WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Особенности гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией при различных формах респираторной патологии

Автореферат докторской диссертации

 

На правах рукописи

КРИВИЦКАЯ Вера Зорьевна

ОСОБЕННОСТИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ

С РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ РЕСПИРАТОРНОЙ ПАТОЛОГИИ

03.02.02-Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2012


2

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Санкт-Петербург

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор           Соминина Анна Адольфовна

Официальные оппоненты:


доктор медицинских наук


Найхин Анатолий Нойевич



доктор биологических наук


Жилинская Ирина Николаевна



доктор биологических наук


Ленева Ирина Анатольевна


Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки

" Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека


часов на заседании Диссертаци-

Защита диссертации состоится   29 мая    2012 года в

онного совета Д 001.043.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова

15/17).


Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук


2012 г.


Суховецкая Вера Федотовна


3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Актуальность проведенного исследования определяется важной ролью, которую респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) играет в структуре инфекционной патологии дыхательного тракта. РСВ является одной из основных причин госпитализации детей первых двух лет жизни (Greenough А., 2009). Смертность от РСВ-инфекции (РСВИ), регистрируемая среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет, варьирует в различных странах в пределах 0-33%, достигая 37% при осложненном анамнезе (Welliver R., et al., 2010). Несмотря на то, что РСВИ представляет наибольшую опасность в раннем возрасте, РСВ является важным патогенетическим фактором в структуре респираторных заболеваний всех возрастных групп (Walsh E., 2011). Факторами риска для осложненного течения РСВИ являются ранний и престарелый возраст, наличие кардио-пульмонологических заболеваний, иммунодефицитных состояний. Среди взрослых реципиентов трансплантатов различных органов РСВИ принимает тяжелые формы и может являться причиной смерти 30-100% пациентов (Whimbey E.and Ghosh S., 2000). Адаптивный иммунитет, формирующийся в результате перенесенной РСВИ как у детей (с еще незрелой иммунной системой), так и у взрослых, является краткосрочным и не обеспечивает полную противовирусную защиту, что является одной из причин реинфекций, наблюдаемых на протяжении всей жизни (Murry A. and Dowell S., 1997). Материнские анти-РСВ антитела, содержащиеся в крови новорожденных, также не гарантируют полную защиту от инфицирования (Vangeel I. et al., 2007). Долгосрочные наблюдения показывают, что поражение нижних дыхательных путей в результате этой инфекции может повлечь за собой функциональную дыхательную недостаточность, регистрируемую в течение последующих 3-4 лет (Ogra Р., 2004). До 70% маленьких детей, госпитализированных с РСВ- бронхиолитами, подвержены рецидивирующим эпизодам бронхообструкции в течение последующих 6-12 лет (Hyvбrinen М. et al., 2007), что связано с риском развития в дальнейшем бронхиальной астмы. РСВИ способствует развитию хронических легочных заболеваний у взрослых - хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), а также бронхиальной астмы (Чучалин А., и др., 2007; Travйs S. and Proud D., 2007).

В большинстве случаев РСВИ протекает в виде обычного ОРЗ. Причины и механизмы осложненного течения РСВИ (бронхиолита, бронхита или пневмонии) и ее отдаленных последствий до конца не ясны и являются в настоящее время предметом интенсивного изучения. В последние годы было показано, что ключевую роль при этом играет нарушение баланса Thl/Th2-зависимых регуляторных механизмов со сдвигом в сторону активации Тп2-опосредованных реакций, оказывающих патогенное действие (Becker Y., 2006). РСВ обладает мощным иммуномодулирующим потенциалом. Индуцируемая им патология может быть обусловлена как супрессией, так и гиперактивацией различных типов иммуно-компетентных клеток. Баланс между протективными и патологическими иммунными реакциями весьма подвижен. В зависимости от конкретных условий (состава локальной ци-токинной среды, генетической предрасположенности, наличия сопутствующих заболева-


4

ний) одни и те же иммуннологические механизмы могут индуцировать как противовирусную защитную, так и патологические реакции (Oshansky С. et al., 2009). Такая двойственность присуща также гуморальному противовирусному иммунитету. В модельных опытах было показано, что наряду с противовирусным протективным действием РСВ-специфические антитела могут принимать участие в иммунопатологических механизмах, обуславливающих тяжелое течение экспериментальной РСВИ у лабораторных животных.

Большинство исследований, изучающих патогенез РСВИ, выполнено в модельных экспериментах на животных, которые не всегда адекватно отражают процессы, протекающие в организме человека. До сих пор при изучении закономерностей противовирусного иммунитета преобладают исследования, посвященные Т-клеточным реакциям. Механизмы В-клеточного иммунитета изучены в значительно меньшей степени. О характере гуморального анти-РСВ иммунитета у инфицированных больных до сих пор можно судить главным образом на основании работ, выполненных 20-30 лет назад, что свидетельствует о недостаточной изученности проблемы на современном уровне. При этом некоторые недавно обнаруженные особенности патогенеза РСВИ указывают на необходимость изучения закономерностей именно В-клеточного иммунного ответа. Так, из двух основных поверхностных гликопротеинов (F и G) образование анти-РСВ протективных цитотоксических CD8+ Т-клеток вызывает только F-белок. При этом вируснейтрализующие антитела формируются в ответ на воздействие обоих гликопротеинов (de Waal L. et al., 2006). Для защиты от РСВ необходимы высокоаффинные AT к G-белку, что обусловлено патогенным действием на иммунную систему определенных антигенных детерминант этого гликопротеина. Кроме того РСВ обладает уникальной для респираторных вирусов особенностью - наличием секреторной формы G-белка (sG), играющей в организме роль «антигенной ловушки» для нейтрализующих AT (Bukreyev A. et al., 2008). Эти особенности структуры РСВ должны быть учтены при создании вакцинных препаратов.

Объектом клинических исследований являются преимущественно дети до двух лет жизни с первичными РСВИ. Однако модельные эксперименты свидетельствуют о том, что механизмы противовирусной гуморальной защиты, так же как и иммунопатологии, в том числе обусловленные действием AT, различны при первичном и повторном инфицировании. Недостаточное понимание этого аспекта патогенеза РСВИ привело к трагическим последствиях при введении детям инактивированной формалином РСВ-вакцины. Этот тип вакцин без патогенных последствий был применен при вакцинации против гриппа и некоторых других ОРВИ. Однако в случае РСВ введение препарата привело к осложненному течению первичной РСВИ (с несколькими летальными исходами) по сравнению с непривитыми детьми грудного возраста (Kim Н. et al.,1969). Такого негативного эффекта не было показано в группах старших детей, уже перенесших РСВИ до вакцинации (Waris М. et al., 1997). Этот пример ясно показал необходимость расширения возрастных рамок при изучении закономерностей формирования гуморального РСВ-специфического иммунного ответа у пациентов.


5

Изучению РСВ-специфического гуморального ответа у пациентов с точки зрения соотношения активности иммуноглобулинов различных изотипов посвящены лишь единичные работы. Тем не менее, результаты модельных экспериментов показывают значимость изучения этого вопроса. Например, показана патогенная роль анти-РСВ IgE, связь этих AT с развитием аллергических реакций, характерных для тяжелого течения РСВИ: легочной эозинофилии и повышенной гиперреактивности дыхательных путей (Dakhama A. et al., 2009).

Изотипическая структура противовирусного гуморального ответа дает определенное представление об особенностях регуляторных механизмов и характере патогенеза заболевания. Соотношение активности антиген-специфических IgG2a/ IgGl традиционно рассматривается как показатель баланса между протективным Thl и патогенным Th2 -типом иммунного ответа у мышей (Nuriиva R., and Chung Y., 2010), в том числе при характеристике гриппозной инфекции и свойств гриппозных вакцин. Отсутствие соответствующей информации затрудняет понимание механизмов патогенеза РСВИ, и той роли, которую играют при этом РСВ-специфические AT.

Решение этих вопросов может быть осуществлено с использованием иммунофер-ментного анализа. Иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для серодиагностики РСВИ производятся целым рядом зарубежных фирм, однако спектр РСВ-специфических иммуноглобулинов (Ig), которые можно детектировать с их помощью, ограничен тремя изотопами - G, М и А. Нет коммерческих ИФТС для выявления анти-РСВ IgE и субклассов IgG. Все вышеизложенное определяет необходимость создания отечественных иммунофер-ментных тест-систем, позволяющих проводить углубленный анализ изотипической и сайт-специфической структуры анти-РСВ гуморального ответа у больных. Создание чувствительных серологических тест-систем имеет также важное практическое значение. Поскольку симптомы РСВИ и гриппа сходны клинически, РСВИ в период эпидемии гриппа остаются во многих случаях нераспознанными. Необходимость дифференциальной диагностики РСВИ и назначения своевременного лечения диктуется тем, что РСВ значительно чаще, чем другие респираторные вирусы, вызывает развитие иммунопатологических проявлений в легких (Walsh E. et al., 2007).

Цель работы состояла в сравнительной оценке структуры и особенностей РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в зависимости от формы бронхолегочной патологии и возраста пациентов с использованием разработанных иммуноферментных тест-систем моноклонального типа.

Задачи исследования

1. Сконструировать иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для детекции в сыворотках крови РСВ-специфических антител различных классов и подклассов (IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE), а также выявления IgG, взаимодействующих с функционально значимыми консервативными эпитопами F- и G- белков РСВ.


6

  1. С применением сконструированных ИФТС охарактеризовать особенности реагирования РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов в зависимости от возраста пациентов и характера заболевания.
  2. Охарактеризовать вируснейтрализующую активность антител в сыворотках крови пациентов с различными клиническими формами РСВИ.
  3. Оценить влияние перенесенной ранее РСВИ на течение последующих респираторных заболеваний.
  4. Провести сравнительную оценку иммунного ответа, направленного к консервативным эпитопам F- и G- белков РСВ,   у пациентов с РСВИ.

6.Проанализировать влияние материнских антител на характер РСВ-специфического гуморального ответа, формирующегося у детей при первичном заболевании.

7.    Провести сравнительную оценку формирования аутореактивных антител при

респираторных вирусных заболеваниях различной этиологии.

8.  Оценить in vitro и in vivo иммуногенные и протективные свойства препаратов,

созданных на основе синтетического пептида, имитирующего структуру части главного

нейтрализующего домена F- белка РСВ.

Научная новизна работы. Впервые в России сконструированы ИФТС для детекции РСВ - специфических Ig семи изотипов (М, A, E, GМ, G2, G3, G4), а также ИФТС на основе синтетических пептидов (СП), представляющих структуру иммунодоминантных эпитопов F- и G- белков РСВ, для выявления эпитоп-специфичных IgG. Разработанные ИФТС позволяют проводить углубленный анализ структуры анти-РСВ гуморального иммунного ответа.

С использованием разработанных ИФТС впервые проведена комплексная сравнительная оценка ответа со стороны РСВ-специфических AT различных классов и субклассов в зависимости от возраста и формы заболевания пациентов. В соответствии с соотношением активности ответа Thl- и Тп2-регулируемых AT определен тип РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в различных группах пациентов. Впервые проведена сравнительная оценка ответа со стороны Th2-зависимых анти-РСВ IgE и IgG4 при РСВИ у детей и взрослых, осложненной аллергическим компонентом. Полученные данные дополняют существующие представления о патогенезе РСВИ.

