственной газо-воздушной смеси.

Адсорбент цеолит, импрегнированный «Онкосорбом» в 1,3 раза

эффективнее адсорбировал ?-нитрозодиметиламин (НДМА), чем адсорбент,

состоящий из «Онкосорба». Его эффективность в отношении N -нитрозо-

пиперидина    (Н11И11),        ?-нитрозо-пирролидина    (НПИР)    и              ?-

нитрозодиэтиламина (НДЭА) в 3.0; 1.8 и 2.9 раза соответственно выше, чем у адсорбента, содержащего в качестве действующего начала «Онкосорб» и в 3,3; 2,2 и 6,25 раз выше, чем у  цеолита (клиноптилолита).

Таблица 8. Содержание нитрозаминов в искусственной газо-

воздушной смеси (нг/м ).

Нитрозамины

АДСОРБЕНТЫ

-

1

2

3

НДМА

4.08

1.75

1.71

0.90

НПИП

70.80

5.30

4.80

1.60

НПИР

70.50

50.00

41.60

23.16

НМОР

28.00

3.00

6.00

3.30

НДЭА

18.00

5.00

2.30

0.80

Условные обозначения: НДМА - ?-нитрозодиметиламин; НПИП - ?-нитрозо-пиперидин; НПИР - ?-нитрозо-пирролидин; НМОР -нитрозоморфолин;   НДЭА - ?-нитрозодиэтиламин. Адсорбенты:

1-цеолит; 2- «Онкосорб; 3-«Онкосорб» на цеолите. Исследование   способности  удалять   из   газо-воздушных   смеси   ПАУ (таблица 9) выявило наибольшие различия в свойствах адсорбентов связывать


39

такие ПАУ как бенз(а)пирен, перилен, дибенз(§,п,1)перилен. И в данном случае наибольшей эффективностью в адсорбции токсикантов из газовоздушной смеси обладал адсорбент, представленный цеолитом, обработанный «Онкосорбом».

Таблица 9. Содержание полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в искусственной газо-воздушной смеси

(нг/м3).

ПАУ

АДСОРБЕНТЫ

-

1

2

3

Пирен

5.4

3.3

3.8

3.0

Бенз(а)пирен

5.5

1.5

1.6

1.1

Бенз(е)пирен

6.3

3.7

3.6

2.8

Перилен

1.7

1.1

0.8

0.3

Дибенз(а,п)антрацен

1.0

0.4

0.6

0.4

Дибенз(а,с) антрацен

1.2

0.4

0.5

0.4

Дибенз^пд) перилен

5.0

4.3

3.7

2.5

Бензантрацен

1.1

0.6

0.7

0.7

Условные обозначения адсорбентов, как и в таблице 13.

Данные, полученные на основании химического анализа газовоздушных смесей, позволяют прийти к заключению, что адсорбент «Онкосорб» на цеолите довольно эффективно очищает газо-воздушную смесь от ПАУ и нитрозаминов.

6. Влияние затравки искусственной газо-воздушной смесью на индукцию цитохрома Р 450 и энергетику митохондрий печени.

Высокая эффективность очистки газо-воздушных смесей адсорбентом «Онкосорб» на цеолите доказывается опытами по хронической затравке белых крыс искусственной газо-воздушной смесью, содержащей ПАУ и НА. Мы исследовали влияние длительной затравки крыс этой смесью на содержание цитохрома Р 450 в ткани печени. Необходимость таких исследований обусловлена ролью цитохрома Р 450 в химически индуцированном канцерогенезе. Ферменты монооксигеназной системы, включая цитохром Р 450, осуществляют метаболическую активацию многих прокацерогенных соединений, в том числе ПАУ и НА. На рисунке 17 представлены данные по влиянию искусственной газо-воздушной смеси на содержание Р 450 в ткани печени. Видно, что через 1-1,5 месяца затравки крыс этой смесью содержание


40

цитохрома    Р 450 в ткани печени снижалось на 45% , что свидетельствовало о токсическом эффекте {Куценко С. А.,2002).

