WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Цитоморфология органов иммуногенеза кур при реализации комплексных программ вакцинаций и коррекция иммунного статуса в условиях промышленных птицефабрик

Автореферат докторской диссертации по ветеринарии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 |
 

ТУРИЦЫНА ЕВГЕНИЯ ГЕННАДЬЕВНА

ЦИТОМОРФОЛОГИЯ ОРГАНОВ ИММУНОГЕНЕЗА КУР

ПРИ РЕАЛИЗАЦИИ КОМПЛЕКСНЫХ ПРОГРАММ ВАКЦИНАЦИЙ

И КОРРЕКЦИЯ ИММУННОГО СТАТУСА В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПТИЦЕФАБРИК

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология

и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Барнаул 2011


Работа выполнена на кафедре анатомии и гистологии животных института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, профессор

Донкова Наталья Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор

Малофеев Юрий Михайлович

доктор ветеринарных наук, профессор

Панфилов Алексей Борисович

доктор ветеринарных наук, профессор

Ильина Ольга Петровна

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Уральская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится 30 марта 2011 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 220.002.02 при Алтайском государственном аграрном университете в институте ветеринарной медицины по адресу: 656922, Алтайский край, г. Барнаул, ул. Попова 276, тел./факс (3852) 31-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет»

Автореферат разослан «____» ______________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                           П.И. Барышников


  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Птицеводство является самой устойчивой и наиболее динамичной отраслью агропромышленного комплекса нашей страны, которое сумело в короткие сроки увеличить объем производства и обеспечить население страны высококачественной мясной и яичной продукцией [Фисинин, 2010]. В условиях промышленных птицефабрик содержатся миллионы голов птицы, представляющие огромный биологический потенциал, который следует рассматривать как совокупный биологический организм, требующий постоянного внимания к своему здоровью. Задачи сохранения поголовья птиц, повышения их продуктивности неотделимо связаны с повышением естественной резистентности и состоянием иммунной системы.

Морфологические особенности органов иммунной системы разных видов сельскохозяйственной птицы освещены в ряде научных публикаций, в том числе монографиях [Крок, 1962; Техвер, 1965; Селезнев, 1999], учебных пособиях [Селянский, 1980; Вракин, Сидорова, 1984], диссертациях [Селезнев, 2000; Ванина, 2003; Овсищер, 2005;  Деблик, 2007; Панина, 2008; Бородулина, 2009], научных статьях [Оуэн, 1996; Дроздова Л.И., Шацких Е.В., 2009; Gulmez, Aslan, 1999; Schoenwolf, Singh, 2005; Nagy, Olah, 2007; Pabst, Tschernig, 2010].

Особое внимание исследователей уделяется возрастной морфологии органов иммунной системы, которая раскрывает онтогенетические закономерности становления органов, и позволяет выявить критические периоды развития иммунной системы и организма в целом. Однако сведения о динамике становления иммунокомпетентных органов у современных высокопородных яичных кроссов птиц являются недостаточными, носят противоречивый характер и требуют уточнения.

Для иммунной системы характерна высокая мобильность, но при развитии некомпенсированных сдвигов развиваются иммунопатологические процессы, главным проявлением которых является повышенная восприимчивость птицы к инфекционным заболеваниям и пролонгированные поствакцинальные реакции [Монтиэль, 2003].

Оценка состояния иммунной системы основывается на количественной характеристике иммунокомпетентных клеток и антител, и является основой контроля эффективности и безопасности вакцин [Груздев, 2005]. В то же время цитоморфологическая оценка иммунного статуса до вакцинаций и в поствакцинальный период до сих пор не нашла своего применения в практическом птицеводстве. Совершенствуя существующие программы иммунизаций и разрабатывая новые схемы вакцинопрофилактики, специалисты птицефабрик не принимают во внимание изменений в органах иммуногенеза, возникающих при массированных антигенных воздействиях.

В литературе имеются единичные сведения, освещающие морфологию органов иммунной системы кур при отдельных иммунизациях, например против ИББ [Садчикова, 2004], ИЛТ [Старун, 2005], НБ [Луппова, Грушин, 2008]. Они не создают полной картины структурных изменений органов иммуногенеза кур при реализации комплексных программ вакцинаций и не раскрывают  механизмы развития иммунологического дисбаланса при многократных антигенных стимуляциях. Всесторонняя диагностика патологий иммунной системы птиц на основе цитоморфологического анализа позволила бы принимать своевременные и адекватные меры по их коррекции и восстановлению полноценной функциональной деятельности.