Впервые показано, что характерной особенностью осложненного течения повторных РСВИ как у детей, так и у взрослых, является активность РСВ-специфических IgM, значительно более высокая, чем при неосложненном течении заболевания.

Впервые показаны изменения иммунодоминирования при ответе на В-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов РСВ у пациентов с РСВ-реинфекциями в зависимости от характера заболевания. Полученные результаты дополняют данные литературы о механизмах иммунодоминирования среди Т-клеточных детерминант РСВ.

Впервые показано негативное влияние материнских IgG, специфичных к консервативным антигенным детерминантам поверхностных гликопротеинов РСВ, на характер РСВ-специфического иммунного ответа, формирующегося у детей в возрасте до 10 месяцев при первичном заболевании.


7

Впервые выявлен синтез аутореактивных IgM и IgG у пациентов с осложненными формами РСВИ.

Впервые синтезированы препараты с использованием синтетического пептида, имитирующего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка РСВ, и оценены его иммуноген-ные и протективные свойства.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Сконструированные ИФТС для детекции РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов рекомендуется использовать как при серодиагностике РСВИ, так и при оценке роли РСВИ в структуре инфекционной респираторной патологии среди различных групп пациентов.
  2. Изотипическая структура РСВ-специфического ответа, оцененная с использованием разработанных ИФТС, отражает особенности гуморального иммунитета, характерные для определенного возраста и присущие различным формам бронхолегочной патологии при РСВИ.

3.     Осложненное течение РСВИ ассоциировано со                       сниженной вирус-

нейтрализующей активностью антител, а также повышенным уровнем синтеза "Не

регулируемых РСВ-специфических иммуноглобулинов.

  1. Перенесенная ранее РСВИ, осложненная аллергическим компонентов, показателем чего является высокое содержание в крови предсуществующих анти-РСВ IgE, оказывает негативное влияние на течение последующих респираторных заболеваний.
  2. Характер иммунодоминирования при ответе на В-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов РСВ меняется у РСВ-инфицированных лиц в зависимости от клинической формы заболевания.
  3. Пассивно приобретенные материнские IgG, специфичные к консервативным детерминантам F-белка (аминокислотная последовательность 221-232) и G- белка (последовательности 152-164 и 184-198) РСВ, оказывают негативное влияние на формирование адаптивного РСВ-специфического гуморального иммунного ответа при первичном инфицировании детей.
  4. При осложненном течении РСВИ наблюдается интенсивный синтез аутореактивных IgM и IgG.
  5. Препараты, сконструированные с использованием синтетического пептида, представляющего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка РСВ (аминокислотная последовательность 221-232), оказывают иммунопатогенное действие на лабораторных животных.

Практическая значимость результатов работы. Сконструированные ИФТС для детекции анти-РСВ Ig различных изотипов рекомендуется использовать для подтверждения диагноза РСВИ, а также для оценки протективной и потенциально патогенной составляющих РСВ-специфического иммунитета.

Выявление РСВ-специфических IgE на ранних сроках заболевания позволит снизить риск отдаленных последствий перенесенной инфекции, в том числе рецидивирующей брон-хообструкции и формирования хронической бронхолегочной патологии в более зрелом воз-


8

расте. Высокое содержание в крови анти-РСВ IgE является прогностическим показателем повышенного риска осложненного течения последующих респираторных заболеваний.

Для оценки вируснейтрализующей активности РСВ-специфических AT был предложен новый вариант постановки реакции нейтрализации (РН) с оценкой результатов в мик-рокультуральном ИФА при использовании вирусспецифических МКА. Этот метод может быть применен в эпидемиологических исследованиях для определения уровня защищенности населения от РСВИ.

Детекция анти-РСВ IgA в сыворотках крови непрямым ИФА предложена в качестве диагностического теста, показавшего высокую эффективнось при выявлении заболевания у детей первых лет жизни. Простота исполнения позволяет применять этот метод в практических лабораториях.

Низкое содержание в крови предсуществующих IgG, взаимодействующих с синтетическими пептидами, имитирующими структуру антигенных детерминант, функционально значимых для репродукции РСВ, может служить прогностическим показателем для выявления контингентов с повышенным риском РСВ-инфицирования. Этот подход может быть использован при изучении группового гуморального РСВ-специфического иммунитета.

Внедрение результатов работы. По результатам Госиспытаний получен Сертификат производства (СП № 002907, июнь 2010) на производство медицинского иммунобиологического препарата «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-PC-IgG)». ИФТС внедрена в практику и используется для диагностики РСВИ в клиниках и ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии» на территории России.

Опытные образцы сконструированных ИФТС для детекции анти-РСВ Ig различных изотипов прошли первичную апробацию в стационарах С.-Петербурга.

Методические рекомендации по детекции специфических иммуноглобулинов различных изотипов к вирусам гриппа и ОРЗ иммуноферментным методом приведены в «Практических рекомендациях по лабораторной диагностике вирусных инфекций» (С.Петербург, 2005).

Работа выполнялась в рамках плана НИР ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразви-тия РФ, начиная с 1995г, а также по темам, выполненным в 2002 - 2003гг в рамках Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", Генеральным Заказчиком которой являлось Министерство промышленности, науки и технологий Российской Федерации.

Личный вклад автора в проведенные исследования состоял в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, разработке методологии, выборе моделей, статистической обработке, анализе полученных результатов и формулировке научных положений. Вклад соавторов выражается в предоставлении клинических материалов (Суховецкая В.Ф., Головачева Е.Г., Львов Н.И., Войцеховская Е.М.), результатов лабораторной диагностики РСВИ, проведенной в РСК и изоляции вирусов в культуре клеток (Голованова А.К.),  иммунофлуоресценции (Милькинт К.К.), ИФА-выявления антигенов


9

РСВ в клинических материалах (Амосова И.В.), предоставлении противовирусных моно-клональных AT (Сорокин Е.В., Царева Т.Р.). Автор выражает благодарность Зарубаеву В.В. за патоморфологический анализ, Васильевой И.А. и Головачевой Е.Г. за предоставление данных об интерфероновом статусе обследованных нами пациентов, Смирновой Т.Д. за предоставление клеточных культур, Власову Г.П. за синтез пептидных препаратов, Н.Н. Хромову-Борисову за предоставление авторской статистической программы SANCT.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту д.м.н. А.А. Сомининой за помощь в организации исследований, консультации при обработке материала и оформлении диссертации.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были отражены в тезисах, представленных в сборниках трудов национальных, Всероссийских и международных конференций и конгрессах, в том числе: Пятом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1995), Шестом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), Юбилейной международной научной конференции «Грипп -XXI век» (С.-Петербург, 1997), Всероссийской научной конференции «От Materia Medica к современным медицинским технологиям» (С.-Петербург, 1998), Eropean Respiratory Society Annual Congress (Geneva, 1998), Восьмом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1998), Девятом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва 1999), World Congress on Lung Health and 10 E.R.S. Annual Congress, (Florence, 2000), 11 European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, (Istanbul, 2001), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001), Девятом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2002), Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004), Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (С.-Петербург, 2011).

Материалы исследования были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.А.Смородинцева «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 35-летию НИИ гриппа РАМН «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (С.-Петербург, ноябрь 2004), Четырнадцатом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (С.-Петербург, 2003 и 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 статей (из них 16 - в журналах, рекомендованных ВАК), и 23 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав изложения результатов собственных исследова-


10

ний, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на страницах текста, включая 15 таблиц и 46 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 350 источников, из них   20 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинические материалы были получены от пациентов с респираторными заболеваниями из детских городских больниц №4 и №5, Инфекционной больницы №30 им СП. Боткина и Военно-медицинской академии им С.М.Кирова (Санкт-Петербург) в 2000-2007гг. Диагностирование РСВИ проводили комплексом лабораторных методов: выделения вируса из носоглоточных смывов и соскобов в культуре клеток, детекции вирусных антигенов (АГ) в эпителиальных клетках из носовых ходов прямым иммунофлуоресцентным методом с использованием ФИТЦ-конъюгатов, выпускаемых "Предприятием по производству диагностических препаратов" (С.-Петербург), а также сэндвич-ИФА, выявления сероконверсий анти-РСВ AT в реакции связывания комплемента, ИФА и реакции нейтрализации. Клетки, вирусы,  вирусспецифические моноклональные антитела (МКА). В работе использовали перевиваемые культуры клеток MA-104 и MDCK, а также диплоидную культуру фибробластов легких эмбрионов человека (ФЛЭЧ)   из банка клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ. РСВ, штамм Long , был получен музеем вирусов НИИ гриппа из National Institute for Medical Research, London. Вирус парагриппа 2 типа, аденовирус 6 типа, вирусы гриппа Аи В были предоставлены музеем вирусов НИИ гриппа. Все использованные в работе МКА, специфичных к F-белку РСВ, гексонному АГ аденовирусов, ??-белку вирусов гриппа А или В, были получены в лаборатории диагностических препаратов НИИ гриппа.

Культивирование вируса и получение антигенного вирусного материала. РСВ культивировали в бессывороточной среде в культуре клеток MA-104. Очистку и концентрацию вируса проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахаразы по методу Orvell (Orvell С. et al., 1987). Полученный цельновирионный РСВ (РСВ-ЦВ) хранили при -75°С. Для контроля контаминации посторонними вирусными агентами в полученном РСВ проводили электронно-микроскопический анализ и непрямой ИФА с МКА, специфичными к различным вирусам ОРЗ. Антигенную активность вирусного материала оценивали непрямым ИФА с использованием МКА, специфичных к F-белку РСВ.

Иммунологические методы для характеристики антител. Детекцию РСВ-пецифических иммуноглобулинов (Ig) изотипов G, GМ, G 2, G3, G 4, A, E в сыворотках крови проводили непрямым ИФА с использованием в качестве АГ для сенсибилизации твердой фазы очищенного РСВ-ЦВ и пероксидазных конъюгатов МКА к соответствующим изотипам Ig человека (НПО "Полигност", С.-Петербург). Оценку AT класса G, специфичных к функционально значимым эпитопам поверхностных гликопротеинов РСВ, проводили непрямым ИФА с использованием для нанесения на твердую фазу синтетических пептидов (СП), имитирующих первичную структуру консервативных аминокислотных последовательностей


11

(??) F- и G- белков РСВ. Детекцию аутореактивных антител классов М и G в сыворотках крови людей оценивали непрямым ИФА с использованием в качестве АГ донорского IgG человека (Предприятие НИИ им.Пастера, С.-Петербург), солюбилизированных неионным детергентом ?-октилглюкозидом (Sigma, США) белков клеток ФЛЭЧ, а также гепарина (ОАО «Синтез», г. Курган) в качестве аналога клеточного гепаран сульфата. Непрямой ИФА был применен также для оценки содержания IgG различной специфичности в сыворотках крови лабораторных животных. Детекцию связавшихся с антигенами AT в сыворотках кроликов проводили с помощью пероксидазного конъюгата стафилококкового белка А (Производство при НИИ им.Пастера, С.-Петербург) или анти-мышиных AT козы, меченных пероксидазой (Sigma, США), в сыворотках мышей. Выявление анти-РСВ IgM в сыворотках пациентов проводили ИФА «с захватом IgM» с использованием на стадии захвата МКА М/2В9 к мю-цепи молекулы IgM человека (НПО "Полигност", С- Петербург) и МКА к F-белку РСВ, меченных пероксидазой, на стадии детекции.

