WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА ПРИ ТРЕМАТОДОЗАХ ПОСЛЕ ХИМИОТЕРАПИИ АНТИГЕЛЬМИНТИКАМИ

Автореферат докторской диссертации

 

На правах рукописи

 

 

Бибик Оксана Ивановна

 

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА ПРИ ТРЕМАТОДОЗАХ ПОСЛЕ ХИМИОТЕРАПИИ АНТИГЕЛЬМИНТИКАМИ

 

Специальность 03.02.11 – паразитология

 

 

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

 

 

 

 

Москва– 2012


Работа выполнена на кафедре общей биологии с основами генетики и паразитологииКемеровской государственной медицинской академии

Научный консультант: НАЧЕВА Любовь Васильевна

доктор биологических наук, профессор, заведующая

кафедрой общей биологии с основами генетики и

паразитологии Кемеровской государственной

медицинской академии

Официальные оппоненты: НОВИК Тамара Самуиловна

доктор биологических наук, профессор, ведущий

научный сотрудник лаборатории экспериментальной терапии Всероссийского НИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина

ЖДАНОВА Ольга Борисовна

доктор биологических наук, доцент, заведующая

кафедрой гистологии Кировской медицинской академии

СИВКОВА Татьяна Николаевна

доктор биологических наук, доцент кафедры инфекционных болезней Пермской ГСХА им. академика Д.Н. Прянишникова

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

 

Защита диссертациисостоится «30»мая2012 г. в1100часов на заседании   Совета   по   защите   докторских  и  кандидатскихдиссертаций Д 006.011.01. при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина» (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, Б.Черемушкинская ул., д. 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  ГНУ ВИГИС.

Автореферат разослан «      »                          2012 г.

 

Ученый секретарь Совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций,

доктор биологических наук, профессор                                      В.К.Бережко

Введение

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем в развитии гельминтологической науки является подробное изучение микроморфологии гельминтов, подвергшихся действию препаратов. Знание изменений микроструктуры тканей гельминтов и специфики их обменных процессов под воздействием антигельминтиков, по сравнению с нормой, даёт возможность оценить эффективность препарата,выявить пути его проникновения в организм гельминта и раскрыть механизм воздействия на паразита (Сенутайте Я.Ю., 1970; Сташайтис Ю.Н., 1974; Казанцева Г.Н., 1984; Начева Л.В., Бибик О.И., Гребенщиков В.М., 2000). Это может реализоваться с помощью гистологических, гистохимических и морфометрическихметодов иследования тканей и органов трематод после применения антигельминтиков(Кошкина Н.Г., 1970; Начева Л.В., 1977; Гребенщикова В.М., 1984; Чебышев Н.В., Котовский Е.Ф., Беречикидзе И.А., 1991; Бибик О.И., 1997). Патоморфология, вызываемая конкретным антигельминтиком, позволяет определить степень деструктивных процессов, как у паразита, так и у хозяина (Чебышев Н.В., Беречикидзе И.А., Богоявленский Ю.К., 1991; Богоявленский Ю.К., Рачковская И.В., Чебышев Н.В., 1994; Чебышев Н.В., Богоявленский Ю.К., Гришина Е.А., 1998) и прогнозировать возможность «привыкания» гельминта кпрепарату.

В течение многих лет коллектив сотрудников кафедры биологии КемГМА под руководством профессора Е.Д. Логачёва (1956-1992гг.) занимался микроморфологическими и гистохимическими исследованиями тегумента и кишечника трематод после воздействия антигельминтикови продолжает эти исследования в настоящее время.Особый вклад в развитие патомикроморфологического направления при трематодозах внесли ученые –Кошкина Н.Г. (1969-1985), Начева Л.В. (1977-1993), Гребенщиков В.М. (1981-1985). Их работы убеждают об актуальности более глубокого анализа патоморфологии трематод, патофизиологии и патогенеза гельминтов, изучения внутренних механизмов взаимоотношений паразита и хозяина при воздействии антигельминтиков (Начева Л.В., Бибик О.И., Гребенщиков В.М., 2000; Начева Л.В., Воробьёва Е.И., 2007; Гребенщиков В.М., Начева Л.В., 2008).

Однако недостаточно исследованной остается патоморфология органов хозяина при трематодозах (Начева Л.В., Додонов М.В., Воробьёва Е.И., 2009). Вместе с тем характеристика соединений с предполагаемой антигельминтной активностью требует комплексного подхода – одновременного изучения изменений в системе «паразит-хозяин» (Писарева Т.А., 1975; Рачковская И.В., 1985;Воробьева Е.И., 1992).Актуальным вопросом является изучение гистохимической реактивности тканей гельминта и хозяина при воздействии антигельминтиков, который также недостаточно освещен.

В последнее 15 лет вопросами изучения микроморфологических механизмов взаимоотношений в системе «паразит-хозяин» до и после воздействия антигельминтиков занимаются фрагментарно, что ограничивает возможность поиска новых препаратов и актуальных способов борьбы с трематодозами. До сих пор не окончательно разработаныи не внедрены патоморфологический, гистохимический и морфометрический критерии оценки эффективности воздействия антигельминтиков с позиций системогенеза, в то время, как каждый новый препарат требует широкого исследования и обязательного учета этих показателей.

Актуальностьисследований настоящей работы подтверждается тем, что она была включена в Межведомственную координационную программу фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2006-2010гг.

Цель исследования-разработать иобосновать с позиций системогенезапатоморфологические, гистохимические и морфометрические критерии оценки эффективности воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод и хозяина.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности патоморфологии органов и тканей Fasciolahepatica, F.gigantica, DicrocoeliumlanceatumиParamphistomumcervi после воздействия антигельминтиками (димезол,триклабендазол, тетраксихол, политрем, антитрем, тегалид, фаскоцид) и определить пути проникновения антигельминтиков в организм трематод.

2. Изучить гистохимическую реактивность тегумента, пищеварительной и половой систем трематод (дикроцелий, фасциол, парамфистом) после воздействия антигельминтиков для расшифровки морфофункциональных механизмов их действия.

3. Провести микроморфологические и гистохимические исследования тонкого отдела кишечника хозяина при парамфистомозе овец до и после воздействия антигельминтиков антитрема и тегалида.

4. Разработать и обосноватьпатоморфологические и гистохимические критерии оценки эффективного воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод.

5.Провести морфометрический анализ яиц трематод после воздействия разных антигельминтиков со статистической обработкой результатов и разработать морфометрические критерии оценки эффективности овоцидных свойств препаратов.

Научная новизна

Выдвинута и экспериментально обоснована концепция патоморфологического и гистохимического контроля эффективности антигельминтиков. Впервые установлены морфофункциональные изменения в органах и тканях трематод после воздействия триклабендазола, тегалида, антитрема и фаскоцида. Установлено, что степень воздействия препарата на организм паразита на уровне его клеток, тканей или органов определяется химической структурой антигельминтика. Препараты, которые в своей структуре содержат меньшее число полярных групп (–ОН, –С=О, –NН–), и наибольшее число атомов галогена вызывают более глубокую патологию.

Впервые показано, что триклабендазол, антитрем и тегалид – препараты из разных химических групп оказывают однотипное воздействие на внутреннюю часть тегумента и базальную часть кишечного эпителия, вызывая увеличение количества клеточных элементов – пролиферацию ядер, как усиление регенераторно-адаптивных реакций в условиях среды I порядка.

Впервые доказано, что политрем, димезол и триклабендазол при фасциолёзе, а также тетраксихол, антитрем и тегалид при парамфистомозе и фасциолёзе и фаскоцид при дикроцелиозе вызывают глубокие нарушения распределения углеводов и белков во всех органах и тканях трематод, подтверждающие их трематодоцидную эффективность. Установлены особенности абсорбционных механизмов антигельминтиков и пути их проникновения в организм трематод.

Впервые установлено, что антитрем и тегалид вызывают в органах и тканях F.hepatica и P.cervi однотипные изменения (деструкцию, дезорганизацию, дистрофию и др.), но степень их проявлений выражается различно, что подтверждает свойство тканевой специфичности трематод, принадлежащих к разным видам. Определено, что наиболее сильный эффект воздействия антитрем и тегалид оказывают на ткани F. hepatica.

Впервые определена последовательность воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод с позиций системогенеза: 1) Изначально – токсическое воздействие на тегумент и кишечник, вызывая уменьшение в них количества гексозаминогликанов, резко снижая защитные силы гельминта. Органы становятся неспособными создавать регулирующий барьер на границе раздела фаз системы «паразит-хозяин». 2) Проникновение токсинов в паренхиму, что приводит к нарушению осмотического и электролитного обмена трематод с развитием гидропической дистрофии, деструкцией белково-углеводных комплексов и тканевому некрозу. 3) Двойное воздействие, как антигельминтика, так и метаболитов лизиса ткани внутренней среды самого гельминта способствует усилению степени токсического давления на органы его половой системы. У трематод нарушается цитоархитектоника желточников, яичников, семенников; прекращаются процессы вителлогенеза, овогенеза и сперматогенеза, блокируется процесс формирования яиц.

Впервые показано, что морфофункциональные изменения эндостации паразита при парамфистомозе до лечения представлены дегенеративно-дистрофическими и пролиферативно-метапластическими процессами кишечника овец, выполняющего роль ксеногостального барьера. Гистохимически выявлены очаги мукоидного (после воздействия тегалида) и фибриноидного (после воздействия антитрема) набухания. Установлено, что изменения в тканях эндостации паразита являются обратимыми, но отмечено, что воздействие антитрема сильнее, чем тегалида.

Впервые установлен феномен деструкций эозинофилов и блокировки эозинофильной реакции при парамфистомозе после воздействия антитрема, что является основой для расширения области применения для препарата.

Разработаны патоморфологические и гистохимические критерии оценки эффективного воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод.

Разработан метод морфометрического анализа яиц трематод до и после воздействия антигельминтиков со статистической обработкой результатов и внедрен как морфометрический критерий оценки эффективности овоцидных свойств препаратов.

Практическая значимость

Реализация полученных результатов позволяет повысить объективность и информативность оценки эффективности воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод.

Разработаны и внедрены объективные и достаточно информативные критерии оценки эффективности воздействия препаратов на трематод: патоморфологический контроль органов и тканей гельминтов после воздействия антигельминтиков; гистохимический анализ реактивности их тканей в ответ на воздействие антигельминтиков; морфометрический анализ яиц трематод.

Результаты изучения гистохимической реактивности тегумента, пищеварительной и половой систем трематод при воздействии антигельминтиков могут быть использованы при разработке новых схем и методов лечебной и профилактической дегельминтизации трематодозов животных и человека.

Выявлены морфофункциональные изменения яиц трематод после воздействия антигельминтиков и предложен разработанный метод морфометрического критерия яиц гельминтов со статистическим анализом, который позволяет оценить овоцидное воздействие различных препаратов и влияние на яйцепродукцию гельминтов после химиотерапии хозяина.

Результаты исследования использованы при разработке: методических рекомендаций «Выявление трематодоцидной эффективности антигельминтных средств методом морфометрического анализа яиц трематод после воздействия препарата» одобренных секцией «Инвазионные болезни животных» РАСХН 29 мая 2008 г. (протокол №2 от 29.05.2008) и «Паразитарные болезни, распространенные на территории Кузбасса (меры борьбы и профилактики)» одобренных Ученым Советом ГБОУ ВПО «Кемеровской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России 23 июня 2010 г. и секцией «Инвазионные болезни животных» РАСХН 23 сентября 2010г. (протокол №3 от 23.09. 2010).

Научные материалы диссертации внедрены в НИИ ВИГИС (г. Москва) и НИЛ «Микроморфология плоских червей» ГБОУ ВПО Кем ГМА (г. Кемерово), а также могут быть внедрены в другие учреждения соответствующего профиля для оценки эффективности антигельминтиков.

Результаты исследования внедрены в учебно-методическую литературу для ветеринарных специалистов, преподавателей и студентов факультетов ветеринарной медицины и используются в учебном процессе кафедр: общей патологии человека в разделе «Инфекционные и паразитарные болезни» ГБОУ ВПО «Бурятского ГУ»; общей биологии с основами генетики и паразитологии в разделе «Паразитология», инфекционных болезней в разделе «Паразитарные болезни» и фармакологии по теме «Противопаразитарные средства» ГБОУ ВПО «Кемеровской ГМА»; зоологии и экологии в разделах «Паразитология» и «Практическая зоология беспозвоночных и позвоночных животных» ГБОУ ВПО «Кемеровского ГУ».

Положения, выносимые на защиту

1. Патоморфологические изменения органов и тканей трематод (фасциол, парамфистом, дикроцелий) после химиотерапии животных антигельминтиками (димезола,триклабендазола, тетраксихола, политрема, антитрема, тегалида, фаскоцида), как критерии степени эффективности воздействия препаратов.

2. Гистохимическая реактивность тканевых структур трематод (дикроцелий, фасциол, парамфистом) как критерии оценки воздействия антигельминтиков на функциональную морфологию органов и тканей трематод.

3. Морфометрический анализ яиц трематод до и после воздействия разных антигельминтиков со статистической обработкой результатов, как критерий оценки эффективности воздействия препаратов.

4. Микроморфофункциональные механизмы взаимоотношений в системе «паразит-хозяин» на примере паразитирования P.cervi в тонком кишечнике овец до и после воздействия антитрема и тегалида.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских конференциях общества гельминтологов РАН «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1997, 1999, 2004-2007, 2009-2011,Межрегиональной конференции «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 1997, 2000, 2001, 2008, 2010, 2011), Всероссийской конференции-семинаре с международным участием «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 1998, 1999), Конференции, посвящённой Всемирному дню охраны окружающей среды «Среда обитания и профилактика заболеваний в г. Кемерово» (Кемерово, 1999), Всероссийской конференции, посвященной 50-летию кафедры общей биологии и 80-летию со дня рождения первого заведующего кафедрой, д.б.н. Логачева Е.Д. (Кемерово, 2006), Межрегиональной конференции с международным участием, посвященной 55-летию Кем ГМА «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины, медицинской науки и образования» (Кемерово, 2010), Международной конференции «Экология России и сопредельных территорий»(Новосибирск, 2010), Конференции с международным участием, посвящённой 55-летию кафедры общей биологии с основами генетики и паразитологии КемГМА и 85-летию со дня рождения д.б.н., проф. Е.Д. Логачёва «Теоретические и практические вопросы паразитологии» (Кемерово, 2011).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста, состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключительного обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 304 источников, из них 62 иностранных и 15 страниц приложения.Работа иллюстрирована 24 таблицами и 174 рисунками.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 научных работ, из них 15 статей в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ для представления научных результатов диссертационных работ на соискание учёной степени доктора наук, монография.

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом 14-летних исследований автора. Анализ данных литературы по теме диссертации, гистологическая обработка материала, приготовление парафиновых срезов, окрашивание препаратов гистологическими и гистохимическими методами,описание, микрофотосъёмка препаратов, анализ и статистическая обработка полученных результатов и написание диссертации проведены лично автором.

Работа выполнялась при консультативном руководстве доктора биологических наук, профессора Л.В. Начевой, которому автор выражает искреннюю благодарность.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Представлен анализ литературы по вопросам патоморфологических и гистохимических исследований органов и тканей трематод после воздействия антигельминтиков.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили трематоды – тип плоские черви (Plathelminthes), класс сосальщики (Trematoda):

Dicrocoeliumlanceatum(StilesetHassall, 1896), род DicrocoeliumDujardin, 1845, семействоDicrocoeliidaeOdhner, 1911, полученныеиз желчных протоков печени крупного рогатого скота Тверской области после лечения фаскоцидом в дозе 10 мг/кг по ДВ однократно пероральным введением. Мариты D.lanceatum, собранные на 7 день после дачи препарата, фиксировали в 700-ном спирте.