Пропускание газо-воздушной смеси через слой цеолита или Онкосорба

приводило к снижению содержания цитохрома Р 450 на 20 и 10%

соответственно. И только в случае использования адсорбента «Онкосорб» на

цеолите эта величина не отличалась от контроля. Более того, длительная

экспозиция крыс газо-воздушной смесью приводила к повышению содержания

цитохрома Р-450 в ткани печени на 22%. В печени крыс, затравливаемых этой

же смесью, пропущенной через слой цеолита или «Онкосорба» содержание Р-

450 было ниже по сравнению с животными, затравливаемыми искусственной

газо-воздушной смесью. И только в группе животных, затравливаемых газо

воздушной смесью, прошедшей через слой цеолита, обработанного

«Онкосорбом» содержание цитохрома Р-450 в ткани печени почти не

отличалось от контроля. Увеличение        концентрации цитохрома Р-450 при

хроническом воздействии на организм ПАУ и НА, отмечается в работах (Худолей В.В. , 1985; Falahatpisheh М.Н. et al, 2004; Lin-linLiuet al, 2005), что отражает индукцию фермента этими веществами и может иметь следствием биоактивацию этими проканцерогенами.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о большей эффективности адсорбента «Онкосорб» на цеолите по сравнению с другими исследуемыми адсорбентами.


41

К такому же выводу можно прийти исходя из данных по влиянию длительной затравки газо-воздушной смесью крыс на энергетику митохондрий печени. Месячная затравка животных не очищенной газо-воздушной смесью приводила к некоторым изменениям в энергетике митохондрий печени. При этом почти в 2 раза снижались максимальные скорости окисления NAD-зависимых субстратов с 26,0±1,9 до 11,6±0,8нмолей 02/мг белка х мин. Уменьшалась и эффективность окислительного фосфорилирования: величина дыхательного контроля по Чансу (V3/V4) падала с 2,8±0,3 до 2,0±0,2. Однако скорости окисления сукцината не изменялись. Спустя 3-6 месяцев от начала затравки максимальные скорости окисления NAD-зависимых субстратов возвращались к норме, а скорости окисления сукцината снижались в 1,5 раза. При этом величина дыхательного контроля по Чансу уменьшалась почти в 2,5 раза (таблица 10).

Кроме того, в ткани печени на 14% падал сигнал ЭПР с g=l,94, обусловленный железосерными белками, входящими в состав мембран митохондрий. Можно предположить, что при сочетанном действии ПАУ и НА активируются процессы деградации митохондрий, что свидетельствует об индукции апоптоза (Bhagawat S.V. et al, 1998; TimothyS. et al, 2000; S. Hiura et al, 2000; T. Matikainen et al, 2001; Budhi Sagar Tiwari et al, 2002).

Таблица 10. Влияние 6-месячной затравки крыс искусственной газовоздушной смесью на скорости окисления сукцината митохондриями печени. (Приведены данные 8 экспериментов). (Скорости дыхания в

нмоляхР2/мг белка х мин).

Группа

v2

v3

v4

v3/v4

Vfccp

Контроль

9,4±1,2

22,3±1,7

6,7±0,5

3,4±0,1

22,9±2,2

Газовоздушная смесь

4,1±0,4

16,9±0,8

12,1±1,3

1,4±0,1

16,7±0,6

Цеолит

4,4±0,5

16,6±1,4

9,6±1,3

1,7±0,1

17,0±1,0

Онкосорб

8,0±0,5

18,9±1,4

6,5±0,8

2,9±0,2

19,3±1,1

Онкосорб на цеолите

9,0±1,4

23,4±2,1

6,7±0,9

3,5±0,2

23,5±2,1

Состав среды инкубации см. методы. Дополнительные добавки: 200 мкМ ADP, ia6M FCCP, 5 мМ сукцинат.Уо- скорости окисления субстратов;

Уз- скорости окисления субстратов в присутствии АДФ; V4- скорости окисления в состоянии покоя (скорости окисления субстрата при исчерпании АДФ).


42

Снижение скоростей окисления сукцината, эффективности окислительного фосфорилирования, открытие циклоспорин А-зависимой поры и, как следствие, падение величины мембранного потенциала при действии на организм ПАУ, НА наблюдали и ряд авторов (О. Mirуet al, 1999; T.R. Kaplan et al, 2000; Xia Tet al, 2004). Отметим, что митохондрии крыс, затравливаемых газо-воздушной смесью, пропущенной через слой адсорбента «Онкосорб» на цеолите, по энергетическим характеристикам не отличались от митохондрий контрольной группы. Цеолит и «Онкосорб» также оказывали защитный эффект на энергетику митохондрий, однако, он был значительно ниже, чем у адсорбента «Онкосорб» на цеолите.

