WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Функциональные особенности эндогенных ретровирусов на примере Gypsy (МДГ4)

Автореферат докторской диссертации

 

                                                                                  На правах рукописи

 

 

 

 

                        СЁМИН БОРИС ВЛАДИМИРОВИЧ

 

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ НА ПРИМЕРЕ GYPSY (МДГ4)

 

 

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

 

 

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

 

 

 

 

 

 

Москва – 2012


Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ  Россельхозакадемии)

 

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор, академик РАН                                                                      

Ильин Юрий Викторович

Официальные оппоненты:             

Савченкова Ирина Петровна, доктор биологических наук, профессор, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии, заведующая сектором

Николаев Лев Григорьевич,  доктор биологических наук, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, старший научный сотрудник

Еремец Владимир Иванович, Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук,  профессор, ГНУ  Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии,

заместитель директора по научной работе

Ведущая организация:                    

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной                                                             вирусологии и микробиологии РАСХН

 

Защита диссертации состоится «_____»_________________ в ___часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии по адресу: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, корпус 1, тел. (495) 970-03-69

 

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ  Россельхозакадемии

 

Автореферат разослан  «         »   _________________________ 2012 года.  

 

Учёный секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук                                                      Ездакова  И.Ю.                            


                                      1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

­

Актуальность проблемы. Эндогенные ретровирусы и ретротранспозоны, будучи интегральной частью эукариотического генома, как правило, занимают около 10%, а в некоторых случаях до 50% генома. Их способность к транспозициям и горизонтальному переносу представляет один из основных факторов генетической нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний животных и человека. В настоящее время с активностью эндогенных ретровирусов связывают ряд психосоматических расстройств, включая шизофрению (T. Christensen, 2010), гипертонию, аутоиммунные заболевания (D.H. Dreyfus, 2011), появление некоторых видов опухолей, псориаз (R. Sarid and S.J. Gao, 2011)  и т.д. Кроме того, в вероятности межвидового переноса эндогенных ретровирусов таится главная опасность ксенотрансплантации клеток свиньи, несмотря на то, что подобный подход имеет большой потенциал для лечения многих заболеваний человека, включая замену органов и диабет (J. Denner, 2011). Прогресс в изучении эндогенных ретровирусов имеет фундаментальную и теоретическую значимость для ветеринарной вирусологии и генетики и важен с хозяйственной точки зрения, например, для понимания причин многолетнего персистирования вируса лейкоза в российской популяции крупного рогатого скота.

 Наиболее удобной моделью для изучения эндогенных ретровирусов на сегодняшний день является ретровирус дрозофилы (эрантирвирус) gypsy (его другое название – МДГ4). Интерес к изучению gypsyопределён его довольно активной экспрессией, высокой частотой транспозиций и  амплифицированностью в геноме. Именно на примере gypsy  впервые была установлена способность эндогенного ретровируса перемещаться не только внутри генома, но и между разными клетками и организмами.  Межклеточные перемещения gypsy явились одним из первых примеров трафика вируса, независимого от белков оболочки вирусной частицы. Сейчас это явление подтверждено многими примерами, а механизмы, лежащие в его основе, развиты в теорию экзосомной стратегии распространения вируса  (S.J. Gould et  al., 2003).

Изучение молекулярной архитектуры вирусных и вирусоподобных частиц, образуемых эндогенными ретровирусами, актуально для  развития новейших нанобиотехнологий. В последние годы стало очевидным, что свойства структурного белка ретровирусов (как и некоторых других вирусов) можно использовать при разработке рекомбинантных вакцин, а также систем доставки в клетку нуклеиновых  кислот или иных биологически активных молекул. В частности, в последнее десятилетие показано, что структурный белок (Gag) ряда  ретровирусов способен  самостоятельно формировать вирусоподобную частицу вне зависимости от каких либо факторов эукариотической клетки, упаковывать вовнутрь частицы нуклеиновые кислоты и/или экспонировать на поверхности собранной частицы гетерологичный пептид.  

 Цель работы. Выявить функциональные особенности эндогенного ретровируса gypsy(МДГ4) и образуемых им частиц.

 Основные задачи исследования.

1. Разработать тесты на примере gypsyдля выявления способности эндогенного ретроэлемента сохранять свою генетическую информацию во внеклеточной форме в виде вирусоподобных частиц.

2. Разработать систему, моделирующую «экзогенизацию» эндогенного ретровируса. Изучить на примере gypsyи родственного ему ретротранспозона МДГ3 способность к межклеточной передаче эндогенных ретровирусов.

3. Исследовать функции структурного белка gypsy(Gag) в процессе  межклеточной передачи частиц ретроэлемента.

4. Клонирование и экспрессия в гетерологичных системах структурного белка ретровируса gypsy; разработать технологию его очистки.

5.  Определить принципы образования мономерами Gag вирусоподобных частиц.

Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе на примере gypsy обобщен опыт моделирования функциональных особенностей эндогенного ретровируса. Исследованы  функции частиц, образуемых gypsy и ретротранспозоном МДГ3, принадлежащим к группеgypsy. Впервые обнаружен феномен межклеточного переноса ретроэлементов от одной клетки к другой. На основе культивируемых соматических клеток была разработана система, позволяющая моделировать межклеточный перенос эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов и определять частоту таких событий. Установлено, что межклеточные перемещения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов происходят без какой либо предварительной стимуляции реципиентных или донорных клеток.

Экспериментально доказана возможность межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов их  вирусоподобными частицами. Раскрыто, что межвидовой процесс передачи не зависит от гена env,а структурный белок ретровируса может обеспечить его медленные межклеточные перемещения.

Обоснована теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. В рамках теории о том, что взаимодействие структурного белка ретроэлемента с клеточными белками-партнёрами может регулироваться его фосфорилированием, изучена кинетика взаимодействия казеиновой киназы типа 2 (СК2) cо структурным протеином gypsy;

Была клонирована нуклеотидная последовательность, кодирующая структурный белок (Gag) ретровируса gypsy. Gag gypsy был впервые экспрессирован в гетерологичных системах, используя бактериальные (Е. coli) и эукариотические (S. frugiperda) клетки. 

Продемонстрированы подходы для изучения молекулярной архитектуры частиц, образуемых структурными белками ретровирусов типа gypsy.  Проведён теоретический и экспериментальный анализ функциональных областей структурного белка gypsy.  Экспериментально определена функция нуклеокапсида в формировании частиц gypsyи раскрыт механизм мультимеризации мономеров Gag в вирусоподобные частицы.

Полученные результаты закладывают фундаментальную базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.

Вклад автора в развитие отечественной биологической науки был отмечен Главной Премией МАИК “Наука/Интерпериодика” в области биологии за 2004 г. С обоснованием такого решения можно ознакомиться по следующей ссылке:

http://www.maik.ru/cgi-perl/contents.pl?lang=rus&catalog=4&page=18

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в обнаружении  феномена межклеточного переноса ретроэлементов и межвидовой передачи эндогенных ретровирусов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, раскрывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не всегда зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необ­ходимость гликопротеина Env для инфекционности ретровируса. Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них.

Практическая значимость работы состоит в том, что на  основе структурного белка ретровируса gypsy и конструкций, позволяющих его экспрессию в гетерологичных системах экспрессии, разработаны принципы построения биотехнологичных глобулярных наночастиц.  Кроме того, в рамках диссертационной работы впервые предложены для научно-исследовательских работ следующие технологии:

  1. На культурах клеток разработана система для моделирования распространения вируса и вирусоподобных наночастиц;
  2. Разработаны методы очистки казеиновой киназы типа 2 (СК2) из культуры клеток и фосфорилирования мономеров Gag invitro;
  3. Предложен метод лиганд-блоттинга, позволяющий детектировать структурные белки вирусов. Эта технология защищена патентом;
  4. Разработаны методологические основы получения вирусоподобных частиц в эукариотической системе экспрессии и их очистки;
  5. Получены и очищены глобулярные белковые наночастицы в бактериальной системе экспрессии;
  6. Предложена технология получения глобулярных белковых наночастиц из мономеров белка invitro;
  7. Определена минимальная последовательность Gag gypsy, необходимая для производства рекомбинантной белковой наночастицы.

Методология диссертационной работы может помочь в изучении ряда медленно развивающихся заболеваний животных и человека, имеющих вирусную этиологию, например лейкоза КРС и аденомотоза овец. Разработанные в рамках диссертации генно-инженерные наночастицы могут послужить основой для создания рекомбинантных вакцин нового поколения и разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментально доказано, что геном беспозвоночных населяют эндогенные ретровирусы, также как геном млекопитающих.

2. Обнаружен феномен межклеточного перемещения ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и межвидовая передача эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. На модели культивируемых клеток разработана система, моделирующая  процесс межклеточных перемещений эндогенного ретровируса.

3. Процесс межклеточной передачи частиц ретротранспозонов не связан с геном env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для распространения ретровируса. Межклеточные перемещения частиц эндогенного ретровируса могут быть определены его структурным белком, т.е. обнаружен альтернативный путь распространения ретровируса, обеспечивающий его межвидовую передачу.

4. Ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретровируса  для выхода из клеток или проникновения в них. Определены несколько клеточных белков, взаимодействующих с Gag gypsy: убиквитин, SUMO и казеиновая киназа типа 2.

5. Gag gypsy способен образовывать вирусоподобные частицы в гетерологичной эукариотической системе экспрессии. Он самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку, экспрессированный в бактериях, способен также образовывать частицы.

6.  Нуклеокапсид существенно влияет на организацию частиц Gag gypsy, и эту функцию определяет последовательность аминокислотных остатков на его N-конце (проксимальная часть нуклеокапсида). Формирование частиц эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов произвольной последовательности.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ем и 4-ом Всероссийском симпозиуме по генетике культивируемых соматических клеток, Москва, 1986 г. и   Москва-Звенигород, 1989 г.; на 2-ом Европейском конгрессе по клеточной биологии,  Будапешт, 1986 г.; на 2-ом Всероссийском сипозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» Москва, 1987 г.; на 6-ом Всероссийском симпозиуме по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса,  1989 г.;  на Международном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии». Москва-Самарканд. 1991 г.; на 42-й и 50-й Ежегодной конференции по исследованиям на дрозофиле, Вашингтон, США, 2001 г. и Чикаго, США, 2009 г.; 4-ом Международном симпозиуме по исследованиям ретровирусного нуклеокапсида, 2003 год, Страсбург, Франция; Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2004 г.; 23-ей Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, 2010 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвящённой 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны ВИЭВ, Москва, 2011 г.;  и др.

Личный вклад автора. На всех этапах диссертационного исследования от постановки задач до выполнения основных результатов роль автора была основной. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ, в том числе 25 статей в рецензируемых научных журналах и  патент на изобретение.

Объём и структура диссертации.  Диссертация изложена на 245 страницах, содержит 8 таблиц, 48 рисунков и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, рекомендаций по использованию научных выводов и списка цитируемой литературы. Список цитированной литературы состоит  из 427 ссылок.

                                 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Использовали культуры клеток дрозофилы: D. melanogaster, линии Schneider 2 и 67j25D; D. hydei, линии Dh14 и Dh33;D. virilisлинии 79f7Dv3g. Вирусные частицы выделяли из клеток и среды их культивирования по методике (T.Miyake et al., 1987) с модификациями (B.Syomin et al., 1993). Плазмида, которая обеспечивает клеткам устойчивость к антибиотику G 418 (pUChsneo) была предоставлена Dr. Pirotta (H.Steller and V.Pirotta, 1985), c помощью кальциевого приципитата она была трансформирована в клетки D. hydei  и таким образом получена линия DH33-neo, устойчивая к антибиотику. В исследованиях использовали традиционные методы ПЦР и гибридизационного анализа (J.Sambrook et al., 1989). Полиаденилированные нуклеиновые кислоты выделяли на колонке с поли(U)-сефарозой (Pharmacia), Подготовка образцов для флюорисцентной in situ гибридизации (FISH-анализ) на хромосомах ядер клеток подробно описана в работе (B.Syomin et al., 2001). Для электронной микроскопии образцы окрашивали 2%-ным уранилацетатом и анализировали на электронном микроскопе JEM-100CX (80 кВ, “JEOL”, Япония).  При выделении клеток D. virilis  из смешанной культуры D. virilisиD. melanogasterиспользовали различие в том, что клетки D. virilisв культуре растут, прикрепляясь к поверхности, в  отличие от клеток D. melanogaster. Кроме того,  морфология клеток этих видов различна. Использовали также способность клеток D. virilis образовывать колонии при плотности посева 5x103 клеток/мл, тогда как для клеток D. melanogaster необходима на порядок большая плотность  (5x104 клеток/мл).