Fasciolagigantica(Cobbold, 1855), родFasciolaL., семействоFasciolidaeRailliet, 1895, собранные из желчных протоков печени спонтанно инвазированных овецРеспублики Калмыкии после лечения политремом в дозе 140 мг/кг и тетраксихоломв дозе 200 мг/кг по ДВ однократно перорально. Мариты F.gigantica, собранные на 17 день после дачи препаратов, фиксировали в 700-ном спирте.

Fasciolahepatica(Linneus, 1758),родFasciolaL., 1758, семействоFasciolidaeRailliet, 1895, собранные из желчных протоков спонтанно инвазированных овец Кабардино-Балкарской Республики после лечения триклабендазолом в дозе 10 мг/кг по ДВ однократно перорально. F.hepatica, собранные из желчных протоков печени крупного рогатого скота Московской области после лечения антитремом в дозе 200 мг/кг итегалидомв дозе 30 мг/кг по ДВ однократно пероральным введением. МаритыF.hepatica, собранные на 7 день после дачи препаратов, фиксировали в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). F.hepatica изжелчныхпротоков спонтанно инвазированных овец после лечения димезолом в дозе 200 мг/кг по ДВоднократно пероральным введением. МаритыF.hepatica,собранные на 7 день после дачи препарата, фиксировали в 700–ном спирте.

Paramphistomumcervi(Zeder, 1790),род ParamphistomumFischоeder, 1901, семейство ParamphistomatidaeFischоeder, 1901, набранные при гельминтологическом вскрытиииз рубца спонтанно инвазированного крупного рогатого скота после лечения тетраксихолом в дозе 200 мг/кг по ДВ однократно перорально. Трематод, собранных на 7 день опыта, фиксировали в 700-ном спирте. P.cervi, собранные из тонкого кишечникаспонтанно инвазированных овец Нижегородской области после лечения антитремом в дозе 200 мг/кг и тегалидом в дозе 30 мг/кг по ДВ однократно перорально. Трематоды, собранные на 7 день опыта, фиксировали в 700-ном спирте.

Контролем служили трематоды, собранные при гельминтологическом вскрытии животных, не подвергавшихся лечению. Всех гельминтов контрольных групп фиксировали соответствующими растворами для каждой экспериментальной группы.

Микроморфологические, гистохимические и патоморфологическиеособенностивзаимоотношений в системе «паразит-хозяин» до и после воздействия антитрема и тегалида изучались в сравнительном аспекте на примере паразитирования парамфистом в кишечнике овец. Кусочки ткани тонкой кишки овец с P.cerviдо и после лечения антитремомв дозе 200 мг/кг по ДВ и тегалидом в дозе 30 мг/кг по ДВфиксировали в 700–ном спирте. Препараты вводили однократно перорально, материал был получен на 7 день опыта.

Трематоды после воздействия антигельминтиков были любезно предоставлены для микроморфологических исследованийзаведующим лабораторией экспериментальной терапии животных ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии имени К.И. Скрябина доктором ветеринарных наук, профессором И.А. Архиповым (ВИГИС, г. Москва).Настоящая работа выполнялась в соответствии с заданием №02 «Провести поиск новых методических подходов для получения фундаментальных знаний об экологических особенностях формирования паразитоценозов, биоценотических взаимоотношений и генетической структуре их сочленов, об эпизоотическом процессе, механизмах иммунитета и разработать относительно простые и экономичные средства диагностики, специфической профилактики и борьбы с паразитарными болезнями», которые проводились по Межведомственной координационной программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ (2006-2010гг.).

АНТИТРЕМ – антигельминтик из группы трихлорметилбензолов, содержит не менее 98% парабистрихлорметилбензола с внесением полиглицеридов. ДИМЕЗОЛ(БЗЛ)синтезирован в ВИГИСе, в химическом отношении относится к группе бензимидазолов: 5,6-диметилбензимидазол. ПОЛИТРЕМ (гексихол С) – лекарственная форма гексахлорпараксилола, полученная на основе гексихола (1,4-бистрихлорметилбензола) с внесением сульфоната натрия, относится к хлорированным углеводородам.ТЕГАЛИД разработан в ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского, по химической структуре относится к салициланилидам:N-[3'-(4-хлорбензоил)-4'-хлорфенил]-2-окси-3,5-дибромбензамид. ТЕТРАКСИХОЛ – комбинированный препарат, разработанный на основе политрема (3) и тетрахлордифенилсульфида (1) в ВИГИСе. Тетрахлордифенилсульфид (битионол) в химическом отношении представляет 2,2'-тиобис(4,6-дихлорофенол). ТРИКЛАБЕНДАЗОЛ(фазинекс) по химической структуре относится к группе бензимидазолов:5-хлор-6-(2,3-дихлорфенокси)-2-метилтиобензимидазол, получен на основе отечественного сырья сотрудниками ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и ВИГИС. ФАСКОЦИД(10% гранулят оксиклозанида, занил, метилин, салинид, диплин, дистонин) – отечественный препарат, разработанный «НВЦ Агроветзащита», по химической структуре относится к салициланилидам: 3,3',5,5'-6-пентахлор-2,2'-диоксибензамид.

Материал – половозрелые особи сосальщиков, взятые после воздействия антигельминтиков, а также мариты контрольных групп (без воздействия антигельминтных препаратов), после фиксации обрабатывали по общепринятой гистологической методике(Елисеев В.Г., 1967; Меркулов Г.А., 1969). Парафиновые блоки раскладывались на микротоме на срезы из трематод толщиной 5-6 мкм, а из тканей хозяина – толщиной 6-7 мкм. Депарафинированные поперечные, продольные и косые срезы гистологически окрашивали гематоксилином (Эрлиха,Карацци, Майера) с докраской эозином, по методу Маллори. Для изготовления гистологических препаратов использовали новый метод одновременной фиксации и окрашивания по А.Г. Михееву (Михеев А.Г., А.с. № 1807400, МКИ G 01 № 01 33/48, 1990).

Гистохимические реакции были проведены по рекомендациям методов гистоцитохимического анализа в патологии (Авцын А.П., Струков А.И., Фукс Б.Б., 1971), а также с учетом гистохимических методов в нормальной и патологической морфологии (Португалов В.В., Струков А.И., 1958) и гистохимии соединительной ткани (Фукс Б.Б., Фукс Б.И., 1968). В качестве базового пособия по гистохимии использовали «Гистохимия» Э. Пирс (1962).

Гистохимически выявлялись суммарные белки методом сулемма-бромфеноловый синий (БФС) по Бонхегу. Гликоген, нейтральные мукополисахариды (гликопротеиды) и мукопротеиды выявлялись Шик-реакцией по Мак-Манусу. Кислые мукополисахариды (гексозаминогликаны, ГАГ) выявлялись альциановым синим (АС) по Стидмену и Моурипри низких значениях рН (2,0-3,0) и толуидиновым синим (ТС) при рН=4,0 и рН=6,0, а также при рН=11,0 (Начева Л.В., 1993) выявлялись мукополисахариды и гликопротеиды. Оценка полученных результатов гистохимических реакций проводилась визуально с помощью светового микроскопа, путём сравнения окраски препаратов, полученных из гельминтов, подвергшихся воздействию антигельминтиков, с контрольными препаратами.

Ферментативный контроль для идентификации гистохимически положительных веществ, проводился на срезах, которые обрабатывались ферментами:1) При выявлении белков проводился ферментативный контроль с трипсином и пепсином. Обработку ферментами проводили при температуре 370С в течение 60 минут в термостате, после окрашивали БФС. 2) При выявлении гликогена использовался контроль сдиастазой и амилазой слюны, после которого наблюдалось отсутствие гранул полисахарида при постановке Шик-реакции. Депарафинированные срезы инкубировали в ферменте в течение часа при 370С в термостате, после проводили Шик-реакцию. 3) Методом ацетилирования 1,2-гликольных групп выявляли Шик-положительные соединения с реакционоспособными 1,2-гликольными группами от Шик-положительной окраски, обусловленной другими веществами. Ацетилирование достигалось обработкой препаратов в растворе уксусного ангидрида на безводном пиридине. При ацетилировании происходило подавление Шик-положительной окраски структур.4) При обработке тестикулярной гиалуронидазой наблюдалось ослабление метахроматического окрашивания и слабое подавление альцианофилии тканей. Результаты контроля показывают, что снижение окраски тканей АС обусловлено гексозаминогликанами в большей степени сульфатированноготипа, а при снижении окрашиванияТС – гиалуроновой кислотой. 5) Частичное удаление сульфатных групп в результате «мягкого» метилирования по Спайсеру при 370С в течение 60 минут значительно ослабляло окраску АС на всех контрольных препаратах. Последующее деметилирование не восстанавливало альцианофилию. В результате «жесткого» метилирования при 600С в течение 60 минут наблюдалась полная блокада альцианофилии, деметилирование не возвращало тканям способности к окрашиванию.6) Сульфатирование контрольных срезов по Мору и Шенбергу (усиливало интенсивность метахроматической окраски ТС и окраски препаратов АС. Интенсивность окрашивания хромотропов особенно возрастала в структурах ярко окрашивающихся в малиновый цвет реактивом Шиффа. Корреляция гистохимических методов проводилась по рекомендациям Лойда З. (Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т., 1982).

Изготовлено и изучено более 15 000 гистологических микропрепаратов после воздействия антигельминтиков и при различных способах окрашивания, которые изучались в световом микроскопе «Микмед-6» с фотонасадкой, и параллельно производилась микрофотосъемка. Микрофотосъемку производили цифровой фотокамерой «Canon» PowerShotА510. Всего было сделано 5522 микрофотокадра, а в диссертационную работу отобрано 562 микрофотографий. Все приведенные в диссертации микрофотографии являются авторскими оригиналами.

Оценку эффективности воздействия антигельминтиков на трематод проводили, используя патоморфологический и гистохимический методы анализа их тканей и органов, а также метод морфометрии яиц гельминтов (Бибик О.И., Начева Л.В., 2009), путем сравнения трематод, набранных у подопытных и контрольных групп животных.

Метод морфометрии яиц трематод и их содержимого со статистическим анализом включал следующие этапы:

1) На гистологических препаратах изтрематод (фасциол, парамфистом, дикроцелий), окрашенных гематоксилин-эозином, измерялись в миллиметрах с помощью окуляр-микрометра ШИО-8* в световом микроскопе общие размеры 50 яиц трематод и размеры их содержимого по большому (D) и малому (d) диаметрам в норме и после воздействия антигельминтика, находящихся в дистальном отделе матки, яйца с несформированными мирацидиями (фасциолы, парамфистомы) и зрелые яйца с личинкой – мирацидием (дикроцелии)(рис. 1).

Окуляр-микрометр – круглое стёклышко с нанесённой на него шкалой длиной 1 см, разделённой на 100 частей. Величину одного деления шкалы окуляр-микрометра определяли с помощью объект-микрометра. В объект-микрометре между предметным и покровным стёклами нанесена шкала длиной 1 мм, разделённая на 100 частей, каждая из которых равна 0,01мм (10 мкм).

D

 

d

 АIMG_0890

d

 

D

 БIMG_1147.JPGВIMG_1149.JPG                             

Рис. 1. ЯйцоF.hepatica (А). Измерение яйцаF. hepatica с помощью окуляр-микрометрапослевоздействия димезола (Б, В). D – большой диаметр яйца; d – малый диаметр яйца.Микрофото. Увел.: ок. 7 (Б, В), 10 (А) х об.40.Окраска гематоксилин-эозином.

Объект-микрометр помещали на предметный столик микроскопа, наводили на резкость, при которой были достаточно чётко видны обе шкалы объективной и окулярной линейки расположенные параллельно. Отсчитывали, сколько делений окулярной линейки и объект-микрометра совпадали между собой. Вычисление производили по формуле:

А=

где А – видимая величина одного деления окуляр-микрометра при данном увеличении; р – число делений объект-микрометра, совпадающих с определённым числом делений окулярной линейки; а – величина одного деления объект-микрометра, равная 0,01; с – число делений окулярной линейки, совпадающих с определённым числом делений объект-микрометра (р).

2) Рассчитывались объемы яиц (Vя) и их содержимого (Vс) с применением формулы объема эллипсоида (Автандилов Г.Г., 1990):

V = ·D·d2

гдеD – большой диаметр, d – малый диаметр.

3) Статистический анализ данных выполнен с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 и MicrosoftОfficeExcel 2007 (лицензионное соглашение 74017-640-0000106-57177). Исследование проводилось на достаточном объеме наблюдений. Критическое значение уровня статистической значимости, при проверке нулевых гипотез, принималось принимался равным 0,05. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия этой величины, принималась нулевая гипотеза.

Анализ нормальности распределения вероятности количественных признаков осуществлялся с помощью критерия Шапило-Уилка (W). Критерий W проверяет гипотезу (Н0): распределение признаков в совокупности не отличается от нормального. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия Н0 не отклонялась и распределение исследуемого признака считалось нормальным. В представленном исследовании вычисленные значения критерия W соответствуют 0,000000-0,831401 при достигнутом значении уровня статистической значимости 0,000000-0,000005. Принята альтернативная гипотеза (Н1): распределение изучаемого признака отличается от нормального.

Описание количественных признаков в сравниваемых группах производилось с использованием средних арифметических и среднеквадратических (стандартных) ошибок среднего. Эти дескриптивные статистики в тексте представлены как М±m, где М – среднее, а m – ошибка среднего.

Для сопоставления двух зависимых выборок по количественным признакам (параметрам морфометрии), которые не являются нормально-распределеннымииспользовался непараметрический критерий Вилкоксона (Т) для парных сравнений. Критическое значение уровня статистической значимости, при проверке Н0, принималось равным 0,05. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия гипотеза (Н0) об отсутствии различий групп по изучаемому признаку принималась; при достижении уровня значимости статистического критерия менее 0,05 принималась альтернативная гипотеза (Н1) о существовании различий групп по изучаемому признаку.

Работа выполнялась в микроморфологической лаборатории на кафедре общей биологии с основами генетики и паразитологии ГБОУ ВПО «Кемеровской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России.


2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1. МИКРОМОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕГУМЕНТА, ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ И

ПАРЕНХИМЫ ТРЕМАТОД ДО И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ

2.2.1.1. Морфофизиологические особенности трематод в условиях эндостации – среде I порядкауказывают на то, что между гельминтом и эндостацией в организме хозяина складываются определённые трофические связи, которые непосредственно оказывают влияние на механизм воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод.

2.2.1.2.Микроморфологическаяхарактеристика тегумента, пищеварительной системы и паренхимы трематод до воздействия антигельминтиковсоответствуетклассичеким гистологическим описаниям, которые излагаются в данном разделе.

2.2.1.3.Микроморфологические исследования тегумента, пищеварительной системы и паренхимы трематод после воздействия антигельминтиковпоказали, что изначально дегенеративные повреждения выявлялись впограничных структурах – тегументе, присосках и кишечникегельминтов, которые в первую очередь вступают в адгезивный контакт с паразитарной нишей в организме хозяина.

После воздействия антигельминтиков в тканях и органах трематод отмечается выраженный отёк.Сравнительный анализ микроморфологии тегумента и кишечника показал, что антигельминтики в одних и тех же тканях трематод вызывают развитие однотипных некробиотических процессов с разной выраженностью структурных изменений. Организм трематод на воздействие каждого антигельминтика отвечает неоднозначной реакцией морфофункциональных перестроек. Чем и обусловлена сила их эффективности в той или иной степени. Сильные деструктивные процессы наблюдались при воздействии политрема на F.gigantica,тетраксихола на F.gigantica и P.cervi,антитрема на F.hepaticaи P.cervi, фаскоцида на D.lanceatum и тегалида на F.hepaticaи P.cervi.