Таким образом, затравка животных газо-воздушной смесью, содержащей ПАУ и НА, приводила к индукции цитохрома Р 450 в ткани печени и снижению максимальных скоростей окисления сукцината митохондриями печени. Газо-воздушная смесь, пропущенная через слой адсорбента «Онкосорб» на цеолите не оказывала влияния на исследуемые биологические показатели, что свидетельствует об эффективности очистки газо-воздушных смесей от ПАУ и НА.

7. Влияние ПАУ и нитрозаминов на гуморальный иммунитет и разработка биологической модели для оценки эффективности очистки

газо-воздушных смесей.

Изменения в энергетике митохондрий печени были сопоставимы с изменениями в активностях ферментов энергетического обмена лимфоцитов периферической крови. Затравка крыс этой смесью имеет следствием снижение активности таких ферментов как а-глицерофосфат-дегидрогеназа (?-ГФДГ) и сукцинат-дегидрогеназа (СДГ) лимфоцитов периферической крови. Активность ?-ГФДГ снижалась в 1,6 раза спустя две недели от начала эксперимента и спустя 6 месяцев от начала затравки оставалась на 37% ниже контрольного уровня. Активность СДГ резко падала через две недели от начала эксперимента (в 3,3 раза), а затем медленно нарастала, но и через шесть месяцев оставалась в 1,64 раза ниже контрольных значений. Газовоздушная смесь, прошедшая через слой адсорбента «Онкосорб» на цеолите не вызывала описанных изменений в активностях этих ферментов лимфоцитов. Отметим, что адсорбенты «Онкосорб» и цеолит оказывали меньший защитный эффект: активность ?-ГФДГ и СДГ спустя 6 месяцев затравки   газо-воздушной   смесью,   прошедшей   через   слой   адсорбента


43

«Онкосорб» снижалась на 19 и 32% соответственно, а при использовании в качестве адсорбента клиноптиолита - на 24 и 41%. Снижение активности ферментов энергетического обмена, по-видимому, может свидетельствовать о снижении функциональной активности лимфоцитов и всего иммунологического статуса организма. Действительно, длительная затравка крыс искусственной газо-воздушной смесью приводила к уменьшению числа клеток селезенки и числа антителобразующих клеток (АОК) в пересчете на селезенку в 3 и 1,6 раза соответственно. Отметим, что затравка крыс газовоздушной смесью, прошедшей через слой «Онкосорба» или клиноптилолита имела следствием снижение числа клеток селезенки на 20 и 58% соответственно, число АОК в пересчете на орган при этом снижалось на 11 и 30% . Использование адсорбента «Онкосорб» на цеолите предотвращало описанные изменения в иммунологических показателях (таблица 11).

Таблица 11. Число клеток в селезенке и количество АОК в

пересчете на селезенку после 3-6 месячной затравки крыс

искусственной газо-воздушной смесью

ГРУППА ЖИВОТНЫХ

ЧИСЛО КЛЕТОК

ЧИСЛО АОК В ПЕРЕСЧЕТЕ НА        ОРГАН (х 108)

Контрольные животные

233100 ±6720 (10)

5.50 ±0.60 (10)

Крысы, затравливаемые искусственной газо-воздушной смесью

84000±1600 (15)

3,36±1,10 (15)

Крысы, затравливаемые газовоздушной смесью, пропущенной через слой цеолита

147000 ±5350 (15)

3.90 ±0.70 (15)

Крысы, затравливаемые газовоздушной смесью, пропущенной через слой «Онкосорба»

193300 ±5990 (15)

4.90 ±0.80 (15)

Крысы, затравливаемые газовоздушной смесью, пропущенной через слой «Онкосорба» на цеолите

231500 ±5700 (15)

6.00 ±1.50 (15)

В скобках указано число независимых экспериментов

Отличия биологических эффектов газо-воздушных смесей, прошедших через исследуемые адсорбенты, вероятно, связаны с различной степенью


44

поглощения ПАУ и НА этими адсорбентами. Это предположение подтверждается опытами по влиянию «конденсатов» газо-воздушных смесей на спонтанную и индуцированную митогеном бласттрансформацию лимфоцитов крови здоровых доноров.