Для создания рекомбинантного бакуловируса, позволяющего синтез Gag gypsy в культурах клеток Spodopterafrugiperda, фрагмент ДНК, соответствующий гену gag gypsy, был получен из клонированной копии проретровируса c использованием термостабильной ДНК полимеразы Pfu. Полученную ДНК клонировали в челночный вектор pBlueBac4.5/V5-His-TOPO (Invitrogen), под полиэдриновый промотор и полученную конструкцию, названную BG1, амплифицировали в E. сoli. Очищенную плазмиду BG1 ко-трансфецировали в культивируемые клетки Spodopterafrugiperda  (Sf9) cовместно с  фрагментированной ДНК вируса ядерного полиэдроза AcMNPV (бакуловируса). В результате получили рекомбинантный бакуловирус, несущий под полиэдриновым промотором полноразмерный ген gag gypsy.

Были получены антитела к Gag gypsy. Для этого в аминокислотной  последовательности белка были определены антигенные детерминанты. Были синтезированы пептиды, состоящие из 20 и 19 аминокислот, соответствующие двум из них. Оба этих пептида одновременно были использованы для иммунизации кролика. Иммуноглобулиновую фракцию из сыворотки крови кролика очищали при помощи хроматографии на белок-А-сефарозе и использовали в дальнейших иммунологических экспериментах. Связывание антител к Gag gypsy с фракционированными в ПААГ пептидами анализировали методом иммуноблотинга, детектируя их по связыванию со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, по стандартной методике с использованием ECL Western blotting analysis system (“Amersham”).

Для синтеза в бактериях Gag gypsy и его делеционных мутантов создавали конструкции на основе векторов серии рЕТ (Novagen). Для амплификации полученных конструкций использовали линию клеток EscherichiacoliXl-Blue (Stratogene), а линию E. coli BL21 (DE3) (Novagen) использовали для синтеза белков.

Плазмиды, предназначенные для синтеза в бактериях белка Gag gypsyи его делеционных мутантов, получены на основе плазмиды BG1. При получении конструкции 1 («укороченная форма» Gag) NcoI-HindIII фрагментплазмиды BG1 клонировали в сайты NcoI–HindIII вектора рЕТ23d(+). При получении конструкции 2 («удлиненная форма» Gag) с помощью точечной мутации на 5'-конец ОРС gag ввели сайт расщепления рестриктазой NdeI так, чтобы инициирующий АUG-кодон входил в его состав. Затем NdeI-HindIII фрагмент, соответствующий«удлиненной форме» ОРС gag, лигировали в вектор рЕТ23b (+), который обработали эндонуклеазами рестрикции NdeI и HindIII.

Конструкцию «1?RRM» получили в результате клонирования в вектор рЕТ23d(+) по сайтам DraII (затуплен фрагментом Кленова) и NcoI фрагмента ДНК HindII-NcoI из конструкции BGI. Плазмиду, позволяющую экспрессировать нуклеокапсид Gag gypsy NC»), получили, выделив StyI-HindIII 3’-концевой фрагмент Gag из плазмиды BG1 и достроив концы фрагмента до тупых фрагментом Кленова. Полученный фрагмент лигировали в сайт NheI плазмиды рЕТ23d(+), достроенный до тупого. Созданные конструкции были способны экспрессировать в бактериальной клетке мутантные (делетированные) формы Gag gypsy, схематичное изображение которых представлено на рис. 13б. Конструкции были сконструированы таким образом, чтобы все указанные белки содержали на С-конце полигистидиновый тракт (His)6, для того, чтобы иметь возможность использовать очистку продуктов методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе.

Экспресию конструкций проводили по методике Novagen с модификациями (Б.В.Сёмин и др. 2011). Для выделения вирусоподобных частиц, синтезируемых в бактериях, лизат бактериальных клеток  осветляли центрифугированием при 36000 ? g, супернатант наслаивали на “подушку” из 30% - ного раствора сахарозы и центрифугировали 2 ч при 180000 ? g. Образовавшийся осадок ресуспендировали и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и вновь фракционировали, используя метод ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте 20/30/70% - ных концентраций сахарозы. Фракции после такого центрифугирования анализировали методом электрофореза в ПААГ.

Для очистки мономеров белка из лизатов бактериальных клеток получали осадок центрифугированием при 12 000 х g, который растворяли  в присутствии 8 М мочевины. Поскольку все синтезированные белки содержали полигистидиновую последовательность, их  выделяли методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе по методике производителя (“Pharmacia”). В некоторых случаях образцы белков дополнительно очищали гель-фильтрацией на колонке Superose 12 (“Pharmacia”) в системе FPLC.

Связывание меченой ДНК с белками, иммобилизованными на фильтре, проводили по методике, подробно описанной ранее (Б.В.Сёмин и др. 1999). ДНК метили Р32 при помощи «рассеянной затравки» ("Amersham") по методике производителя. Для получения меченной РНК in vitro плазмиду pGEMgyp (B.Syomin et al., 1993) линеаризовали рестриктазой BamHI и проводили реакцию синтеза РНК SP6 полимеразой ("Amersham") по методике производителя. В качестве предшественника использовали [Р32]-меченый ATP в количестве 100 мкКи на одну реакцию синтеза.

 

            3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Обнаружение вирусоподобных частиц ретротранспозона   gypsy в культуральных средах пересеваемых клеток. Начальный этап работы был посвящён ответу на вопрос, возможно ли вообще обнаружить частицы ретротранспозонов (тогда употребляли термин мобильные элементы) вне клетки? Важность такого исследования была определена тем, что ряд авторитетных учёных постулировал, что  мобильные элементы образуют исключительно внутриклеточные частицы, в отличие от ретровирусов (T. Miyake et al., 1987; D.J. Finnegan, 1994).

В большей степени этот вопрос был адресован к gypsy, поскольку секвенирование показало сходство его организации с ретровирусами, и его последовательность была обнаружена в геноме нескольких неродственных видов   Drosophila. Мы впервые обнаружили частицы gypsy вне клетки – в их культуральной среде,  используя культуру клеток линии67j25D. Для выделения частиц культуральную среду меняли на свежую за сутки перед опытом, а во время эксперимента  последовательно центрифугировали, так как это принято при очистке вирусов. В результате получили препараты, обладающие обратнотранскриптазной активностью и содержащие  полноразмерные нуклеотидные последовательности ряда ретротранспозонов, в частности gypsy, МДГ1, МДГ3 и copia.

Дальнейшая очистка образцов с помощью равновесного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (20-60%) позволила определить, что частицы всех ретротранспозонов, включая gypsy, распределены по градиенту одинаково и сосредоточены при плотности 1,22 г/мл, что отличается от аналогичного параметра для инфекционных ретровирусов млекопитающих (1,19 г/мл).

Нами впервые было выявлено, что геномная ДНК D.virilis, вида неродственного D. melanogaster, также содержит последовательности похожие на полноразмерную форму gypsy, а последующее секвенирование обнаруженных последовательностей, выполненное в другой лаборатории, показало, что они имеют приблизительно 80% сходство с gypsyиз D. melanogaster (L.Mizrokhi and A.Mazo, 1991), т.е. в геноме D.virilisтакже содержится gypsy.

Был проведён сравнительный анализ нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в средовых частицах gypsy, как из D. melanogaster, так и D.virilis, очищенных в градиенте плотности сахарозы. Из препаратов выделили полиаденилированные нуклеиновые кислоты, и подвергли их обработке щёлочью, ДНКазой, РНКазой, затем фракционировали в агарозном геле при денатурирующих условиях,  и гибридизовали с клонированной последовательностью gypsy, меченной Р32. Результаты в обоих случаях оказались сходными (рис. 1) и продемонстрировали, что значительная часть внеклеточных частиц gypsyсодержит полноразмерные поли(А+)-РНК-ДНК гибридные молекулы, также как это наблюдается в клетке(I.R. Arkhipova et al, 1986).

Рис. 1.  Гибридизация полиаденилированных нуклеиновых кислот из средовых ВПЧ D. melanogaster  и D.virilis. ВПЧ из среды культивирования D. melanogaster (1,2) и D.virilis (3, 4). фракционировали при денатурирующих условиях, с ДНК gypsy в зависимости от условий обработки перед фракционированием: а - 1, 3 - необработанные, 2,4- обработка NаОН; 6-1,3- обработка ДНКазой, 2,4- обработка NаОН и затем ДИКазой; в— 1,4-обработка РНКазой в растворе высокой ионной силы (2хSSС), 2, 3-обработка РИКазой в растворе низкой ионной силы (0,1 хSSС). Стрелкой отмечены зоны гибридизации, соответствующие по подвижности полноразмерному транскрипту gypsy.

Электронная микроскопия препаратов частиц обнаружила морфологически сходные частицы в образцах  D. melanogaster и D.virilis. Их можно разделить на  три типа. Два типа частиц являлись РНК содержащими вирусами персистирующими в культуре клеток дрозофилы (бирнавирусы Х, сигма вирусы и реовирусы). Вирусоподобные частицы (ВПЧ) ретротранспозонов мы связали с частицами третьего типа (рис. 2). Эти частицы, диаметром 25 – 45 нм превалировали в препаратах. Они имели сферическую или эллипсовидную форму. Несомненно, в условиях постоянной экспрессии не только gypsy, но и других ретротранспозонов выделить чистые нативные частицы gypsyбыло невозможно. Тем не менее, в совокупности вышеописанные результаты впервые показали, что gypsy образует вирусоподобные частицы, которые в недеградированном виде можно обнаружить в среде культивирования соматических клеток.

А                                                     Б

Рис. 2. Морфология частиц третьего типа  в среде культивирования пересеваемых клеток D. melanogaster  (А) и D.virilis (Б). Масштабный отрезок 50 нм.

Таким образом, результаты стимулировали три важных вывода:

(1) возможность интактного существования геномной РНК gypsy вне клетки; (2) поскольку в частице происходит обратная транскрипция, они, скорее всего, предназначены быть внутриклеточной репликативной интермедиатой  gypsy и их выход из клетки не является специфическим; (3) частицы ретротранспозонов могут достаточно долго сохраняться во внеклеточной форме и накапливаться в недеградированном виде в среде культивирования.

3.2. Способность вирусоподобных частиц, образуемых gypsy, к  межклеточной передаче этого мобильного элемента. Могут ли средовые частицы gypsy обеспечить его межклеточную передачу? Для ответа на этот вопрос, препарат внеклеточных вирусоподобных частиц, с плавучей плотностью 1,22 г/мл и содержащий частицы gypsy и  copia (представителей двух групп ретротранспозонов: Ty1-copia- и gypsy- группы) добавили к культивируемым клеткам D. hydei (Dh14). Выбор реципиентных клеток был определён тем, что ни gypsy ни  copia не населяют геном дрозофилы этого вида. После добавления препарата реципиентные клетки культивировали как обычно.

На начальных стадиях эксперимента мониторинг реципиентных клеток проводили с помощью ПЦР. Для синтеза фрагментов в ПЦР использовали праймеры на лидерную область gypsy  и на 5’ – область первой рамки считывания copia. Отметим, что выбор праймеров для синтеза части последовательности gypsyбыл определён тем, что ко времени проведения эксперимента было известно, что существует два транскрипционно активных варианта этого мобильного элемента. Нетранслируемая лидерная область в одном из вариантов имеет делецию в 109 пар нуклеотидов.  Нас интересовало, какой из вариантов gypsy будет иметь преимущество в случае успешного переноса ретротранспозона в чужеродную клетку.

На первых пассажах после «заражения» анализ с помощью ПЦР геномной ДНК, выделенной из реципиентных клеток, позволил обнаружить последовательности gypsy и copia, также, как возможно было детектировать их в исходном препарате ВПЧ (рис. 3). ПЦР анализом изначально было выявлено два фрагмента gypsy, различающихся на 109 пар нуклеотидов. Начиная с 11-го пассажа, последовательность copiaне обнаруживалась в испытуемых клетках. Напротив, на 31 пассаже культивирования реципиентных клеток, мы смогли детектировать gypsyв них не только методом ПЦР, но и используя менее чувствительный метод блот-гибридизации геномной ДНК, что указывало на постепенное увеличение колическва копий элемента в реципиентных клетках.