Конкурентный ИФА с использованием СП применяли для детекции AT определенной эпитопной направленности в сыворотках пациентов, перенесших РСВИ. Для стандартизации результатов, полученных в лаборатории в течение ряда лет, средний групповой уровень анти-РСВ AT всех классов и субклассов представляли в виде нормализованного показателя OD450/OD450K+, где OD450 - средняя арифметическая всех индивидуальных показателей, полученных для исследуемых пробы, OD450 К+ - содержание Ig исследуемого изотипа в высокотитражных сыворотках (внутренний лабораторный положительный контроль), используемых в рабочих разведениях в качестве референс-препарата во всех опытах. При анализе содержания AT в ИФА использовали сыворотки в одном разведении: 1/400 , 1/200, 1/100 , 1/10, 1/400, 1/20, 1/40, 1/80 для Ig изотипов G, М, A, E, G1, G2, G3, G4, соответственно.

Методы выявления вирусных антигенов. Для оценки репродукции вирусов в культуре клеток был разработан планшетный вариант микрокультурального ИФА с оценкой содержания внутриклеточных вирусных белков с помощью вирусспецифических МКА, меченных пероксидазой. Сэндвич-ИФА с использованием МКА к F-белку РСВ на стадии захвата и их пероксидазного конъюгата на стадии детекции применяли при выявлении антигенов РСВ в вируссодержащем жидком материале.

Оценку вирус-нейтрализующей активности анти-РСВ антител проводили с применением разработанного варианта реакции нейтрализации с учетом результатов ингибирова-ния репродукции вируса в присутствии AT микрокультуральным ИФА. Конкурентная нейтрализация с использованием СП была применена для оценки содержания в сыворотках нейтрализующих AT, взаимодействующих с определенными эпитопами поверхностных белков РСВ.

Определение содержания цитокинов: интерферона-? (IFN -а), интерферона-? (IFN-y ), IL-8, TNF-a, IL-lRa, G-CSF осуществляли с помощью ИФА-тест-систем производства ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов (С.-Петербург).


12

Синтетические пептиды, имитирующие первичную структуру функционально важных детерминант F и G- белков РСВ, а также их конъюгаты были синтезированы в НИИ высокомолекулярных соединений (С.-Петербург).

Работа с животными выполнялась согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава №724, от 13.11.1984 г). Мыши BALB/c и кролики были получены из ФГУП "Питомник лабораторных животных «Раппо-лово», РАМН, Ленинградская область.

Действие пептидных препаратов на репродукцию вирусов in vitro после совместного культивирования вирусов с СП оценивали по результатам ингибирования синтеза вирусных белков в микрокультуральном ИФА с помощью вирусспецифических МКА, а также по снижению инфекционной активности вирусов при последующем титровании вируссодер-жащего материала в культуре клеток.

Оценку иммуногенности пептидных препаратов проводили при иммунизации кроликов и мышей BALB/c. Животные были иммунизированы липопептидом, который представлял собой конъюгат СП, имитирующего аминокислотную последовательность вирус-нейтрализующего домена F-белка РСВ (АП221-232), с альдегидом лауриновой жирной кислоты (F-SP12-LA), а также конъюгатом СП с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Динамику образования IgG, взаимодействующих с СП, РСВ и невирусными антигенами, определяли в крови иммунизированных животных непрямым ИФА с нанесением на твердую фазу соответствующих антигено . Противовирусная активность AT из сывороток крови была определена в микрокулыуральной реакции нейтрализации.

Протективное действие пептидных препаратов было оценено после интраназального инфицирования (50 мкл культуральной жидкости, содержащей 10 ТЦД50 РСВ) предварительно иммунизированных мышей BALB/c по результатам детекции вирусных АГ (в сэн-двич-ИФА), а также анализа инфекционной активности РСВ (в микрокультуральном ИФА после титрования вируса), содержащегося в легких животных.

Гистологический анализ фиксированных 10% формалином срезов, приготовленных из органов животных, проводили под световым микроскопом. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином и оценивали общую структуру ткани, интенсивность некротических процессов и клеточный состав инфильтрата.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютеризированных программ, включая «Statistica» (версия 6) и DAG-Stat. Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики - среднее арифметическое, стандартное отклонение, среднегеометрические титры. Были применены непараметрические критерии Манна-Уитни (для независимых выборок), знаковых рангов Уилкоксона (для связанных совокупностей), корреляционный анализ Спирмена. При множественных попарных сравнениях независимых выборок на одном массиве данных использовали критерий Данна после проведения рангового дисперсионного анализа Круске-ла-Уоллиса. Для оценки качественных признаков применяли точный критерий Фишера с учетом поправки на множественность по методу Шидака. Мерой  связи между двумя каче-


13


ственными измерениями служил коэффициент ассоциации Пирсона. Степень согласованности результатов, полученных двумя различными методами на одной выборке, оценивали по величине Каппы Коэна. Проверяемые критериями нулевые гипотезы отвергались при уровне значимости р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование иммуноферментных тест-систем для детекции РСВ-специфических антител различных классов и подклассов

При создании ИФТС в качестве антигенного материала использовали цельновирион-ный РСВ (РСВ-ЦВ), очищенный и сконцентрированный в градиенте плотности сахарозы. Степень антигенной сохранности вирусного материала, являющейся критическим показателем для качества тест-систем, и отсутствие в нем контаминации посторонними агентами оценивали в ИФА с использованием МКА 9С5 или RS-25, направленных к F-белку РСВ, а также панели МКА, специфичных по отношению к гетерологичным вирусам. Целостность и структурированность вирусных частиц оценивали с помощью электронной микроскопии. Эффективное выявление сероконверсий анти-РСВ IgG в сыворотках пациентов, перенесших РСВИ, наблюдалось при использовании вирусного материала, состоящего преимущественно из неповрежденных вирионов (по данным электронной микроскопии), активно взаимодействующих в ИФА с РСВ-специфическими МКА. Чувствительность метода снижалась на 30 - 80% при использовании морфологически неполноценного РСВ с нарушенной целостностью вирусной гликопротеидной оболочки.

Оценка качества антигенного материала, используемого в сконструированных ИФТС, была проведена в сравнении с антигеном из тест-системы для детекции анти-РСВ IgG производства фирмы «Virion» (Швейцария). Более высокая интенсивность реагирования с РСВ-специфическими МКА свидетельствовала о преимуществе полученного нами антигенного вирусного материала (рис.1). 1,2

Для детекции в сыворотках анти-РСВ AT классов G, А и М, а также подклассов G1, G2, G3, G4 были сформированы ИФТС, работающие по принципу непрямого ИФА. Анти-РСВ AT, связавшиеся с вирусными антигенами (АГ), сенсибилизированными на твердой


14

фазе, детектировали пероксидазными конъюгатами мышиных МКА, направленных к определенному изотипу иммуноглобулина (Ig) человека (ООО "Полигност", С.-Петербург).

Диагностическая эффективность разработанных ИФТС была оценена при сравнении с результатами, полученными другими лабораторными методами.

Так, результаты выявления сероконверсий РСВ-специфических AT класса G в ИФА и реакции нейтрализации (РН), которая является наиболее чувствительным серологическим методом, показали высокую степень согласованности при анализе сывороток, полученных от 102 пациентов с ОРВИ: Каппа Коэна составила 0,78 (р<0,001). Чувствительность и специфичность ИФА по сравнению с РН составила 86,7% и 93,0%, соответственно. При этом частота диагностирования РСВИ с использованием ИФТС была в 1,5 раз выше, чем в РСК.

Согласно Программе, утвержденной Комитетом МИБП Минздрава РФ, были проведены Госиспытания изделия медицинского назначения «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-PC-IgG)» при сравнении с ИФТС RSV-IgG-ELISA фирмы «NovaTec» (Германия). Чувствительность ИФТС-РС- IgG (НИИ гриппа) в сравнении с лицензированным зарубежным аналогом составила 94,4%, специфичность - 95% при общем совпадении результатов 94,7%.

Преимуществом данной ИФТС, в которой для детекции связавшихся с РСВ AT класса G используются МКА к общему молекулярному маркеру IgG человека, по сравнению с разработанной нами ранее тест-системой с использованием стафилококкового белка А (Кривиц-кая и др., 1991), является детекция IgG всех субклассов в совокупности. В то время как белок А не взаимодействует с IgG3 человека, что снижает чувствительность анализа.

По результатам Госиспытаний получен Сертификат производства (СП № 002907, июнь 2010) на производство медицинского иммунобиологического препарата «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-PC-IgG)» (действителен до 30 июня 2013г).

Следующим этапом работ являлось конструирование изотопических ИФТС. Специфичность разработанных тест-систем была подтверждена при анализе парных сывороток, полученных от 460 пациентов с ОРЗ различной не РСВ-этиологии. Отсутствие РСВИ было подтверждено комплексом лабораторных методов. Частота выявления неспецифических сероконверсий составила 0,2-0,4%) для AT субклассов Gl, G2, G3, G4 и 1,9-2,2%) для IgE и IgA.

Помимо ИФТС, основанных на принципе непрямого ИФА, для выявления анти-РСВ AT класса М была сконструирована тест-система, в которой использовался принцип «захвата IgM». Такой подход позволяет избежать ложноположительных результатов, свойственных методу непрямого ИФА при оценке AT этого класса из-за присутствия в сыворотках «нормальных» аутореактивных IgM. Специфичность сконструированной ИФТС, показанная при выявлении анти-РСВ IgM в сыворотках пациентов с ОРВИ и здоровых лиц, составила 94%. Данный тип ИФТС с успехом был использован для раннего диагностирования РСВИ, поскольку сыворотки 50-60% детей с лабораторно установленной РСВИ были положитель-


15

ными по содержанию анти-РСВ IgM на 2-7 день заболевания. На 8-14 день РСВИ этот показатель увеличивался до 70-80%.

Частота детекции анти-РСВ Ig различных изотипов была оценена при анализе парных сывороток, полученных от пациентов различных возрастных групп с лабораторно подтвержденной РСВИ (табл.1).

Таблица 1 — Частота детекции сероконверсий анти-РСВ AT разных классов и под

классов у пациентов с документированной РСВИ, полученная с использованием

разработанных ИФТС     ________________________________________________________

Группы пациентов

Число пациентов

Частота регистрации сероконверсий РСВ-специфичных AT (%) следующих изотипов:

IgG

(общий)

IgM

IgGl

IgG2

IgG3

IgG4

IgA

IgE

IgM+ IgG

+IgA (в совокупности)

Дети до 3 лет с первичной РСВИ

36

47

72

31

11

44

31

50

39

100

Дети и подростки от 3 до 18 лет

88

60

78

50

30

41

34

28

40

98

Взрослые пациенты (старше 18 лет)

115

70

50

50

45

38

29

37

32

92

Детекция сероконверсий по субклассам IgG (особенно IgGl) позволила увеличить частоту диагностирования РСВИ на 20-30% по сравнению с результатами, полученными при выявлении только общего IgG. При совокупном анализе общего IgG и сывороточного IgA частота диагностирования РСВИ у детей младшего возраста с первичной РСВИ возрастала в 1,5 раз. Сероконверсий анти-РСВ IgA с наибольшей частотой регистрировали при первичных РСВИ у маленьких детей. Известно, что при первичном инфицировании диагностирование РСВИ по выявлению конверсии вирусспецифических IgG затруднено в силу достаточно низкого уровня их синтеза, а детекция IgM в ИФА «с захватом AT» связана с решением многих проблем методического характера. В этой связи, оценка сероконверсий анти-РСВ IgA в непрямом ИФА может быть предложена в качестве простого и эффективного теста для серодиагностики РСВИ у маленьких детей.