«Конденсаты»   оказывали   либо   стимулирующее,   либо   подавляющее действие на спонтанную пролиферацию лимфоцитов (рис. 18, 19). У доноров


45

с высокими значениями спонтанной пролиферации лимфоцитов «конденсаты» оказывали стимулирующее влияние на пролиферацию (рис.18). У доноров с более низкими значениями спонтанной пролиферации «конденсаты» подавляли пролиферацию (рис.19). Митогенный эффект «конденсата» газовоздушной смеси, прошедшей через адсорбент, представляющий собой цеолит, импрегнированный «Онкосорбом» был выражен значительно меньше, чем у других «конденсатов». Для проявления его митогенного эффекта требовалась концентрация на два порядка превышающая концентрацию «конденсатов» неочищенной газо-воздушной смеси или прошедшей через слой цеолита (клиноптилолита). Митогенный эффект «конденсата» газовоздушной смеси, прошедшей через адсорбент «Онкосорб» на цеолите, был на порядок ниже, чем у «конденсата», полученного с использованием адсорбента, содержащего только «Онкосорб». Величина этого эффекта была в 1,5 раза меньше, чем у «конденсата» неочищенной газо-воздушной смеси. Все четыре вида конденсата газо-воздушной смеси оказывали сходное действие на ФГА - индуцированную бласттрансформацию лимфоцитов: в больших дозах (100мкг/мл и 1000мкг/мл) подавляли ее, а в малых (1мкг/мл и 10мкг/мл) не влияют (включение    Н-тимидина на уровне ответа на ФГА).

Таким образом, данные по оценке токсичности газо-воздушных смесей в условиях хронической затравки животных согласуются с данными по влиянию «конденсатов» газо-воздушных смесей на пролиферацию лимфоцитов и с данными по эффективности улавливания ПАУ и летучих НА исследуемыми адсорбентами. На основании приведенных результатов разработана иммунологическая модель оценки эффективности очистки газо-воздушных смесей от ПАУ и НА. Она основана на исследовании влияния «конденсатов» газо-воздушной смеси на спонтанную бласттрансформацию лимфоцитов донорской крови. Использование такой модели позволяет сделать заключение не только об эффективности очистки, но и оценить токсичность исследуемой газо-воздушной смеси.

8. Перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий

печени, ткани легких и плазме крови при затравке крыс

искусственной газо-воздушной смесью

Изменения в энергетике митохондрий могут быть обусловлены активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ). Действительно, в мембранах митохондрий затравливаемых искусственной газо-воздушной смесью крыс интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ была почти в 6,5


46

раз выше, чем в мембранах митохондрий контрольной группы животных (рис.20). Эти результаты согласуются с данными, полученными MartinSklorz, 2007; Jacob-Jan Briede с соавторами (2007), наблюдавшими увеличение продукции АФК и активацию ПОЛ в присутствии ПАУ. Затравка животных газо-воздушной смесью, прошедшей через слой «Онкосорба» на цеолите, не вызывала значительной активации ПОЛ в мембранах митохондрий печени. Защитный эффект адсорбентов «Онкосорб» и цеолит был значительно ниже: затравка крыс газо-воздушной смесью, прошедшей через слой этих адсорбентов несколько снижала интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах митохондрий. Однако интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах митохондрий печени крыс, затравливаемых газо-воздушной смесью, пропущенной через слой «Онкосорба» или цеолита была в 4,5 и 5,5 раза выше контрольных значений соответственно.

Увеличение содержания продуктов ПОЛ при затравке крыс искусственной газо-воздушной смесью наблюдали также в ткани легких и плазме крови. При этом флуоресценция продуктов ПОЛ и содержание ТБК-активных продуктов к концу эксперимента возрастало в 1,5-2,0 раза. И в данном случае затравка крыс искусственной газо-воздушной смесью, прошедшей через слой адсорбента «Онкосорб» на цеолите не вызывала изменений в изучаемых параметрах.


5     7000000

tu

?      6000000

л

ri

5     5000000

?с

1     4000000

- S

Ir "

Н3 &       3000000

Q.