Установили, чтоантигельминтики нарушают гомеорезисное состояние биологической системы «паразит-хозяин», вызывая необратимые процессы в форме тотальной деструкции органов эктосоматического барьера – тегумента и кишечника, которые обеспечивают адаптацию в среде I порядка. Первоначальное воздействие антигельминтиков происходит через органы разных систем трематод. Патологическая картина показала, что, несмотря на наличие некоторых качественных отличий в патологических реакциях, вызванных антигельминтиками, в эктосоматических органах трематод наиболее значительные изменения структуры тегумента трематод вызывают хлорированные углеводороды. На препаратах тегумент полностью выглядит разрушенным. После воздействия димезола, антитрема, тетраксихола и тегалида наблюдали усиленную вакуолизацию в дистальном слое тегумента фасциол. Во внутренней части тегумента у F. hepatica после воздействия триклабендазола и тегалида у F. hepaticaи P. cervi обнаруживалось увеличение количества клеточных элементов и отмечалось возрастание гиперсекреции клеток. Пролиферация клеток после воздействия тегалида наглядно выявлялась и в базальной части кишечного эпителия данных видов трематод. Процесс клеточной пролиферации является защитной реакцией тканей паразита, которая выявлялась как I стадия токсического воздействия антигельминтика. Отмечено, что триклабендазол, тегалид и фаскоцид оказывают более сильное воздействие на ткани пищеварительной системы трематод, особенно разрушают эпителий кишечника, который является внутренним «барьером», ипреимущественно в тело трематодпроникаютчерез пищеварительную систему, а не покровную ткань. Антитрем и тегалид обладают неодинаковой степенью воздействия на одни и те же ткани разных видов трематод, проявляя свойство тканевой специфичности. Антигельминтики в органах и тканях фасциол и парамфистом вызывают гидропическую дистрофию, отёк, набухание и вакуолизацию с наибольшим их проявлением в пограничных тканях F. hepatica. Некробиотические нарушения в тканях P. cervi выражены слабее.

После абсорбции антигельминтика организмом паразита в тканевых структурах трематод происходит изменение восприятия гистологических красителей. Усиливается оксифильность тканей, их способностьактивно воспринимать кислые красители, или повышается их базофильность. Происходит нарушение рН внутренней среды организма паразита и химического состава тканевых компонентов. Обнаруживается разрушение ядерного аппарата, чтоподтверждает токсическое воздействие на генетические структуры.

Паренхима как промежуточное звено подвергается двухстороннему влиянию: со стороны тегумента и со стороны пищеварительной системы. Антигельминтики в разной степени вызывают декомпозицию паренхимы трематод, как ткани внутренней среды, обеспечивающей гомеостаз организма паразита. Микроморфологические изменения с выраженными деструктивными нарушениями соединительной ткани у F.gigantica и P.cervi вызывал тетраксихол. Токсическое воздействие на ткань внутренней среды оказывают триклабендазолу F.hepatica и фаскоцид у D.lanceatum, вызывая деструкцию ткани с некротическими явлениями. У F.hepaticaтегалид максимально разрушал соединительную ткань, когда у P.cervi воздействие препарата выражено незначительными морфологическими изменениями. Некрозпаренхимы отмечается после влияния антитрема как уF.hepatica,так и уP.cervi. К необратимым патологическим процессам в тканях фасциол приводят политрем и димезол.


2.2.2.МИКРОМОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ

ОРГАНОВ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ ТРЕМАТОД ДО И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ

2.2.2.1. Морфофункциональная характеристика репродуктивных органови гаметогенеза трематод до воздействия антигельминтиков показала, что у всех изученных трематод (F.hepatica, F.gigantica, D.lanceatum, P.cervi) мужские половые органы представлены семенниками, семяпроводами, семенными пузырьками, семяизвергательным каналом, простатической железой и совокупительным органом (циррусом). Выявлено, что стенки семенников состоят из соединительнотканных волокон. Цитоархитектоника внутреннего строения семенников представлена четырьмя зонами (размножения, роста, созревания, формирования). Зоны размножения сперматогоний у трематод выражены не однотипно. Поэтому, выделены две группы трематод:P.cervi, D.lanceatum, у которых зона размножения локализуется в пристеночном слое семенников;F.hepatica, F.gigantica,у которых зона размножения не имеет строгой приуроченности к какому-либо участку семенника. Пристеночно в семенниках расположены первичные половые клетки, образующие зону сперматогоний – округлых клеток, основная часть которых занята ядром. Вокруг ядер сперматогоний выявляются сформированные округлой формы симпласты с ярко окрашенной эозином цитоплазмой. Пространство между клонами в семенниках заполнено гелеобразной массой, в которой встречаются волокнистые структуры, вероятно, способствующие упорядоченному расположению клониальных элементов и сохранению архитектоники органа. Семявыводящие путитрематод представлены парными семяпроводами, семенными пузырьками, которые морфологически имеют вид трубок, изнутри выстланных микроворсинчатым эпителием. Семенные пузырьки–непарные органы, расположены внутри циррусной сумки у D.lanceatum и F.hepatica,F.gigantica и вне ее у P.cervi. Семенной пузырек имеет форму мешочка или извитой широкой трубки. Семенные пузырьки заполнены сперматозоидами у F.hepatica,F.gigantica и D.lanceatum и сперматидами у P.cervi. У последних трематод сперматозоидывыявляются только вблизи семяизвергательного канала. Вокруг семяизвергательного канала наблюдается хорошо сформированая простатическая железа, клетки которой располагаются вокруг канала и имеют грушевидную форму. У F.hepatica иF.gigantica простатическая железа состоит из многочисленных сильно вакуолизированных каплевидных одноклеточных желез, располагающихся вокруг семяизвергательного канала в несколько рядов и содержащих большие прозрачные везикулы. Выводные протоки клеток пронизывают стенки семяизвергательного канала и имеют выход в его просвет. Простатическая железа у P.cervi отграничена от окружающей паренхимы тонковолокнистой соединительнотканной мембраной. Клетки простаты располагаются в 3-5 рядов. Простатическая железа D.lanceatum состоит из немногочисленных крупных железистых клеток с длинными протоками, не образуя многорядья. Циррус и циррусный мешок D.lanceatum и F.hepatica,F.gigantica отграничены от паренхимы волокнистым тяжем.

Женские половые органы у F.hepatica, F.gigantica, D.lanceatumиP.cervi представлены яичником, яйцеводом, тельцем Мелиса, желточниками и их протоками, маткой. Микроморфологически яичники представлены небольшими органами округлой формы у P.cervi и D.lanceatum или выглядят древовидно рассеченными у F.hepaticaиF.gigantica. Стенка яичников сформирована из соединительнотканных волокон коллагенового типа, окрашенных в голубой цвет по Маллори и тесно связаных с окружающей паренхимой. В слепых трубочках яичников фасциол выявляются очень мелкие клетки– овогонии, имеющие неправильную (полигональную) форму, расположенные пристеночно.Они составляют зону размножения яичника. Овоциты, выявляютсяв просвете яичника трематод с эксцентрично лежащим ядром икрупным ядрышком. Между клетками выявляется питательный материал в виде тёмных зернистых скоплений. В яйцеводе форма овоцита становится круглой, а ядро занимает почти половину клетки. У P.cervi зона размножения из клеток овогоний расположена с одной стороны яичника, а не по всей периферии пристеночно, как у фасциол. Центральная часть яичника заполнена бесформенной, слегка зернистой массой, которая представляет собой коллоид белкового происхождения, окрашенной в оранжево-красный цвет по Маллори.Тельце Мелиса (скорлуповая железа) – орган сферической формы с резко очерченными границами располагается рядом с яичником. Орган состоит из двух типов железистых клеток, погруженных в основное вещество по периферии тельца. Многочисленные базофильные крупные неправильно-каплевидной формы клетки содержат гранулы и имеют все признаки секреторных клеток. Мелкие центральные клетки имеют эозинофильную цитоплазму. Внутренняя часть железы эозинофильна. У P.cervi тельце Мелиса – компактный орган с чёткой границей, обособленный от окружающей паренхимы, а у F.hepatica, F.giganticaи D.lanceatum железа рыхлая, состоит из пучка клеток, радиально расходящихся в разные стороны и не обособленных от паренхимы. Желточные фолликулы, в которых развиваются желточные клетки, располагаются по бокам тела трематод в виде групп, имеющих форму гроздевидных образований у D.lanceatum. У F.hepaticaиF.giganticaжелточники занимают большую часть тела. У P.cervi желточные фолликулы мелкие, неправильной формы.Желточные клетки шаровидной формы, содержат гранулы желтого цвета, располагающиеся по периферии. Вителлиновые клетки участвуют в образовании яйцевой скорлупы и питании развивающегося зародыша. В протоке тельца Мелиса происходит распад желточных клеток. Расплавленные желточные гранулы вместе с яйцеклетками перемещаются в начальные отделы матки, где и происходит образование яйцевой скорлупы. Это процесс пластификации, в котором участвуют скорлуповые гранулы и секрет тельца Мелиса. Вматке трематод наблюдается разная микроморфологическая картина, соответствующая стадиям оплодотворения яйцеклеток, дробления яиц после формирования скорлуповой оболочки и развитию яиц до образования личинки. Дробление оплодотворенной яйцеклетки и начальное образование скорлуповой оболочки наблюдается в проксимальных отделах матки. В средних отделах яйца содержат развивающийся зародыш, который у каждого вида имеет свои особенности строения и не до конца оформленную яйцевую оболочку. В дальнейшем, в связи с дублением скорлупы, цвет её становится вначале желтым, а затем желто-коричневым. В дистальных отделах матки обнаруживаются яйца со сформированной скорлуповой оболочкой желтого или как у D.lanceatum коричневого цвета и содержат сформированный зародыш, готовый к развитию в окружающей среде, при этом у каждого сосальщика он находится на различной стадии онтогенеза. У D.lanceatum в яйце выходит личинка – мирацидий, а у F.hepatica,F.gigantica иP.cervi – выходит яйцо, в котором мирацидий заканчивает развитие в окружающей среде.

2.2.2.2. Патоморфологические исследования репродуктивной системы трематод после воздействия антигельминтиковпоказали, что органы половой системы оказываются в условияхдвойного токсикогенного воздействия, подвергаясь химиопрессии как антигельминтика, так и метаболитов самого гельминта, выделяющихся при распаде тканей тегумента, кишечника и паренхимы.Установлено, что все используемые антигельминтики в терапевтических дозах вызывают в половой системе трематод деструктцию, деформацию, декомпозицию тканей и клеточных форм органов.Некробиотические и дистрофические явления в органах половой системы, сопровождаются выраженными разрушениями стенок органов, распадом клонов и клеточных элементов. Максимальную силу эффекта на гаметогенез F.hepaticaи F.giganticaоказывают триклабендазол, тегалид, антитрем, тетраксихол, димезол иполитрем (табл. 1). Эффект воздействия тегалида и антитрема у P.cervi с большой степенью воздействия проявляется в семенниках и в яичнике. Фаскоцид вызывает дегенеративные процессы в семенниках и яичнике D.lanceatum. Гиперэффект воздействия – тотальная некротизация структур тканей в яичнике и семенниках наблюдается у P.cervi после применения тетраксихола. Токсическое влияние антигельминтиков нарушает гомеостатику в репродуктивной системе трематод, изменяя цитоархитектонику половых желез, и тем самым,блокирует сперматогенез и овогенез. Структура яйцеклеток и сперматозоидов резко изменяется, не происходит их созревание.


                                                                                                                                                    Таблица 1

Эффект степени воздействия антигельминтиков на органы половой системытрематод

 

                                       

Антигельминтики

 

Органы

Бензимидазолы

Хлорированные углеводороды

Салициланилиды

 

Триклабендазол

Димезол

Политрем

Антитрем

Тетраксихол

Тегалид

Фаскоцид

 

фасциолы

парамфистомы

фасциолы

парамфистомы

дикроцелии

Мужские половые органы:

Семенники

 

+++±

О, Л

 

++++

О, Л

 

++++

О, Л

 

+++++

О, Л

 

+++±

 

+++++

О, Л

 

+++++

О, Л

 

++++

 

+++±

О, Л

 

+++

О

Семенной пузырёк

++++

Л

+++±

Л

++++

Л

+++

+++±

++++

+++±

+++++

Л

+++±

О, Л

+++±

О, Л

Простатическая железа

+++++

О, Л

++++

Л

+++

+++±

+++±

++++±

+++++

+++++

Л

+++±

+++

Женские половые органы:

Яичник

 

++++±

Л

 

+++±

 

++++

Л

 

+++++

О, Л

 

+++±

Ля

 

+++++

 

++++±

О

 

++++±

 

+++±

Пя

 

+++

Тельце Мелиса

++++

О, Л

++++

О, Л

++++

Л

+++

+++

++++±

++++

++++

+++

+++

Желточники

++±

+++

+++

++++

О

+++±

++++

+++±

++±

+++±

+++

Матка

+++++

О, Л

+++++

++++±

++++

+++++

+++++

++++±

+++++

Л

++++±

+++±

Примечание к таблице: + – минимальный эффект степени воздействия антигельминтика на ткань; ++ – эффект средней силы воздействия; +++ – эффект сильного воздействия; ++++ – максимальный эффект воздействия антигельминтика; +++++ – гиперэффект воздействия антигельминтика; ± – местами разной силы воздействия (скачкообразно); В – вакуолизация; О – отёк; Л – лизис структур; А – атрофия ткани; П – ядерная пролиферация; Пя – пикноз ядер; Ля – лизис ядер.


Микроморфологические исследования тканей трематод помогли установить и показать, что антигельминтикитоксически воздействуют на желточники, их функции, вызывая прекращение синтеза желточного материала, необходимого для формирования скорлуповой оболочки яиц. Дегенерация желточников приводит к блокаде развития вителлиновых клеток и скорлуповых гранул.Выявляется цепь патологических явлений, действующих на весь процесс развития новой генерации паразита. Патологические нарушения архитектоники вителлогенеза, сперматогенеза и овогенеза способствуют стерилизации гельминта, скорлуповые оболочки яиц не формируются, и прекращается яйцепродукция трематод.

Репродуктивная система трематод в норме направлена на продуцирование инвазионных яиц. Все антигельминтики оказывают гиперэффект воздействия на матку и формирующиеся в ней яйца. В меньшей степени воздействует на яйцаD.lanceatum фаскоцид. После триклабендазола, димезола, антитрема, тетраксихола выявляется: нарушение целостности и деформация яиц; увеличение их размеров; усиление проницаемости их скорлуповой оболочки; деструкция и декомпозиция содержимого яиц; прекращение процессов их созревания.

Результаты наших наблюдений показали, что значительные микроморфологические изменения цитоархитектоники половых желёз (семенников, яичника, простатической железы, тельца Мелиса, желточных фолликулов), нарушения процессов сперматогенеза, овогенеза и вителлогенеза зависят от химической природы антигельминтика, длительности его воздействия на гельминта и видовой специфики ответных реакций трематод (F. hepatica, F. gigantica, P. cervi, D. lanceatum).

2.2.2.3. Морфометрический анализ яиц трематод до и после воздействия антигельминтиков при статистической обработке морфометрических параметров яиц, находящихся в конечных отделах маткиподтвердил данные патоморфологии о трематодоцидных возможностях триклабендазола, димезола, тегалида, фаскоцида, антитрема, политрема и тетраксихола.Анализ общих объёмов яиц трематод объективно показал увеличение объёма яиц трематод по отношению к норме у фасциол после воздействия димезола, триклабендазола, антитрема, тетраксихола и у парамфистом после воздействия тегалида (рис. 2-4). Это подтверждают гистологические результаты о проницаемости скорлупы яиц. После воздействия триклабендазола у F.hepaticaпроисходят патологические процессы внутри яиц, выраженные увеличением объёма содержимого яиц, его лизисом, расплавлением тканевых структур. Статистически значимое уменьшение общего объёма яиц трематод выявляетсяпосле воздействияполитрема уF.gigantica, тегалида у F.hepatica, антитрема уP.cervi и фаскоцида у D.lanceatum(рис. 2-5).