Таким образом, ИФТС, разработанные нами для детекции анти-РСВ AT класса G и М, обладают высокой эффективностью при диагностировании РСВИ в различных группах пациентов. Выявление сероконверсий IgGl и IgA может служить дополнительным диагностическим тестом. ИФТС данного типа могут быть использованы при оценке роли РСВИ в структуре инфекционной респираторной патологии среди групп населения.

В табл. 2 представлены данные о заболеваемости РСВИ среди детей, госпитализированных с респираторными заболеваниями в клиники г.С.-Петербурга, полученные по результатам комплекса лабораторных методов, в том числе с учетом ИФА-серодиагностики. Показано, что с наибольшей частотой РСВИ была диагностирована при пневмонии, об-структивных заболеваниях- остром стенозирующем ларинготрахеите (СЛТ) и остром об-структивном бронхите ( ООБ), а также у пациентов с бронхиальной астмой в стадии обострения. С наибольшей частотой РСВИ регистрировали при развитии стеноза гортани и брон-хообструкции у детей в возрасте до 3 лет.


16

Таблица 2 — Частота выявления РСВИ среди госпитализированных детей с респираторными заболеваниями

Группа пациентов

Средний возраст

Диагноз

Численность групп

Частота Выявления РСВИ (%)

Дети в возрасте

от 6 месяцев

до 3 лет

1,3 года

ОРЗ

70

39

Острый стенозирующий ларинготра-хеит (СЛТ)

27

52

Острый обструктивный бронхит ЮОБ)

44

66

Дети и

подростки

в возрасте

от 3 до18 лет

7,2 года

ОРЗ

179

28

Острый бронхит

28

29

Острый стенозирующий ларинготра-хеит

90

28*

Острый обструктивный бронхит

70

46 **

Бронхиальная астма

63

43

Острая пневмония

47

47

Различия между возрастными группами пациентов с СЛТ (* - р = 0,002 ) и ООБ ( ** - р = 0,035)

Сравнительная оценка реагирования РСВ-специфических Ig различных изо-типов у детей и взрослых в зависимости от формы бронхолегочной патологии

По современным представлениям характер иммунного ответа на чужеродные агенты, включая вирусы, во многом определяется типом цитокинной регуляции, обусловленным различными клетками, в том числе Т-хелперами 1 и 2 типа (Thl и Th2). При первом типе иммунного ответа (условно обозначаемом как Thl-тип) ключевыми регуляторами являются интерферон-гамма (IFN-y ), IL -2 и IL-12. При Тп2-типе иммунного ответа индуцируется синтез IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13. Гиперсекреция этих медиаторов наблюдается также при многих иммунопатологических проявлениях.

Анализ литературы показывает, что обычно при отсутствии осложнений РСВ индуцирует Thl- опосредованный протективный тип иммунного ответа. При неблагоприятных условиях может наблюдаться сдвиг в сторону Th2-зависимого иммунного ответа, что ассоциировано с осложненным течением РСВИ, а также риском развития иммунопатологии: длительной бронхолегочной гиперреактивности, бронхообструкции, аллергизации организма.

Механизм регуляции синтеза АГ-специфических Ig каждого изотипа в достаточной мере индивидуален. Так, дифференциальными регуляторами синтеза IgGl, IgG2, IgG3, к которым относятся вируснейтрализующие AT, являются, главным образом, Thl-факторы, включая IFN-y (Ngo-Giang-Huong N. et al., 2001; Al-Darmaki S. et al., 2004). Th2-опосредованные медиаторы регулируют синтез IgE (IL-4, IL-13), IgA (TGF-beta, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) и IgG4 (IL-4, IL-10, IL-13) (Ellyard J. et al., 2004; Aalberse R. et al., 2009). Синтез IgM у человека стимулируется in vitro как Thl-факторами - IL-12, IFN-aa, IFN-y , так и Th2- цитокинами IL-6, IL-10 (Estes D. et al., 1998; Ellyard J. et al., 2004).

Таким образом, анализ изотипической структуры анти-РСВ гуморального иммунного ответа может дать определенное представление об особенностях   регуляторных меха-


17

низмов при РСВИ, а также о соотношении ТЫ (протективных) и ТЪ2 (потенциально патогенных) составляющих, что имеет большое значение для понимания патогенеза данного заболевания. В этой связи представляло интерес выявление связи между характером ответа со стороны анти-РСВ Ig различных изотипов и клиническим течением заболевания.

После первичного скрининга более 1500 пациентов с ОРЗ с применением сконструированных тест-систем были проанализированы парные сыворотки, полученные в острый (2-4 день) и реконвалесцентный (7-20 день) периоды заболевания от ЗПпациентов (189 детей и 122 взрослых) с РСВИ, лабораторно подтвержденной комплексом методов, протекающей без осложнений или в осложненной форме (СЛТ, ООБ, ОП). Пациенты были разделены на 3 группы : дети в возрасте от 10 месяцев до 3 лет (преимущественно с первичными РСВИ), а также пациенты, уже болевшие РСВИ ранее, - дети от 3 до 18 лет и взрослые пациенты старше 18 лет. Средний возраст в группах составил 1,3 , 6,9 и 28 лет. Критерием первичного заболевания служило отсутствие анти-РСВ IgG в первые три дня РСВИ. Показателем повторного инфицирования служило выявление анти-РСВ IgG в сыворотках, полученных в первые дни заболевания. В группу сравнения были включены 463 пациента из тех же возрастных групп с респираторными заболеваниями не РСВ-этиологии, а также 70 здоровых детей старше 3 лет (средний возраст 11,2 лет) и 47 взрослых волонтеров (средний возраст 20,6 лет).

Оценка содержания РСВ-специфических IgG и у клинически здоровых лиц. Предварительный ИФА сывороток, полученных более чем от 500 здоровых лиц и пациентов с ОРЗ не РСВ-этиологии, показал, что у 100% лиц старше 3 лет вне зависимости от этиологии заболевания в крови содержались анти-РСВ IgG. Это служит свидетельством того, что к трем годам практически все хотя бы однажды переболевают РСВИ, что согласуется с данными литературы.

Определение содержания анти-РСВ IgG в сыворотках клинически здоровых людей дает представление о среднем возрастном уровне ТЫ -регулируемых «иммуноглобулинов памяти», призванных защищать организм от вирусных атак. Этот фон предсущест-вующих AT является результатом пролонгированной активности В-клеток памяти или длительно живущих плазматических клеток, возникших при перенесенных ранее эпизодах заболевания. Оценка активности AT, обладающих вирус-нейтрализующими свойства (IgGl, IgG2, IgG3), показала, что все 100% обследованных здоровых детей старше 3 лет и взрослых были серопозитивны по общему (без подразделения на подклассы) анти-РСВ IgG, в 79-83% случаев было показано высокое содержание РСВ-специфических IgGl. IgG2 и IgG3 были выявлены лишь у 6-10% детей и 21-32% взрослых. На основании этих результатов в сопоставлении с данными таблицы 1, свидетельствующими о достаточно высокой частоте ответа со стороны РСВ-специфических Ig субклассов G1 (31-50%), G2 (11-45%) и G3 (38-44%) при реинфекциях, можно предположить, что после перенесенных ранее РСВИ наиболее длительно сохраняются в крови противовирусные IgGl. IgG2 и IgG3 циркулируют в течение более короткого времени. В этой связи высокое содержание РСВ-специфических IgG2 или IgG3 в крови здоровых индивидуумов или пациентов с РСВИ в первые дни забо-


18


левания с большой степенью вероятности можно рассматривать как свидетельство недавно перенесенной инфекции. Этот критерий может быть использован при оценке влияния предшествующей РСВИ на течение последующих заболеваний.

Особенности реагирования РСВ-специфических IgGl, IgG2 и IgG3 в зависимости от клинической тяжести РСВИ и возраста пациентов

У детей младшего возраста при первичной РСВИ не наблюдалось зависимости реагирования вирусспецифических IgGl, IgG2, IgG3 от тяжести заболевания. Независимо от формы РСВИ наибольшее увеличение содержания в реконвалесцентной фазе по сравнению с острым периодом заболевания наблюдали со стороны IgG3. Реакция IgGl в среднем по группе была выражена слабее. Синтез анти-РСВ IgG2 практически отсутствовал. Сравнение с уровнем AT, выявленным в группе детей без РСВИ, показывает, что анти-РСВ IgG появляются в циркуляции в среднем после 4-5 дня заболевания (рис. 2).

Таким образом, в пределах каждой возрастной группы выявлено несоответствие между одинаковым содержанием анти-РСВ (вирус-связывающих) IgG и IgM, выявленным в ИФА в сыворотках реконвалесцентов с неосложненной и осложненной РСВИ, и сниженной активностью РСВ-нейтрализующих AT при осложненной форме заболевания. Эти данные свидетельствуют о сниженной нейтрализующей функции Ig, синтезируемых при РСВИ, осложненной бронхообструкцией у детей или пневмонией у взрослых, по сравнению с не-осложненным течением заболевания или о низкой доле вируснейтрализующих AT среди общего пула циркулирующих РСВ-специфичных AT.

Полученные результаты согласуются с известным положением о несовершенстве иммунной системы маленьких детей, а также об искажении иммунологических регулятор-ных процессов, при тяжелом течении РСВИ. Механизмы, обуславливающие низкую эффективность анти-РСВ гуморального иммунного ответа, до сих пор во многом не ясны.

Согласно полученным данным, одной из причин слабого нейтрализующего действия РСВ-специфических AT может быть отсутствие синтеза IgG2, показанное нами у детей в возрасте до 3 лет вне зависимости от формы заболевания, а также у пациентов старшего возраста с осложненным течением РСВИ. Известно, что Ig именно этого изотипа реагируют с гликозилированными сайтами протеинов различных патогенов. В этой связи IgG2 имеют для защиты от РСВИ особое значение. Гуморальная защита от РСВ зависит от AT, направленных к двум главным поверхностным белкам вируса - F и G, которые (особенно G-белок) обладают высокой степенью гликозилирования. Структура G-белка в этом отношении уникальна - две трети его молекулярной массы составляют углеводы (Mclntosh К., Channock R.M., 1990). Слабая активность AT по отношению к углеводной составляющей гликопротеинов РСВ может способствовать тому, что вирус избегает воздействия иммунной системы хозяина.

Детекция РСВ-специфическихх IgE и IgG4 у пациентов с различными формами бронхолегочной патологии

Характерной чертой осложненного течения РСВИ является иммунопатология, в том числе аллергические проявления (стеноз гортани, бронхообструкция), обусловленные гиперактивностью Тп2-опосредованных медиаторов (IL-4,IL-5,IL-13) (Oshansky С. et al., 2009).