Рис. 3. Детекция gypsy и copia в исследуемых образцах при помощи ПЦР. а. Блот-гибридизация gypsy с фракционированными электрофорезом в агарозном геле фрагментами, полученными при помощи праймеров специфичных к лидерной области gypsy. В качестве матрицы использовали геномную ДНК клеток D. hydei,  выделенную на 11 пассаже культивирования клеток, после добавления ВПЧ (1) и геномную ДНК клеток D. melanogaster (2). б. Окрашенные бромистым этидием фракционированные в агарозном геле фрагменты ДНК, полученные ПЦР.  Матрицей служила ДНК выделенная из опытных образцов ВПЧ. (1)- праймеры специфичные к gypsy, (2)- праймеры специфичные к copia. в. Блот-гибридизация клонированной последовательности copia с фракционированными электрофорезом в агарозном геле фрагментами, полученными при помощи праймеров специфичных к лидерной области copia. В качестве матрицы использовали геномную ДНК реципиентных клеток D. hydei,  выделенную на 5-ом (1) и 11-ом пассажах культивирования клеток, после добавления ВПЧ.


В описанном выше эксперименте перенос последовательности gypsy был достигнут при использовании относительно высоких концентраций ВПЧ, искусственно добавляемых в среду культивирования чужеродных клеток. Для того, чтобы определить возможен ли перенос вируса при условиях, близких к физиологическим, образовали смешанную культуру, состоящую из двух различных линий Dhydei.

Донорными клетками служили описанные выше, «зараженные» gypsy клетки DH14 (DH14-gypsy), а реципиетными клетками – являлись клетки линии DH33, в которые была трансформирована плазмида, обеспечивающая резистентность к неомицину (G418) – линия DH33-neo. Донорные DH14-gypsyи реципиентные DH33-neo клетки растили в смешанной культуре на протяжении 7 пассажей, затем добавили к клеткам анибиотик G418. После селекции в присутствии антибиотика образовали новую сублинию  DH33-neo-gypsy, в которой методами ПЦР и саузерн-анализа детектировали gypsy. Более того, методом флюорисцентной гибридизации insitu (FISH) с ядрами экспериментальных клеток, взятых на разных пассажах их культивирования, установили, что пропорция клеток D. hydei, несущих gypsy, увеличивается со временем (рис. 4), т.е. амплификация gypsyв  культуре  происходит  благодаря  тому,   что     ретровирус


             

Рис. 4. In situ гибридизация gypsy с ядрами клеток различных линий:

А - D. melanogaster (67j25D), Б - D hydei (ВР14), В - DH14-gypsy (40-й пассаж), Г - DH33-neo-gypsy  (30-й пассаж).


перемещается от клетки к клетке, а не только в результате амплификации элемента в нескольких отдельно взятых клетках популяции. Была проведена оценка частоты межклеточных перемещений gypsy, она довольно низка и составляет 10-3 – 10-2 на клетку за генерацию.

Результаты показали, что вирусоподобные частицы gypsy способны обеспечивать перенос этого элемента от клетки к клетке и это свойство отличает его от ряда других ретротранспозонов, в частности, copia. Соответственно, проделанная работа позволила классифицировать gypsy как ретровирус. Таким образом, на модели клеток насекомых мы продемонстрировали возможность медленной передачи эндогенного ретровируса от клетки к клетке. При этом было выявлено две особенности медленного распространения частиц ретровируса. Во-первых, была продемонстрирована межвидовая передача gypsy, поскольку виды  D. melanogaster и D. hydei  филогенетически отдалённые. Эти виды дивергировали приблизительно 60 миллионов лет назад, то есть в те времена, когда происходила, например, дивергенция человека и свиньи. Во-вторых,  проведённые эксперименты продемонстрировали возможность проникновения в клетку вирусных частиц, лишённых гликопротеина Env, т.е. эксперименты с gypsy показали, что вирусоподобная частица, образованная только структурным белком (Gag), способна проникать в другую клетку и, следовательно, Gag может обеспечить медленную передачу от клетки к клетке частиц эндогенного ретровируса. Этот важный вывод был подтверждён и в других лабораториях (P.Lecher et al., 1997; А. Pelisson  et al., 2002).

3.3. Способность ретранспозона МДГ3 перемещаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании. Изучили способность к межвидовому переносу ретротранспозонов группыgypsy. Актуальность этой работы была определена тем, что многие из этих элементов генома, в отличие от  gypsy, природно лишены гена env и, соответственно, частицы, образуемые ими, состоят только из структурного белка – Gag. Для экспериментов снова использовали смешанную культуру соматических клеток двух разных видов Drosophila. Клетки D. melanogaster, несущие в своем геноме элементы МДГ1, МДГ3, 17.6, 297, 412, B104/roo, являлись донорными и служили источником перечисленных ретротранспозонов. Реципиентными клетками являлись культивируемые клетки  D. virilis, лишённые последовательностей, перечисленных выше, но, являющимися пермессивными для gypsy как нами  было показано ранее. Образовав смешанную культуру, вели её 20 пассажей. Затем из смеси выделяли клоны клеток D. virilis. Два клона отобрали для дальнейшего анализа. Чтобы подтвердить принадлежность клеток этих клонов к виду D. virilis, мыпровели кариологический анализ более 4000 метафазных клеток из каждого клона. Морфология и модальный набор хромосом  (12 хромосом) были одинаковы в клетках обоих клонов и характерны для D. virilis. Несмотря на этот факт, провели дополнительную проверку сублиний на принадлежность D. virilis, использовав видовую специфичность нетранскрибируемых спейсеров  рибосомных повторов в семействе Drosophila (E.S. Coen and G.A. Dover, 1982). Применив клонированную нуклеотидную последовательность одного из таких видоспецифических  спейсеров в качестве зонда  для гибридизации с геномной ДНК D. melanogaster, D. virilis и отобранных клонов реципиентных клеток показали, что выделенный субклон D. virilis не содержит донорных клеток.

Из клеток двух отобранных клонов выделяли геномную ДНК. После гибридизационного анализа рестриктных фрагментов   этой ДНК с нуклеотидными последовательностями различных ретротранспозонов, выявили, что после совместного культивированияв в геномной ДНК D. virilisпоявился   МДГ3. Одно из доказательств этого события проиллюстрировано на  рис. 5, где представлен результат гибридизации фракционированных электрофорезом фрагментов геномной ДНК реципиентных клонов, обработанных перед форезами эндонуклеазами рестрикции, характерными для МДГ3 с клонированной последовательностью  МДГ3, взятой в качестве зонда. Приведённый анализ доказывает, что зоны гибридизации соответствуют внутренним частям полноразмерной формы МДГ3.


 

Рис. 5. Гибридизационный анализ геномной ДНК из линий клеток D. melanogaster (67J25D), D. virilis (79fDv3g) и реципиентного клона. Зондом служила нуклеотидная последовательность МДГ3, меченная Р32. (a) Саузерн-гибридизация  обработанной HindIII геномной ДНК  D. melanogaster (1), D. virilis  (2) и обоих реципиентных клонов (3, 4). (б) Саузерн-гибридизация  обработанной MspI геномной ДНК  из D. melanogaster (1), реципиентного клона (2) и D. virilis  (3). (в) Саузерн-гибридизация  обработанной EcoRI геномной ДНК  из D. melanogaster (1) и реципиентного клона (2). Стрелками указаны зоны гибридизации, соответствующие полноразмерному элементу.


Полученные результаты показывают, что МДГ3 способен перемещаться из культивируемых соматических клеток одного вида в клетки другого вида без какой либо предварительной стимуляции реципиентных или донорных клеток. Такой результат является весомым аргументом в пользу существования механизма межклеточных перемещений ретротранспозонов и ретровирусов без участия гликопротеина Env оболочки их частиц. Анализ геномной ДНК из реципиентных клеток показывает, что МДГ3 способен встраиваться в геном нового хозяина. Исходя из оценки среднего числа копий элемента в донорных клетках (приблизительно 200 копий) и результатов количественного анализа методом дот-гибридизации, было определено, что в среднем 3-4 копии МДГ3 населили геном каждой клетки реципиентного клона.

Возможны два основных объяснения обнаруженного нами перемещения МДГ3: перенос обусловлен либо слиянием донорных и реципиентных клеток в процессе совместного культивирования, либо  осуществляться с помощью ВПЧ.

Мы исключаем, что перенос МДГ3 связан со слиянием клеток. Известно, что слияние клеток в культуре, без их дополнительной обработки происходит крайне редко. Действительно, мы не наблюдали слияния клеток в течение эксперимента, а  кариологический и гибридизационный анализы показали, что клетки реципиентного клона принадлежат D. virilis. Можно предположить, что реципиентный клон получен из клеток, которые формировали агрегаты с донорными клетками в течение краткого периода и при этом произошел обмен частью цитоплазм. Однако, как правило, такие агрегаты приводят к возникновению дикарионов, а мы их не наблюдали. К тому же, если бы эти события действительно имели место, результат опыта скорее бы указывал на перенос нескольких элементов или, по крайней мере, нескольких форм МДГ3 (см. ниже).

3.4. Распределение геномной РНК ретротранспозона МДГ3 в культуре клеток. Существует две основных формы МДГ3: полноразмерная, имеющая размер 5.5 тпн и укороченная, размером 4.2 тпн. К наиболее значимым структурным особенностям укороченной формы МДГ3 следует отнести делецию домена обратной транскриптазы и части последовательности, кодирующей РНказу Н и  делецию центральной части домена gag (С.Н.Аведисов и др., 2001). Тем не менее, укороченная форма имеет идентичные длинные концевые повторы (ДКП), а участки нуклеотидной последовательности, необходимые для транскрипции и обратной транскрипции такие же,  как и у полноразмерной формы. То есть, транскрипты укороченных копий МДГ3 могут обратно транскрибироваться и перемещаться по геному.  Чтобы понять, почему мы не наблюдали перемещение укороченной формы ретротранспозона, сравнили распределение транскриптов полноразмерной и укороченной форм МДГ3 в культуре клеток дрозофилы.

Несмотря на то, что содержание укороченных копий в геноме значительно ниже по сравнению с количеством полноразмерных копий (рис. 6а), количество транскриптов с укороченных копий в клетке не столь резко отличается от количества транскриптов  с полноразмерных копий элемента (рис. 6б, дорожка 1).


Рис. 6. Гибридизация МДГ3 с геномной ДНК и полиаденилированной РНК. ДНК обработана рестриктазой Hind III (а). б – гибридизация МДГ3 с препаратами РНК: тотальной полиаденилированной РНК из клеток (1, 4), из средовых частиц (2, 5), из внутриклеточных частиц (3). Препараты на дорожках 4 и 5 были обработаны щелочью перед электрофорезом. Стрелками отмечены зоны гибридизации соответствующие подвижности полноразмерной  и укороченной формам элемента.


Такое распределение отражает более активную транскрипцию укороченных копий по сравнению с полноразмерными элементами. В данной работе, нас, прежде всего, интересовали транскрипты, вовлеченные в процесс образования вирусных частиц. Во фракции внеклеточных частиц обнаружена практически только РНК  полноразмерной формы элемента (рис. 6б, дорожка 2), в то же время фракция цитоплазматических частиц содержала оба вида транскриптов (рис. 6б, дорожка 3). Обработав препарат полиаденилированной суммарной клеточной РНК щелочью перед денатурирующим электрофорезом,  мы детектировали полноразмерную (-) цепь ДНК, как для укороченной, так и для полноразмерной формы элемента (рис. 6б, дорожка 4), а в препарате средовых частиц, после обработки щелочью,  снова выявляется зона гибридизации  только в области, соответствующей полноразмерным трансриптам (рис. 6б, дорожка 5). Результат, аналогичный показанному на рисунке, также был получен при обработке препарата РНКазой в растворе низкой ионной силы (0.1xSSC). Таким образом, часть транскриптов как полноразмерной, так и  укороченной форм МДГ3 вовлечены в клетке в процесс обратной транскрипции. Вместе с тем, вне клетки обнаружены только частицы, содержащие полноразмерную форму МДГ3. Соответственно,  только такие частицы обеспечивают перенос ретроэлемента от клетки к клетке. Дефектностью структурного протеина, кодируемого укороченной копией и образующего вирион с укороченной РНК, можно объяснить отсутствие транспорта из клетки частиц, образуемых этой формой.