10•10-8

 

2•10-8

 

0

 

Рис. 2. Общий объём яиц F. hepatica и объём их содержимого до и после

воздействия антигельминтиков.

20•10-8

 

10•10-8

 

0

 Рис. 3. Общий объём яиц F. gigantica и объём их содержимого до и после

воздействия антигельминтиков.

10•10-8

 

16•10-8

 

0

 Рис. 4. Общий объём яиц P. cervi и объём их содержимого до и после

воздействия антигельминтиков.

0,5•10-8

 

0

 Рис. 5. Общий объём яиц D. lanceatum и объём их содержимого до и после

воздействия антигельминтика фаскоцида.

Обнаруживается уменьшение объёма содержимого яиц трематод после воздействия димезола, тегалида, антитрема, политрема и фаскоцида по отношению к норме, что демонстрирует блокировку развития личинки – мирацидия и подтверждает гистологические данные о деформации яиц и дегенерации их содержимого. Тенденция к снижению объёмов яиц и их содержимого после воздействия антигельминтиков свидетельствует о торможении развития яиц.

Морфометрические исследования яиц F.hepatica,F.gigantica,P.cervi и D.lanceatum, находящихся в конечных отделах матки подтвердили, что все антигельминтикивызывают микроморфофункциональные изменения яиц трематод и их содержимого, обладают выраженным токсическим эффектом воздействия с прекращением яйцепродукции и позволяют максимально объективизировать патологию, вызванную антигельминтиком.

2.2.3. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ТРЕМАТОД ДО И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ

2.2.3.1. Гистохимические исследованиятканей тегумента, пищеварительной системы, паренхимы и органов половой системы трематод до воздействия антигельминтиковпоказывают состояние химических соединений в клетках тканей и органов F.hepatica,F.gigantica, P.cervi и D.lanceatum, а также изменения их распределения, количества и места локализации в теле гельминта после химиотерапии хозяина антигельминтиками. Высокая концентрация гексозаминогликанов (ГАГ)  выявляетсяв дистальной части тегумента трематод с диффузной ортохроматической толуидинофилией. Цитоплазма цитонов внутренней части тегумента трематод богата ГАГ сульфатированного типа с метахроматическим эффектом при окраске ТС. Отмечается скопление ГАГ вокруг ядра. В отростках цитонов ГАГ выявляются диффузно. Метахромазия проявляется в мышцах присосок, фаринкса и их тегументальных выстилках с ортохромазией ядер.

Альцианофилиянаблюдается на поверхности тегумента и в субинтегументальных клетках, что указывает на: 1) гистохимическую однородность отростчатых цитонов и наружной части тегумента; 2) участие цитонов внутренней части тегумента в создании наружной части тегумента; 3) регуляторную роль тегумента в ионно-осмотических процессах гельминта, за счёт присутствия ГАГ.Проявление интенсивной альцианофилии и толуидинофилии наружной части тегумента и цитоплазмы внутренней его частитрематод, свидетельствует о наличии в тегументе гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов, подтверждая его секреторную функцию и участие в защитных реакциях трематод. ГАГ играют важную роль в регуляции проницаемости тканей,участвуют в ионном обмене, иммунологических реакциях и явлениях межклеточной адгезии. Высокое содержание ГАГ в тегументальных выстилках присосок, фаринкса и пищеводасвидетельствует об активном участии тегумента и его производных образований в белково-углеводном метаболизме трематод.

Ярко-розовое окрашивание дистального отдела тегумента при Шик-реакции обусловлено наличием мукопротеинов с мелкими зёрнами гликогена. В проксимальной части тегумента трематод наблюдается отсутствие гликогена, но у P.cerviгликоген встречается в виде мелких зёрен. Дистальный отдел тегумента дикроцелий за счет содержания небольшого количества мукопротеинов проявляет слабую фуксинофилию, а проксимальный – содержитмелкие гликогеновые глыбки, количество которых увеличивается по направлению вглубь паренхимы. В ротовой присоске и фаринксе D.lanceatum большое количество гликогеновых гранул определяетсяв мышечных волокнах. Большая часть гликогена в присосках трематод сосредоточена на стороне противоположной тегументальной выстилке.У P.cerviгликоген располагается преимущественно на том участке присосок, который находится ближе к тегументальной выстилке. У F.hepatica иF.gigantica гранулы гликогеновой природы не выявляются, арозовое окрашивание обусловлено присутствием мукопротеинов. В присосках трематод встречаютсяединичные крупные клеточные формы с бледно-розовой вакуолизированной цитоплазмой и крупным светлым ядром с чётко контурируемым ядрышком – нейроны.

Бромфенолофилиянаблюдается в шипиках тегумента F.hepatica иF.gigantica, которые тёмно-синего цвета, и свидетельствует о наличии суммарных белков.В цитонах проксимальной части тегумента трематодбромфенолофилия указывает на их секреторную функцию,участие в структурной организации его наружной части и в регуляции обменных процессов.У D.lanceatumидентифицированы БФС-положительные отросчатые цитоны, находящиеся на разных стадиях секреции клетки, которые имеют вариабельные размеры, грушевидную форму.Интенсивнаябромфенолофилия тегументаP. сervi указывает на содержание большого количества суммарных белков. Это объясняется местом их локализации (желудок) в организме хозяина, где происходит 1 этап расщепления белков, и свидетельствует об активном транспорте веществ в организм паразита с участием тегумента в трансмембранном переносе. В мышцах присосок трематод бромфенолофилия демонстрируетскопление большого количества суммарных белков, включая белки сократительного типа. Железы, выявляемые в толще стенок ротовой присоски и фаринкса у трематод, проявляют положительную реакцию с БФС.

Показано, что для апикальной поверхности микроворсинчатого слоя клеток кишечного эпителия трематод характерно наличие зоны гликокаликса. В его состав входят ГАГ, что подтверждается альцианофилией и метахромазией.Шик-положительное окрашивание щеточной каймы эпителия доказывает накопление в этой части углеводов, а наличие альцианофилии и толуидинофилии с метахроматическим эффектом указывает на участие микроворсинок в процессах избирательной проницаемости и защитных свойствах. ГАГ равномерно распределенны в цитоплазме апикальной части энтероцитов. У P.cervi апикальная часть эпителиальных клеток кишечника имеет синий цвет только на уровне микроворсинчатой каемки. Шик-реакция выявила пылевидные гликогеновые зёрна среди микроворсинок в апикальной части кишечного эпителия трематод науровне базальной мембраны, а также паренхиматозных ячейках вдоль ветвей кишечника. Интенсивное окрашивание, подтверждающее наличие мукопротеинов, характерно для апикальной (микроворсинчатой) части кишечника. У фасциол, парамфистом и дикроцелий интенсивная пурпурно-малиновая окраска наблюдается в апикальной части кишечного эпителия. В микроворсинках обнаруживаются пылевидные гликогеновые зерна.Большое количество белков при бромфенолофилии определяется в кишечной стенке трематод. Апикальная часть энтероцитов приобретает зеленоватую окраску, а базальная часть эпителия – синюю, что свидетельствует о содержании разных белковых комплексов. Цитоплазма кишечных клеток P.cervi и D.lanceatumв реакциях на белки окрашивается слабо.В период пищеварения в кишечнике, та часть эпителия, которая несёт функциональную нагрузку, чётко отличается по цвету и при окрашивании БФС приобретая коричневый цвет. Метахромазия, бромфенолофилия и фуксинофилияэнтероцитов подтверждают наличие белок-полисахаридных комплексов. Содержание в эпителии кишечника кислых белков в комплексе с кислыми углеводами придаёт клеткам устойчивость к химическому воздействию хозяина.

В паренхиме трематод обнаруживаетсяналичие значительного количества ГАГ. У трематод основные запасы гликогена, находящегося как в диффузной, так и в гранулярной формах, сосредоточены в паренхиме центральной части тела вблизиорганов половой системы.Но самое большое количество гликогена в виде глыбок выявляется в паренхиме D.lanceatumP.cervi гликоген накапливается в отдельных ячейках паренхимы, преимущественно на вентральной стороне тела. Волокнистая структура паренхимы окрашивается ярко БФС. Сетевидная цитоплазма основной ткани трематод богата суммарными белками и представлена рыхлой массой светлой окраски. Ячейкипаренхимыцентральной зоны и вобласти половых желез окрашиваются в голубой цвет БФС.

Исследования на содержаниеГАГ и гликогена в репродуктивных органах трематод показали неравномерное их распределение и различное их содержание у каждого вида. ГАГ в большей степени выявляются в органах женской половой системы – стенках матки, яйцах и желточниках. Это свидетельствует об их секреторной активности, выполнении защитной и барьерной функций. В яйцах фасциол и дикроцелий содержание ГАГ незначительно, но их достаточно много определяется в полости матки. Небольшое количество ГАГ в половых железах указывает на низкую способность участвовать в образовании защитного барьера. Неравномерное распределение окраски у разных видов трематод прослеживается в желточниках и железистых клетках тельца Мелиса. В меньшихколичествах, чем в женских половых органах, ГАГ выявляются в органах мужской половой системы – семенниках, семенных пузырьках и наружных покровах цирруса и полового сосочка. Самое интенсивное окрашивание наблюдается в семенниках. В простатической железе ГАГ не накапливаются. Пространство между клонами в семенниках заполнено гелеобразной жидкостью, проявляющей толуидинофилию и альцианофилию.

В зернистой форме гликоген встречается в органах женской половой системы: желточниках, яйцах, стенках матки. Особенно много мелких зёрен гликогена накапливается между желточными гранулами, вместе с которыми он попадает в формирующееся яйцо. При Шик-реакции в стенках фолликулов трематод и прилежащей паренхиме выявляется ярко-малиновое окрашивание, что обусловлено гликопротеидами. У P.cervi гликоген в желточных клетках не обнаружен. Яичники проявляют интенсивное окрашивание при Шик-реакции, в их стенке выявляются мелкие зёрна гликогена. В овоцитахF.gigantica и F.hepaticaобнаружен диффузно распределенный гликоген, который, возможно, потребляется при делении и созревании клеток, так как внутри скорлупы яйца клетки свободны от гликогена. В клетках тельца Мелиса гликоген определяется в виде мелких зёрен в небольшом количестве. Шик-реакция стенок матки трематод достаточно интенсивнная, особенно, сильно окрашивается эпителиальный слой. В диффузной форме гликоген выявляется в органах мужской половой системы трематод – в сперматозоидах семенников и семенных пузырьков. Шик-реакция определяется в стенках семенников и сформированных сперматозоидах, которые образуют скопления на выходе из семенников в семяпроводы. Окрашивание каплевидных клеток простатической железы и их протоков происходит за счет накопления мукопротеидов.Обнаруживаются мелкие зёрна гликогена в цитоплазме колбовидного основания клеток простатической железы, а также незначительное их количество вокруг ядер клеток.

Реакция на суммарные белки с БФС, показала, что соединительнотканные волокна и мышцы стенки семенников, семяизвергательных каналов и циррусных сумок трематод интенсивно окрашены. Основная окраска приходится на долю ядер, где хорошо контурируются ядерная мембрана и хроматин. Особенно интенсивно окрашиваются ядра клеток на ранних стадиях развития, поэтому зона размножения окрашена сильнее, чем остальная часть семенников. Секрет клеток простатической железы проявляет положительную окраску с БФС, что подтверждает гликопротеиновую природу.Сложное волокнистое строение стенок семенников трематод и их положительный эффект при окрашивании ТС, БФС, АС и Шик-реакция подтверждают защитно-коррелятивную функцию и метаболическую активность органов половой системы.Гистохимические реакции показывают, что ядра желточных клеток трематод окрашиваются БФС в голубой (синий) цвет, а гранулы в зеленовато-голубой (зелёный). При постановке реакции с БФС в желточниках хорошо выявляются возрастные особенности клеток. Синее окрашивание БФС подчеркивает границы скорлуповых гранул, а цитоплазма зрелой желточной клетки окрашивается в зеленоватый цвет. Стенка яичника трематод богата белками. Овогонии в яичнике выявляются гораздо лучше по сравнению с овоцитами за счет большего количества хроматина. Периферические клетки тельца Мелиса проявляют бромфенолофилию сильнее, чем центральные клетки, что демонстрирует выраженнуюбелковую секрецию. Стенки матки окрашиваются БФС интенсивно, особенно базальная часть. Большое количество белков определяется в яйцах начальных отделов матки и оотипа. Интенсивность окрашивания скорлупы яиц от тёмно-синего до голубовато-синего окраса, по мере продвижения яиц в матке снижается и становится жёлтой.

2.2.3.2. Гистохимические исследования тканей тегумента, пищеварительной системы, паренхимы и половой системы трематодпосле воздействия антигельминтиковпоказали большую разницу реактивности тканей F.hepatica, F.gigantica,P.cervi и D.lanceatum. Гистохимические реакции демонстрируют нарушение обменных процессов, которые в первую очередь, связаны с углеводами,проявляющиеся с одной стороны, в исчезновении гликогена в паренхиме и мышцах, а с другой – в увеличении количества ГАГ в наружном тегументе и в апикальной части кишечного эпителия. Последствием этих нарушений является углеводная дистрофия и тканевая декомпозиция.Извращённая гистохимическая реактивность тканей и органов трематод при окраске на белки подчёркивает дегенерацию ядерных структур, несостоятельность белкового обмена.Последнее доказывается снижением реакции с БФС и извращенном окрашивании тканевых структур трематод.

Наиболее отрицательное альционофильное окрашивание наблюдается после воздействия тегалидом на F. hepaticaиP. cervi, а также тетраксихолом на F. giganticaи P. cervi. Антигельминтики димезол, триклабендазол, политрем, антитрем, тетраксихол,тегалид, фаскоцид в тегументе, кишечнике и паренхиме трематод вызывают уменьшение распределения углеводов, оказывая угнетающее воздействие на углеводный обмен. Тегалид, антитрем, политрем и тетраксихол видоизменяют полимерную структуру сохранившегося гликогена в тканях F. hepaticaи P. cervi, который определяется в виде атипично окрашенной расплавленной массы. Резко уменьшается содержание гликогена в паренхиме и мышечных структурах присосок и фаринксаD. lanceatumпосле воздействия фаскоцидом (табл. 2). Увеличение содержания Шик-положительных веществ и смещение окраски в сторону цвета зелёно-синей гаммы с БФС: в кишечном эпителии, желточниках и семенниках P. сerviив паренхиме вокруг органов половой системы и стенке матки F. hepatica после воздействия антитремом; в паренхиме вокруг органов половой системы и желточникахF. hepatica после тегалида; в яичникеF. hepatica после триклабендазоласвидетельствует о том, что токсичность препаратов влияет на дезорганизациюуглеводно-белковых комплексов с освобождением углеводного компонента. Прокрашивание скорлупы яиц, особенно, у F. hepatica после воздействия бензимидазолов и тегалида указывает на её повышенную проницаемость. Влияние антигельминтиков на F. hepatica,F. gigantica,P. cerviиD. lanceatum выражается уменьшением или исчезновением метахромазии хромотропных структур, что указывает на снижение в тканях гельминтов ГАГ или нарушении их структурной организации.