Промышленному птицеводству предлагаются разнообразные иммунокоррегирующие препараты, такие как пробиотики [Панин и др., 2002; Ноздрин и др., 2005; Субботин, Данилевская, 2005], биостимуляторы растительного происхождения и их синтетические аналоги [Брыкина, 2004; Пронин, 2005; Топурия, 2008], соединения селена и йода [Рубцов, 2006; Дроздова, Шацких, 2009], а также препараты тимуса [Смирнов, 2005]. В последние годы созданы препараты на основе нуклеиновых кислот, способные оказывать на иммунную систему поликлональное стимулирующее действие [Ершов, 2007]. Их влияние на организм птиц практически не исследовано.

Таким образом, изучение становления органов иммуногенеза современных высокопородных кроссов птиц в постнатальном онтогенезе, исследование влияния многократных антигенных стимуляций вирусвакцинами на иммунную систему молодняка кур, определение параметров диагностики иммунопатологических состояний на основе цитоморфологического анализа и разработка способа коррекции иммунного статуса представляется актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение цитоморфологии органов иммуногенеза кур при реализации комплексных программ вакцинаций и коррекция иммунного статуса в условиях промышленных птицеводческих предприятий Красноярского края.

Были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать комплексные программы вакцинаций, реализуемые в промышленных птицефабриках Красноярского края, с учетом количества прививаемого поголовья, кратности антигенных стимуляций, арсенала применяемых вакцин и синдроматики иммунизируемого поголовья.

2. Изучить морфометрию и цитоморфологию органов иммуногенеза кур (тимуса, фабрициевой бурсы, селезенки, лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой кишечника и печенью) в постнатальном развитии.

3. Определить возрастную динамику морфологических, биохимических, цитокариометрических, цитохимических и метаболических параметров крови иммунизированных и неиммунизированных кур.

4. Установить влияние многократных антигенных стимуляций на структурно-функциональные, морфометрические, гистохимические показатели органов и тканей иммунологического обеспечения кур.

5. Дать оценку морфофункциональных изменений органов иммунной системы кур при патологических состояниях, обусловленных факторами инфекционной и неинфекционной этиологии.

6. Изучить влияние индуктора эндогенного интерферона провеста на производственные показатели (привесы живой массы, сохранность), напряженность поствакцинального гуморального иммунитета, морфофункциональное состояние органов иммунной системы кур при реализации комплексных программ вакцинаций в условиях промышленных птицеводческих предприятий.

Научная новизна. В работе впервые проведено цитоморфологическое исследование органов иммуногенеза кур при реализации комплексных программ вакцинопрофилактики в условиях промышленных птицеводческих предприятий. Дополнены сведения о структуре центральных и периферических органов иммунной системы кур. Получены новые данные об уровне метаболических процессов в клетках цельной крови кур в постнатальном онтогенезе и при состояниях, детерминированных вакцинными вирусами, на основе хемилюминесцентного анализа. Дана оценка микроструктурных изменений органов иммуногенеза кур при иммунопатологических состояниях, обусловленных факторами инфекционной и неинфекционной этиологии. Предложен способ коррекции иммунного статуса кур с помощью пролонгированного индуктора эндогенного интерферона провеста.

Теоретическая и практическая значимость. Установленные закономерности роста органов иммуногенеза кур характеризуют незавершенность их морфогенеза в раннем постнатальном периоде и отражают наличие инволюции фабрициевой бурсы у молодняка кур 45-90-суточного возраста между двумя пиками активности на 30-е и 120-е сутки жизни, что необходимо учитывать при составлении программ вакцинопрофилактики.

Выявленное преобладание генерации первичных люцигенинзависимых радикалов кислорода, как в спонтанном, так и в антигениндуцированном состоянии свидетельствует о видовых особенностях кислородного метаболизма клеток цельной крови кур. Зафиксированное сокращение интенсивности и объемов продукции активных форм кислорода клетками периферической крови под влиянием живых вирусвакцин отражает снижение неспецифической резистентности иммунизированного молодняка кур.