3.5. Способность функциональных мотивов аминокислотной последовательности Gag обеспечивать его взаимодействие с белками-партнерами. B настоящее время секвенировано несколько вариантов gypsy. Два из них - gypsy(GypDm)   и Gtwin присутствуют в геноме D.melanogaster. Кроме того, два варианта gypsy (GypDsu  и GypDv) обнаружены в других неродственных видах плодовой мушки: D. subobscura и D. virilis. Известно, что последовательность гена gag наименее консервативна, среди других генов, кодируемых ретровирусом. Например, в перечисленных вариантах gypsy совпадение по аминокислотной последовательности Gag составляет менее 60%. Исходя из предположения, что функциональные участки Gag являются консервативными, мы выявили совпадающие участки в эпитопах Gag  перечисленных последовательностей различных вариантов gypsy. Затем сравнили выявленные последовательности с другими известными белками, используя EMBL FASTA Server, для того чтобы выявить сайты, по которым Gag может взаимодействовать с определенными белками внутриклеточного транспорта для своего перемещения внутри клетки или на плазматическую мембрану. Эти клеточные белки-партнёры могут также определять эндоцитоз частиц, образуемых gypsy.

               Структурные белки вариантов gypsy  в центральной части их аминокислотной последовательности содержат консервативную область, в которой можно выделить короткий мотив (Рис. 7а), имеющий  консенсус YXXO, где  O – обозначает аминокислоту с гидрофобной боковой цепью (I, L, V, М, F или Y), а по  крайней мере один из Х является полярной аминокислотой. Известно, что подобный мотив специфически распознается ? – цепью адаптерного комплекса, который обеспечивает связывание белка с клатрином  для образования эндоцитозных окаймленных пузырьков, которые осуществляют транспорт белка. Для вируса инфекционной анемии лошадей было доказано, что существование мотива с указанным консенсусом в структурном белке является необходимым условием для выхода вируса из клетки. Структурные белки всех эрантивирусов дрозофилы и ряда ретротранспозонов, например МДГ3,  содержат  один или два таких мотива в своей последовательности. 
               Показано, что ретровирусы позвоночных содержат убиквитин (V.Vogt, 2000). При убиквитинилировании белка создается обратимая энзиматически катализируемая связь между С-концом  полипептида убиквитина и аминогруппой в лизинах акцепторного белка. Убиквитин хорошо известен по его роли в деградации белков через образование 26S протеосомы. Потенциально любой из лизинов в молекуле Gag gypsy может связаться с  убиквитином, однако Gag каждого  из вариантов этого ретровируса содержит несколько сайтов предпочтительного связывания с убиквитином, которые совпадают с сайтами предпочтительного связывания с SUMO (small ubiquitin-related modifier) – белка, родственного убиквитину. В отличие от убиквитина, SUMO, не является меткой белка, подлежащего деградации, но способствует  внутриклеточному транспорту белка. На рис. 7б показаны совпадающие вероятные места для связывания SUMO с Gag gypsy. Интересно, что консенсус, соответствующий последнему из показанных на рисунке мотивов, обнаруживается практически во всех Gag эрантивирусов. В отмеченных на рисунке сайтах лизин также может связываться с убиквитином. Однако,  в противоположность убиквитинилированию белка, связывание с SUMO ингибируется фосфорилированием. Как показал анализ с использованием NetPhos Server в указанных сайтах, белок может фосфорилироваться киназами и, видимо, фосфорилирование регулирует связывание SUMO и убиквитина c Gag gypsy и тем самым определяет транспорт  мономеров и частиц Gag.
 

a
GypDm(201) QGDLPLMQYYDEVEKKLTLVTN
GypDv(198) QGEMCLMQYYDDVEKKLTLVTN 
GypDs(160) QGEMSLMQYYDDVEKKLTLVTN 
Gtwin(200) QGELSLMQYYDDVEKRLTLITN 
 
б
GypDm (5) HNYRKVKVEYESED  (259) VVFPAQPKDLPSAL     
GypDv (3) WNYREIKVEYNSDD  (256) VVFPAQPKDLPSAL
GypDs          ----       (218) VVFPAQPKDLPSAL   
Gtwin (4) TAYRDIKVERNSDG  (258) IVLPAQPKDLPSAL

Рис. 7. Выравнивание последовательностей Gag различных вариантов gypsy.  Числа в скобках обозначают номер первой показанной на рисунке аминокислоты в последовательности Gag. а – Консервативный участок присутствующий в средней части всех рассмотренных Gag, содержащий мотив, сходный с сигналом, распознаваемым ?2 субъединицей адаптерного белка. б Сходные сайты в последовательностях Gag вариантов gypsy которые с наибольшей вероятностью способны связаться с SUMO, предсказанные исходя из минимального консенсуса акцепторного сайта SUMO (Melchior, 2000) и по алгоритму SUMOplot™ Prediction Program. 

Таким образом, проведенный анализ указывает на то, что структурный белок gypsy связывается с белками внутриклеточного транспорта для перемещения в ядро клетки или на плазматическую мембрану. Упомянутые  клеточные белки могут также определять эндоцитоз частиц, образуемых Gag gypsy.

Экспериментально определили, что  фракция, обогащенная частицами gypsy, обогащена так же SUMO и убиквитином (рис. 8). Разделяли клетки и среду их культивирования, а затем из обеих фракций ультрацентрифугированием (так, как принято при очистке вируса – см. выше) получали препараты, обогащённыпе частицами gypsy. Таким образом, из клеток и среды их культивирования получили по две фракции белка – осадка и супернатанта. В полученных четырёх образцах измерили содержание белка и равные количества белка всех фракций нанесли на нитроцеллюлозный фильтр. Полученные доты инкубировали с антителами к Gag, SUMO и убиквитину. Результат показан на рис. 8.


Рис. 8. Детекция SUMO и убиквитина в препаратах Gag gypsy. Связывание антител, специфичных к  Gag gypsy, убиквитину и SUMO. с 5 нг белка, нанесённого на каждый дот. 1 и 2 – белок выделен из клеток, 3 и 4 - белок выделен из среды, использованной для культивирования клеток. 2 и 4 – осадки, полученные при ультрацентрифугировании материала через 30% сахарозную подушку, 1 и 3 – супернатант от такого центрифугирования


.


3.6. Экспрессия структурного белка Gag реровируса gypsy рекомбинантным бакуловирусом в культуре клеток Spodopterafrugiperda. Для анализа экспрессии Gag gypsy в бакуловирусной системе культуру клеток Sf21, образующую монослой на поверхности культурального пластика, инфицировали рекомбинантным бакуловирусом и следили за экспрессией белка  в клетках через 12,  36, 60, 84 и 108 часов (рис. 9). Как видно из рисунка, условия инфекции были подобраны так, что можно было наблюдать заметную экспрессию белка уже через 48 часов. Только через  120 часов после инфекции в культуре наблюдали лизированные клетки.

Gaggypsyбыл обнаруживали не только в клетках, но и в среде их культивирования. Тотальный белок бессывороточной среды культивирования, используемой для роста инфицированных клеток,  осаждали трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и анализировали во времени также как и лизаты клеток. Также как и в клетках, Gag gypsyдетектировали в среде культивирования уже через 36 часов после инфекции. Этот результат нельзя объяснить простым лизисом клеток, и он указывает на транспорт Gag из клеток, поскольку количество живых клеток в культуре было более 97 процентов. Процессиг белка не наблюдали ни в клетках, ни в среде. Для ответа на вопрос, образует ли Gaggypsy вирусоподобные частицы, клетки лизировали через 70 часов и центрифугировали так, как это общепринято при очистке вируса. Тем самым изолировали Gag в мультимеризованной форме. Супернатант от такого центрифугирования осаждали ТХУ. Таким же образом фракционировали материал и среде культивирования клеток. Таким образом, из клеток и среды их культивирования получили по две фракции белка – осадка и супернатанта.


     

 

Рис 9. Иммунохимическое выявление белка Gag ретровируса gypsy в культуре клеток Spodopterafrugiperda Sf21. а – связывание

антител к Gag c фракционированными лизатами клеток через 12,  36, 60, 84 и 108 часов после инфекции рекомбинантным вирусом – дорожки 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно. В указанное  время равное количество клеток было собрано и  тотальный белок из них фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле. б – идентификация Gag gypsy  в среде культивирования  клеток Sf21, заражённых рекомбинантным бакуловирусом через 70 ч. после инфекции. кл – фракционированный лизат клеток, ср – фракционированный электрофорезом препарат вирусоподобных частиц выделенный ультрацентрифугированием из среды культивирования заражённых клеток. Стрелкой обозначен мономер Gag gypsy. Фильтр инкубировали с антителами, специфичными к Gag gypsy.


В полученных четырёх образцах измерили содержание белка и равные количества белка всех фракций нанесли на нитроцеллюлозный фильтр. Полученные доты инкубировали с антителами к Gag. Результат представлен на рис. 10, третий ряд. Он показывает,  что в клетке Gag обнаруживается в виде мономеров


Рис. 10. Связывание антител, специфичных к  Gag gypsy, убиквитину и SUMO в препаратах ВПЧ, полученных в бакуловирусной системе.  5 мкг белка, нанесено на каждый дот. 1 и 2 – белок выделен из инфицированных рекомбинантным бакуловирусом клеток, 3 и 4 - белок выделен из среды, использованной для культивирования клеток. 2 и 4 – осадки, полученные при ультрацентрифугировании материала через сахарозную подушку, 1 и 3 – супернатант от такого центрифугирования.


 (дот 1 – препарат супернатанта) и в виде мультимеров, способных осаждаться как вирусоподобные частицы (дот 2). В среде культивирования Gag представлен в виде мультимеров, т.е. в виде вирусоподобных частиц (дот 4 – препарат осадка после ультрацентрифугирования через сахарозную подушку). Поскольку в эксперименте анализировали клетки и всю среду культивирования использованную для роста этих клеток,  показанный на рисунке 2 результат даёт картину распределения мультимеризованной формы Gag между клеткой и средой её культивирования. Так как в осадках из лизата клеток и среды их культивирования находилось приблизительно равное количество белка, результат демонстрирует, что значительная часть (около 50 %) вирусоподобных частиц, образованных Gag обнаруживается вне клетки. Полученный результат указывает на транспорт из клетки мультимеров Gag, то есть образованных им вирусоподобных частиц. Вирусоподобные частицы Gag gypsy из среды культивирования клеток осаждали ультрацентрифугированием и анализировали связыванием с антителами после электрофореза в ПААГ и переноса на мембрану. Помимо мономеров белка в препарате можно было обнаружить минорные зоны белка большего молекулярного веса, чем Gag, но выявляемые антителами к белку. Для выяснения их природы, мембрану с иммобилизованными на ней пептидами связывали также с SUMO и убиквитином. Результат показал, что некоторая часть мономеров Gag связана с этими белками. Этот результат согласуется с тем, что мы наблюдали в частицах gypsy, синтезируемых в клетках дрозофилы. Видимо, ассоциация частиц gypsy с SUMO не случайна, и этот клеточный белок способен  играть определяющую роль при транспорте частицы из клетки.

3.7. Первое экспериментальное доказательство того, что белок, кодируемой первой рамкой считывания gypsy является его структурным белком. Особенность Gag gypsyзаключается в том, что его аминокислотная последовательность не содержит известных канонических мотивов, характерных для Gag ретровирусов млекопитающих. В этом белке отсутствуют классические последовательности – «цинковые пальцы» (CСHС-мотивы), обычно обеспечивающие связывание структурного белка с РНК ретровируса. Вместе с тем, такая организация Gag не ограничивается исключительно ретровирусом gypsy, а характерна для ряда ретротранспозонов дрозофилы и дрожжей и эндогенных ретровирусов, обнаруженных также и у человека (например, HERVL). На момент начала наших исследований практически ничего не было известно о том, какие домены белка ответственны за те или иные его функции, да и вообще, был открыт вопрос, присущи ли этому белку все свойства, характерные для классически организованных структурных белков ретровирусов.