Таблица 2

Распределение углеводов и белков в тканях и органах дикроцелий

 до и после воздействия антигельминтика фаскоцида

 

Ткань, орган

До воздействия фаскоцида

После воздействия фаскоцида

 

 

Шик-реакция

БФС

Шик-реакция

БФС

Тегумент

Дистальная часть

++

зелёное

+++

+

ярко-синие

++

Проксимальная

часть

+++

МЗГ

синие

+++

+

синие

++

Присоски

+++±

ГГ

синие

++++

+++

сине-зелёное

++

Паренхима

Кортикальной зоны

+++

КГГ

зелёно-синие

+++

+

ВПК

сине-зелёное

+

Вокруг органов половой системы

+++++

КГГ

зелёно-синие

+++

++±

ВПК

синие

+

Кишечник

Апикальная часть эпителия

++

сине-зелёное

+++

+

зелёное

+

Базальная часть эпителия

+++

МЗГ

сине-зелёное

+++

+

зелёное

++

Базальные мембраны

+++

тёмно-сине-зелёное

++++

++

зелёное

++

Женская

Яичник

+++

МЗГ

сине-зелёное

++++

±

тёмно-зелёное

+

половая

Стенка матки

+++

МЗГ

сине-зелёное

++

+

синие

+

система

Скорлупа яиц

-

-

зелёное

+

Содержимое яиц

++++

МЗГ

сине-зелёное

++

++

тёмно-зелёное

+

Желточники

+

МЗГ

синие

+++

++

зелёное

+

Тельце Мелиса

++

зелёно-синие

++++

зелёное

+

Мужская

Семенники

+++

ГГ

сине-зелёное

++++

+

зелёно-синие

+

половая

Семенной пузырёк

++++

синие

++

++

сине-зелёное

+

система

Простатическая железа

++

синие

+++

+

сине-зелёное

+

Примечание к таблице: + (плюс) – положительная реакция; - (минус) – отрицательная реакция; + – небольшое содержание углеводов и белков (следы компонентов); ++ – умеренное их содержание; +++ – сравнительно большое их содержание; ++++ – высокая концентрация веществ; +++++ – максимальное. Шик-реакция – окраска на гликоген и мукопротеины; БФС – окраска на суммарные белки; МЗГ – мелкие зёрна гликогена; ГГ – гранулы гликогена; КГГ – крупные гранулы гликогена; ВПК – видоизменённый полисахаридный компонент.

2.2.4.МИКРОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭНДОСТАЦИИ ХОЗЯИНА ПРИ ПАРАЗИТИРОВАНИИ PARAMPHISTOMUMCERVIПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ

Паразит обитает внутри организма хозяина и трофически зависим от него. Совместное существование выгодно только паразиту, тогда как хозяину его присутствие может приносить вред (Всеволодов Б.П., 1971). Паразит может существовать с хозяином, не причиняя ему серьезного вреда, обеспечивая собственное будущее в среде I порядка. Согласно занимаемой эндостации, трематоды обладают разнообразными приспособлениями. В системе «паразит-хозяин» на первое место выступают коэволюционные взаимоотношения. Оба партнёра обладают сохраняющими реакциями, которые обеспечивают устойчивость паразитарной системы, способной к авторегуляторным процессам, защищающих, как хозяина, так и паразита, обеспечивая установление динамически стабильных взаимоотношений. Паразит и хозяин, взаимодействуют как две биологические системы, деятельность морфологических структур которых направлена на формирование гомеокинеза каждого при гомеорезисе в целом системы «паразит-хозяин» в условиях относительного антагонизма.Установлено, что взаимоотношения между паразитом и хозяином осуществляются с помощью адгезивных процессов, в которых участвует ксенопаразитарный барьер (Додонов М.В., 2007).

2.2.4.1. Микроморфологические и гистохимические исследования тонкой кишки овец при парамфистомозепоказали, что P.cervi, паразитирующие в кишечнике овец, вызывают патоморфологические изменения, представленные атипичным воспалением. Складки, ворсинки и крипты кишечника при макроскопическом осмотре имеют обычный вид, среди них расположены парамфистомы, которые повторяют форму ворсинки, что указывает на явление конгруэнтности трематод, которая, будучи адаптивным компонентом паразитирования в данной эндостации, не расценивается как чужеродное, а способствует снижению напряженности конфликта между паразитом и хозяином. Морфофункциональные видоизменения эпителиального слоя ворсинок кишечника хозяина выполняют роль ксеногостального барьера, проявляющиеся:дегенеративно-дистрофическими и пролиферативно-метапластическими процессами эпителия ворсинок; образованием слоя молодой соединительной ткани с клеточными элементами; начальными стадиями формирования фиброза.Обнаруживается набухание эпителия ворсинок и крипт, его вакуолизация и зернистая дистрофия. В соединительнотканной основе слизистой оболочки кишечника выявляютсявыраженные признаки воспалительного процесса:отёчность, круглоклеточная инфильтрация, расширение сосудов микроциркулярного звена. Местами выявляется пролиферация эпителиального пласта слизистой оболочки, наблюдается гиперплазия эпителия, в некоторых случаях переходящая в метаплазию. В основном веществе ворсинки наблюдается небольшое количество эозинофилов, гранулы которых по Маллори окрашиваются в ярко-оранжевый цвет. Эозинофильная реакция является защитным механизмом организма хозяина на внедрение P.cervi в кишечник хозяина.

При гистологических и гистохимических исследованиях кишечника овец при парамфистомозе удалось выявить адгезию. Между парамфистомами и эпителием слизистой оболочки кишечника наблюдается образование плотного контакта в разных вариантах адгезии, что связано с различной локализацией паразита в эндостации хозяина: 1) с присасыванием гельминта задней присоской к листовидной ворсинке; 2) с взаимодействием тегумента паразита с поверхностью эпителиального слоя пальцевидной ворсинки. Установлены разные морфофизиологические особенности адгезии, которые зависят от степени взаимосодействия паразита с хозяином. Трансэпителиальная, поверхностная адгезия–сближение паразита с тканью хозяина на уровне гликокаликсного слоя, с проявлением альцианофилии, метахромазии, бромфенолофилиии положительной Шик-реакции.Интрафибриллярная тканевая интерференция–глубокая адгезия, при которой наблюдается срастание соединительнотканных волокон тегумента парамфистом с тканью стенки кишечника хозяина. При таком контакте, открепление тела гельминта от ворсинки сопровождается отслоением эпителиальной выстилки кишечника с последующей её десквамацией и прилипанием к тегументу паразита. Слабо выраженные альцианофилия, метахромазия, фуксинофилия и тотальное окрашивание БФС указывают на перемешивание фибриллярных белков тегумента парамфистом с тканью эндостации.Установленные виды адгезии являются морфологическими и гистохимическими отражениями стадий формирования паразито-хозяинной системы, обеспечивающей генез самой паразитарной системы на уровне «парамфистома-кишечник хозяина».

2.2.4.2. Микроморфологические и гистохимические исследования тонкой кишки овец при парамфистомозе после химиотерапии антигельминтикамипоказали, что введениеантигельминтиков усугубляет патологические процессы, вызванные инвазией парамфистом, что приводит к развитию некробиотических очагов в стенке кишечника хозяина. Возрастает пролиферация клеток эпителия ворсинок и крипт слизистой оболочки с усилением и видоизменением эозинофильной пролиферациив паразитарной ниши, за счёт миграции эозинофилов в ткань, где осуществляется их патогенное воздействие. При воздействии антитремом в строме ворсинок преобладают эозинофилы в большей степени, чем при воздействии тегалидом. В дезорганизованной соединительной ткани гистохимически выявляютсяочаги мукоидного (после воздействия тегалида) и фибриноидного (после воздействия антитрема) набухания. После химиотерапиитегалидом и антитремомв стенке кишечника овец наблюдается усиление дистрофических процессов, преобладание воспаления альтеративно-пролиферативного характера с десквамацией эпителия, некробиозом и фиброзом. Несмотря на то, что установлена эффективность воздействия препаратов на парамфистом, они оказывают токсикогенное влияние и на ткани хозяина, которое наиболее выражено после воздействия антитрема.Считаем, что в дальнейшем целесообразно разработать новые схемы комбинированого лечения, которые будут обеспечивать более высокий терапевтический эффект.

2.2.5. КОНЦЕПЦИЯ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО И ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА КАК ОЦЕНКА ТРЕМАТОДОЦИДНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ

(Заключительное обсуждение)

Вопросы патоморфологии и гистохимии как до, так и после воздействия антигельминтиков разного генеза на органы и ткани гельминта и его хозяина обеспечивают раскрытие новых особенностей механизмов воздействия препаратов и направлению поиска к синтезу антигельминтиков с усовершенствованными их качествами. Установление признаков гистохимической реактивности тканевых систем трематод и хозяина обосновывает тонкие механизмы взаимодействия в системе «паразит-хозяин» до и после воздействия антигельминтиков.

2.2.5.1. Патоморфологические исследования органов и тканей паразита и хозяина как критерии оценки противотрематодоцидной эффективности антигельминтиков следует проводить при сравнении патологии органов всех систем трематод, взаимозависимость от степени их морфофункциональной дегенерации, чтобы сделать вывод о несостоятельности или возможностигельминта к функционированию в организме хозяина после химиотерапии.

Наши исследования показали, что в результате интоксикации после воздействия антигельминтиков в организме трематод происходит нарушение водно-электролитного и белкового обмена, что приводит к изменению коллоидно-осмотического давления и развитию гидропической дистрофии тканей гельминтов. Накопление воды вызывает набухание, расплавление и вакуолизацию тканевых и клеточных структур, выраженный отёк. Всё это приводит кколликвационному некрозу и прекращению функции органа.

Отёк тканевых структур трематод – один из важнейших показателей повреждения, который указывает на проницаемость покровов трематод, а также пониженную тоничность в эндостации. Избыток межтканевой жидкости приводит к развитию водной интоксикации в организме паразита. В результате этого резко нарушается мембранный водно-электролитный транспорт, следствием чего происходит набухание клеток и отёк тканей. Проникновение лекарственных препаратов в организм паразитов связывают с химической структурой соединения, концентрацией препарата, поверхностью паразита, а также физико-химическими свойствами его окружающейсреды (AlvarezL.I., MottierM.L.,LanusseE., 2004). Тегумент и кишечник имеют непосредственную связь с компонентами эндостации хозяина, как органы эктосоматического блока (Начева Л.В., 1985, 1993). Все антигельминтики внедряются в организм трематод в большем количестве через тегумент и в меньшем – через ротовое отверстие гельминта и об этой избирательной проницаемости писали ранее (Ханбегян Р.А., 1971) и данные автора совпадают с нашими наблюдениями.Разрушение тегумента и кишечного эпителия трематод, как мультифункциональных органов (Начева Л.В., 1985), обеспечивающих динамическую стабилизацию гельминта, способствует усилению токсикогенного влияния и проникновения антигельминтика в организм паразита. Выраженная атрофия микроворсинок апикальной части кишечного эпителия трематод после воздействия антигельминтиков приводит к нарушению процессов всасывания и подтверждает высокую степень проникновения препарата и через пищеварительную систему трематод. Дегенерация кишечника и прекращение трофики гельминта способствует его гибели.

Ткань внутренней среды трематод назвали органом мезосоматического блока(Начева Л.В., 1993). Паренхима, выполняя в организме паразита роль транспорта и обезвреживания веществ в норме, после воздействия антигельминтиков перестает участвовать в этих процессах. Разрушение паренхимы повышает токсические свойства антигельминтика, которые усугубляются влиянием продуктов распада тканей гельминта. Патологические изменения в паренхиме, удваивают токсическое воздействие на органы репродуктивной системы, в результате чего происходит нарушение их цитоархитектоники и прекращение развития половых гамет.

Органы половой системы, сохраняющие и обеспечивающие процесс паразитирования трематод за счёт продукции новой генерации половых клеток, оплодотворения и развития яиц и личинок, были отнесены исследователями к энтосоматическому блоку (Гребенщиков В.М., 1984; Начева Л.В., 1992; Гребенщиков В.М., Начева Л.В., 2008).

Раскрыты морфофункциональные механизмы развития патологических процессов, происходящих в организме трематод при воздействии антигельминтиков.Наблюдаемая пролиферация ядер дистальной части тегумента и базальной эпителия кишечника после воздействия тегалида морфологически подтверждает патологию клеточного ядра, происходящие изменения его функционального состояния. Увеличение содержания нуклеиновых кислот подтверждается возрастанием базофильности кариоплазмы. После антитрема в тегументе и кишечнике выявляется большое количество ядер, сохраняющих контур границ, но прозрачным содержимым, что указывает на разрушение генетического материала трематод в жизненно важных структурах.

После воздействия тегалида и антитрема морфологические изменения однотипных морфофункциональных процессов (декомпозиция, дезорганизация и др.) в организме F. hepatica и P. cervi проявляются специфично.Воздействие антитрема на ткани F. hepatica и P. cervi проявляется более сильным набуханием и лизисом их структур, развитием некроза (рис. 3, 4), что после тегалида, особенно в тканях парамфистом, не наблюдалось.Это связано не только с тем, что трематоды разной видовой принадлежности, но и с тем, что они занимают в организме хозяина разные паразитарные ниши – эндостации.

Таблица 3

Морфофункциональные изменения в органах и тканях

F.hepatica и P.cervi после воздействия антитремом

Патологический

процесс

Органы

Тегумент

Кишечник

Паренхима

F.hepatica

P.cervi

F.hepatica

P.cervi

F.hepatica

P.cervi

Дистрофия

гидропическая

+++

++

++

++

+++

++

углеводная

+++

+++

+++

+++

+++

+++

белковая

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Аутолиз (лизис, расплавление)

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Базофилия ткани

+++

++

+++

++

+++

++

Деструкция

+++

++

+++

++

+++

++

Дезорганизация

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Декомпозиция

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Некробиоз

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Некроз

++±

+

+++

++

+++

++

 

Примечание к таблицам 3, 4: + (плюс) – положительная реакция; – (минус) – отрицательная реакция; + – патологическая картина с незначительными морфофункциональными изменениями после воздействия антигельминтика; ++ – выраженные морфофункциональные изменения; +++ – необратимые процессы патогенеза; ± – процессы с разной степенью проявления.

Таблица 4

Морфофункциональные изменения ядер тегумента и кишечного эпителия

F.hepatica и P.cervi после воздействия антитремом

Патологический процесс

Ядро

F.hepatica

P.cervi

Базофилия

+++

Пролиферация

только в эпителии

+

Пикноз

+++

Лизис

+++

+++

Антигельминтики (триклабендазол, димезол, политрем, тетраксихол, фаскоцид) проявляют высокую степень эффективности, что подтверждается морфофункциональными изменениями с необратимыми явлениями в органах и тканях трематод.В исходе необратимые некротические изменения тканей после воздействия тегалида, антитрема и тетраксихола отмечаются значительнее в организме фасциол, чем парамфистом при сравнении. Фаскоцид же обладает выраженным воздействием на тканевые системы дикроцелий. Нарушение белкового и углеводного обмена с перераспределением и накоплением компонентов в тканях трематод кислого характера, приводящее в исходе к необратимым процессам некробиоза и некроза тканей и органов трематод, подтверждает сильную степень фасциоло-парамфистомоцидного и дикроцелиоцидного воздействия антигельминтиков.

Таким образом, патоморфологический контроль включает в себя разные патоморфологические критерии оценки эффективности воздействия антигельминтиков, которые необходимо учитывать для подтверждения трематодоцидных свойств препаратов.

2.2.5.2. Гистохимический анализ тканей трематод после воздействия антигельминтиковпоказал снижение степени окраскиорганов и тканей F.hepatica,F.gigantica,PerviиD.lanceatum при реакциях с АС, ТС, БФС и Шик-реакции, что подтверждало нарушение физиологического состояния трематод. У трематод в тегументе и кишечнике, находящихся на границе раздела фаз «паразит-хозяин», выявлено наличие мукополисахаридов – поверхностно-активных веществ, при увеличении или уменьшении которых соответственно меняется поверхностное натяжение поверхностей клеточных структур тегумента и кишечника, что обуславливает развитие патологического процесса, как внутри клеток, так и тканей трематод. Антигельминтики являются катионными детергентами, которые, попадая в организм трематод, образуют с полианионами мукополисахаридов поверхностно-неактивные соединения, проникающие вовнутрь тканевых (тегумент, кишечник) и клеточных структур тела паразита, то есть в глубину внутриклеточного раствора, способствуя развитию патологического процесса.