Установленные цитоморфологические изменения, развивающиеся на фоне многократных иммунизаций, свидетельствуют о развитии иммунопатологических процессов, таких как лимфофолликулярная гиперплазия тимуса, преждевременная инволюция фабрициевой бурсы, сосудистый гиалиноз в тимусе и селезенке, а также о дисбалансе лейкоцитов крови, характеризующемся стойким лимфоцитозом и гранулоцитопенией; что может стать причиной поствакцинальных осложнений, обусловленных условно-патогенной микрофлорой.

Комплекс структурных и морфометрических изменений тимуса, фабрициевой бурсы и селезенки кур, описанный при патологических состояниях инфекционной и неинфекционной этиологии, может служить критерием при морфологической диагностике иммунодефицитов птиц.

Предложенный способ коррекции иммунного статуса с помощью препарата «провест» обеспечивает повышение сохранности молодняка кур, усиление напряженности поствакцинального гуморального иммунитета, подавление циркуляции микоплазм, умеренную стимуляцию гемопоэза и плазмоцитарной реакции, пролиферацию кортикальных лимфоцитов тимуса.

Материалы диссертационной работы легли в основу двух научно-практических рекомендаций:

1. «Методы оценки морфофункционального состояния органов и тканей иммунологического обеспечения птиц», одобренных и принятых к внедрению на заседании подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 4 от 10 ноября 2009 года);

2. «Оценка морфофункционального состояния крови птиц при вирусных антигенных стимуляциях», одобренных и принятых к внедрению Научно-техническим советом Красноярского государственного аграрного университета (протокол № 5 от 10 марта 2009 года).

Научно-практические рекомендации используются для оценки морфофункционального статуса сельскохозяйственных птиц при вирусных антигенных стимуляциях на птицефабриках Красноярского края, Иркутской области, в республике Хакассия, в работе научно-производственных ветеринарных лабораторий КГБУ «Краевая ветеринарная лаборатория» (Красноярск), КГУ «Алтайская краевая ветеринарная лаборатория», ГУ «Тюменская областная ветеринарная лаборатория», ФГУ «Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория».

Результаты научно-производственных испытаний провеста вошли в отчет о доклинических, токсикологических и ветеринарных исследованиях лекарственного средства «провест» и в инструкцию по применению данного препарата, зарегистрированного в Российской Федерации в качестве иммуномодулятора и стимулятора неспецифической резистентности сельскохозяйственных животных и птиц (регистрационный номер ПВР-1-6.8/02306 от 15 января 2009 г.). Провест используется в качестве иммуномодулятора в ОАО «Птицефабрика Заря» Красноярского края.

Материалы работы вошли в три практикума: «Цитология и эмбриология» (Красноярск, 1998), «Общая гистология» (Красноярск, 2001, 2007), «Частная гистология» (Красноярск, 2002); три электронных учебно-методических комплекса: «Морфология сельскохозяйственных животных»,  «Анатомия домашних животных», «Анатомия сельскохозяйственных и промысловых животных» и используются в учебном процессе при изучении дисциплин «Цитология, гистология, эмбриология» и «Анатомия домашних животных» в Красноярском государственном аграрном университете, Хакасском государственном университете, Бурятской государственной сельскохозяйственной академии, Оренбургском государственном аграрном университете, Вятской государственной сельскохозяйственной академии, Санкт-Петербургской государственной ветеринарной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

– анализ комплексных программ вакцинаций в промышленных птицефабриках Красноярского края;

– закономерности роста и становления органов иммуногенеза кур в постнатальном периоде развития;

– характеристика морфобиохимических, цитохимических, кариоцитометрических, метаболических показателей крови кур в постнатальном онтогенезе на фоне вирусных антигенных воздействий;

– особенности морфофункционального состояния органов иммунной системы кур под действием многократных антигенных стимуляций при реализации комплексных программ вакцинаций;

– оценка структурных изменений органов иммунной системы кур при патологических состояниях инфекционной и неинфекционной этиологии;

– влияние провеста на сохранность, показатели поствакцинального гуморального иммунитета, циркуляцию  внутриклеточных микроорганизмов (микоплазм) и цитоморфологические параметры органов иммунной системы кур при реализации комплексных программ вакцинаций.