Прогресс в изучении Gag gypsy мы связали с бактериальной системой экспрессии. На начальном этапе, приступая к изучению этого белка, была поставлена цель получить его  в чистом виде и экспериментально оценить, способен ли он связываться с нуклеиновыми кислотами, подобно классически организованным Gag ретровирусов. Клонировали нуклеотидную последовательность Gag gypsy под промотор РНК-полимеразы фага Т7 в вектор рЕТ3а. Исходили из того, что клонируемая последовательность закачивается стоп-кодоном, который сохранили при клонировании.  В результате получили плазмиду, названную 3agg, позволяющую экспрессию Gag gypsy, начиная со второго метионина его аминокислотной последовательности до конца рамки считывания, ограниченной стоп-кодоном. Используя метод лиганд-блотинга, мы показали, что Gag gypsy способен эффективно связываться с однонитевой ДНК. Затем очистили белок из бактериального лизата с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose, и  аффинной хроматографии на Heparin-Sepharose и исследовали связывание очищенного рекомбинантного белка с РНК gypsy, полученной в результате транскрипции invitroплазмиды pGEMgyp, в которой под SP6 промотор была встроена последовательность ретровируса. В результате определили константу связывания  Gag с РНК ~ 4,5х108  M-1, и это значение хорошо коррелирует с рассчитанными аналогичным образом величинами для стандартно организованных Gag ретровирусов,  имеющих CСHС мотивы. 

3.8. Gypsy  Gag как эффективный белковый субстрат для казеиновой киназы типа 2. Анализ аминокислотной последовательности белка, используя  NetPhos 2.0 Server, показал наличие большого количества потенциальных сайтов фосфорилирования в нём, выявив, что Gag gypsy является природным субстратом казеиновой киназы типа 2 (СК2).

СК2 получили из культуры клеток Drosophilamelanogaster при использовании трёхступенчатой процедуры, включающей аффинную хроматографию на гепарин-сефарозе, хроматографию на фосфоцеллюлозе Р11 и хроматографию на mono-Q в системе FPLC. Удельная активность полученного препарата  составляла 148 ед/мкг белка, при выходе 13,5%. Фермент, который мы получили из культуры клеток Drosophilaпредставлен двумя полипептидными цепями с молекулярной массой 37 и 28 кДа (рис.11), соответствующих ?- и ?-субъединицам СК 2.


Рис. 11. ПААГ-электрофорез гомогенного препарата казеиновой киназы типа 2 из культуры клеток D. melanogaster.1 – препарат СК2 после хроматографии на Мопо-Q; 2- набор белков-маркеров (справа - их молекулярные массы в кДа), Гель окрашен коллоидным кумасси G-250


Для сравнения кинетики фосфорилирования казеиновой киназой, использовали так же фермент, полученный из ооцитов Ranatemporaria. Этот белок имеет иную организацию: он состоит из трех полипептидных цепей с молекулярными массами 43, 41 и 29 кДа, что соответствует ?-, ??- и ?-субъединицам СК 2.

Препараты гомологичной и гетерологичной киназ использовали для изучения фосфорилирования очищенного Gag gypsy, полученного в бактериальной системе экспрессии. Характеристики фосфорилирования этого белка как гомологичной, так и гетерологичной СК 2 оказались весьма схожими. Максимальное включение Р32 в исследуемый белковый субстрат составило в обоих случаях 2 пмоля на пмоль белка, при этом кривые насыщения имели идентичную форму. Кинетические параметры (Кm, Vmах) также оказались весьма схожими. Сродство СК 2 к Gag gypsy оказалось неожиданно высоким по сравнению с большинством других известных внутриклеточных белковых субстратов СК 2. Обычно величина Кm для субстратов СК 2 составляет 0,39—100 мкМ, в случае Gag gypsy было определено примерно в десять раз меньшее значение константы Михаэлиса – Ментен. Т.е, казеиновая киназа типа 2  специфично взаимодействует  с Gag gypsy. В результате фосфорилирования изменяется сродство белка к РНК. Концентрация белка при которой происходит связывание 50% РНК gypsy, составляла для нефосфорилированного белка 220 нг на 100 мкл реакционной смеси, а для фосфорилированного (в случае использования СК2 из клеток D. melanogaster) - 78 нг. Для точного определения константы связывания фосфорилированной  и нефосфорилированной форм белка, фиксированное количество 32Р - меченой РНК gypsyсмешивали с различными количествами белка 1 – 500 нг (0,026 – 10 пмоль) и в каждом случае определяли процент связавшейся РНК. Результаты зависимости связывания РНК на нитроцеллюлозных фильтрах от количества белка Gag gypsyбыли представлены в координатах Скэдчард (рис. 12). Каждое значение на графиках является усредненным  результатом нескольких измерений. Константу связывания рассчитывали исходя из предположения, что все РНК–связывающие центры этого белка одинаковы и независимы. Усредненные экспериментальные значения определили прямые, наклон которых определил константу связывания для нефосфорилированной и фосфорилированной форм Gag gypsy с РНК. Константа связывания для нефосфорилированной формы белка составила 4 ? 108 М-1 (рис. 12), что согласуется с оценкой, полученной ранее иным способом (см. раздел 3.7). Вместе с тем, константа связывания для фосфорилированной формы белка существенно уменьшилась до 1,2 ? 108 М-1. То есть, в результате фосфорилирования сродство исследуемого белка к РНК уменьшается в среднем в  3,3 раза.


Рис. 12. Определение констант связывания нефосфорилированного и фосфорилированного Gag gypsy с РНК в координатах Скетчард. Обработка данных произведена  при помощи программы Microsoft Excel 2000. Кружки - нефосфорилированный Gag gypsy, ромбики - фосфорилированный Gag gypsy.


3.9. Способность Gag gypsy  формировать вирусоподобные частицы в бактериальной  клетке. Традиционно считалось, что трансляция аминокислотной цепи Gag ретроэлемента gypsy начинается с первого AUG-кодона ? по ходу кодирующей его ОРС (R. L. Marlor et al., 1986). Именно в таком виде аминокислотная цепь этого белка представлена во всех электронных банках последовательностей. Вместе с тем, в составе этой ОРС, через 120 н., имеется второй AUG-кодон, который находится в контексте ACCAUGG. Ранее показано, что такой мотив минимального окружения AUG-кодона оптимален для инициации трансляции и с вероятностью приблизительно 90% (M. Kozak, 1991), можно утверждать, что трансляция аминокислотной цепи Gag начинается не с первого, а со второго, находящегося в «удобном» контекстном окружении, инициирующего кодона.

С целью исследовать способность белка Gag gypsy формировать вирусоподобную частицу, мы создали две конструкции на базе векторов серии pET для экспрессии в бактериях полипептида Gag: 1) с предпочтительного места инициации трансляции (конструкция 1) и 2) с первого AUG-кодона ОРС (конструкция 2)  (см. рис 13а).


Рис. 13. Схематичное изображение использованных в работе белков, экспрессированных в бактериях. а – 1 и 2 – теоретически возможные варианты полноразмерной формы Gag gypsy. Белок 1 начинается с предпочтительного места инициации трансляции, белок 2 - с первого AUG-кодона открытой рамки считывания (ОРС) б – сверху вниз изображены «1», «1?RRM», «1?NC» и «NC» соответственно. Последовательность аминокислотных остатков нуклеокапсида приведена на схеме. Подчёркнута положительно заряженная последовательность, содержащая парные остатки аргинина и серина (SR-мотив). На схемах белков она представлена зелёным (тёмным) прямоугольником.



В клетках E. coliBL(DE3), трансформированых конструкцией 1 или 2, после индукции проходила эффективная экспрессия соответствующего белка. Клетки собирали, разрушали ультразвуком и центрифугировали при 36 000 х g. В результате получали 2 фракции: осветленный лизат и осадок, состоящий из клеточного дебриса и водонерастворимых белков. Исследуемые белки 1 и 2 обнаружены в обеих фракциях. Из супернатанта лизата бактериальной культуры сконцентрировали фракцию водорастворимой части лизата, потенциально содержащую вирусоподобные частицы ультрацентрифугированием при 120000 g, наслаивали ее на ступенчатый градиент увеличивающихся концентраций сахарозы (20/30/70%). В использованных нами условиях ультрацентрифугирования (180 000 х g, 40 мин) вирусные частицы проходят через слой 30%-ной сахарозы, и задерживаются на границе с 70%-ной сахарозой. После центрифугирования градиент делили на 8 фракций, которые анализировали электрофорезом в денатурирующем ПААГ (рис. 14).

Рис. 14. Анализ экспрессированного в бактериальных клетках полипептида Gag gypsy : а ? вариант 1, б – вариант 2. Состав фракций, полученных путем ультрацентрифугирования осветленного лизата бактериальных клеток в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы, проанализирован методом электрофореза в 12.5%-ном SDS-ПААГ; номера дорожек соответствуют номерам фракций. Стрелками отмечены варианты 1 и 2 полипротеина Gag.

Как видно из рис. 14а и б, во фракции градиента, соответствующей интерфазе 30?70%-ной сахарозы, аккумулируется белок, совпадающий по подвижности с экспрессированным Gag. Анализ этой фракции градиента методом вестерн-блот с использованием анти-Gag-антител  (рис. 15) показал, что оба экспрессированных в бактериях варианта Gag (1 и 2) находятся во фракции №7 сахарозного градиента. Такой результат ? свидетельство в пользу того, что в водорастворимой части лизата бактериальных клеток Gag находится в виде вирусоподобных частиц, которые можно выделять так же, как и нативные частицы gypsy из клеток дрозофилы (рис. 15, дорожки 3 и 4).


Рис. 15. Вестерн-блот анализ с антителами к белку Gag gypsy. Фракция №7 ступенчатого сахарозного градиента, показанная на рис. 14: вариант 1 (дорожка 1) и вариант 2 (дорожка 2) полипептида Gag; вирусоподобные частицы, выделенные из культуры клеток D. melanogaster (5-дневные клетки культуры Sсhneider2) (дорожка 3) и среда культивирования этих клеток (дорожка 4). Стрелками отмечены варианты 1 и 2 полипептида Gag.


Некоторое количество Gag обнаружено во фракции 70%-ной сахарозы. Такое распределение Gag gypsy схоже с поведением структурных белков других ретровирусов, а причиной может быть образование ассоциациатов белка с компонентами клетки и/или его избыточное связывание с РНК. Электронная микроскопия препаратов интерфазной фракции показала, что в обоих вариантах, 1 и 2, Gag представлен глобулярными частицами различного диаметра, хотя белок 2 образует более аморфные, гетерогенные  частицы, чем  1 (рис.16).

На следующем этапе мы исследовали способность мономеров Gag, образующих макромолекулярные агрегаты (тельца включения) и собранные в водонерастворимой части лизата, формировать вирусоподобные частицы. Образцы растворяли в 8М мочевине и Gag очищали аффинной хроматографией на Ni-агарозе, восстанавливали конформацию белка, ступенчато уменьшая концентрацию мочевины. Затем образцы анализировали методом электронной микроскопии. В обоих образцах (варианты 1 и 2 Gag) видны частицы (рис. 16в), морфологически схожие с представленными на рис. 16а и 16б.

Из результатов вестерн-блот анализа (рис. 15) можно сделать заключение о низкой вероятности события трансляции варианта 2 Gag. Тем не менее, можно допустить синтез этого полипептида в клетке в малых количествах. Показав, что оба варианта Gag gypsy способны формировать схожие частицы, мы исследовали возможность образования вирусоподобных частиц в смеси обоих вариантов Gag. На рис. 16в показана микрофотография частиц, полученных invitro из мономеров Gag вариантов 1 и 2 смешанных в пропорции 9 : 1. То есть, было продемонстрировано, что оба варианта могут совместно формировать вирусоподобные частицы, морфологически не отличающиеся от тех, которые образуют индивидуальные мономеры.

Рис, 16. Идентификация вирусоподобных частиц в препаратах полипептидов Gag gypsy методом электронной микроскопии. 2%-ным уранилацетатом окрашены следующие образцы: а –вариант 1 полипротеина Gag, выделенный из водорастворимой части лизата бактериальных клеток; б –вариант 2, выделенный из водорастворимой части лизата бактериальных клеток; в – препарат получен in vitro в результате смешения выделенных из телец включения полипротеинов 1 и 2 в соотношении 9:1. Масштабный отрезок равен 200 нм.

Результаты, показывающие отсутствие принципиальных различий в частицах, которые формируют варианты Gag 1 и 2, могут быть полезными при разработке рекомбинантных частиц для биотехнологических целей, поскольку наши данные указывают на то, что если к N-концу Gag gypsy  (белок  1) подшить  гетерологичный пептид в 40 аминокислотных остатков (такова разница между 1 и 2),  то он не  нарушит способность Gag мультимеризоваться в глобулярные частицы. Отметим, что пока никем не раскрыт биологический смысл участка аминокислотной последовательности между первым и вторым метионинами, присутствующим в белке 2. Во всяком случае, отличительные черты матрикса, характерные для классически организованных Gag, мы не обнаруживаем в указанной области, как и в целом в Gag gypsy.