о

Ш2000000

I—

i      1000000

co

u

?                 0

i-

s                                 300                                 440                                500

Длина волна в нлл


Рис. 20. Спектры флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах митохондрий печени при затравке крыс ПАУ и НА. 1- контроль; 2 - «Онкосорб» на цеолите; 3 - Онкосорб; 4 - цеолит; 5 - газо-воздушная смесь.


47

Данные химического анализа и биологические исследования позволяют сделать заключение, что адсорбент «Онкосорб» на цеолите эффективно очищает газо-воздушные смеси от полициклических ароматических углеводородов и нитрозаминов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стрессовые воздействия приводят к перестройкам в липидном составе мембран митохондрий: изменяется количество и степень насыщенности с жирных кислот, что, вероятно, является сигналом действия стрессового фактора [Войников В.К, 2010]. Это приводит к изменению активности компонентов дыхательной цепи митохондрий. Нашими исследованиями показано, что первичные нарушения в функционировании электрон-транспортных цепей митохондрий наблюдаются в I комплексе дыхательной цепи, что, вероятно, способствует увеличению генерации АФК дыхательной цепью. Антиоксиданты, предотвращая изменения в жирнокислотном составе мембран митохондрий, повышают устойчивость растений и животных к действию стрессовых факторов.

Поскольку дисфункция митохондрий происходит и при действии токсических веществ на организм весьма актуальной задачей является поиск методов снижения содержания токсикантов в окружающей среде. Для уменьшения токсического действия ПАУ и НА необходимо было создать новые адсорбенты, эффективно поглощающие эти токсиканты из газовоздушных смесей. На основании проведенных исследований совместно с сотрудниками Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН создан и запатентован новый адсорбент для очистки газо-воздушных смесей «Онкосорб» на цеолите, эффективно поглощающий ПАУ и НА из газо-воздушной среды (патент РФ № 2113810, выданный 27.06. 1998; патент РФ № 2129913, выданный 10.05 1999 г.).

ВЫВОДЫ

1. Проведенными исследованиями установлено, что первичными нарушениями в функционировании электронтранспортных цепей митохондрий растительного и животного происхождений при действии стрессовых факторов является снижение активности NAD-зависимых дегидрогеназ.


48

  1. Биологически активные вещества в концентрациях эффективно снижающих процессы перекисного окисления липидов предотвращают изменения биоэнергетических функций митохондрий при действии на организм стрессовых факторов и повышают устойчивость организма к действию этих факторов.
  2. Показано, что недостаточное увлажнение приводит к снижению коэффициента ненасыщенности жирных кислот с 18 и 20 углеродными атомами в липидной фракции мембран митохондрий проростков гороха, что сопровождается снижением максимальных скоростей окисления NAD-зависимых субстратов. Обработка семян мелафеном предотвращает изменения жирнокислотного состава мембран митохондрий и изменение биоэнергетических функций этих органелл.
  3. Длительное воздействие на организм микродоз ПАУ и НА вызывает нарушение энергетики митохондрий, снижение функциональной активности лимфоцитов и всего иммунологического статуса организма, что обусловлено активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ).
  4. Новый адсорбент «Онкосорб» на цеолите эффективно адсорбирует ПАУ и НА из газо-воздушных смесей. О чем свидетельствуют данные химического анализа искусственной газо-воздушной смеси, пропущенной через 25мм слой адсорбента и биологические эффекты длительной затравки животных искусственной газо-воздушной смесью.

По материалам диссертации опубликовано 25 статьи, в рецензируемых российских журналах, входящих в перечень ВАК печатных работ и 20 статей, опубликованных в других журналах.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Статьи,    опубликованные   в   рецензируемых   российских   журналах,

входящих в перечень ВАК:

  1. Дробинская И.Е., Жигачева И.В., Каштан Е.Я. Влияние производных ионола на энергетику митохондрий печени. Биохимия 1982, 47 (1), 81-85.
  2. Жигачева И.В., Каплан Е.Я., Цукерман А.И. Внешний путь окисления НАДН и вязкость митохондриальных мембран. Биохимия 1983, 48 (2), 254-258.
  3. Жигачева И.В., Каплан Е.Я. Жирнокислотный состав митохондрий печени при введении антиоксидантов ионолового ряда белым крысам. Биохимия, 1985, 50, 1582-1586.