Апробация работы. Основные материалы исследований доложены и одобрены на IX, X, XI Всесоюзных конференциях по патологической анатомии животных (Каунас, 1984; Саратов, 1987; Харьков, 1990); III Всесоюзном съезде паразитоценологов (Киев, 1991); научно-практической конференции «Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии (Сумы, 1991); Всероссийской научно-производственной конференции «Гигиена, ветсанитария и экология животноводства» (Чебоксары, 1994); IX и XIII Международных симпозиумах «Реконструкция гомеостаза» и «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск, 1998, 2006); Международном съезде терапевтов, диагностов «Актуальные проблемы патологии животных» (Барнаул, 2005); научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири» (Новосибирск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири» (Красноярск, 2006); региональных научно-практических конференциях «Аграрная наука – на рубеже веков» (Красноярск, 2006-2007); научном семинаре института медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Бердск, 2009); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию П.Г. Петского (Киров, 2009); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития» (Красноярск, 2008-2010).

Публикации. Основные научные положения диссертации изложены в 55 работах, в том числе 9 – в трудах Международных конференций, 10 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ; в монографии «Иммунодефициты птиц: этиология, патогенез, морфологическая диагностика, способы коррекции»; двух научно-практических рекомендациях.

Личный вклад. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В исследовании кислородного метаболизма клеток крови кур практическую помощь оказывали сотрудники сектора иммунологии Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН кандидат биологических наук Г.В. Макарская и С.В.Тарских; при изучении провеста консультативную помощь оказывал руководитель ОБТК ООО «Диафарм» доктор биологических наук Ю.С. Аликин.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 470 наименований, из них 218 зарубежных источников. Материалы диссертации иллюстрированы 22 таблицами и 129 рисунками, из них 43 диаграммы, 85 микрофотографий и 1 схема.

  1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены в течение 1990-2010 годов на кафедре анатомии и гистологии животных института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета в рамках госбюджетной научно-исследовательской тематики кафедры. Данная работа вошла в межведомственную координационную программу фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Сибири на 2006-2010 годы (шифр VIII.02.02.). Общая структура проведенных исследований представлена на рисунке 1.

Объектом исследования являлись клинически здоровые интактные и иммунизированные цыплята, а также выбракованные и павшие цыплята яичных кроссов «Родонит-2»,  «Хайсекс браун», «Хайсекс уайт» разных возрастных групп в период выращивания от 1 до 120 суток жизни и цыплята-бройлеры кроссов «Сибиряк» и «ISA-F-15» 1-42-суточного возраста. Птица для исследований была получена из СПХ ЗАО «Владимировское», ОАО «Птицефабрика Заря», ООО ПФ «Сибирская губерния», ООО ПФ «Красноярская» Красноярского края. Материалом для исследований служили тимус, фабрициевая бурса, селезенка, печень,  участок кишечника в области бифуркации слепых кишок, цельная венозная кровь и сыворотка крови.

Изучение программ вакцинаций проведено на основании анализа схем иммунизаций птицефабрик, документов ветеринарной отчетности Управления ветеринарии, а также информационно-аналитических материалов министерства сельского хозяйства и продовольствия Красноярского края.

Коррекция иммунного статуса кур при реализации комплексных программ вакцинаций проведена на основании договора о научном сотрудничестве (14.12.2005) с ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора (г. Бердск, Новосибирской области) в серии научно-производственных испытаний на птицефабриках Красноярского края.