Произведя фосфорилирование белка, мы рассмотрели способность к мультимеризации его фосфорилированной формы. Фосфорилированный СК2 Gag gypsy так же эффективно образовывал вирусо-подобные структуры  той же морфологии как и его нефосфорилированная форма.

3.9. Роль нуклеокапсида в мультимеризации Gag gypsy.  Gag gypsy состоит из двух доменов: капсида и нуклеокапсида, причем нуклеокапсидный домен был экспериментально определён по его классическому свойству – отжигать тРНК к вирусной РНК. Из концепции, согласно которой мультимеризация Gag начинается со взаимодействия нуклеокапсида с РНК, следует, что нуклеокапсид играет ключевую роль в формировании частицы ретровируса. Мы экспериментально оценили вклад нуклеокапсида в формирование частицы gypsy. Для этого сравнили способность к мультимеризации полноразмерной формы белка с двумя его мутантными формами: в одном случае из белка Gag нуклеокапсид удалили полностью, а в другом – только С-концевую часть нуклеокапсида, содержащую мотив, определяющий большой положительный заряд белка и распространённый в белках, связывающихся с РНК (см. рис.13).

На первом этапе работы была исследована способность белка Gag gypsy образовывать вирусоподобные частицы без участия нуклеокапсида. Нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеокапсидный домен, делетирована в созданной конструкции «1?NC». Сравнив экспрессию целевых продуктов, синтезируемых конструкциями «1?NC» (без нуклеокапсида) и «1» (полноразмерный Gag), оценили способность этих белков формировать частицы, используя для этого тест, упомянутый в предыдущей главе: способность частиц аккумулироваться на границе между 30- и 70%-ной сахарозой при ультрацентрифугировании через трехступенчатый градиент увеличивающихся концентраций сахарозы 20/30/70%. Как указывали ранее, после ультрацентрифугирования белок 1 возможно было обнаружить на границе между 30- и 70%-ной сахарозой. Вместе с тем, белок без нуклеокапсида ? конструкция «1?NC» ? также аккумулировался на 30?70%-ной интерфазе, и этот результат стал отправной точкой для дальнейшей работы.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов интерфазы 30- и 70%-ной сахарозы выявило существенное различие между структурами, образуемыми белками «1» и «1?NC» (рис. 17а и 17б). Если Gag gypsy(продукт конструкции «1») формирует достаточно однородные глобулярные частицы со средним размером 27 нм, то его делеционный мутант, с удаленным нуклеокапсидом, образует глобулярные агрегаты, размеры которых варьируют от 3 до 50 нм. Несмотря на то, что «1?NC» формирует неоднородные агрегаты, полученный результат свидетельствовал о способности Gag мультимеризоваться без участия нуклеокапсида.

Рис. 17. Электронная микроскопия частиц, очищенных из бактериальных клеток , после экспрессии в них белка «1» – а, «1?NC» – б, «1?RRM» – в. Стрелками отмечены примеры наиболее характерных для каждого препарата частиц. Масштабный отрезок составляет 50 нм.

Поскольку пока нет альтернативного объяснения механизма инициации мультимеризации Gag, кроме как через взаимодействие с нуклеиновой кислотой, нами экспериментально проверено, только ли нуклеокапсид определяет сродство Gag к нуклеиновым кислотам. Для этого применён метод лиганд-блоттинга. Метод основан на связывании иммобилизованных на мембране белков с меченными нуклеиновыми кислотами.

Конструкции, кодирующие Gag gypsy1»), мутантную форму Gag без нуклеокапсида («1?NC») и нуклеокапсид («NC»), экспрессировали в клетках E.coli BL21(DE3). После экспрессии клетки лизировали и подбирали объемы аликвот из лизатов таким образом, чтобы в них были одинаковые массы экспрессированных белков. Затем компоненты лизатов фракционировали с помощью электрофореза в 10%-ном SDS-ПААГ (рис. 18а) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроблоттингом и связывали с денатурированной лидерной последовательностью ДНК gypsy, меченной Р32 с помощью метода рассеянной затравки. Результат представлен на рисунке 18б.

Рис. 18. Тест на связывание с нуклеиновыми кислотами белков «1» , «1?RRM», «1?NC» и «NC».

а – картина распределения фракционированных пептидов лизатов в 12,5 % ПААГ. Гель окрашен коллоидным кумасси G-250. Дорожки 1, 2, 4, 5 – бактериальные лизаты, после экспрессии белков «1» , «1?RRM», «1?NC» и «NC», соответственно. Дорожка 3 – контроль; б – препарат, аналогичный изображенному на рис. а, после переноса на фильтр и связывания с Р32ДНК, меченной методом «рассеянной затравки». в – связывание пептидов бактериальных лизатов после экспрессии белков «1» , «1?RRM», «1?NC» и «NC» (дорожки 1, 2, 3, 4, соответственно) и фракционированных  в 12,5 % ПААГ с Р32 (+) цепью РНК gypsy, синтезируемой in vitro при помощи SP6 РНК полимеразы с плазмиды PGEMgyp.

Полноразмерная форма белка «1» и нуклеокапсид «NC» эффективно связываются с нуклеиновой кислотой. Разница в эффективности связывания между «1» и «NC» усилена тем, что при равенстве условий иммобилизации (по массе белка) количество нуклеокапсида на фильтре в 2.4 раза больше (соответственно больше центров связывания), чем полноразмерной формы Gag. Кроме того, нельзя исключить возможность более эффективного переноса на мембрану низкомолекулярных полипептидов по сравнению с высокомолекулярными. Обращает на себя внимание тот факт, что делетированные формы Gag, прежде всего «1?NC», также проявляют слабое сродство к нуклеиновым кислотам  (рис. 18в). По-видимому, как и в случае нуклеокапсида, связывание делетированного по нему полипептида с нуклеиновыми кислотами обусловлено положительно заряженными участками с большим содержанием остатков лизина (их осталось15) и аргинина (16), причем оставшаяся, капсидная, часть Gag образует глобулярные агрегаты (рис. 17б). Таким образом, нуклеокапсид не есть исключительная область белка, обеспечивающая связывание с нуклеиновой кислотой, но его присутствие необходимо для образования однородных глобулярных частиц (рис. 17). Из этого можно предположить, что нуклеокапсид обеспечивает специфичность взаимодействия мономеров при сборке частицы.

В нуклеокапсиде Gag gypsyобращает на себя  внимание участок, расположенный между 333-м и 348-м аминокислотными остатками белка (рис. 13), который, наряду со значительным положительным зарядом, содержит последовательность похожую на SR-мотив (P.Shepard and K.J.Hertel, 2009) (один из РНК-распознающих мотивов (RRM)), определяемую наличием пары остатков Arg и Ser. Этот мотив характерен для белков, специфически связывающихся с нуклеиновыми кислотами в эукариотической клетке.Мы экспериментально оценили вклад вышеуказанного участка в мультимеризацию Gag, синтезируемого в бактериях. Для этого создали делеционный мутант Gag gypsy «1?RRM» и проанализировали структуры, которые он образует в бактериальной клетке. Использовали описанный выше тест: из водорастворимой части лизата ультрацентрифугированием выделяли фракцию частиц, которую затем также ультрацентрифугированием анализировали с помощью ступенчатого градиента сахарозы. В результате показано, что Gag gypsy, у которого удалено больше половины нуклеокапсида на С-конце (белок «1?RRM»), способен не менее эффективно, чем полноразмерная форма Gag формировать частицы в бактериальной клетке. Частицы, образуемые «1?RRM», морфологически мало отличались от таковых для полноразмерного белка (рис. 17в). Таким образом, результаты сравнения мультимерных структур, образуемых Gag и двумя его делеционными мутантами, свидетельствуют о том, что нуклеокапсид необходим для построения глобулярных частиц и эта функция может быть обеспечена его N-концевым (проксимальным) участком.

Ранее нами показано, что основная масса экспрессируемого в бактериях Gag gypsyобразует макромолекулярные агрегаты – тельца включения ? внутри бактериальной клетки. Сходным образом ведут себя и мутанты Gag: «1?NC» и «1?RRM». Этот материал был взят нами для моделирования invitro вирусоподобных частиц gypsy, т.е. мы рассмотрели, способны ли делеционные мутанты Gag, образующие макромолекулярные агрегаты, формировать частицы invitro.

Стратегию экспериментов вырабатывали на основании следующих результатов, полученных для классически организованных Gag: во-первых, для мультимеризации структурного белка необходимы нуклеиновые кислоты и, во-вторых, последовательности, которая лучше других стимулирует этот процесс in vitro, не выявлено. Водонерастворимую фракцию, полученную в виде осадков в результате центрифугирования лизатов бактериальных клеток после синтеза в них белков, растворяли в 8 М мочевине и очищали с помощью аффинной хроматографии на никель-агарозе. Затем для полного удаления из препарата нуклеиновых кислот проводили гель-фильтрацию в системе FPLC. Таким образом, получили чистые бактериально экспрессированные денатурированные мономеры Gag («1») и два его делеционных мутанта («1?RRM» и «1?NC»).

Далее искали ответ на следующие вопросы: 1) возможен ли рефолдинг белков, 2) способны ли ренатурированные белки образовывать вирусоподобные частицы и 3) необходима ли для образования частиц нуклеиновая кислота? В описываемом ниже тесте использовали два типа нуклеиновых кислот: раствор полиаденилированной РНК из клеток D. melanogaster и 22-членный олигонуклеотид, состоящий из повторяющейся пары GT. Нуклеотидный состав (GT)22 выбран на том основании, что именно такой олигонуклеотид использовали при тестировании invitro мультимеризации Gag, имеющих CСHС-мотив (S.F.Yu et al., 2001).

Отобрав по три аликвоты из каждого очищенного белкового препарата, добавляли к одной из них раствор полиаденилированной РНК, к другой – олигонуклеотид, а третью использовали как контроль. С помощью диализа в препаратах снижали концентрацию мочевины от 8 до 0.25 М, наслаивали на ступенчатый градиент 20/30/70%-ной сахарозы и центрифугировали при 180 000 x g в течение 45 мин – как и в предыдущих экспериментах по выделению вирусоподобных частиц. Затем для каждого образца анализировали фракцию, соответствующую интерфазе 30- и 70%-ной сахарозы (рис. 19).


Рис. 19.  Анализ мультимеризации белков в присутствии нуклеиновой кислоты. Изображён результат электрофореза в SDS- полиакриламидном (12,5%)  геле фракций, соответствующих границе между 30 и 70%-ными ступеньками сахарозы. Дорожки 1–3 – «1», 4–6 – «1?RRM», 7–9 – «1?NC». В препараты 1, 4,7 к раствору чистого белка добавляли РНК, в 2, 5, 8 – 20-членный дезоксирибонуклеотид, препараты 3, 6, 9 – не содержали нуклеиновые кислоты.


Если нуклеиновую кислоту в образец не добавляли, то белка в рассматриваемой зоне практически не было, то есть макромолекулярные структуры не образовывались. Вместе с тем, основная масса белка во всех препаратах, куда была добавлена РНК, находилась на границе 30- и 70%-ой сахарозы. При добавлении олигонуклеотида полноразмерная форма белка, также как и в присутствии РНК, эффективно аккумулировалась в «зоне частиц» градиента. Обращает на себя внимание тот факт, что белок с делетированным нуклеокапсидом («1?NC») также проявлял способность эффективно мультимеризоваться в присутствии нуклеиновых кислот.

Электронно-микроскопическое исследование образцов, полученных из препаратов интерфазной фракции, подтвердило, что все рассматриваемые белки способны эффективно мультимеризоваться при добавлении нуклеиновой кислоты. Для каждого белка частицы, образуемые при добавлении РНК, схожи с частицами, образуемыми при добавлении олигодезоксирибонуклеотида иподобны тем, которые выделены из бактериальных клеток (рис. 20).

Рис. 20. Электронная микрофотография препаратов частиц, образованных in vitro из изначально денатурированного белка в присутствии РНК и отобранных из интерфазы между 30 и 70%-ными ступеньками сахарозы. «1» – а,  «1?RRM» – б, «1?NC» – в. Стрелками отмечены примеры наиболее характерных для препарата частиц. Масштабный отрезок составляет 50 нм.