В этой связи особую значимость при изучении патогенеза РСВИ приобретает исследование роли AT, регуляция которых обусловлена Тп2-зависимыми факторами (IgE и IgG4), поскольку синтез этих Ig связан с аллергическими проявлениями. Функции Ig этих изотипов при вирусных инфекциях мало изучены. Основные представления о механизмах их действия получены при изучении аллергических заболеваний. Показано, что аллерген-специфические IgE играют сенсибилизирующую роль, в то время как IgG4, наоборот, могут выполнять функцию блокаторов аллергических IgE-опосредованных реакций. В модельных экспериментах выявлена связь между высокой активностью анти-РСВ IgE и формировани-


24

ем у инфицированных РСВ животных повышенной гиперреактивности дыхательных путей и бронхоспазма (Dakhama A. et al., 2009).

В представленной работе впервые проанализировано соотношение активности РСВ-специфических IgE и IgG4 в зависимости от возраста и формы патологии пациентов.

У детей до 3 лет жизни с первичной РСВИ, протекающей без осложнений, средне-групповой уровень анти-РСВ IgE и анти-РСВ IgG4 как в острый, так и в реконвалесцент-ный периоды заболевания не отличался от базовых показателей, полученных для детей с ОРЗ не РСВ-этиологии. При наличии бронхообструкции (ООБ) активный синтез РСВ-специфических IgE наблюдали на 5-14 дни заболевания на фоне очень незначительного повышения содержания IgG4. Соотношение содержания IgE/IgG4 в реконвалесцентной фазе РСВИ составляло 0,8 ; 1,1 и 1,8 для ОРЗ, СЛТ и ООБ, соответственно. Таким образом, при первичной РСВИ высокая активность вирусспецифических IgE, не сопровождающаяся параллельным синтезом IgG4, ассоциирована с формированием бронхообструкции.

У детей старшего возраста при всех осложненных формах РСВ-реинфекций содержание РСВ-специфических IgE уже впервые 2 дня превышало (р < 0,05) уровень, наблюдаемый при неосложненном течении инфекции. Анализ динамики синтеза анти-РСВ AT показал, что при РСВИ, проходящей без осложнений, увеличение содержания IgG4 в крови наблюдалось на 3-4 день заболевания при отсутствии синтеза IgE.

При СЛТ высокая активность анти-РСВ IgE, регистрируемая до 7-8 дня заболевания, сопровождалась одновременным синтезом IgG4. Однако на 9-12 день, когда стеноз уже был компенсирован, уровень анти-РСВ IgE снижался, в то время как активность IgG4 продолжала возрастать. Наиболее тяжелое течение РСВИ с длительно сохраняющимися изменениями дыхательных функций наблюдалось в группах детей с ООБ и ОП. У этих пациентов активность анти-РСВ IgE значительно превышала таковую со стороны IgG4 на протяжении всего времени наблюдения (ООБ) или после четвертого дня заболевания (ОП) -рис.6.

У взрослых с неосложненным течением РСВИ (п=70) и ОП (=52) была показана принципиально та же закономерность. При неосложненном течении РСВИ наблюдали одновременное умеренное повышение синтеза IgE и IgG4 на 5-9 день заболевания. В эти же сроки при ОП содержание РСВ-специфических IgE значительно преобладало над IgG4 (р<0,001). На второй неделе заболевания содержание IgE и IgG4 в обеих группах приближалось к исходному. По сравнению с ОП у детей, у взрослых ответ со стороны анти-РСВ IgE был менее интенсивным.

Таким образом, впервые на клиническом материале получены данные, дополняющие результаты модельных экспериментов, проведенных с использованием мышей, о негативном влиянии осложненного течения РСВИ на патогенез последующих гетерологичных инфекций. Объяснением данного явления служит Тп2-цитокиновая локальная среда (IL-4, IL-5, IL-13), создаваемая в легких инфицированных животных РСВ-специфическими дол-гоживущими резидентными лимфоцитами (Walzl G. et al., 2000; Harker J.et al., 2007).

Таким образом, детекция анти-РСВ Ig различных изотипов предоставляет возможность выявления закономерностей, которые невозможно обнаружить при анализе AT только основных классов. Полученные результаты показали, что структура РСВ-специфического системного гуморального иммунного ответа отражает особенности клинического течения заболевания, характерные для определенного возраста и присущие различным формам бронхолегочной патологии. Сопоставление характера реагирования Thl- и Тп2-регулируемых РСВ-специфических AT позволило определить тип гуморального иммунного ответа, присущий неосложненному течению РСВИ. При этом изотипическую картину ответа, выявленную у лиц старших возрастных групп (у которых иммунная система уже сформировалась, в отличие от детей первых лет жизни) можно рассматривать в качест-


28

ве «точки отсчета», сравнение с которой позволяет оценивать нарушения, наблюдаемые при осложненном течении заболевания.

Так, при РСВИ, протекающей без осложнений, как первичной у детей до 3 лет жизни, так и при реинфекциях у пациентов старшего возраста, наблюдается ответ преимущественно со стороны ТЫ - регулируемых изотипов анти-РСВ Ig, обладающих вируснейтрали-зующими свойствами- IgGl, IgG3 и IgG2 (за исключением слабой реакции со стороны IgG2 при первичной инфекции). При этом уровень Ig этих изотипов у детей первых лет жизни с первичными РСВИ, значительно уступает (особенно со стороны IgG2) показателям, полученным при РСВ-реинфекциях в старших возрастных группах.

При РСВИ, осложненных стенозом гортани, бронхообструкцией или пневмонией у детей, а также пневмонией у взрослых, показана слабая реакция со стороны IgG2 наряду с появлением в крови РСВ-специфических AT классов E и А, являющихся показателем Th2-опосредованного аллергического течения заболевания.

Необходимость выявления Th2-зависимых реакций при РСВИ обусловлена негативным влиянием осложненного течения РСВИ на патогенез последующей инфекции, вызванной как РСВ, так и иными респираторными вирусами, что было показано в экспериментах на лабораторных животных (Schwarze J. et al., 1999; Harker J.et al., 2007).

Детекция на ранних сроках РСВИ повышенного содержания анти-РСВ IgE и IgA в крови является основанием для принятия мер, призванных не допустить развития обструкции и гиперреактивности дыхательных путей.

Наряду с активированием Тп2-зависимой составляющей гуморального иммунного ответа, осложненное течение РСВ-реинфекций у детей и взрослых ассоциировано также с повышенной реакцией ТЫ -опосредованных Ig (IgGl, IgG3) и IgM при одновременно сниженной вируснейтрализующей активности AT.

Поскольку AT всех классов, особенно IgG, являются мощными иммуномодулятора-ми, их гиперактивация может быть чревата патогенными последствиями (гипервоспалением) (Heyman В., 2000; Nimmerjahn F. And Ravetch J. et al., 2010). He исключена возможность того, что AT, взаимодействующие с вирусом, но не способные снизить уровень его репродукции, усугубляют течение инфекции. В экспериментах на мышах была показана патогенная роль ненейтрализующих анти-РСВ AT. Образованные ими циркулирующие иммунные комплексы (ИК) активировали систему комплемента, что приводило к повреждению нормальной ткани легких и бронхиальной гиперреактивности (Polack F. et al., 2002). Помимо этого, согласно экспериментальным данным, комплексы (PCB+IgG) способствуют инфицированию вирусом альвеолярных макрофагов в результате взаимодействия с клеточными Fcy -рецепторами. Инфицирование макрофагов в свою очередь приводит к иммуно-супрессии и, соответственно, к утяжелению течения РСВИ в результате вирус-индуцированного синтеза иммуносупрессорных факторов IL-4 и IL-10 (Fach S. et al, 2007). В связи с вышеизложенным, полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения углубленных исследований, направленных на всестороннюю оценку препаратов, стимулирующих активность гуморального иммунитета, для лечения РСВИ.


29

Характеристика гуморального иммунного ответа, направленного к функционально значимым эпитопам F- и G - белков РСВ, у пациентов с РСВИ

В последние годы установлено, что определенные эпитопы белков РСВ способны индуцировать синтез медиаторов и AT, оказывающих в зависимости от условий протектив-ное или повреждающее действие. В этой связи выяснение роли сайт-специфичных AT как в антивирусной защите, так и в развитии осложнений, важно для определения правильной стратегии борьбы с РСВИ. Для решения этого вопроса по результатам анализа литературы были синтезированы синтетические пептиды (СП), представляющие первичную структуру четырех консервативных линейных В-клеточных детерминант F- белка (F- SP12, F- SP13) и G-белка (G-T15, G-H13), играющих важную роль в репродукции вируса. Эпитоп F-SP12 (АП 221-232) идентифицирован как часть «главного вируснейтрализующего домена» F-белка РСВ. F-SP13 важен для процесса слияния вирусной и клеточной мембран. Эпитопы G-T15 (АП 184-198) и G-H13 (АП 152-164) играют важную роль в присоединении РСВ к клетке. На основе СП были сконструированы иммуноферментные тест-системы (ИФТС-СП) для детекции эпитоп-специфических IgG в сыворотках крови. Специфичность ИФТС-СП в отношении выявления анти-РСВ IgG была доказана в конкурентном ИФА способностью пептидов конкурировать с вирионами РСВ за связь с РСВ-специфическими AT из сывороток людей, переболевших РСВИ.

С использованием ИФТС-СП были проанализированы сыворотки, полученные в острой и реконвалесцентной фазах от 226 детей и взрослых с лабораторно установленной РСВИ. Результаты показали, что IgG к анализируемым эпитопам синтезируются у РСВ-инфицированных пациентов всех возрастных групп, однако с различной интенсивностью. При первичной инфекции у детей младшего возраста частота сероконверсий IgG, специфичных к эпитопам F-SP-12, G-T15 и G-H13, была в 1,7-2,2 раза ниже, чем в среднем по группе у старших пациентов с повторными РСВИ. Несмотря на повышение иммуногенно-сти вирусных В-клеточных детерминант при реинфекциях (с возрастом), частота регистрации сероконверсий эпитоп-специфических AT была недостаточно высока даже в группе взрослых пациентов (табл.3).

Таблица 3 — Частота сероконверсий IgG, специфичных к антигенным детерминантам F- белка и G-белков РСВ, у пациентов с установленной РСВИ

Группы больных

Численность групп

Средний возраст (лет)

Частота сероконверсий (%) к антигенам:

РСВ-ЦВ IgG

F-SP12 IgG

G-N15 IgG

G-H13 IgG

Дети с первичной РСВИ

33

42  +

21

21   *

24

Дети и подростки с повторной РСВИ

47

6,8

66

45

43

47

Взрослые пациенты с повторной РСВИ

64

27,8

72  +

42

47   * *

45

Возрастные отличия, показанные для AT определенной специфичности: + - р — 0,012    * - р — 0,04

Полученные результаты подтверждают имеющиеся немногочисленные данные о достаточно низком уровне гуморального ответа на отдельные антигенные детерминанты


30

различных белков РСВ. Частота сероконверсий, регистрируемых в ИФА с использованием различных СП, составляет по сообщениям различных авторов 19-38% у детей с первичной РСВИ, 30-50% у взрослых (Akerlind-Stopner В. et al., 1995; Leonova I. et al., 1998; Murata Y. et al., 2010).