Адсорбируясь изначально на поверхности тела гельминта, антигельминтики, блокируют мукополисахаридный слой гликокаликсатегумента. Этот компонент влияет на свойства клеточной поверхности - всасывание, иммунологическое поведение, адгезивные силы, выполняет барьерную функцию в сложившейся системе «паразит-хозяин» (PolicardA., 1975; GabrionC., GabrionJ., 1976; ThreadgoldL.T., BefusA.D., 1977; Перминов А.А., Воробьёва Е.И., 1995; Ястребов М.В., 1996). Нарушение антигельминтиками тинкториальных свойств втегументе и кишечном эпителии трематод подтверждается ослаблением окрашивания тканевых структур АС. Возрастание степени интенсивности положительнойШик-реакции свидетельствует об увеличении полисахаридов. Вопрос о перестройке белково-углеводных комплексов после воздействия антигельминтных препаратов, обсуждался в работах исследователей (Кошкина Н.Г., 1984).О блокировке гликолитических путей антигельминтиками упоминалось в работах ранее на примере фасциол (СенутайтеЯ.Ю., 1970), но это были биохимические исследования. Увеличение или уменьшение окраски тканей трематод ТС после воздействия антигельминтиков указывает на снижение или усиление кислотности среды, что регулируется степенью концентрации ГАГ. Это связано с воздействием антигельминтика на изменение метаболизма паразита. Муцины, выявляемые в норме в больших количествах в тегументе и кишечном эпителии трематод (BjorkmanN., ThorsellW., LiemertE., 1963; Резник Г.Н.,1972; Начева Л.В., 1975) придают пограничным структурам влажность и эластичность, предохраняя органы от воздействия протеолитических ферментов, к которымони устойчивы (ThreadgoldL.T., 1963). Антигельминтики значительно уменьшают содержание муциноподобных веществ, нарушая избирательную проницаемость тканей и ослабляя защитные свойства тегумента и кишечника.Наличие сульфатированных мукополисахаридов в тегументе трематод подтверждает избирательную проницаемостьпокровной ткани трематод и её взаимозависимостьне только с обменными процессами самого паразита, но и с метаболизмом хозяина. Выявление ГАГ в эпителии матки, желточниках и яйцах у F. hepatica и P. cervi после воздействия триклабендазолом, тегалидом и антитремом в большем количестве, чем при норме, а также у D. lanceatum после фаскоцида, доказывает повышениесекреторной активности органов и их защитной – главной функции ГАГ, выступающих в роли ксеногостального барьера. Аналогичная картина описана на примере других видов трематод (Гребенщиков В.М., 1984; Начева Л.В., 1993).

После воздействия антигельминтиков у трематод в тканевых структурах всех органов происходило изменение природы белкового компонента, перераспределение его функциональных групп, о чём свидетельствовало извращённое окрашивание БФС. Воздействие димезола уF. hepatica, а также тегалида у F. hepatica и P. cervi смещало белковое равновесие в сторону белков основной природы. Политрем у F. gigantica и фаскоцид у D. lanceatum вызывали перераспределение в сторону кислых белков. Преобладание зелёно-синего цвета в реакции с БФС проявлялось в тканях после воздействия антитрема уF. hepatica и P. cervi, а также тетраксихола уF. gigantica, что указывает на большее количество мукополисахаридов. Воздействие триклабендазола, антитрема и тегалида на F. hepatica, а также политрема и тетраксихола на F. gigantica и тетраксихола на P. cervi приводило к наличию нехарактерного,коричневого и болотного окрашивания тканевого субстрата. Триклабендазол и политрем вызывали атипичное окрашивание, как со стороны тегумента, так и кишечника,а тетраксихол, тегалид и антитрем только со стороны тегумента. Именно это подтверждает их неидентичный механизм проникновения в организм трематод, изменение физико-химических и морфологических свойств белков в организме гельминтов, синтез аномальных белково-полисахаридных комплексов.

Тетраксихол, в составе которого содержится битионол, как в организмеF. gigantica, так иP. cervi вызывал сильное изменение в белковом обмене, нарушая структуру белкового компонента, а значит и ферментных систем.Об ингибирующем влиянии битионола на ферментные системы фасциол указывалось ранее (Бенедиктов И.И., 1982). Антигельминтики, вступая в реакцию с доступными функциональными группами биополимера, блокируют взаимодействие с красителями. При достаточно высокой концентрации белка в отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование хлопьевидного осадка. Результаты наших исследований подтверждают этот механизм воздействия. Окрашивание тканей трематод БФС на белки выявляет наличие хлопьевидной массы коагулирующего белкового компонента, выпадающего в виде осадка в большом количестве после воздействия тегалидом и антитремом у F. hepatica, политремом и тетраксихолом у F. gigantica, фаскоцидом у D. lanceatum, а также антитремом и тетраксихолом уP. сervi. Особенно демонстративной и показательной картина была после воздействия хлорированных углеводородов, содержащих в химической структуре наибольшее число атомов хлора и меньше полярных групп. Наименьшее количество денатурирующего белкового компонента в тканях отмечалось у F. hepatica после воздействия димезолом – антигельминтика, не содержащего ни одной из вышеперечисленных функциональных группировок.

Антигельминтики являются типичными алкиляторами, полярные органические молекулыкоторых с различной структурой эффективно угнетают активность ферментов (Бенедиктов И.И., 1982). Обязательным структурным требованием к неспецифическим ингибиторам ферментов является наличие полярной группировки (–С=О или –ОН), т.к. механизм воздействия обусловлен адсорбцией ингибитора на границе контакта гидрофобной площадки фермента с полярной фазой. Антигельминтик как электролит, вызывает коагуляцию биополимеров, поэтому чем больше в своей структуре содержит ионогенных групп, тем сильней эффект его воздействия. Катион-антигельминтики, образуя прочные связи с карбоксил-анионами субстрата тканей вызывают разрывы ионных связей (Переверзева Е.И., 1994). Снижение электрической поляризации белка уменьшает его растворимость. Вследствие этого, находящийся в растворе белок, коагулируя, выпадает в осадок. Что наиболее часто обнаруживалось нами в тканях трематод (Начева Л.В., Бибик О.И., 2006).Большинство антигельминтиков относится к дифильным соединениям, их молекулы включают два центра, один из которых способен к ионизации в водных средах, а другой образует гидрофобные связи.

При разрушении белково-углеводных комплексов, происходит освобождение анионных центров, которые задерживают антигельминтики – катионные молекулы, образуя комплексы.Поэтому, мы считаем, что при взаимодействии в системах «антигельминтик-полимер ткани», с одной стороны, могут образовываться солевые связи между антигельминтиком и карбоксиланионами поликислот, которыми и являются ГАГ ткани паразита, а с другой стороны, молекулы препарата могут связываться с основной цепью белково-углеводного комплекса благодаря неполярным взаимодействиям.

Положительной стороной гистохимического изучения механизмов воздействия антигельминтиков и их производных является то, что помимо выявления точек приложения испытуемых препаратов появляется возможность раскрытия связи антигельминтного воздействия с их молекулярной структурой и определения роли функциональных групп в формировании ингибирующего эффекта. Установлено, что изменение химической структуры фасциолоцидов влияет на избирательную токсичность: антигельминтики с карбоциклическим строением активнее ациклических; разделение фенольных колец у производных дифенилов метиленовой группой и в большей степени серой и еще больше окисленной, уменьшают фасциолоцидную эффективность; с увеличением атомов хлора в соединении возрастает эффективность препарата(Ханбегян Р.А., 1977).

В своих исследованиях И.И. Бенедиктов доказал, что антигельминтики, относящиеся к производным замещённых фенолов, бензимидазолов и салициланилидов, в которых присутствуют группы с диссоциирующим протоном, проявляют свойства типичных разобщителей окислительного фосфорилирования динитрофенольного типа. Введение в состав молекулы ингибитора-антигельминтика возрастающего числа атомов галогена приводит к усилению тормозящего воздействия соединений, т.е. ингибирующего влияния соединения на ферментные системы гельминта. При этом природа галогена практически не сказывалась на эффекте торможения – препараты, содержащие атомы брома (Br), проявляли себя аналогично соединениям, содержащим атомы хлора (Cl). Включение в сульфидный мостик (–S–) атомов кислорода (–S=O) снижает эффективность тормозящего воздействия препаратов на ферментные системы трематоды. При изучении производных бензимидазола для проявления ингибирующего воздействия необходимы замещения в фенильном кольце производных 2-фенилбензимидазола. Включение у 2-го углеродного атома фенила атомов хлора и брома, аминогруппы и гидроксила приводит к выраженному тормозящему эффекту на ферментативную активность митохондрий гельминта(Бенедиктов И.И., 1982).

Гистохимически установлено, что все антигельминтики вызывали структурные изменения в тканях тегумента, паренхимы, пищеварительной и половой систем трематод, которые выражались дистрофиями разного генеза: 1) декомпозицией – наблюдалась деструкция углеводно-белковых комплексов, с высвобождением и накоплением белков или углеводов; 2) инфильтрацией (дистрофия количественного характера) – отмечалось накопление белков и углеводов; 3) извращённым синтезом (дистрофия качественного характера) на уровне белков. Гистохимическая гиперплазия характеризовалась увеличением количества белков хлопьевидной формы, что проявлялось при БФС окрашивании и указывало на нарушение внутриклеточного транспорта продуктов метаболизма. Выявляемый некробиоз тканей трематод подтверждал необратимые дистрофические изменения на уровне нарушения углеводного и белкового обменов. Исчезновение гликогена после воздействия антигельминтика, указывает на преобладание в тканях трематод катаболических реакций над анаболическими, а значит, происходит нарушение биохимических путей синтеза жизненно важных веществ.

Таким образом, воздействие антигельминтиков на органы и ткани F.hepatica, F.gigantica, P.cervi и D.lanceatumвыражалось постепенными изменениями: 1) деформацией, вакуолизацией, отечностью, атрофией и фокальным некрозом тегумента и кишечного эпителия; 2) набуханием, углеводно-белковой инфильтрацией всех соединительнотканных волокон с очагами их лизиса; 3) обезвоживанием ткани внутренней среды с явлениями инфильтрации ее волокон, исчезновением гликогена как запасного питательного материала, частичными некротическими явлениями; 4) декомпозицией половых желез, инфильтрацией их клеток и волокон углеводами, извращенным синтезом белков, разрушением цитофоров и распадом клонов, их смешиванием, с участками коагуляционного некроза; 5) разрушением зрелых яиц и морфофункциональных блоков их формирования, нарастающей дистрофией желточников с распадом желточных клеток, их декомпозицией и склеротизацией гранул; 6) извращённым и нарастающим снижением окрашивания тканей при реакциях толуидиновым, бромфеноловым и альциановым синим, Шик-реакцией, что свидетельствовало о белково-углеводных дистрофиях.

Однозначно, что степень воздействия антигельминтика на органы и ткани трематод, определяется химической структурой препарата и является процессом, сопровождаемым определенной морфологической перестройкой, в основе, которой лежат тонкие изменения внутриклеточного метаболизма.

Таким образом, гистохимический анализ тканевой реактивности необходимо использовать как критерии эффективности воздействия антигельминтиков при трематодозах.

2.2.5.3. Микроморфологические особенности взаимоотношения в системе «паразит-хозяин» на примере паразитирования парамфистом в кишечнике овец до и после воздействия антигельминтиков.

При изучении биологических основ патогенеза гельминтозов, показано, что взаимоотношения гельминтов с органами и тканями хозяина, их механическое и токсическое воздействие, равно, как и реакции со стороны хозяина, являются причиной и основной сутью гельминтологического процесса (Шульц Р.С., Гвоздев Е.В., 1976). С точки же зрения функциональной морфологии для установления эффективности воздействия антигельминтиков на трематод необходимо рассматривать взаимоотношения между паразитом и хозяином с учётом системного анализа.

Адаптивные реакции эндостаций паразита, динамика ксенопаразитарных барьеров и специфика их формирования, зависят от локализации трематод в среде первого порядка. Коэволюционный подходк изучению взаимоотношений в системе «паразит-хозяин» был использован многими авторами (НачеваЛ.В., ВоробьёваЕ.И., 1990; Воробьёва Е.И. 1992; Штейнпрейс Т.А. , 2000; Перминов А.А., 2000; Додонов М.В., 2007). Отмечалась способность хозяина к сохраняющим морфологическим и физиологическим реакциям, позволяющим достичь определённой степенистабилизации системы, повышающейеё жизнеспособность. Было установлено, что формирование систем «трематода-млекопитающее» характеризуется преобладанием пролиферативно-диспластических процессов в эндостации среды первого порядка, а формирование и специфика ксенопаразитарного барьера определяется, как механизмом паразитирования, так и особенностями реактивности тканей хозяина(Воробьёва Е.И., 1992;Воробьёва Е.И., Начева Л.В., 1994; Начева Л.В., Воробьёва Е.И., 2007).

Несомненно, воздействие антигельминтиков на трематод связано с эндостацией паразита, в которой между хозяином и гельминтом складываются определенные трофические связи, и что важной причиной в снижении напряжённости конфликта между паразитом и хозяином является эволюционно сложившаяся адаптация паразита. Она выражается в мимикрии формы гельминта, способностью к межгельминтной адгезии, антигенной близостью паразита к окружающей ткани хозяина, что рассматривалось в исследованиях других учёных (Березанцев Ю.А., 1964; Перминов А.А., 2000).

Возникновение ксенопаразитарного барьера, а в настоящее время называемого ксеногостальным (Воробьёва Е.И., Начева Л.В., Штейнпрейс Т.А. и др., 2008), является необходимым морфофункциональным звеном, не только объединяющим, но и разъединяющим генетически неоднородные организмы. Ксенопаразитарный барьер является важной особенностью формирования гомеореза биологической системы «паразит-хозяин» с относительным физиологическим равновесием, как состоявшейся системы с взаимосохраняющейся динамической стабилизацией (Додонов М.В., Начева Л.В., 2007) и энергетическим балансом, обеспечивающим обмен веществ обоих партнеров в процессе их сосуществования.

В наших исследованиях выявляется локализация паразитов в слизистой оболочке кишки овец, спонтанно заражённых парамфистомами. Слизистая оболочка кишки овец выглядит резко утолщённой. P.cervi, располагаются на верхушках кишечных ворсин листовидной формы, при этом находясь между пальцевидными ворсинами, что создает условия для наилучшего контакта между паразитом и хозяином. При расположении между ворсинками трематоды приобретают удлиненную форму, приспосабливаясь к очертаниям ворсинок, на которых они паразитируют. Несмотря на конгруэнтность, т.е. соответствие формы паразита, занимаемой им ниши, плотный контакт P.cervi с тканью хозяина происходит не через тегументтела, а через заднюю присоску гельминта. Чётко выявляются адгезивные взаимодействия на уровне системы «Pervi-слизистая оболочка кишечника овцы». За счет такого контакта и прикрепления парамфистомы обладают двоякой диманичностью: седентарным характером (прикреплением задней частью) и относительной подвижностью передней части. В то же время такой способ существования дает возможность парамфистомам осуществлять пофазное перемещение за счет прикрепления фаринкса к ворсинке и открепления задней присоски, а затем возвращение в первоначальное состояние, но на другом участке кишечника.

Адгезию в морфофункциональном комплексе «тегумент-эпителиальная ткань ворсинки кишечника» при парамфистомозе овец рассматриваем как показатель зрелости взаимных отношений паразита и хозяина. При этом, взаимодействие обнаруживается на уровне контакта двух гликокаликсных слоёв – тегумента P.cervi и поверхности эпителиальных клеток ворсинок кишечника хозяина. При глубокой адгезии отмечается гистологическое и гистохимическое единство участков контакта паразита и хозяина, которое проявляется как при окрашивании гематоксилин-эозином, так и при Шик-реакции, АС, ТС, БФС. Происходитсмешивание биохимического состава тегумента трематод и ткани эндостации хозяина, участвующих в адгезивном процессе.Эти данные свидетельствуют, что в системе «паразит-хозяин» складываются гомеорезисные взаимоотношения, то есть паразитарная система состоялась. Изменение гистохимических параметров в зоне контактирующего участка паразитов с тканью хозяина имеет подтверждение в исследованиях других учёных на различных видах(AggarwalA., NashT.E., 1988; CapronA., DessaintI.P., 1989; DamianR.J., 1989; Начева Л.В., Штейнпрейс Т.А., 1995; Начева Л.В., Воробьёва Е.И., 1996).