ЦИТОМОРФОЛОГИЯ ОРГАНОВ ИММУНОГЕНЕЗА КУР ПРИ РЕАЛИЗАЦИИ КОМПЛЕКСНЫХ ПРОГРАММ ВАКЦИНАЦИЙ И КОРРЕКЦИЯ ИММУННОГО СТАТУСА В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПТИЦЕФАБРИК

Анализ комплексных программ вакцинаций и синдроматики поголовья кур на птицефабриках Красноярского края

Закономерности роста и становления органов иммуногенеза кур и возрастная динамика крови в постнатальном онтогенезе

Цитоморфология органов иммунной системы и крови кур при реализации комплексных программ вакцинаций

Коррекция иммунного статуса кур при реализации комплексных программ вакцинаций

Объект исследования:

  1. Документы ветеринарной отчетности управления ветеринарии и информационно-аналитические материалы министерства сельского хозяйства и продовольствия Красноярского края.
  2. Цыплята яичных кроссов «Родонит-2», «Хайсекс браун», «Хайсекс уайт» возраст 1-120 суток.
  3. Цыплята мясных кроссов « «Сибиряк», «ISA-F-15» возраст 1-46 (42) суток

Рекомендации к использованию научных положений

Оценка структурных изменений органов иммунной системы кур при патологических состояниях различной этиологии

Материал исследования: тимус, фабрициевая бурса, селезенка, лимфоидная ткань кишечника, печень, кровь

Методы исследования

Подпись: ГистологическиеПодпись: ГистохимическиеПодпись: СерологическиеПодпись: ГематологическиеПодпись: БиохимическиеПодпись: Хемилюминес-  центный  Подпись: ЦитохимическиеПодпись: ЦитокариометрияПодпись: МорфометрияПодпись: ИммунологическийПодпись: СтатистическийПодпись: ПатологоанатомическийПодпись: 9 


Рис. 1. Схема общей структуры исследований


В качестве иммунокоррегирующего средства использован препарат провест (синоним: комплекс А), разработанный в ООО «Диафарм» совместно с ИМБТ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, представляющий комплекс натриевых солей однонитевых и двуспиральных РНК, полученных их киллерных дрожжей Saccharomycescerevisiae, с добавлением поливинилпирролидона, обеспечивающего его пролонгированное действие.

С целью установления безвредности и оптимальных доз провеста в одном из производственных цехов ЗАО СПХ «Владимировское» было создано четыре группы суточных цыплят кросса «Родонит-2» по 910 гол. в каждой: три опытные и одна контрольная. Провест в дозах 8 мкг/гол., 16 мкг/гол. и 24 мкг/гол. вводили птице первой, второй и третьей опытных групп одновременно с вакциной против БМ внутримышечно полуавтоматическим инъектором ИП-1. Для первой группы в 200 мл разбавителя для сухих вирусвакцин растворяли одну (8 мг), для второй группы – две (16 мг) и для третьей – три ампулы провеста (24 мг) и использовали одновременно с вакциной в дозе 0,2 мл готового раствора на голову. Контрольная птица иммунизирована без провеста.

Влияние провеста на органы иммуногенеза и показатели гуморального иммунитета изучено в ОАО «Птицефабрика Заря» в двух производственных  опытах. В первом опыте было сформировано три группы суточных цыплят породы «Родонит-2». Птице первой группы (1392 гол.) провест растворяли в 160 мл разбавителя для сухих вирусвакцин и вводили с вакциной против БМ из расчета 10 мкг/гол., цыплятам второй группы (1496 гол.) – 20 мкг/гол., контрольная птица (1869 гол.) привита без провеста. Во втором опыте партия суточных цыплят «Хайсекс браун» (24000 гол.) обработана провестом в дозе 10 мкг/гол., контрольная партия птицы (20900 гол.) привита без препарата.

Для исследования влияния провеста на цыплят-бройлеров в ООО ПФ «Сибирская губерния» были сформированы две группы суточной птицы кросса «ISA-F-15». Цыплята опытной группы (2400 гол.) обработаны провестом с вакциной против БМ подкожно в дозе 8 мкг/гол. Птица контрольной группы (2600 гол.) привита без провеста. Всего на птицефабриках Красноярского края обработано провестом 32018 гол., контролем служили 26279 гол.

В течение всего периода наблюдений проводился клинический осмотр, учет сохранности, падежа, прироста живой массы, абсолютной и относительной массы тимуса, фабрициевой бурсы, селезенки, патологоанатомическое вскрытие, цитоморфологические исследования. Контроль напряженности гуморального поствакцинального иммунитета к ИБК, ИББ, НБ  и иммунологический мониторинг микоплазмоза осуществлялся в ИФА и РЗГА.