Средний диаметр частиц в образцах белков конструкций «1» и «1?RRM» составлял 27 нм. Несмотря на эффективную мультимеризацию в присутствии нуклеиновой кислоты, белок без нуклеокапсида («1?NC») образовывал глобулы, размер которых варьировал в широких пределах (диаметр от 5 до 20 нм) и которые проявляли склонность к образованию агрегатов (рис. 20в).

В этом исследовании показано, что мультимеризация капсида может происходить без участия нуклеокапсида; и этот факт согласуется с результатами авторов, которые изучали способность делеционных мутантов структурных белков других ретровирусов и ретротранспозонов формировать частицы invitro (например, L.S. Larsen et al., 2008). Кроме того, полученные нами результаты хорошо согласуются с наблюдением, что добавление нуклеиновой кислоты значительно ускоряет мультимеризацию белка с мотитвом «цинковые пальцы» (M.C. Johnson et al., 2002).

Экспрессия капсидной части структурного белка («1?NC») в бактериях, как и моделирование самосборки такого полипептида invitro, приводит к образованию неоднородных глобулярных агрегатов. Из этого можно предположить, что нуклеокапсид Gag gypsyне есть необходимое условие для мультимеризации белка. Однако несомненна его роль в организации и симметрии частиц, которые образуются через взаимодействие белка с нуклеиновой кислотой. Нами показано, что мультимеризация мономеров белков происходит как при добавлении РНК, так и ДНК. Причем нуклеотидный состав добавляемых нуклеиновых кислот не важен – такой вывод сделан нами на основании результатов, приведенных выше и полученных в дополнительных экспериментах, где к препаратам белка добавляли различные нуклеиновые кислоты. Например, экстракт РНК из бактериальных клеток также вызывал эффективную мультимеризацию белков.

Чтобы оценить, насколько важна область с 333-го по 348-й аминокислотные остатки нуклеокапсида (положительно заряженная последовательность, содержащая парные остатки аргинина и серина) Gag при экспрессии белка в бактериях, мы удалили указанную область вместе с C-концом нуклеокапсида (белок «1?RRM»). Показано, что делетированный белок эффективно образует глобулярные частицы того же размера, что и полноразмерная форма – значит, проксимальной части нуклеокапсида достаточно для того, чтобы обеспечить построение однородных глобулярных частиц в бактериях и invitro. Вместе с тем, несмотря на то, что частицы, образуемые в гетерологичной бактериальной системе, напоминают частицы, образуемые в клетках дрозофилы, отсутствие какой либо определённости в последовательности нуклеиновых кислот при сборке бактериально полученных белков в частицу, указывает на ограниченный характер действия нуклеокапсида в этом случае. То есть за рамками модельных экспериментов, представленных в работе, остались механизмы специфического белок-нуклеинового узнавания, которые имеют место при репликации вируса в хозяйских клетках.

Подводя итог этому исследованию, отметим, что получен принципиальный биотехнологический результат, указывающий на то, что для формирования белком Gag gypsy однородных глобулярных частиц в гетерологичной системе важна только N-концевая часть нуклеокапсида. Добавление нуклеиновых кислот инициирует образование частиц мономерами Gag. Не выявлено ни какой-либо определённой нуклеотидной последовательности, ни оптимального размера нуклеиновой кислоты, запускающей мультимеризацию бактериально экспрессированных белков.

3.10. Gag gypsy является полезным инструментом для производства технологичных наночастиц. В работе было рассмотрено два типа бактериально экспрессируемого Gag gypsy, отличающихся С-концевыми аминокилотными остатками. В одном случае С-конец белка полностью соответствовал природной форме Gag (конструкция 3agg), а в другом к С-концу был подшит гетерологичный пептид, состоящий из 18 аминокислотных остатков и содержащий полигистидиновый тракт, необходимый для очистки белка с помощью метало аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (конструкция 1). Несмотря на эту разницу, остаются абсолютно одинаковыми свойства белков связываться с нуклеиновыми кислотами, также они мультимеризуются в одинаковые глобулярные частицы как внутри бактериальной клетки, так и invitro, тождественные тем, что изображены на рис. 17а и 20а.Частицы, образуемые мономерами этих белков, можно одинаковым образом очистить ультрацентрифугированием из бактериального лизата, как рассказано выше. Вместе с тем, в случае белка 1,  образуемые им частицы можно очистить из осветлённого лизата бактериальных клеток металоаффинной хроматографией, а это означает, что  гетерологичный пептид, содержащий (His)6 и подшитый к мономерам Gag оказывается на поверхности частиц, собранных из этих мономеров белка. 

В предыдущем разделе было указано, что делеционный мутант Gag («1?RRM»), образованный удалением приблизительно 80 аминокислотных остатков с С-конца Gag, также эффективно мультимеризуется в глобулярные частицы. Кроме того, пептид, содержащий полигистидиновый тракт, также экспонируется на поверхности частиц, образуемых мономерами 1?RRM, поскольку и в этом случае частицы эффективно связываются с Ni-NTA агарозой. То есть, результаты прямо указывают на то, что гетерологичный пептид в 80-100 аминокислотных остатков, подшитый к С-концу «1?RRM» не нарушит способность рекомбинантного белка мультимеризоваться в глобулярные частицы, на поверхности которых будет вероятно экспонирован подшитый гетерологичный пептид. Это обстоятельство позволяет рассматривать Gag gypsy в качестве потенциального претендента для разработки наночастиц для медицинских целей. Например, для производства рекомбинантных вакцин, поскольку хорошо известно, что эпитопы инфекционного агента в составе частицы  вызывают существенное увеличение реактивности организма к ним.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ            

Представленная работа посвящена изучению механизмов межклеточного распространения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Эта проблема приобретает все больший интерес, так как в последние годы появилось множество данных о том, что перемещение эндогенных ретровирусов может являться причиной различных заболеваний человека и животных. Вместе с тем, такое явление открывает перспективы для создания биотехнологичных наночастиц, способных распространяться по клеткам организма. Несмотря на важность проблемы в настоящее время пока мало известно о биологии эндогенных ретровирусов и, особенно о механизмах их распространения.

В диссертационной работе внимание уделено изучению функций частиц, образуемых эндогенными ретровирусами и ретротранспозонами.  Изучали два ретроэлемента дрозофилы – gypsy и МДГ3, структурно сходные с простейшими эндогенными ретровирусами человека и других млекопитающих. Следует отметить, что эти элементы явились одними из первых обнаруженных мобильных элементов животных и были клонированы и охарактеризованы соавтором большинства работ академиком Ю.В. Ильиным в  1970-80-е годы.  До сих пор в мире велик интерес к изучению этих элементов генома дрозофилы, поскольку они представляют собой пример простейших ретровирусов и, соответственно, удобным инструментом для изучения генов gag, pol и env функционирование которых определяет распространение всех ретровирусов.

Центральным моментом работы явилось обнаружение феномена межклеточного переноса ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и даже межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, показывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для инфекционности ретровируса. Эти данные согласуются с массой косвенных свидетельств в пользу того, что ретротранспозоны, большинство из которых не содержат env-ген, способны к межвидовому переносу, и это является существенным фактором нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний, в том числе и у человека.

Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. Выявлен ряд функциональных мотивов в последовательностях структурного белка Gag. Экспериментально определен один из белков-партнеров – казеиновая киназа типа II и изучена кинетика ее взаимодействия со структурным протеином ретровируса gypsy. В работе выявлено, что убиквитин и SUMO, являясь клеточными белками-партнёрами Gag, могут способствовать неспецифическому выходу частицы из клетки и проникновению в неё либо определять неспецифическое проникновение частицы в клетку, если частица оказалась вне клетки вследствие разрушения хозяйской клетки.

До представленной работы ничего не было известно о молекулярной архитектуре частиц, образуемых структурными белками ретротранспозонов типа gypsy. Особенностью Gag gypsy является то, что он не содержит известных канонических мотивов, характерных для Gag всех подсемейств ретровирусов: лентивирусов, онковирусов и спумавирусов. Более того, нет свидетельств, позволяющих предполагать, что Gag gypsy процессирует на отдельные матриксный, капсидный и нуклеокапсидный пептиды, как это присуще структурным белкам большинства ретровирусов позвоночных. Деление Gag gypsy на соответствующее домены возможно лишь виртуально. Дополняет картину то, что в нуклеокапсидной части этого белка отсутствуют классические «цинковые пальцы» (или так называемые CСHС мотивы), обычно обеспечивающие связывание структурного белка с РНК  ретровируса. Актуальность изучения такого белка определена тем,  что такая организация Gag не ограничена gypsy, а также характерна для ряда ретротранспозонов дрозофилы и дрожжей. Кроме того, структурные белки спумавирусов млекопитающих и ряда эндогенных ретровирусов, обнаруживаемых также  у человека (например, HERVL) также лишены CСHС.

В результате наших исследований было показано, что Gag gypsy самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки,  поскольку в бактериях способен образовывать частицы. Несмотря на то, что для мультимеризации белка необходима нуклеиновая кислота, нуклеокапсид не является исключительным необходимым фактором мультимеризации Gag gypsy. Капсидная часть белка также способна мультимеризоваться в присутствии нуклеиновой кислоты. Нуклеокапсид существенно влияет на организацию и структуру частиц, и эту функцию определяет N-концевая часть нуклеокапсида gypsy. Формирование частиц белками эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов, при этом какая-либо специфичность последовательности нуклеиновых кислот не требуется.

Диссертационная работа является вкладом в изучение феномена горизонтального и межвидового распространения ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Мы впервые продемонстрировали, что этот процесс определён вирусоподобными частицами ретроэлементов, и функции структурных белков таких частиц не ограничены только структурной компонентой. Эти белки обеспечивают механизм медленной и неспецифической передачи частиц ретроэлементов от клетки к клетке, что определяет горизонтальное и межвидовое распространение ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Полученные результаты закладывают базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.

                                          5. выводы

1. Обнаружены внеклеточные интактные частицы gypsy. Это явилось первым экспериментальным доказательством ретровирусной природы этого мобильного элемента и указало на то, что геном насекомых содержит эндогенные ретровирусы подобно геному позвоночных.

2. Показано, что полноразмерные РНК-ДНК гибридные комплексы являются нуклеиновой составляющей значительной части внеклеточных частиц эндогенного ретровируса (эрантивируса) gypsy.

3. На модели культивируемых клеток разработана система, моделирующая  «экзогенизацию» эндогенного ретровируса. Экспериментально было доказано, что внеклеточные частицы ретротранспозона gypsy способны проникать в клетку,  приводя к появлению экзогенной копии в геноме чужеродной клетки.

4. На примере gypsyи МДГ3впервые было показано, что эндогенный ретровирус способен перемещаться между клетками неродственных видов. Проведена оценка частоты перемещений эндогенного ретровируса по соматическим клеткам.

5. Показано, что межклеточные перемещения частиц gypsy  и ретроэлемента МДГ3, родственного gypsy, определены структурным белком Gag  этих элементов.

6. Использование бакуловирусной системы для экспрессии Gag gypsy позволило показать, что этот белок способен образовывать вирусоподобные частицы в гетерологичной эукариотической клетке. Такие частицы могут накапливаться вне клетки, в среде культивирования. 

7. Выявлено, что клеточные белки – убиквитин и SUMO могут являться клеточными белками-партнёрами Gag gypsyи способствовать транспорту его частиц.

8. Экспериментально доказано, что протеиновая киназа является белком-партнёром Gag gypsy. Казеиновая киназа типа 2 – была очищена и изучена кинетика взаимодействия киназы со структурным протеином gypsy. Показано, что gypsy Gag является одинаково эффективным белковым субстратом как для гомологичной, так и для гетерологичной киназы.

9. Установлено, что необычно организованный Gagретровируса gypsy, не имеющий канонических сайтов для связывания с нуклеиновыми кислотами, эффективно связывается с РНК и ДНК. Показано, что сродство структурного белка к РНК выше, чем к ДНК, а фосфорилирование белка снижает более, чем в 3 раза его сродство к РНК.

10. Экспериментально доказано, что Gag gypsy самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки,  поскольку, будучи экспрессированным в бактериях, способен образовывать частицы.

11. На модели Gag gypsy разработан алгоритм для производства глобулярных рекомбинантных наночастиц в бактериях и invitro.