Анализ литературных источников и результатов собственных исследований позволяют говорить о том, что при спонтанных трематодозах, адаптивные процессы, конфликтные и компенсаторные реакции имеют как стереотипный характер, так и дифференциальные особенности во взаимодействиях партнёров бинарной системы.

Патоморфологические проявления парамфистомоза разрешают охарактеризовать тканевую реактивность хозяина как биологически относительно целесообразный комплекс адаптивных реакций, направленных на установление длительных стабильных и относительно бесконфликтных отношений с паразитом. Тканевая реактивность хозяина как эндостация обитания паразита имеет ряд общих признаков: 1) длительное динамическое течение; 2) преобладание в среде 1-го порядка реакций пролиферативного плана; 3) изменения в ретикуло-эндотелиальной системе; 4) пролиферация соединительной ткани; 5) гиперплазия лимфоидной ткани; 6) активация камбиальных тканевых элементов; 7) сохраняющая реакция вокруг гельминта; 8) гранулематозные процессы в ответ на выделение продуктов жизнедеятельности и гибель гельминтов (Воробьёва Е.И., 2006). А уплотнение и новообразование волокон соединительной ткани обеспечивает стабильность паразитов и снижает меру их воздействия на ткани хозяина (Начева Л.В., Воробьёва Е.И., 1990). Продуктивно-гиперпластическая активность, распространяясь на весь орган и затрагивая все его тканевые элементы, развивается и в исходе может привести к диффузному фиброзу.

Наши исследования показали, что подтверждением аллергического состояния при парамфистомозе овец являются: эозинофилия, гиперемия и тканевые отёки. Это согласуется с другими работами (Жариков И.С., Бобкова А.Ф., Орловский В.И., 1978; Найт Р., 1985; Озерецковская Н.Н., 2000). Патоморфологические изменения слизистой оболочки кишки овец при парамфистомозе характеризуются наличием альтеративных и пролиферативных явлений со стороны эпителия и собственной пластинки. Пролиферация, гиперплазия и метаплазия в эндостации паразита обеспечивают динамическую стабильность паразито-хозяинной системы, за счёт относительной изоляции парамфистом, их трофических связей, определяют клинико-морфологическую картину парамфистомоза, предопределяя прогноз данной патологии для хозяина. Пролиферативные процессы имеют многообразие проявлений, обнаруживающихся в эпителии слизистой оболочки кишечника, где они выражены гиперплазией и метаплазией, разрастанием соединительной ткани в строме ворсинок. Благодаря секреторной активности эпителия тонкого кишечника хозяина, паразит получает достаточное трофическое обеспечение.

Патоморфологические проявления в тонкой кишке овец при парамфистомозе и химиотерапии тегалидом и антитремом складываются из альтернативно-дистрофических и пролиферативных процессов. Максимально выражены процессы пролиферации с местами некробиоза. Функциональные нарушения пролиферативных эпителиальных элементов в наших исследованиях характеризуются снижением содержания углеводных соединений и застоем секреторного продукта клеток. Это свидетельствует в пользу тканевой дегенерации. Умеренная эксудативная реакция в слизистой и подслизистой оболочках проявляется субэпителиальным отёком ворсин и крипт, отёком волокон и периваскулярного пространства, лимфогистиоцитарной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки. Альтерация представлена истончением и обрывками ворсинок, растяжением крипт, десквамацией и дистрофией эпителия с функциональными нарушениями в нём. Эти процессы можно объяснить повышением токсических реакций на ткани хозяина. При введении антигельминтика в организм хозяина происходит нарушение гомеокинетического состояния каждого из биологических видов, составляющих данную бинарную систему, что приводит к дестабилизации и гомеоклазу, а далее к гибели системы и развитию заболевания с клиническими проявлениями, хотя паразит изгоняется из организма хозяина, но хозяин реагирует на разрушение коадаптивных взаимоотношений (Штейнпрейс Т.А., 2000;Начева Л.В., Додонов М.В., Воробьева Е.И., 2009).

Продукты метаболизма гельминтов способствуют изменению биоценоза кишечника и увеличению доли условно-патогенной и патогенной микрофлоры (Заяц Р.Г., Рачковская И.В., Карпов И.А., 2002). После химиотерапии антитремом в глубине кишечных крипт не наблюдалось содержание простейших. В тоже время, простейшие чётко обнаруживались нами до лечения в полости присосок самих гельминтов, что обеспечивает их трофику. Считается, что макроорганизм и его желудочно-кишечная микрофлора — единая экологическая система, находящаяся в динамическом равновесии (Асадуллина И.И., Галимова В.З., 2010). А так, как компенсаторные возможности организма весьма ограничены, то с этих позиций микрофлора пищеварительного тракта может выступать в качестве высокочувствительной индикаторной системы, которая реагирует своим составом на изменение клинического состояния животного связанного с отрицательным воздействием препарата на его кишечную микрофлору, что и отмечалось в наших исследованиях.

Тканевые реакции после воздействия антигельминтиков (тегалида и антитрема) в наших исследованиях представлены гиперемией и плазморрагией, которые приводят к инфильтрации, декомпозиции и дезорганизации соединительной ткани.Нарушение физико-химической и структурной организации соединительной ткани эндостации паразита выражалось мукоидным набуханием – перераспределением ГАГ. Последние обладают гидрофильными свойствами и накопление их способствует тканевой и сосудистой проницаемости. Деполимеризация ГАГ межуточного вещества с пропитыванием его белками плазмы крови приводит к набуханию ткани и повышению внутреннего давления. Это увеличивает фильтрацию жидкости из сосудов в ткани, где происходит её задержка. Поэтому мукоидное набухание с одной стороны способствует гидропической дистрофии, набуханию, отёку, результатом которого является колликвационный некроз. Аналогичное проявление процессов в механизме воздействия антигельминтика выявлялось у самого паразита. С другой стороны, мукоидное набухание переходит в фибриноидное, дальнейшее развитие которого приводит к фибриноидному некрозу, характеризующегося полной деструкцией ткани.Воздействие антитрема характеризуется наличием ворсинок, покрытых массивными пластами дегенеративного пролиферирующего эпителия. Такие утолщённые ворсинки имели боковые выросты, в виде аденоматозных образных структур. Наблюдался субэпителиальный отек, в результате которого кишечный эпителий ворсинок был отделен от стромы.Альцианофилия, толуидинофилия и Шик-реакция демонстрировали слабое проявление функциональной способности пролиферативных клеточных элементов, что свидетельствует в пользу дегенерации слоя кишечного эпителия, вызванной химиотерапией антигельминтиком.

Воспалительный процесс, вызываемый эозинофилией в строме ворсинок тонкого кишечника овец при парамфистомозе, подтверждает наличие паразитарной инвазии. Эозинофилы, мигрируя к месту эндостации хозяина, что вызвано наличием чужеродного белка, становятся «избирательно» цитотоксичными (Озерецковская Н.Н., 2000;Додонова М.В., 2007). К активации их цитотоксичности приводит наличие инородных организмов – паразитов, а значит, в организме хозяина эозинофилия выполняет защитную роль. Было отмечено, что при интенсивности заражения эозинофилоциты усиливают своё действие на паразита, уничтожая его. Продукты эозинофильной дегрануляции играют защитную роль, способствуя лизису тканевых паразитов, но, фиксируясь в тканях, эозинофилы начинают выделять ферменты, обладающие протеолитической активностью в отношении не только паразитов, но и нормальных тканей хозяина. Поэтому роль эозинофилии положительна лишь частично. Появление эозинофилов в ткани указывает на усиление воздействия этих зернистых гранулоцитов (Воробьева Е.И., Начева Л.В., Штейнпрейс Т.А. и др., 2008). Некоторые авторы указывают, что морфофункциональные механизмы эозинофилии при трематодозах обладают однотипностью и обеспечиваются рядом факторов, активирующих эозинофилоцитов на выброс гранул (Брылева А.В., Фролов А.В., Додонов М.В., 2008; Додонов М.В., Брылева А.В., Додонова Г.Х., 2009).

После химиотерапии антитремом в ворсинках наблюдалось скопление эозинофилов, оболочка клеток которых была сохранена, ядра некротизированы (пикнотичны), зернистые включения клеток лизировались под влиянием антитрема и цитоплазма клеток окрашивалась в оранжевый цвет по Маллори. Считаем, что влияние антигельминтика блокирует эозинофильный эффект воздействия на окружающие ткани хозяина, вызывая гибель эозинофилов. Это указывает на приоритетность и перспективность использования препарата на практике, основой для расширения области применения антитрема, блокирующего цитотоксичность эозинофилии, что благоприятно для тканей хозяина.Антитрем – синоним препарата циклодол из группы холинолитических средств, блокирующих мускариновые и никотиновые холинергические рецепторы. Опираясь на вышесказанное, мы предполагаем, что противопаразитарный эффект антитрема обусловлен воздействием на холинорецепторы скелетных мышц. Холинолитическое воздействие антитрема может проявляться в двух вариантах, как мускаринолитическом, так и никотинохолинолитическом. Мускаринолитическое воздействие антитрема выражается расслаблением гладкой мускулатуры эндостации, что является, как мы считаем, последствием угнетения нервно-мышечной передачи на уровне постсинаптической мембраны. На P. cervi антитрем оказывает никотинохолинолитическое воздействие, что проявляется в снижении тонуса и расслаблении поперечнополосатых мышечных структур органов фиксации и мышечных элементов кожно-мускульного мешка. Миорелаксантный эффект приводит к параличу мышечной системы паразита не позволяющий ему фиксироваться внутри полости тела хозяина. Воздействие на нервную систему паразита, приводит к угнетению метаболизма и нарушению окислительно-восстановительных реакций, вызывая его гибель. Данный эффект подтверждается при исследовании нами углеводного обмена гистохимическими методами.

Мы считаем, что определенный дуализм токсического воздействия происходит за счет усиленной диффузии после воздействия антигельминтиков, разрушающих защитные барьеры в системе «паразит-хозяин». Токсические вещества, образующиеся в результате распада паразита, проникают в организм хозяина беспрепятственно, так же как и антигены хозяина диффундируют в гельминта, усиливая его разрушение.

Результаты собственных исследований позволили нам выдвинуть концепцию патоморфологического контроля и гистохимической тканевой реактивности паразита и хозяина, которая раскрывает механизмы морфофункциональных взаимоотношений в процессе перехода системы «паразит-хозяин» из гомеорезистого состояния в гомеоклазисное и позволяет оценить эффективность воздействия антигельминтиков при трематодозах.

 

ВЫВОДЫ

1. Морфофункциональные изменения органов и тканей трематод указывают на высокую эффективность антигельминтиков: антитрема (в дозе 200 мг/кг по ДВ) и тегалида (30 мг/кг) на Fasciolahepatica, а также тетраксихола (200 мг/кг) на Paramphistomumcervi и фаскоцида (10 мг/кг) на Dicrocoeliumlanceatum при трематодозах крупного рогатого скота; политрема (в дозе 140 мг/кг по ДВ) и тетраксихола (200 мг/кг) на Fasciolagigantica, а также триклабендазола (10 мг/кг) и димезола (200 мг/кг) на F.hepatica, антитрема (200 мг/кг) и тегалида (30 мг/кг) P.cerviпри трематодозах овец.Степень воздействия препаратовна уровне клеток, тканей, органов и организма паразита и хозяина определяется химической структурой антигельминтика.

2. Установлено, что антигельминтики вызывают разный эффект развития некробиотических процессов в тканях пограничных органов трематод –тегументе и кишечнике:деструкцию и разрушение наружной части и вакуолизацию внутренней части с дезорганизацией цитонов тегумента; атрофию апикальной и базальной частей эпителия, пикноз и лизис ядер сохранившейся базальной части кишечника. Максимальную степень воздействия на тегумент трематод оказывают тетраксихол, политрем и антитрем, а на кишечник – тегалид и фаскоцид.

3. Все антигельминтики приводят к необратимым патологическим нарушениям ткани внутренней среды трематод с выраженным отёком, набуханием её клеточных и волокнистых структур. Наибольшие некротические явления в паренхиме выявляются вблизи тегумента и эпителия кишечника. Максимальная степень воздействия на ткань внутренней среды гельминтов обнаруживалась после тетраксихола, триклабендазола, тегалида и фаскоцида.

4. При патоморфологическом контроле органов и тканей трематод показано, что триклабендазол, антитрем и тегалид – препараты из разных химическим группам оказывают однотипное воздействие на внутреннюю часть тегумента и базальную часть кишечного эпителия, вызывая увеличение количества клеточных элементов – пролиферацию ядер, как усиление регенераторно-адаптивных реакций в условиях среды I порядка.

5. При гистохимическом анализе органов и тканей трематод после воздействия антигельминтиков выявлено: усиление извращённого окрашивания БФС демонстрирующего нарушение реализации белков; снижение Шик-реакции, что свидетельствует о блокировке синтеза углеводных компонентов; повышение альцианофилии в тегументе и кишечнике указывающей на возрастание защитных свойств гельминта.

Изменение тинкториальных свойств трематод с нарастающим диссонансом повышения и снижения бромфенолофилии, альцианофилии, толуидинофилии и Шик-реакции тканевых структур и глубокие нарушения распределения углеводов и белков во всех органах сосальщиков свидетельствует о выраженной токсичности антигельминтиков.

6. Установлено, что антитрем и тегалид вызывают в органах и тканях F.hepatica и P.cervi однотипные изменения (деструкцию, дезорганизацию, дистрофию и др.), но их проявления выражаются различно, что подтверждает свойство тканевой специфичности трематод, принадлежащих к разным видам. Антитрем и тегалид оказывают более сильный эффект степени воздействия на ткани F.hepatica.

7. При микроморфологическом анализе органов половой системы трематод показано, что антигельминтики вызывают патологию тканей и клеточных форм в репродуктивных органах F.hepatica, F.gigantica, P.cervi и D.lanceatum. Максимальный эффект степени воздействия на органы половой системы трематод оказывает триклабендазол и димезол у F.hepatica, тегалид и антитрем у F.hepatica и P.cervi, а также тетраксихол у F.gigantica и P.cervi.

8. Определено, что воздействие антигельминтиков на органы и ткани трематод происходит последовательно в несколько стадий: 1) Изначально – токсическое воздействие на тегумент и кишечник, вызывая уменьшение в них количества гексозаминогликанов, резко снижает защитные силы гельминта и эти органы становятся неспособными создавать регулирующий барьер на границе раздела фаз системы «паразит-хозяин». 2) Проникновение токсинов в паренхиму приводит к нарушению осмотического и электролитического обмена трематод с развитием гидропической дистрофии, деструкцией белково-углеводных комплексов и тканевому некрозу. 3) Двойное воздействие, как антигельминтика, так и метаболитов лизиса ткани внутренней среды самого гельминта способствует усилению степени токсического давления на органы его половой системы. У трематод нарушается цитоархитектоника желточников, яичников, семенников; прекращаются процессы вителлогенеза, овогенеза и сперматогенеза, блокируется процесс формирования яиц.

Антигельминтики, которые в своей структуре содержат меньшее число полярных групп (–ОН, –С=О, –NН–), и наибольшее число атомов галогена, оказывают более высокий эффект воздействия, вызывая глубокую патологию.