49

4.  Агуреев А.П., Жигачева И.В. К механизму действия пирацетама на

окисление NADH по внешнему пути в митохондриях печени. Вопросы

медицинской химии 1986, 2, 106-108

  1. Митрохин Н.М., И.В. Жигачева, Л.Т. Чаморовская. Активация перекисного окисления липидов в митохондриях печени и острая токсичность химических соединений Гигиена и санитария 1991, № 1, 49-51.
  2. Митрохин Н.М., Жигачева И.В., Чамаровская Л.Т., Буров Ю.В. Влияние комбинированного действия солей тяжелых металлов и фенола на энергетику изолированных митохондрий печени крыс. Бюл. эксперим. биологии и медицины 1992,1, 47-49.
  3. Жигачева И.В., Каштан Е.Я., Христианович Д.С., Розанцева Т.В., Воронков М.Г. Влияние табачного дыма на фосфолипидный состав и энергетику митохондрий печени. ДАН 1992, 325 (3), 617-620
  4. Жигачева И.В., Власова М.Е., Каплан Е.Я., Пахомов В.Ю., Воронков М.Г. Оценка эффективности фильтра сигарет по изменению энергетического статуса организма. ДАН 1992, 325 (3), 853-856.
  5. Жигачева И.В., Власова М.Е., Каплан Е.Я., Пахомов В.Ю. Анфен и энергетический статус организма животных. Вопросы медицинской химии 1993, 39 (6), 6-9.

10.  ЖигачеваИ.В., Каплан Е.Я., Пахомов В.Ю., Т.В. Розанцева, Д.С.

Христианович, Е.Б. Бурлакова, М.Г. Воронков Препарат «Анфен» и

энергетический статус печени ДАН 1995,340, (4), 547-550.

  1. ЖигачеваИ.В., Е.Б. Бурлакова, Л.С. Евсеенко, Л.Е. Кривошеева, М.И. Савина, М.Г. Воронков " Отходящие газы и нуклеотидный обмен в печени и тимусе» ДАН, 1999, 367, (1), 117-119.
  2. Жигачева И.В., Е.Б. Бурлакова, Л.С. Евсеенко, Никонова М.Ф., Е.Г. Буланова, М.М. Литвина, М.Г. Воронков. Курение и иммунологический статус организма ДАН, 1999, 366, (5), 705-707.
  3. Жигачева И.В., Бурлакова Е.Б., Евсеенко Л.С, Кривошеева Л.В., Е.Г. Буланова, М.Ф. Никонова, М.М. Литвина, Д.С. Христианович, М.Г. Воронков Гуморальный иммунитет. Полициклические ароматические углеводороды и нитрозамины. ДАН 2002, 383(6), 834-837
  4. Жигачева И.В., Л.Д. Фаткуллина, А.Г. Шугаев, С.Г. Фаттахов, B.C. Резник, А.И. Коновалов Препарат Мелафен и энергетический статус клеток растительного и животного происхождения. ДАН 2006, 409 (1), 123-126.

50

15. Жигачева И.В., Л.Д. Фаткуллина, Е.Б. Бурлакова, А.Г. Шугаев, С.Г.

Фаттахов, А.И. Коновалов Препарат Мелафен и физико-химическое состояние

мембран. ДАН 2006, 409, (4), 547-549.