Материалом для морфобиохимических, цитохимических, цитокариометрических, серологических исследований и хемилюминесцентного анализа служила периферическая венозная кровь(цельная или сыворотка). У цыплят раннего возраста кровь брали из яремной вены, у птицы старшего возраста – из подкожной локтевой (крыловой) вены. В качестве антикоагулянта использовали 1% раствор гепарина в дозе 25-50 МЕ на 1 мл цельной крови. Содержание эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали в камерах Горяева после разведения образцов цельной крови 3%-ным раствором генцианвиолета, приготовленного на 0,85% растворе натрия хлорида. Лейкоцитарный профиль крови изучали на мазках, окрашенных по Паппенгейму [Карпуть, 1986]. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) определяли микрометодом Панченкова. Гемоглобин исследовали гемоглобинцианидным методом на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ4.2 при длине волны 540 нм, общий белок в сыворотке крови – биуретовой реакцией, уровень белковых фракций – нефелометрическим методом на фотоколориметре при длине волны 670 нм.

Цитокариометрический анализ, в соответствие с рекомендациями К. Ташкэ (1980), включал определение диаметра, площади и объема ядра, цитоплазмы и ядерно-клеточного отношения (ЯКО). При округлой форме ядра и клетки использовали формулу: S=p?r2, а при эллипсоидной форме ядра и клетки – S=p?а?b/4, где a – длина эллипса, b – ширина эллипса. Объем шарообразных или почти шарообразных ядер и клеток, имеющих элонгацию (удлиненность) не более 1,2, рассчитывали по формуле: V=?/6?D3, а для ядер и клеток с элонгацией от 1,2 до 2,0 –  V=?/6?LB2, где L – большой диаметр, а B – меньший диаметр ядра. Для установления объема цитоплазмы из объема клетки вычитали объем ядра. Полученные данные использовали для определения ЯКО.

Цитохимические исследования клеток крови включали определение лизосомально-катионных белков (ЛКБ), гликогена и миелопероксидазы. ЛКБ определяли 0,1% забуференным спиртовым раствором прочного зеленого марки C.I.42053 (производство Диа*М) при рН 8,15 по В.Е. Пигаревскому (1987). Ядра клеток подкрашивали 0,25%-ным водным раствором азура А. Гликоген в клетках крови выявляли в ШИК-реакции по МакМанусу. Контрольные мазки перед окраской обрабатывали амилазой слюны или диастазой в течение 2 часов в термостате при температуре 37оС. Пероксидазу выявляли бензидином по методу Грэхем-Кнолля [Хейхоу, Кваглино, 1983].

При полуколичественной оценке цитохимических реакций использовали принцип Астальди-Верга, основанный на разделении клеток на группы в зависимости от степени интенсивности специфической окраски. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) определяли по L. Kaplow в модификации В.Е. Пигаревского, Ю.А. Мазинга (1987).

Хемилюминесцентный анализ проведен на основании договора о научном сотрудничестве (10.06.2009) в секторе иммунологии Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН (Красноярск). Уровень кислородного метаболизма клеток венозной нефракционированной крови оценивали по методу Tono-Oka et al. (1983) в модификации В.М. Земскова и А.А. Барсукова (1988) и нашей модификации по кинетике активированной и спонтанной генерации активных форм кислорода (АФК), регистрируемой микрометодом люминол- и люцигенинусиленной хемилюминесценции (ХЛ) с использованием аппаратурно-программного 36-канального комплекса «Хемилюминометр CL-3604» – ПЭВМ (СКТБ «Наука», Красноярск). Активацию клеток крови проводили путем антигенной стимуляции in vitro частицами латекса размером 2,3 мкм.  Время записи ХЛ-кривой составляло 90 минут при температуре +42оС.

Состав реакционной смеси состоял из 100 мкл гепаринизированной крови, разведенной в 2, 5 и 10 раз неокрашенным раствором Хенкса, 200 мкл раствора люминола ("Sigma", USA) в концентрации 2,2*10-4М или люцигенина ("Sigma-Aldrich", Switzerlend) 10-4 М на растворе Хенкса при рН=7,4, 50 мкл взвеси частиц латекса в концентрации 5?108 частиц/мл (ВНИИСК, СПб), опсонизированных белками пуловой сыворотки крови взрослых кур.