9. Выявленые патологические изменения общего объёма яиц трематод (Vя), находящихся в задних отделах матки,а также объёмов содержимого яиц, (Vс) при анализе их морфометрических параметров,статистически значимо показали: 1) увеличение общего объёма яицF.hepaticaпосле воздействия антитрема, димезола, триклабендазола иP.cervi при воздействия тегалида (р<0,05);2) уменьшение общего объёма яицF.hepaticaпосле воздействия тегалида,F.giganticaпосле тетраксихола и политрема,D.lanceatumпри влиянии фаскоцида; 3) увеличение объёмов содержимого яиц F.hepatica после воздействия триклабендазола,P.cervi после тегалида и антитрема;4) уменьшениеобъёмов содержимого яицF.hepatica после воздействия димезола, тегалида, антитрема,F.giganticaпосле политрема иD.lanceatumпосле фаскоцида; 5) правильно подобраную терапевтическую дозу антигельминтиков и их овоцидную эффективность.

10. Морфофункциональные изменения эндостации паразита при парамфистомозе до лечения представлены дегенеративно-дистрофическими и пролиферативно-метапластическими процессами эпителиального слоя ворсинок и крипт стенки кишечника овец, выполняющего роль ксеногостального барьера. В системе «паразит-хозяин» барьер обеспечивает иммобилизацию паразита и формирование адаптивной трофической зоны.

11. Воздействие антигельминтиков на кишечник хозяина проявляется альтеративно-пролиферативными реакциями, десквамацией эпителия и некробиозом, но антитрем вызывает более сильную патологию, чем тегалид. Гистохимически выявлялись очаги мукоидного (после воздействия тегалида) и фибриноидного (после воздействия антитрема) набуханияв тканях эндостации хозяина, которые являются обратимыми.

Установлен феномен деструкции эозинофилов и блокировки эозинофильной реакции при парамфистомозе после воздействия антитрема, что является основой для расширения области применения этого препарата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработаны критерии оценки эффективности воздействия антигельминтиков на трематод: 1) Патоморфологический контроль и патоморфологические критерии воздействия антигельминтиков на органы и ткани трематод;2) Гистохимические критерии на основе гистохимическогоанализа реактивности тканей трематод после воздействия антигельминтиков. 3) Морфометрическиекритерии оценки овоцидного воздействия антигельминтиков. Разработаные критерии следует использовать, как методологические подходы прогнозирования процессов патогенеза в органах и тканях трематод после химиотерапии животных.

Список

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бибик О.И. Патоморфологический анализ органов и тканей трематод после действия антигельминтиков / О.И. Бибик // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 1997. ? Вып. 2. ? С. 40.

2. Бибик О.И. Сравнительный патоморфологический и морфометрический анализ яиц дикроцелий после действия кубена / О.И. Бибик, А.В. Васильев // Проблемы медицины и биологии: Материалы Всероссийской конфференции-семинара с международным участием. ? Кемерово, 1998. ? С. 94.

3. Бибик О.И. Результаты экспериментального изучения противоописторхозного препарата из растительного сырья /О.И. Бибик, А.Л. Смирнов //Проблемы медицины и биологии: Материалы Всероссийской конференции-семинара с международным участием. ? Кемерово, 1998. ? С. 87-88.

4. Бибик О.И. Гельминтоз – это болезнь, лечение которой необходимо / О.И. Бибик, Л.В. Начева // Проблемы медицины и биологии: Сборник научных трудов по материалам Всероссийской научной конференции-семинару, посвящённой 275-летию Российской Академии наук. ? Кемерово, 1999. ? ч. 1. ? С. 124.

5. Бибик, О.И. Анализ действия тетраксихола на ткани фасциол и парамфистом / О.И. Бибик, Л.В. Начева, В.М. Гребенщиков // Среда обитания и профилактика заболеваний в г. Кемерово: Тезисы докладов к городской научно-практической конференции, посвящённой Всемирному дню охраны окружающей среды. ? Кемерово, 1999. ? С. 113-114.

6. Бибик О.И. Патоморфологический контроль трематодоцидных возможностей сочетанного действия празиквантеля и мебендазола / О.И. Бибик // Проблемы медицины и биологии: Сборник научных трудов. ?  Кемерово, 2000. ?  ч. 2. ? С. 83-84.

7. Бибик О.И. Микроморфологические и гистохимические исследования органов и тканей описторхов после действия антигельминтиков / О.И. Бибик // Проблемы медицины и биологии: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2000. ? ч. 2. ? С. 85.

8. Бибик О.И. Микроморфологические исследования дикроцелиев после фебантела / О.И. Бибик, Л.В. Начева, В.М. Гребенщиков // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ?  Кемерово, 2000. ? Вып. 7. ? С. 9-10.

9. Бибик О.И. Антигельминтики, эффективность их действия на органы и ткани Opisthorchisfelineus (гистологические и гистохимические исследования) / Л.В. Начева,О.И. Бибик, В.М. Гребенщиков. ? Кемерово, 2000. ? 92 с.

10. Бибик О.И. Гельминтоз как болезнь и лечение его лекарственными средствами / Л.В. Начева,О.И. Бибик, Н.Г. Кошкина, В.М. Гребенщиков // Роль техногенных факторов в формировании патологии в Сибири: Сборник научных работ КемГМА. ? Кемерово, 2000. ? Вып. 2. ? С.45-46.

11. Бибик О.И. Сравнительная микроморфология органов и тканей описторхов после действия мебендазола и празиквантела в эксперименте / Л.В. Начева, О.И. Бибик, К.С. Сурцев // Проблемы медицины и биологии: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2001. ? ч. 2. ? С. 107-108.

12. Бибик О.И. Действие антигельминтиков на органы и ткани трематод / Л.В. Начева,Н.Г. Кошкина, В.М. Гребенщиков,О.И. Бибик, М.В. Додонов, А.Т. Закирова // Проблемы медицины и биологии: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2001. ? ч. 2. ? С. 109-110.

13. БибикО.И. Патоморфологические исследования дикроцелиев после воздействия фебантела / Л.В. Начева, О.И. Бибик // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2002. ? Вып. 10. ? С. 8-10.

14. Бибик О.И. Эффективность альбазола-С при аскариозе и его влияние на организм животных и репродуктивную систему Ascarissuum / И.А. Архипов, С.В. Русаков, Л.В. Начева, О.И. Бибик // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2003. ? Вып. 12. ? С. 33-34.

15. Бибик О.И. Эффективность тегалида при фасциолёзе и его влияние на фасциол и организм животных / И.А. Архипов, С.В. Русаков, М.Б. Мусаев, Н.И. Кошеваров, Д.Н. Шемяков, Л.В. Начева, О.И. Бибик // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2003. ? Вып. 12. ? С. 32-33.

16. Бибик О.И. Гистохимическая реактивность тканевых систем трематод при действии антигельминтиков /Л.В. Начева, О.И. Бибик //Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2004. ? Вып. 13. ? С. 31-36.

17. Бибик О.И. Действие бифенала в системе «паразит-хозяин» / И.А. Архипов, М.Б. Мусаев, О.И. Бибик, Л.В. Начева, В.В. Лошкарёва // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2004. ? Вып. 13. ? С. 7-8.

18. Бибик О.И. Микроморфология органов и тканей Fasciolahepatica, взятых после лечения антитремом /О.И. Бибик //Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2005. ? Вып. 14. ? С. 77-79.

19. Бибик О.И. Патоморфологические изменения органов и тканей Paramphistomumcervi после действия тетраксихола / Л.В. Начева, О.И. Бибик // Медико-биологические проблемы: Сборник научных трудов. ? Кемерово, 2005. ? Вып. 14. ? С. 94-96.

20. Бибик О.И. Действие антитрема на микроморфологию органов и тканей фасциол / О.И. Бибик, И.А. Архипов, Л.В. Начева // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН. ? М., 2005. ? Вып. 6. ? С. 57-59.

21. Бибик О.И. Микроморфология органов и тканей Fasciolahepatica после лечения тегалидом / О.И. Бибик // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. ? 2006. ? Т. 42. ? С. 84-87.

22. Бибик О.И. Патоморфологический контроль токсикогенного действия тегалида на органы и ткани Paramphistomumcervi / О.И. Бибик // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. ? 2006. ? Т. 44. ? С. 46-52.

23. Бибик О.И. Патоморфологический контроль токсикогенного действия тегалида на органы и ткани трематод Paramphistomumcervi и Fasciolahepatica / О.И. Бибик // Теоретические и практические вопросы паразитологии: Сборник работ Всероссийской научной конференции, посвящённой 50-летию кафедры общей биологии с основами генетики и паразитологии и 80-летию со дня рождения первого заведующего кафедрой, д.б.н., профессора Е.Д. Логачёва. ? Кемерово, 2006. ? С. 73-79.

24. Бибик О.И. Микроморфологические исследования органов и тканей разных видов трематод до и после воздействия антигельминтиками / Л.В. Начева, О.И. Бибик //Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. ? 2006. ? Т. 44. ? С. 162-169.

25. Бибик О.И. Патоморфологические исследования органов и тканей разных видов трематод до и после действия антигельминтиков / Л.В. Начева, О.И. Бибик // Теоретические и практические вопросы паразитологии: Сборник работ Всероссийской научной конференции, посвящённой 50-летию кафедры общей биологии с основами генетики и паразитологии и 80-летию со дня рождения первого заведующего кафедрой, д.б.н., профессора Е.Д. Логачёва. ? Кемерово, 2006. ? С. 35-41.

26. Бибик О.И. Микроморфологические изменения органов и тканей Paramphistomumcervi после тетраксихола / О.И. Бибик, Л.В. Начева, И.А. Архипов // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. ? 2006. ? Т. 44. ? С. 53-57.

27. Бибик О.И. Распространение гельминтозов среди населения Кемеровской области / Л.В. Начева, О.И. Бибик, Т.Е. Старченкова // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН. ? М., 2006. ? Вып. 7. ? С. 266-268.

28. Бибик О.И. Гистохимические исследования нарушения углеводного обмена в тканях и органах фасциол после воздействия тегалида / О.И. Бибик // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. ?  2007. ? Т. 45. ? С. 40-45.

29. Бибик О.И. Оценка влияния триклабендазола на микроморфологические параметры органов и тканей Fasciolahepatica / О.И. Бибик // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. ? 2007. ? Т. 45. ? С. 46-52.

30. Бибик О.И. Патоморфологическая оценка эффективности действия триклабендазола на органы и ткани фасциолы печёночной / О.И. Бибик, Л.В. Начева // Медицина в Кузбассе: Научно-практический медицинский журнал. ? Кемерово, 2007. ? № 3. ? С. 19-22.

31. Бибик О.И. Гистохимические исследования базальных мембран в органах и тканях паразита до и после воздействия антигельминтиков / Л.В. Начева, О.И. Бибик // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН. ? М., 2007. ? Вып. 8. ? С. 241-244.

32. Бибик О.И. Гистохимические исследования базальных мембран органов и тканей гельминтов до и после воздействия антигельминтиками / Л.В. Начева, О.И. Бибик // Российский паразитологический журнал. ? 2007. ? № 1. ? С. 63-66.

33. Бибик О.И. Патоморфология органов и тканей трематоды вида Fasciolahepatica после действия антигельминтика «альбен-супер» / О.И. Бибик, С.В. Енгашев, Л.В. Начева // Ветеринария. ? 2007. ? № 1. ? С. 29-31.

34. Бибик О.И. Гельминтозы населения Кузбасса / Л.В. Начева, О.И. Бибик, Т.Е. Старченкова, М.В. Додонов // Медицина в Кузбассе: Научно-практический медицинский журнал. ? Кемерово, 2007. ? № 1. ? С. 22-29.

35. Бибик О.И. Описторхоз в Кемеровской области / Л.В. Начева, Т.Е. Старченкова, О.И. Бибик, М.В. Додонов //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. ? 2007. ? № 1. ? С. 25-28.

36. Бибик О.И. Морфофункциональная характеристика органов и тканей паразита и хозяина при трематодозах после химиотерапии антигельминтиками / О.И. Бибик // Российский паразитологический журнал. ? 2008. ? № 1. ? С. 99-106.

37. Бибик О.И. Гексозаминогликаны в органах и тканях половозрелых Fasciolahepatica после воздействия триклабендазола / О.И. Бибик, Л.В. Начева // Российский паразитологический журнал. ? 2008. ? № 3. ? С. 72-76.

38. Бибик О.И. Методические рекомендации по выявлению трематодоцидной эффективности антигельминтных средств методом морфометрического анализа яиц трематод после действия препарата / О.И. Бибик, Л.В. Начева // Российский паразитологический журнал. ? 2009. ? № 1. ? С. 102-106.

39. Бибик О.И. Действие триклабендазола в системе «паразит-хозяин» / И.А. Архипов, Н.И. Кошеваров, М.Б. Мусаев, О.И. Бибик, Ф.С. Михайлицин //Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН. ? М., 2009. ?Вып. 10. ? С. 26-28.

40. Бибик О.И. Микроморфология органов половой системы трематоды Fasciolahepatica, взятых после лечения тегалидом / О.И. Бибик // Медицина в Кузбассе: Научно-практический медицинский журнал. ? Кемерово, 2010. –спецвып. 3. ? С. 14-15.

41. Бибик О.И. Патоморфологический контроль изменений в органах и тканях половой системы трематоды Dicrocoeliumlanceatumпосле воздействия антигельминтика фаскоцида / О.И. Бибик // Российский паразитологический журнал. ? 2010. ? № 4. ? С. 41-44.

42. БибикО.И. Гистохимические исследования распределения гликогена в органах и тканях Opisthorchisfelineus, взятых после лечения антигельминтиками / Л.В. Начева, О.И. Бибик, Ю.А.Нестерок //Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН. ? М., 2010. ?Вып. 11. ? С. 312-314.

43. Бибик О.И. Паразитарные болезни, распространённые на территории Кузбасса (меры борьбы и профилактики). Методические рекомендации для врачей практического здравоохранения и ветеринарной медицины, студентов, ординаторов и аспирантов соответствующего профиля / О.И. Бибик, Л.В. Начева.– Кемерово, 2010. – 63 с.

44. Бибик О.И. Морфометрический анализ яиц Fasciolahepatica до и после воздействия антигельминтиков / О.И. Бибик, Т.А. Штернис //Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН. ? М., 2011. ?Вып. 12. ? С. 73-77.

45. Бибик О.И. Микроморфологическое и гистохимическое исследование тонкой кишки овец при спонтанном парамфистомозе после воздействия тегалида / О.И. Бибик, Л.В. Начева, И.А. Архипов //Российский паразитологический журнал. ? 2011. ? № 2. ? С. 101-105.

46. Бибик О.И. Патоморфология тонкой кишки овец при парамфистомозе и после воздействия тегалидом / О.И. Бибик, Л.В. Начева, И.А. Архипов // Теоретические и практические вопросы паразитологии: Материалы II Юбилейной научно-практической конференции с международным участием, посвящённой 55-летию кафедры общей биологии с основами генетики и паразитологии КемГМА и 85-летию со дня рождения д.б.н., проф. Е.Д. Логачёва. ? Кемерово, 2011. ? С. 22-27.

47. Бибик О.И. Морфометрический анализ яиц Fasciolahepaticaдо и после воздействия антигельминтиков триклабендазола и тегалида / О.И. Бибик, Т.А. Штернис // Российский паразитологический журнал. ? 2011. ? № 4. ? С. 132-138.

48. Бибик О.И.Патоморфологияорганов и тканей FasciolahepaticaиParamphistomumcervi после воздействия антитрема / О.И. Бибик, Л.В. Начева, И.А. Архипов //Российский паразитологический журнал. ? 2012. ? № 1. ? С. 14-21.

49. Бибик О.И. Микроструктура тонкой кишки овец при парамфистомозе после воздействия антитрема / О.И. Бибик, Л.В. Начева, И.А. Архипов //Российский паразитологический журнал. ? 2012. ? № 1. ? С. 62-65.

 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.