  1. Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Русина И.Ф., Шугаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И. Антистрессовые свойства препарата мелафен. ДАН 2007, 414, (2), 263-265.
  2. Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Шугаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г., Резник B.C., Коновалов А.И. Функциональное состояние мембран митохондрий корнеплода сахарной свеклы при действии препарата мелафен Физиология растений 2007, 54, 672-677.
  3. Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б., Шугаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И.                                                   Влияние фосфорорганического регулятора роста растений на структурные характеристики мембран растительного и животного происхождения. Биологические мембраны, 2008,.25, (2), 150-156.
  4. Жигачева И.В., Бурлакова Е.Б., Шугаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И. Фосфорорганический регулятор роста растений: устойчивость клеток растений и животных к стрессовым воздействиям, Биологические мембраны, 2008, 25, (3), 183-189.
  5. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С, Бурлакова Е.Б., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И. Влияние фосфорорганического регулятора роста растений на транспорт электронов в дыхательной цепи митохондрий, ДАН, 2009,.427 (5), 693-695.
  6. Жигачева И.В, Мишарина Т.А.., Тренина М.Б., Крикунова Н.Н., Генерозова И.П., Шугаев А.Г., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И. Недостаточное увлажнение и мелафен изменяют жирнокислотный состав митохондрий проростков гороха. ДАН 2010,.432,(1), 124-126.
  7. Жигачева И.В, Мишарина Т.А.., Тренина М.Б., Крикунова Н.Н., Бурлакова Е.Б., Генерозова И.П., Шугаев А.Г.,                                                  Фаттахов С.Г. Жирнокислотный состав мембран митохондрий проростков гороха при недостаточном увлажнении и обработке фосфорорганическим регулятором роста растений Биол. мембраны 2010, 27, (3), 256-261.
  8. Жигачева И.В, Мишарина Т.А.., Тренина М.Б., Крикунова Н.Н., Бурлакова Е.Б., Генерозова И.П., Шугаев А.Г., Фаттахов С.Г., Коновалов А.И. Жирнокислотный состав мембран митохондрий проростков гороха в условиях недостаточного увлажнении и умеренного охлаждения. ДАН 2011, 437(4), 124-126

51

  1. Жигачева И.В., Бурлакова Е.Б., Генерозова И.П., Шугаев А.Г, Фаттахов С.Г., Коновалов А.И «Регуляторы роста растений мелафен и пирафен предотвращают              вызванную недостаточным увлажнением дисфункцию митохондрий» ДАН 2011,441(5),
  2. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С,Бурлакова Е.Б., Воронков М.Г., Кривошеева Л.В. Новый кремнийорганический адсорбент для очистки газо-воздушных смесей. Катализ в промышленности 2011, 2, 41-46

Статьи, опубликованные в других журналах

  1. Митрохин Н.М., И.В. Жигачева, Л.Т. Чаморовская, А.П. Агуреев. Сопряжение окисления и фосфорилирования в митохондриях печени как показатель токсичности сточных вод. Гидробиологический журнал 1991, 27 (2), 85-89.
  2. Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д, Бурлакова Е.Б., Шугаев А.Г. Состояние электрон-транспортной цепи митохондрий растительного и животного происхождения при действии препарата мелафен. В сб. «Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста растений нового поколения «Мелафен» в сельском хозяйстве и биотехнологии», Казань, 2006, 76-84;
  3. Фаткуллина Л.Д. Жигачева И.В., Шугаев А.Г, Голощапов А.Н. «Влияние мелафена на структурные параметры биологических мембран». В сб.» Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста растений нового поколения «Мелафен» в сельском хозяйстве и биотехнологии», Казань, 2006, 69-75.
  4. Фаткуллина Л.Д., А.Н. Голощапов, И.В. Жигачева, Е.Б. Бурлакова. ЭПР Исследования структурной организации биомембран при действии регулятора роста растений нового поколения. Сборник трудов Международного симпозиума «Физика и химия процессов, ориентированных на создание новых наукоемких технологий материалов и оборудования. Черноголовка, 2007, 81-85.
  5. Zhigacheva I.V., Е.В. Burlakova, L.S. Evseenko, M.G. Voronkov. Adsorbent for purification of gas-air mixture. Humoral immunity and energy status of an organism. In "Research Progress in Biotechnology, 2008, Nova-Science Publishers, 117-124, ISBN: 1-60456-000-8.
  6. Zhigacheva I.V., L.D. Fatkullina, A.N. Goloschapov, I.F. Rusina, E.B. Burlakova.   Effect   of  low   moisture   content   on   structural   and   functional

52

characteristics   of plant   and   animal   membranes.   In   "Research  Progress   in Biotechnology, 2008, Nova-Science Publishers,   125-130, ISBN: 1-60456-000-8.