Слабая активность AT, взаимодействующих с иммунодоминантными эпитопами РСВ, может отражаться на эффективности защитного противовирусного ответа. Для проверки этого положения на материале, полученном от 82 пациентов, было проведено сопоставление активности IgG, специфичных к двум эпитопам F-белка РСВ (F-SP12 и F-SP13), с интенсивностью образования вируснейтрализующих AT. В предварительных экспериментах в реакции конкурентной нейтрализации была показана способность данных СП взаимодействовать именно с нейтрализующими РСВ-специфичными AT из сывороток крови людей, переболевших РСВИ.

Показано, что во всех возрастных группах пациентов 75-80% случаев отсутствия конверсии нейтрализующих AT ассоциировано (р = 0,02) с одновременным отсутствием ответа со стороны эпитоп-специфичных IgG. Полученные результаты свидетельствуют о том, что одной из причин характерного для РСВИ недостаточно эффективного вирусспецифи-ческого гуморальноного иммунитета, может быть низкая иммуногенность консервативных антигенных детерминант, функционально значимых для репродукции вируса.

Преимуществом ИФТС - СП перед использованием в качестве антигена РСВ-ЦВ, представляющего совокупность всех иммуногенных детерминант вируса, является возможность оценить роль IgG, специфичных к отдельным антигенным вирусным детерминантам, в структуре противовирусного гуморального иммунного ответа. Так, использование СП позволило нам впервые выявить изменение иммунодоминирования (иерархии иммунного ответа на различные антигенные детерминанты) при ответе на В-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов РСВ.

При первичном заболевании сероконверсий IgG, направленных к эпитопам F-SP12, G-T15 и G-H13, выявляли с одинаковой частотой вне зависимости от тяжести заболевания. В отличие от этого, в группе детей старшего возраста и взрослых пациентов с повторными РСВИ наблюдалась определенная иерархия иммунного ответа, которая зависела от характера заболевания. Так, частота конверсии AT, взаимодействующих с эпитопом F-SP12, была значительно выше, а к G-H13, наоборот, ниже при осложненном течении инфекции по сравнению с неосложненным. При этом активность IgG, специфичных к G-T15, не зависела от тяжести РСВИ (рис.9).

В отличие от СП-специфических AT, ответ IgG к РСВ-ЦВ, определяемый по результатам ИФА, не зависел от клинического течения РСВИ. По-видимому, различия, касающиеся отдельных эпитопов, нивелируются при использовании в качестве антигена сложной смеси антигенных детерминант, представленных в составе цельных вирусных частиц.

Таким образом, у пациентов старших возрастных групп с реинфекциями наблюдалось изменение иерархии иммунного ответа на эпитопы поверхностных F- и G- белков РСВ. Поскольку картина иммунодоминирования менялась при осложненном течении заболевания по сравнению с неосложненным, можно предположить, что одним из факторов формирования иммунодоминирования на В-клеточные вирусные детерминанты может быть агрессивная воспалительная среда в очаге поражения. В экспериментах на мышах показано, что гиперсекреция некоторых провоспалительных медиаторов (IFN-y ) является фактором, влияющим на формирование иммунодоминирования Т-клеточного ответа на антигенные белковые детерминанты (Liu F. et al., 2004).

Явление иммунодоминирования среди В-клеточных эпитопов отмечено только у лиц старшего возраста при повторных РСВИ, но не у маленьких детей. Полученные данные свидетельствуют о том, что это явление носит кумулятивный характер и является результатом воздействий на иммунную систему нескольких перенесенных ранее инфекций. Полученные результаты согласуются с данными экспериментов о различиях в характере иммунодоминирования, наблюдаемого при ответе СВ4+Т-клеток на антигенные детерминанты F- белка РСВ при первичном и повторном инфицировании мышей (Castilow E.et al., 2008).

Изучение закономерностей иммунодоминирования имеет не только научный интерес, но и большое практическое значение. Понимание механизмов этого явления необходимо для выработки стратегии вакцинации, поскольку в состав препарата должны быть включены антигены, которые индуцируют такой иммунный ответ, который обеспечит эффективную защиту большинства привитых людей вне зависимости от характера течения последующей инфекции (первичной, повторной, осложненной).


32

Оценка роли предсуществующих эпитоп-специфичных анти-РСВ IgG в патогенезе РСВИ

Анализ литературы показывает, что Ig любых изотипов обладают большим имму-номодулирующим потенциалом, степень реализации которого зависит от конкретных условий (Heyman В., 2000; Hjelm F. et al., 2006). Свидетельства негативного влияния РСВ-специфических AT, синтез которых обусловлен Th2- опосредованными факторами (IgE, IgA), на патогенез РСВИ приведены выше. Однако и Thl-зависимые AT, которые в норме обеспечивают противовирусную защиту, могут при определенных условиях проявлять патогенные свойства. Так, в литературе активно обсуждается роль пассивно (трансплацентар-но) приобретенных материнских антител, поскольку наибольшая частота тяжелого течения РСВИ наблюдается среди детей в возрасте до 7-10 месяцев, когда у них в крови еще циркулируют материнские анти-РСВ IgG (m-IgG). Данные по этому вопросу противоречивы. С одной стороны показана защитная роль m-IgG, с другой приводятся данные об их супрес-сорном действии на формирование собственного гуморального РСВ-специфического ответа. Для прояснения данного вопроса с использованием ИФТС для детекции IgG, взаимодействующих как с РСВ-ЦВ, так и с синтетическими пептидами, имитирующими структуру трех консервативных антигенных детерминант поверхностных гликопротеинов РСВ (F-SP12, G-T15, G-H13), была проведена оценка влияния m-IgG на характер анти-РСВ адаптивного гуморального ответа, формирующегося у детей при первичном инфицировании.

Проведенное предварительное исследование показало, что материнские анти-РСВ IgG могут циркулировать в крови детей вплоть до 10 месяцев жизни, что согласуется с данными других авторов. Для исследования была сформирована группа из 41 пациента в возрасте 1-10 месяцев. У 27 детей была диагностирована РСВИ. Группу сравнения составили 14 детей с ОРЗ не РСВ-этиологии, заболевшие впервые. Поскольку известно, что при первичном инфицировании собственные анти-РСВ IgG не продуцируются раньше 5-6 дня заболевания, ранние сроки забора крови (не позднее 3 дня заболевания) позволили считать выявленные анти-РСВ антитела предсуществующими (материнскими).

Было показано, что m-IgG, взаимодействующие с РСВ-ЦВ, присутствовали в крови детей, инфицированных как РСВ, так и другими инфекционными агентами, приблизительно с одинаковой частотой - в 63% и 57% случаев, соответственно. Напротив, частота детекции m-IgG, специфичных хотя бы к одному из трех выбранных эпитопов поверхностных гликопротеинов РСВ, была в 2,7 раз выше (р = 0,047) в группе детей с РСВИ (56%), чем у пациентов с ОРЗ иной этиологии (21%). Несмотря на выявленные различия, не было установлено статистически значимой связи между содержанием в крови детей m-IgG к анализируемым вирусным эпитопам с частотой заболевания РСВИ: Ra составил 0,28 (р =0,06). Таким образом, можно предположить, что материнские анти-РСВ IgG в крови детей грудного возраста не является фактором, влияющим на возможность первичного инфицирования РСВ.

Тем не менее, дальнейший анализ показал влияние материнских AT на характер первичного анти-РСВ гуморального ответа, которое удалось выявить только благодаря использованию в ИФА синтетических пептидов (но не РСВ-ЦВ), позволивших оценить уро-


33

вень m-IgG к отдельным иммуногенным эпитопам белков РСВ. Суммарные данные о влиянии материнских AT на характер собственного первичного РСВ-специфического ответа у детей приведены ниже.

Так, при первичном ответе на РСВ-инфицирование наличие в крови детей материнских IgG, специфичных к консервативным детерминантам F и G-белков РСВ:

- ассоциировано с осложненным клиническим течением РСВ-инфекции (бронхо-

обструкцией) - Ra=0,60, р = 0,006. Осложненное бронхообструкцией течение РСВИ значи

тельно чаще (р = 7,0 х10" ) наблюдали у детей с m-IgG в крови (82%), чем в случае их от

сутствия (18%).

- не ассоциировано со снижением активности синтеза анти-РСВ IgM. Коэффициент ассоциации Пирсона (RA) =0,10, р > 0,05. У детей, в крови которых присутствуют и отсутствуют m-IgG , синтез собственных анти-РСВ IgM наблюдали с одинаковой частотой (71% и 62%, соответственно)

  1. ассоциировано с отсутствием или сильным запаздыванием (по крайней мере, в течение двух недель) синтеза собственных анти-РСВ IgG - Ra =0,50, р = 0,009. Так, частота сероконверсий анти-РСВ IgG у детей с m-IgG в крови (14%) была значительно ниже (р= 0,018), чем в случае их отсутствия (62%).
  2. ассоциировано с активацией синтеза Th2- регулируемых анти-РСВ IgA (частоты сероконверсий составили в группах детей, имеющих или не имеющих в крови m-IgG 86% и 8% (р=0,0002) , RA =0,60, р = 0,009

Таким образом, в результате проведенного исследования впервые было показано негативное влияние предсуществующих материнских IgG, специфичных к определенным иммуногенным детерминантам F- белка (АП 221-232) и G-белка (АП 152-164 и 184-198) на течение первичной РСВИ у детей в возрасте до 10 месяцев. Наличие в циркуляции эпитоп-специфичных m-IgG ассоциировано у детей с повышенной активностью анти-РСВ IgA, синтез которых, согласно нашим данным, являются показателем аллергического течения РСВИ, и, наоборот, с низкой активностью противовирусных IgG. При этом наличие м-АТ у детей не влияло на синтез анти-РСВ IgM.

В последнее десятилетие описаны некоторые механизмы супрессорного воздействия пассивно введенных Ig на активный синтез АГ-специфических AT. Например, коагре-гирование образованными иммунными комплексами В-клеточных рецепторов с ингиби-рующими рецепторами Fc-gammaRII-bl на мембране В-лимфоцита приводит к супрессии биологических функций лимфоцитов и превращения их в плазматические клетки, секрети-рующие AT. Этим механизмом объясняется тормозящее действие, оказываемое при внутривенном введении АГ-специфического иммуноглобулина на формирование у пациента собственного гуморального иммунного ответа на соответствующий AT (Ravetch J. and Nimmerjahn F., 2008). Возможно, материнские AT могут оказывать ингибирующее влияние на адаптивный иммунитет ребенка по такому же принципу.

Оценка   активности аутореактивных антител у пациентов с ОРВИ


34

В настоящее время наблюдается возрастающий интерес к аутоиммунным процессам, вызванным инфекционными заболеваниями и противовирусной вакцинацией. Известно, что в крови людей изначально присутствуют «нормальные» (natural) AT, которые являются необходимой составляющей врожденного иммунитета. Эти AT выполняют у млекопитающих функцию первой линии иммунологической защиты до начала синтеза высоко аффинных АГ-специфичных AT, поскольку взаимодействуют с эволюционно консервативными шаблонами, присущими вирусам, бактериям и паразитам, зачастую структурно сходными также с хозяйскими антигенами. Помимо нормальных AT, принадлежащих, главным образом, к классу М, синтез аутореактивных IgM (ауто-IgM) и ауто-IgG может быть следствием нарушения иммунологической толерантности в условиях сильного локального воспаления, в том числе вирусного. В исследованиях последних лет содержатся данные о том, что одни и те же механизмы (гиперактивация В-клеточных регуляторов BAFF и APRIL, повышенный синтез IL-17, гиперэкспрессия TLR на иммунокомпетентных клетках) обуславливают такие, на первый взгляд, разные явления, как аллергия (включая астму) и аутоиммунные реакции. Сходные нарушения в регуляторных процессах установлены также при тяжелом течении РСВ (Mackay F. et al., 2007; Reed J. et al., 2009; Mukherjee S. et al., 2011). В то время как связь РСВИ с аллергизацией организма и развитием астмы уже установлена, возможная роль аутоиммунных процессов в патогенезе РСВИ не изучена. Тем не менее, учитывая возможную общность механизмов, рассмотрение этого аспекта патогенеза РСВИ являлось, на наш взгляд, вполне оправданным. Правомерность такого положения показали результаты единственной известной нам работы, целенаправленно исследовавшей аутоиммунную активность при РСВИ. В 2009г были опубликованы данные о том, что в назальных секретах детей с документированной тяжелой РСВИ (но не гриппом) были обнаружены анти-нуклеарные ауто-IgA (Reed J.et al., 2009).