Оценены следующие параметры ХЛ: амплитуда максимальной активности хемилюминесцентной реакции (Imax, имп./с); время достижения максимума (Tmax, мин.); интегральная светосумма (S, имп. за 90 мин.), определяющая общее количество АФК, генерируемых клетками за время записи хемилюминесцентной кривой; индекс активации (ИА=Sакт./Sспонт., усл. ед.), как отношение светосумм активированной и спонтанной ХЛ. По окончании записи ХЛ определяли фагоцитарную активность лейкоцитов в камере Горяева при окраске 0,25% раствором генцианвиолета.

Гистологические исследования тимуса, фабрициевой бурсы, селезенки, печени, участка слепых кишок осуществляли по общепринятым методикам. Органы фиксировали в 10% формалине, жидкости Буэна и Карнуа. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, коллагеновые волокна выявляли по Маллори и ван Гизону, ретикулиновые – импрегнацией серебром по Футу, эластические – резорцин-фуксином по Вейгерту. Углеводсодержащие биополимеры выявляли ШИК-реакцией по МакМанусу, альциановым синим по Стидмену, комбинированной окраской по Крейбергу [Автандилов, 1994]. ДНК и РНК в плазмоцитах определяли метиловым зеленым и пиронином G по Браше [Кононский, 1976]. Контрольные срезы перед окрашиванием инкубировали с соответствующим энзимом (амилазой или рибонуклеазой) при температуре 37оС в течение часа.

Морфометрические исследования включали определение абсолютной массы тела и органов, их абсолютного и относительного прироста. Абсолютный прирост рассчитывали по формуле: V2V1, где V1 – масса тела или органа в начале периода, V2 – масса тела или органа в конце периода. Относительный прирост, отражающий скорость роста, вычисляли по формуле: . Относительную массу органовопределяли как частное от деления абсолютной массы органа (Vo)  и абсолютной массы тела (Vm), выраженное в процентах.Весовой индексрассчитываликак отношение абсолютных масс органа и тела, умноженное на 1000.

Для суждения о функциональном состоянии тимуса определяли соотношение площади коркового и мозгового вещества (индекс коры); плотность лимфоцитов в условном поле зрения коры и медуллы; количество митозов в коре на 1000 зарегистрированных клеток (митотический индекс); количество и размеры телец Гассаля; в фабрициевой бурсе определяли диаметр и площадь лимфатических фолликулов, высоту эпителия складок, плазмоцитарную реакцию оценивали по суммарному содержанию плазмоцитов в 30 полях зрения соединительной ткани; в селезенке – количество и размеры фолликулов, клеточный состав красной пульпы.

При морфометрических исследованиях использовали окуляр-микрометр МОВ-1-15х (ГОСТ 7865-56), объект-микрометр ОМП (ГОСТ 7513-55) и стереометрические окулярные вставки Автандилова. Микрофотографирование проведено на микроскопе МС 100 (Micros, Austria), фотокамерами Digital САМ V200 и Canon PowerShot A520, при объективах 4, 10, 40 и 100. Характеристика изученного материала представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Сводные данные по количеству объектов, подвергнутых исследованиям*

Метод исследования

1

2

3

4

Всего

Патологоанатомический

171

1097

154

37

1459

Гистологический

57

238

14

309

Гистохимический

22

59

81

Морфометрический

57

231

288

Гематологический

51

76

127

Биохимический

44

70

114

Цитохимический

25

64

89

Цитокариометрический

46

46

Иммунологический (ФАЛ)

96

96

Хемилюминесцентный

96

96

Серологический

448

90

538

Примечание – 1 – СПХ «Владимировское»; 2 – ООО «Птицефабрика Заря»; 3 – ООО ПФ «Сибирская губерния»; 4 – ПФ «Красноярская»

Статистический анализ. Полученные данные обработаны с учетом рекомендаций по биометрии [Автандилов, 1984] и статистическому анализу [Берк, Кэйри, 2005] методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стъюдента. Вычисляли средние арифметические (x) и их ошибки (Sx). Разницу показателей считали достоверной при Р?0,05.  Статистическую обработку полученных данных проводили на ПК «Intel Centrino Duo processor T5250» с помощью прикладных программ Microsoft Office Excel 2007.

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 |
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.