  1. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С, Бурлакова Е.Б., Никонова М.Ф., Кривошеева Л.В. Использование иммунологической модели для оценки эффективности очистки газо-воздушных смесей от летучих нитрозаминов и полициклических ароматических углеводородов. «Математика. Компьютер. Образование». Сб. научных трудов. Том. 3. Под ред. Г.Ю.Ризниченко и А.Б.Рубина. - М.-Ижевск: НИЦ "Регулярная и хаотическая динамика". 2008. С. 109-114.
  2. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С, Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н. Адсорбент для очистки газо-воздушных смесей от нитрозаминов и полициклических ароматических углеводородов. В сб. « Сорбенты как фактор качества жизни. Материалы III Международной конференции г. Белгород 22-24 сентября 2008 года» 2008, Белгород, С 172-176.
  3. Zhigacheva I.V., L.S. Evseenko, Е.В. Burlakova Potassium phenozan and electron transport at the terminal (cytochromoxidase) site of respiratory chain of liver mitochondria. "Biological motility. Achivments and Perspectives" Pushchino, 2008, V.l, 188-190.
  4. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С. Фенозан калия и энергетический статус организма В сб. «Международная конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация. 2-4 июня 2009» том 2, 590-594, Пущино 2009. ISBN 978-5-904385-09-5.
  5. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С, Бурлакова Е.Б. Сочетанное действие полициклических ароматических углеводородов и нитрозаминов на гуморальный иммунитет. В сб. «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных II Международная научная конференция». 2009, Саранск, С. 49-51.
  6. Zhigacheva. I.V., Е.В. Burlakova, I.P.Generozova, A.G. Shugaev and S.G. Fattakhov «Ultra-low doses of melafen affect the energy of mitochondria" Journal Biophysics and Structural Biology 2010, 2 (1), 1-8.
  1. Zhigacheva. I.V. , E.B. Burlakova, A.N. Goloschapov, L.B. Krivosheeva "Influence of combined effect of poly cyclic aromatic hydrocarbons, nitrosamines on the humoral immunity" Intrrnational Scientific Publication: Ecology&Safety, 2010, 4, Part 1,311-322
  2. Жигачева И..В., Фаткуллина Л.В., Бурлакова Е.Б. «Сверхмалые дозы фосфорорганического регулятора роста растений изменяют структурные характеристики   биологических   мембран»   В   сборнике   «   Современные

53

проблемы гуманитарных и естественных наук. Материалы II Международной научно-практической конференции 15-25 января 2010 г. Москва» 2010, Т.2 С. 38-42 ISBN 5-90463-03-5 (т.2); ISBN 978-5-904563-01-1

  1. Zhigacheva. I.V. , L.S. Evseenko, E.B. Burlakova, Misharina T.A, Trenina M.B., Krikunova N.N. "Fatty acid composition of membranes and energetics of mitochondrial pea seedlings grown in conditions of insufficient humidifying» В сб. «Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies" Puschino 2010, P. 328-332. ISBN 938-5-91874-029-3
  2. Жигачева И.В., Евсеенко Л.С., Бурлакова Е.Б. «Фенозан калия снижает продукцию активных форм кислорода в условиях гипоксии и гипотермии» В сб. «Математика, Компьютер, Образование» 2010 Москва-Ижевск, вып. 17, 4.1, с. 325-334.
  3. Жигачева И.В., Бурлакова Е.Б. Калиевая соль 2,6-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпропионовой кислоты повышает выживаемость животных в условиях гипоксии и низкотемпературного стресса. В сб.» Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. PhysioMedi» 2010, СПб, Т.З, с. 229-234, ISBN 978-5-7422-2834-9.
  4. Zhigacheva I.V., E. В. Burlakova, Т. A. Misharina, М. В. Terenina, N. I. Krikunova, I. P. Generozova, A. G. Shugaev. The Organophosphorus Plant Growth Regulator Melaphen as Adaptogen to Low Moisher. In "Chemical Reactions in Gas, Liquid and Solid Phases" 2010 Ed. G.E. Zaikov, R.M. Kozlovski, Nova Science, Chapter 7, p.75-82. IBSN
  5. Жигачева И.В., Бурлакова Е.Б., Е.Б., Генерозова И.П., Шугаев А.Г., Фаттахов С.Г. Регуляторы роста растений мелафен и пирафен предотвращают дисфункцию митохондрий, обусловленную временным водным дефицитом. В сб. «Международная конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация. 24-26 мая 2011» том 2, 787-791, Пущино 2011, IBSN 978-5-9900866-7-8

45.    Жигачева И.В., Бурлакова Е.Б. Дисфункция митохондрий в

результате длительного воздействия микродоз полициклических

ароматических углеводородов и нитрозаминов на организм. PhysioMedi» 2011,

СПб, Т.1, 79-83. IBSN 978-5-7423-3181-3

 

 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.