При выборе антигенов для детекции в непрямом ИФА аутореактивных AT в сыворотках пациентов с ОРВИ мы руководствовались известными данными, о том, что некоторые вирусы способны индуцировать синтез IgM к молекуле IgG (анти-IgG IgM). К таким AT относится ревматоидный фактор. Все респираторные вирусы вызывают апоптоз и/или некроз инфицированных клеток, и, следовательно, могут индуцировать синтез AT к компонентам нормальных клеток человека (анти-NCAg IgM , анти-NCAg IgG). Для приготовления нормальных клеточных AT (NCAg) использовали солюбилизированные поверхностные структуры фибробластов легкого эмбриона человека (клетки культуры ФЛЭЧ). Еще одним ауто-АГ при анализе аутореактивных IgG был выбран гепарин - аналог гепаран сульфата, входящего в структуру клеточных мембран (анти-Hr IgG).

Определение содержания ауто-АТ в сыворотках клинически здоровых людей дает представление о среднем уровне «физиологической» аутореактивности, присущей данному возрасту и сформированной в результате воздействия на иммунную систему чужеродных и собственных АГ. Среди обследованных клинически здоровых детей старше 3 лет (п=50) и взрослых доноров (п=47) с большой частотой регистрировали случаи высокого содержания в крови как анти-IgM IgG (52% и 40%), так и анти-NCAg IgM (58% и 64%).  У


35

детей первых трех лет жизни эти показатели были ниже (р< 0,001) и составляли 20-25%. В тех же материалах, ауто-IgG детектировали значительно реже во всех возрастных группах: в 2-8% случаев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что аутореактивные AT класса М, взаимодействующие с молекулой IgG и антигенами неинфицированных клеток человека, относятся к нормальным и являются частью врожденного иммунитета, поскольку присутствуют в сыворотках крови клинически здоровых людей всех возрастных групп, в том числе детей грудного возраста. При этом физиологический уровень нормальных IgM в крови здоровых людей увеличивается с возрастом, что можно объяснить «созреванием» иммунной системы под действием постоянной стимуляции чужеродными и собственными АГ в течение всей жизни. В свете известных данных о защитных и регуляторных функциях, выполняемых аутореактивными нормальными IgM, можно предположить, что формирование и поддержание оптимального (фонового) уровня этого типа AT важно для иммунологической защиты, а низкое их содержание в крови может быть одной из причин повышенной чувствительности маленьких детей к вирусным инфекциям. Низкая частота выявления ауто-IgG у здоровых людей указывает на то, что они не являются нормальными, а образуются, вероятно, в результате антиген-специфичных адаптивных процессов, в том числе при вирусных заболеваниях. Присутствие аутореактивных IgG в крови некоторых здоровых лиц можно объяснить длительной циркуляцией AT, образованных в результате предшествующих контактов с различными антигенами.

Активность аутореактивных AT при ОРВИ была проанализирована в сыворотках 750 пациентов в зависимости от возраста и этиологии заболевания.

У детей от 11 месяцев до 3 лет жизни частота сероконверсий ауто-IgM была невысокой (0-16%) вне зависимости от этиологии заболевания. У пациентов старших возрастных групп с РСВИ и аденовирусной инфекцией (АВИ) частота регистрации конверсии аутореактивных IgM (особенно анти-NCAg IgM) была в 1,4 -5,3 раз выше, чем при ОРВИ иной этиологии. Кроме того, в группах больных РСВИ и АВИ, в отличие от пациентов с другими заболеваниями, были выявлены статистически значимые возрастные отличия (рис. 10)

При оценке аутореактивных IgG у пациентов с ОРВИ активный ответ со стороны этого типа AT был отмечен только при РСВ-инфекции (табл. 4).

В результате проведенного анализа было показано, что интенсивный синтез двух классов аутореактивных AT (IgM и особенно IgG) является характерной чертой патогенеза РСВИ, в отличие от гриппа А, гриппа В, парагриппа.

У детей в возрасте до 3 лет не было установлено подобной зависимости ни при одном из анализируемых заболеваний. В старшей возрастной группе при заболеваниях РСВ-и аденовирусной этиологии, протекающих в осложненной форме (обструкция респираторного тракта или пневмония), частота сероконверсий аутореактивных IgM была в 1,4-1,8 раз выше, чем у больных с неосложненным течением этих инфекций.

Полученный результат дает основание для предположения о том, что чрезмерная активация нормальных ауто-IgM , призванных защищать организм, может играть патогенную роль и способствовать развитию осложнений у людей старшего возраста (т.е. при наличии зрелой иммунной системы, обуславливающей быстрый синтез большого количества AT, включая нормальные IgM), но не у детей до 3 лет жизни с еще не сформированной иммунной системой.

Частота сероконверсий аутореактивных IgG также была значительно выше (в 1,7-3,8 раз) при осложненном течении РСВИ (острый обструктивный бронхит, пневмония) по сравнению с неосложненным. В дополнение к этому была установлена прямая связь (р< 0,001) между активностью ауто-IgG и РСВ-специфическими IgE, чего не было показано для ауто-IgM. Синхронные конверсии анти-РСВ IgE и ауто-IgG были выявлены в 61-74% случаев, что указывает на то, что при РСВИ активная реакция ауто-IgG, но не ауто-IgM, ассоциирована с IgE-опосредованной вирус-индуцированной аллергией. Представленные результаты свидетельствуют о более выраженном патогенном потенциале ауто-IgG по сравнению с ауто-IgM.

Таким образом, характерной чертой патогенеза РСВИ, особенно осложненного ее течения, является синтез аутореактивных IgM и IgG. Вопрос о механизмах возможной реали-зациио патогенного действия этих AT предстоит решить в будущем.

Оценка биологических, иммуногенных и протективных свойств препаратов, созданных на основе синтетического пептида F-SP12

Несмотря на настоятельную потребность, до сих пор не существует ни одной лицензированной вакцины против РСВИ. Спектр препаратов для лечения РСВИ при этом весьма ограничен. В настоящее время ведутся разработки в направлении создания противовирусных препаратов на основе синтетических пептидов (СП), имитирующих структуру коротких фрагментов поверхностных белков РСВ, функционально важных для репродукции вирусов.

Отдельной задачей проведенного исследования являлась оценка иммуногенных и

протективных свойства СП, имитирующего первичную структуру части «главного вирус-

нейтрализующего домена» F-белка РСВ с АП 221-232 (F-SP12) (рис.11).

+                             +                             -

221- Не - Giщ - Phe - Gin - Gin - Lys - Asn - Asn - Arg - Leu - Leu - Giщ -232

Примечание: Сверху указан заряд аминокислотных остатков (АК), снизу подчеркнуты гидрофобные АК Рисунок 11 - Схема структуры синтетического пептида   F-SP12, представляющего

последовательность 221-232 F-белка РСВ


38

Известно, что с этим эпитопом взаимодействуют РСВ-нейтрализующие МКА, полученные при иммунизации мышей вирусом (Lopez J. et al.,1998). Согласно нашим данным, полученным методами конкурентного ИФА и конкурентной нейтрализации, с последовательностью F-SP12 эффективно реагируют РСВ-специфические AT, в том числе нейтрализующие, из сывороток пациентов, перенесших РСВИ.

При оценке противовирусной активности F-SP12 in vitro в культуре эпителиальных клеток почки обезьяны MA-104 было показано, что F-SP12 ингибировал синтез F- белка РСВ на 35-50% при добавлении 0,6-10 мкг/мл в культуральную среду на ранних сроках репродукции РСВ. Параллельно наблюдалось падение инфекционной активности вируса в 20-40 раз при концентрациях F-SP12 0,6 -2,5 мкг/мл и в 80-100 раз при добавлении 5-10 мкг/мл СП. Полученные результаты свидетельствуют о том, что СП F-SP12 подавляет рост РСВ в культуре клеток на ранних стадиях репродуктивного цикла. Ингибирующее действие СП на репродукцию РСВ можно объяснить показанной нами способностью препарата взаимодействовать как с клеточными мембранами, так и с вирусом, что может создавать сте-хиометрические и/или электростатические препятствия для присоединения к клетке.

На следующем этапе исследований была проведена работа по оценке протективного действия препарата in vivo. Одним из перспективных направлений противовирусной вакци-нопрофилактики является создание липовакцин, в том числе на пептидной основе. Высокая иммуногенность препаратов такого типа обусловлена взаимодействием липидных составляющих конструкции с Toll-like рецепторами (TLR), что индуцирует созревание анти-ген-презентирующих клеток, процессинг и презентацию антигенных детерминант белкового компонента липопептида. Результатом является активирование пептидо-специфичного клеточного и гуморального иммунитета, а также формирование долгосрочной иммунологической памяти. Подобный механизм был показан для липопептидных вакцин против гриппа , ВИЧ, ЦМВ- инфекции, гепатита В и С (Brown L. and Jackson, 2005). Известно, что F-белок РСВ является лигандом для TLR4, активация которого на иммунокомпетентных клетках необходима для развития интенсивного врожденного и адаптивного иммунного ответа на РСВ (Kurt-Jones E. et al., 2000) . С учетом этих данных был сконструирован конъю-гат СП F-SP12 с альдегидом насыщенной жирной лауриновой кислоты (С12), которая является лигандом для TLR4 (Bainbridge В. et al., 2006). Оценка иммуногенности липопептида (F-SP12-LA) была проведена с использованием двух моделей - кроликов и мышей BALB/c.

После проведения цикла иммунизации сыворотки кроликов и мышей интенсивно взаимодействовали в ИФА как с СП, так и с РСВ. При долгосрочном наблюдении за четырьмя иммунизированными кроликами был показан замедленный, но пролонгированный синтез СП/РСВ-специфических AT. Пик активности этих AT наблюдали лишь через 12 месяцев, а достаточно высокое их содержание выявляли в крови в течение 2-3 лет после иммунизации. При этом синтез вируснейтрализующих AT был отмечен не ранее, чем через 2,5 месяца (рис. 12).

Патоморфологический анализ органов двух кроликов, иммунизированных F-SP12-LA, проведенный через 25 месяцев после начала иммунизации, показал истощение лимфоидной ткани селезенки и наличие нейтрофильной инфильтрации в интерстиции легких и альвеолах. В селезенке также наблюдались многочисленные очаги нейтрофильного воспаления и некроза. Патологические изменения были ассоциированы с высоким уровнем AT к NCAg и В SA. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о патогенном потенциале IgG, образованных к чужеродным и собственным клеточным АГ, а также о том, что причиной образования AT к клеточным компонентам после введения Т-8Р12-липопептида могло быть хроническое воспаление и повреждение тканей.