12.Доказано, что формирование частицы Gag gypsyв бактериальной системе эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов, при этом какая-либо специфичность последовательности нуклеиновых кислот не требуется.

13. Экспериментально определена роль нуклеокапсида в мультимеризации необычно организованного Gagретровируса gypsy.

  

       6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Методология проведения работы может быть рекомендована в дальнейших исследованиях ретровирусных инфекций. Например, изучения механизмов персистенции ретровируса крупного рогатого скота или в изучении этиологии аденоматоза  лёгких овец.

2. Продемонстрированные  в работе теоретические и экспериментальные подходы  по выявлению клеточных белков-партнёров, которые могут взаимодействовать со структурным белком вируса, обеспечивая его медленное неспецифическое распространение, рекомендуются к использованию для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.

3. Разработанные в рамках диссертации принципы образования наночастиц применимы для создания рекомбинантных вакцин нового поколения и/или разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.

список РАБОТ, Опубликованных по теме диссертации

В журналах:

1. Gorelova T.V. Reverse transcription intermediates of mobile genetic elements in Drosophila melanogaster  cells. / T.V. Gorelova, M. Sh. Kybaneishvili, B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Acta Biologica Hungarica. - 1986. -  Vol. 37. - P. 37-38.

2. Syomin B.V.  Difference  in  intracellular localisation    of    retrotransposons   reverse    transcription intermediates / B.V. Syomin, N.G. Schuppe //  Drosophila  Information  Service (DIS Journal). - 1988. - Vol. 66. - P. 139.

3. Syomin B.V. Intracellular distribution of  sequences homologous to Drosophila retrotransposons changes  with the age of culture / B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Drosophila Information Service (DIS Journal). - 1988. - Vol.67. - P. 76.

4. Сёмин Б.В. Внутриклеточное распределение нуклеотидных последовательностей гомологичных мобильным диспергированным генам // Генетика. - 1989. - Т. 25.- №6. - C. 981-992.

5. Сёмин Б.В. Выявление ДНК-связывающих белков в препаратах вирусоподобных частиц Drosophilamelanogaster / Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, А.В.Семакин, A.B., Цупрун  В.Л., A.С. Степанов // Доклады Академии Наук СССР. - 1992. - Т. 322. - №1. - С. 166-169.

6. Цупрун  В.Л. Cравнительная характеристика вирусоподобных частиц, выделенных из среды культивирования клеток Drosophilamelanogasterи Drosophilavirilis// В.Л.Цупрун, Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, А.В.Семакин, A.С. Степанов // Цитология. - 1992. – Т. 34. - №  9. - С.118.

7. Syomin B.V. Presence of gypsy (mdg4) retrotransposon in  the  extracellular virus like particles / B.V. Syomin, K.V. Kandror, A.B. Semakin, V.L.Tsyprun, A.S. Stepanov //  FEBS  Letters. - 1993. - Vol.323. - N.3. - P. 285-288.

8. Сёмин Б.В. Исследование некоторых биохимических характеристик вирусоподобных частиц  gypsy (МДГ4) / Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, А.В.Семакин В.Л.Цупрун, A.С. Степанов // Биохимия. - 1994. -  Т,59. - №4. - C. 363-369.

9. Сёмин Б.В. Внутриклеточные вирусоподобные частицы ретротранспозона Gypsy(МДГ4) как фактор инфекционности / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин //  Доклады Академии Наук. - 1994. – Т.339. - № 6. - С. 838-841.

10. Рачинский A.З. Клонирование и экспрессия в E. coli GAG-подобного белка gypsy (мдг4) / A.З. Рачинский, О.А. Tyрапов, А.С. Степанов, Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 1997. -  Т.357. - № 4. - С. 554–557.

11. Сёмин Б.В. Связывание с нуклеиновыми кислотами белка, кодируемого первой открытой рамкой считывания ретротранспозона gypsy(МДГ4) / Б.В.Сёмин, О.А. Tyрaпoв, А.С. Степанов и  Ю.В. Ильин //  Молекулярная биология. - 1999. – Т.33. - № 3. - С.  423-427.

12. Syomin B.V. Drosophila melanogaster endogenous retrovirus gypsy can propagate in Drosophila hydei cells / B.V. Syomin, L.I. Fedorova, S.A. Surkov, Y.V. Ilyin // Molecular and General Genetics. -  2001. - Vol. 264. - N. 5. - P. 588-594.

13. Маликова  M.А. Фосфорилирование белка, кодируемого первой открытой рамкой считывания ретротранспозона gypsy гомологичной и гетерологичной казеиновыми киназами типа2 / М.А. Маликова, Б.В. Сёмин Б, А.С. Степанов  // Биохимия. - 2001. -  Т.66. - № 2. - С. 254-260.

14. Сёмин Б.В. Экспрессированный  в бактериальной системе полипротеин Gag ретроэлемента gypsy(МДГ4) способен  формировать мультимерные комплексы /  Б.В. Сёмин, В.И. Попенко, М.А. Маликова, O.A. Tурaпoв, A.С. Степанов, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. -  2001. -  Т.380.- № 2. - С. 266-268.

15. Сёмин Б.В. Гомологичная и гетерологичная казеиновые киназы типа 2 одинаковым образом влияют на сродство структурного полипротеина Gag gypsy (МДГ4) к РНК/Б.В. Сёмин, М.А. Маликова, А.С. Степанов, Ю.В. Ильин //  Молекулярная биология. - 2002.-  Т.36. - № 1. - С. 40-42.

16. Сёмин Б.В. Ретротранспозон МДГ3 способен перемещаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании / Б.В. Сёмин, Т.Я. Леонова, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2002. - Т.36. -  N4. - С. 617-622.

17. Syomin B.V. Evidence for horizontal transfer of  the LTR retrotransposon mdg3 that lacks  an env-gene / B.V. Syomin, T. Leonova, Y.V. Ilyin // Molecular Genetics and Genomics. - 2002. - Vol. 267.  - N. 3. - P. 418-423.

18. Сёмин Б.В. Эрантивирусы Drosophila / Б.В.Сёмин, Ю.В. Ильин //  Генетика. - 2003. – Т.39. - № 5. - С. 657-663.

19. Сёмин Б.В. Распределение транскриптов ретротранспозона МДГ3 в культуре клеток / Б.В.Сёмин, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2003. – Т. 37. - № 4. - С. 634-636.

20. Сёмин Б.В. Функциональные мотивы, выявляемые в аминокислотной последовательности Gag ретровируса Gypsy / Б.В.Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 2004. – Т. 398. - № 3. - С. 419-421.

21. Сёмин Б.В., Pelisson A., Ильин Ю.В., Bucheton  А. Экспрессия структурного белка Gag ретровируса gypsy рекомбинантным бакуловирусом в культуре клеток Spodopterafrugiperda/ Б.В. Сёмин, А. Pelisson, Ю.В. Ильин, А. Bucheton // Доклады Академии Наук. - 2004. -  Т.398. - № 5. - С. 702-704.

22. Сёмин Б.В. Многообразие ДКП ретротранспозонов и механизмы их участия в реорганизации генома / Б.В.Сёмин, Ю.В. Ильин //  Генетика. - 2005. – Т. 41. - №4. - С. 542-548.

23. Сёмин Б.В. Детекция структурного белка (Gag) эндогенного ретровируса  МДГ4 (gypsy) в культивируемых клетках / Б.В.Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 2006. – Т. 408. - № 1. - С. 125-127.

24. Сёмин Б.В. Структуры, образуемые рекомбинантной формой белка Gag ретровируса Gypsy в бактериальных клетках / Б.В. Сёмин, Н.А. Казило, О.Г.Леонова Иванова Ю.Л., Ю.В. Ильин, В.И. Попенко // Доклады Академии Наук. - 2007. -  Т. 417. - № 3. - С. 414-416.

25. Сёмин Б.В. Структурный белок Gag  ретровируса D. melanogaster МДГ4 (gypsy) формирует вирусоподобные частицы в бактериальной клетке / Б.В.Сёмин, Л.А. Иванова, В.И. Попенко, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2011. – Т. 45. - №3. - С. 517–523.

Патенты:

26. Пат. № 2282854 Российская Федерация, МПК G01N 33/49, Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Б.В. Сёмин, М.И. Гулюкин; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2004138714/15; заявл. 30.12.04; опубл. 27.08.06, Бюл. №24.-5с.

Тезисы докладов:

27. Syomin B.V. Virus-like particles and RNA-DNA complexes of mobile genetic  elements in cultured cells of  Drosophila / B.V.Syomin, T.V. Gorelova, M.Sh. Kybaneishvili, N.G. Schyppe //Abstracts of 3-th Soviet Union  Symposium on Genetic of  Somatic  Cultured  Cells. -  Moscow. - 1986. - P. 42 -43.

28. Gorelova T.V. Reverse transcription intermediates of mobile genetic elements in Drosophila melanogaster  cells / T.V. Gorelova, M.Sh. Kybaneishvili, B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Abstracts of 2-d European Congress on Cell Biology. - 1986. - P.146.

29. Syomin B.V. Extrachromosomal nucleic acids of retrotransposones / B.V. Syomin, M.Sh. Kybaneishvili, N.G. Schuppe // Abstract of 6-th  Soviet Union Symposium «Molecular  mechanisms of genetical processes». -  Moscow. - 1987. - P.43.

30. Syomin B.V. Intracellular distribution of nucleotide sequences of Drosophila retrotransposones. - Abstracts of 6-th Soviet Union Symposium on problems of biology and genetics of  Drosophila. Odessa. - 1989. - P. 81.

31. Брауде-Золоторёва Т.Я. Совместное культивирование клеток Drosophila  melanogaster и Drosophila virilis in vitro влечёт интеграцию нуклеотидных последовательностей, гомологичных ретротранспозонам Drosophila  melanogaster в генои Drosophila virilis /Т.Я. Брауде-Золоторёва, Б.В. Сёмин // 4-й симпозиум по генетике культивируемых соматических клеток: Сб. науч. тр. - Москва-Звенигород. - 1989. - С.17.

32. Сёмин Б.В. Исследование специфичности РНК-белкового взаимодействия по первичным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям ретротранспозонов / Б.В. Сёмин, Ж.А. Пак // Симпозиум «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии»: Сб. науч. тр. - Москва-Самарканд. - 1991. - С.173.

33.  Syomin B.V. Experimental approach of LTR retrotransposons interspecific transfer / B.V. Syomin, L.I. Fedorova, S.A. Surkov, T.Ya. Leonova, Y.V. Ilyin // Abstract book of 42nd Annual Drosophila Research Conference. - March 21-25, 2001. - Washington DC. - USA. - 900C(A311)

34. Syomin B.V. Phosphorylation and interactions of a retrotransposon with the genome /  B.V. Syomin, M.A. Malikova, O.A. Turapov, A.S. Stepanov, Y.V. Ilyin.// Abstract book of 42nd Annual Drosophila Research Conference. - March 21-25, 2001. - Washington DC. - USA. - 407B (A144)

35. Syomin B.V. Are functions of gypsy nucleocapsid (NC) protein regulated by cellular partners? / B.V. Syomin, A. Pelisson, Y.U. Ilyin, A. Bucheton // 4-th International Retroviral NC Symposium. - 2003, September. - Strasburg, France.- P.92.

36. Cёмин Б.В. Патогенный потенциал эндогенных ретровирусов животных определен их способностью к межвидовому горизонтальному переносу /  Б.В. Cёмин, Ю.В. Ильин // Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний»: Сб. науч. тр. - Новосибирск. - 2004. - С. 78-79.

41. Kazilo N. The Gag homologue of Drosophila retrovirus Gypsy assembles into spherical particles in E. coli /N.Kazilo, O. Leonova, M. Leyzerovich, V. Popenko, Yu. Ilyin, B. Syomin //50-th Annual Drosophila Research Conference. - March 4-8, 2009. - Chicago, USA.  - (1015A). - P.146.

38. Сёмин Б.В. Экспрессируемый в бактериальной клетке структурный белок (GAG) ретроэлемента MДГ4 формирует два различных типа структур /  Б.В. Сёмин, О.Г. Леонова, В.И. Попенко, Ю.В. Ильин // XXIII  Российская конференция по электронной микроскопии: Сб. науч. тр. - Черноголовка. - 2010 г. - С. 423.

39. Сёмин Б.В. Создание наночастицы для молекулярной терапии в ветеринарии. // Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвящённой 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны: Сб. науч. тр. - М: ВИЭВ - С. 241-242.

 

 

 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.