Для оценки протективного действия пептидных препаратов были использованы мыши BALB/c (по 5 животных в группе). Две группы мышей были интраназально инфицированы введением 50 мкл вируссодержащей культуральной жидкостью, содержащей 10 ТЦД50 РСВ, после двукратной иммунизации липопептидом F-SP12-LA или неконъюгиро-ванным свободным F-SP12. Предварительная иммунизация F-SP12-LA, и в еще большей степени неконъюгированным F-SP12, не только не снижала репродукцию РСВ в легких при последующем инфицировании, но наоборот, способствовала ее увеличению. Так, в легких мышей, иммунизированных свободным F-SP12, содержание антигенов РСВ, по данным сэндвич-ИФА, в среднем в 4,6 раз, а инфекционная активность РСВ, определенная при пассировании в культуре клеток, в 3-4 раза превышала показатели, полученные для животных, инфицированных без предварительной иммунизации. Патоморфологический анализ показал, что иммунизация препаратом СП вызывала у мышей геморрагию легких при последующем вирусном заражении. У животных, инфицированных РСВ без предварительной иммунизации СП, не было обнаружено геморрагических явлений. У 50% мышей, иммунизированных F-SP12-LA, наблюдались обширные очаги кровоизлияния. После иммунизации неконъюгированным СП повреждения были наиболее выражены - обширные очаги поражения (1-3 доли) были обнаружены в легких 80%, в 2 случаях - отек легкого.


41

Таким образом, препарат, сконструированный на основе синтетического пептида F-SP12, имитирующего структуру консервативного эпитопа главного нейтрализующего домена F-белка РСВ, обладал выраженными иммуногенными свойствами и индуцировал синтез РСВ-специфических AT у лабораторных животных. У кроликов инъекция F-SP12-LA вызывала более пролонгированный синтез вируснейтрализующих AT при замедленной динамике их формирования по сравнению с иммунизацией цельновирионным РСВ. Однако препараты вызывали патологические изменения в организме иммунизированных животных.

Результаты нашей работы вынуждают присоединиться к мнению исследователей, призывающих соблюдать особую осторожность и осуществлять тщательный контроль при испытаниях вакцин, изготовленных на основе синтетических пептидов, а также сделать вывод о необходимости долгосрочных наблюдений при проведении испытаний для исключения отдаленных последствий вакцинации.

ВЫВОДЫ

1.    Гарантированное диагностирование РСВИ по результатам детекции анти-РСВ

антител в ИФА (в 92-100% случаев) вне зависимости от возраста и иммунного статуса па

циентов может быть достигнуто только при одновременном тестировании иммуноглобули

нов классов G, М и А, что обусловлено индивидуальными отличиями в характере синтеза

антител различных классов.

2.  Осложненные формы РСВИ (острый стенозирующий ларинготрахеит, острый об-

структивный бронхит, острая пневмония) ассоциированы, как правило, с искаженной реак

цией Thl-регулируемых изотипов РСВ-специфических иммуноглобулинов, обладающих

вируснейтрализующими свойствами: слабым ответом со стороны IgG2 при повышенной

активности IgGl, IgG3, IgM.

  1. Осложненное течение РСВИ характеризуется повышенным уровнем синтеза РСВ-специфических Тп2-регулируемых иммуноглобулинов классов E и А на фоне низкой активности вирусспецифических IgG4. Перенесенная ранее РСВИ, осложненная аллергическим компонентом, оказывает негативное влияние на течение последующей инфекции иной, не РСВ-этиологии, а также повышает восприимчивость к другим патогенам.
  2. Характер иммунодоминирования при ответе на консервативные антигенные детерминанты F- белка (АП 221-232) и G-белка (АП 152-164 и 184-198) меняется у пациентов старших возрастных групп с РСВИ в зависимости от формы заболевания.
  3. Наличие в крови материнских IgG, специфичных к консервативным детерминантам поверхностных гликопротеинов РСВ, ассоциировано с осложненным клиническим течением первичной РСВИ у детей в возрасте до 10 месяцев, замедленным ответом со стороны противовирусных IgG при одновременно повышенном синтезе РСВ-специфических сывороточных IgA.
  4. Характерной особенностью осложненного течения РСВИ является синтез ауторе-активных IgM и IgG.

42

8. Препарат, сконструированный на основе синтетического пептида, представляющего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка РСВ, и жирной лауриновой кислоты, являющейся лигандом для TLR4, индуцирует in vivo синтез РСВ-специфических IgG, однако вызывает патологические изменения в организме иммунизированных животных.

СПИСОК    РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Кривицкая В.З. Особенности некоторых показателей гуморального ответа на респи-раторно-синцитиальную вирусную инфекцию у детей с острыми бронхитами / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В. // Лабораторное дело.- 1991.- № 7.-   С 45-48.
  2. Кривицкая В.З. Применение иммуноферментного анализа для выявления антител к респираторно-синцитиальному вирусу с помощью конъюгата стафилококкового белка А с пероксидазой / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В., Мурыгина Г.Л. // Вопросы вирусологии.-1991.-№ 1.-С.76-78.
  3. Кривицкая В.З. Особенности гуморального ответа на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию у взрослых пациентов с различными формами бронхита / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В. // Вопросы вирусологии- 1992- №3.-С 146-149.
  4. Борисенко Л.В. Применение галотерапии для реабилитации больных с острым бронхитом с затяжным и рецидивирующим течением /Борисенко Л.В., Червинская А.В., Степанова Н.Г., Лукьян B.C.. Гончарова В.А., Походзей И.В., Кривицкая В.З. и др. // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры - 1995- №1.-С. 11-15.
  5. Кривицкая В.З. Особенности анти-РС-вирусного гуморального иммунитета при пер-систенции антигенов респираторно-синцитиального (PC) вируса у взрослых больных с хроническим обструктивным бронхитом / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В., Александрова Н.И. // Вопросы вирусологии -1996 - №5 -С -234-237
  6. Кривицкая В.З., Анти-РС-вирусный IgE при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у взрослых пациентов с осложнен-ным течением бронхита/ Кривицкая В.З., Александрова НИ., Похазникова MA // Журнале микробиологии эпидемиологии и иммунологии .- 1998.-№4.-С.56-61.
  7. Кривицкая В.З. Реакция иммуноглобулина А на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию у детей и взрослых с различными формами острого и хронического бронхита / Кривицкая В.З., Александрова Н.И., Орлов А.В., Походзей И.В. // Иммунология.- 1999.-№2.-С.51-55.
  8. Кривицкая В.З. Разработка новых подходов к стандартизации иммуноферментных тест-систем для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу с использованием электронной микроскопии и моноклональных антител / Кривицкая В.З., Сироткин А.К., Самойлович М.П., Соминина А.А. // Вопросы вирусологии.-1999- № 6.-С. -279-284.
  9. Кривицкая В.З. Возрастные особенности сайтнаправленного иммунитета при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции / Кривицкая В.З., Соминина А.А., Власов Г.П., и др. // Вопросы вирусологии. - 2004. - Т.49, №4 . - С.25-29.

43

  1. Кривицкая В.З. Имунопатологический аллергический Тп2-тип противовирусного гуморального иммунного ответа у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией / Кривицкая В.З, Соминина А.А., Суховецкая и др. // Цитокины и воспаление.- 2004.-Т.З, №3.-С. 34-41.
  2. Штерншис Ю.А. Влияние вирусной инфекции на развитие атопической бронхиальной астмы / Кривицкая В.З., Самойликов П.В., Гервазиева В.Б. // Инфектология (Болгария). -2005.-.Т. XLII.-C.26-30.
  3. Штерншис Ю.А. Острые респираторновирусные инфекции и бронхиальная астма / Штерншис Ю.А., Лизогуб Н.В., Кривицкая В.З., Гервазиева В.Б. // Инфекционные болезни -2006.-Т. 3.- стр. 18-21.
  4. Чучалин А.Г. Роль респираторных инфекций в обострениях бронхиальной астмы / Чучалин А.Г., Оспельникова Т.П., Осипова Г.Л., Лизогуб Н.В., Гервазиева В.Б., Кривицкая В.З. и др. // Пульмонология -2007 №5 -С 14-18.
  5. Кривицкая В.З. Выявление аутореактивных антител класса М у пациентов с респираторными вирусными инфекциями / Кривицкая В.З., Сверлова М.В., Суховецкая В.Ф. и др. //Медицинская иммунология -2008 - Т 10, №2-3 - С 229-238
  6. Румель Н.Б. Особенности респираторно-синцитиальной инфекции у больных с гемо-бластозами и депрессией кроветворения / Румель Н.Б., Гончар В.А., Шилова Е.Р., Бес-смельцев С.С, Стрижах Н.П., Залимко Л.А., Кривицкая В.З. и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни -2008 - № 5.-С. 45-49
  7. Кривицкая В.З. Иммунопатологическое действие на экспериментальных живот-ных пептидных препаратов, представляющих вирус-нейтрализующий домен F-белка респира-торно-синцитиального вируса / Кривицкая В.З., Майорова В.Г., Сорокин Е.В. и др. // Цитокины и воспаление - 2010 -Т 9, №2, С 18-26
  8. Суховецкая В.Ф. Этиология острых респираторных инфекций у госпитализированных детей в пре- и пандемический период гриппа H1N1 / Суховецкая В.Ф., Дондурей Е.А., Осидак Л.В., Дриневский В.П., Гудкова Т.М., Коновалова Н.И., Грудинин М.П., Медведева Н.А., Кривицкая В.З. и др. // Детские инфекции.- 2010.-Т. 9, № 2.- С.8-12.
  9. Кривицкая В.З. Характеристика аутореактивных антител класса IgG у пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями // Цитокины и воспаление.- 2011.- Т. 10, №2.-С. 21-27.
  10. Кривицкая В.З. Применение синтетиче-ских пептидов для характеристики сайт-направленного противовирусного гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией / Кривицкая В.З., Соминина А.А., Войцехов-ская Е.М. и др. // Клиническая лабораторная диагностика.- 2011 - в печати

44

Список сокращений

АГ- антиген AT - антитела

ИФА -иммуноферментный анализ ООБ - острый обструктивный бронхит ОП - острая пневмония

СЛТ - острый стенозирующий ларинготрахеит СП- синтетический петид АП - аминокислотная последовательность МКА -моноклональные антитела СГТ - средний геометрический титр антител АВИ -аденовирусная инфекция РСВ - респираторный синцитиальный вирус РСВИ - респираторно- синцитиальная вирусная инфекция ТЦД - тканевая инфекционная доза ИФТС - иммуноферментная тест-система ЦМВ - цитомегаловирус

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбрионов человека Ауто-АТ 0 аутореактивные антитела

РСВ-ЦВ - цельновирионный респираторный синцитиальный вирус Ig -иммуноглобулины m-IgG - материнские антитела SP- синтетический пептид NCAg- нормальный клеточный антиген BSA - бычий сывороточный альбумин LA - альдегид лауриновой кислоты IFN-?/? - интерферон- альфа, интерферон- гамма

 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.