WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа «quorum sensing» у морских бактерий

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

МАНУХОВ Илья Владимирович

СТРУКТУРА LUX-ОПЕРОНОВ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТИПА «QUORUM SENSING» У МОРСКИХ БАКТЕРИЙ.

(03.02.07 - Генетика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2011


2

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»)


Научный консультант

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»


Завильгельский Геннадий Борисович



Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор НИИ ФХБ им А. Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова

Доктор биологических наук, профессор ЗАО «Научно-Исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Доктор биологических наук, профессор Учреждение Российской Академии Наук Институт Белка РАН


Богачёв Александр Валерьевич

Лившиц Виталий Аркадьевич

Колб Вячеслав Адамович.


Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН


2011 г. в 14 часов на заседании

Защита диссертации состоится "_

Диссертационного совета Д 217.013.01 при Федеральном Государственном Унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика») по адресу 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, дом 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»


Автореферат разослан "_


2011 г


Ученый секретарь диссертационного Совета


кандидат химических наук, доцент


Воюшина Т.Л.


3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В последние 15 лет достигнут значительный прогресс в понимании механизмов регуляции генов по принципу «Quorum Sensing» (QS). QS - система регуляции экспрессии генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с локальной плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /wx-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже в 1994 г Greenberg Е.Р. с сотр. (Fuqua W.C., et al 1994). В результате активного изучения было обнаружено, что феномен QS широко распространён среди бактерий. Оказалось, что ряд генов, определяющих вирулентность патогенных микроорганизмов и устойчивость к лекарственным препаратам, регулируется по принципу QS, что имеет особое значение для медицины и поэтому вызывает высокий интерес научного сообщества к данной проблеме.

Zwx-оперон морских бактерий Aliivibrio fischeri в настоящее время принято считать модельным в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, регулятора lux-оперона было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий, а также о механизмах стабилизирующего отбора /wx-оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых регуляторных QS систем у бактерий и исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки. Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики - фолдинг и рефолдинг белков и роль белков - шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются различающиеся по термостабильности, но гомологичные по аминокислотной последовательности бактериальные люциферазы психрофильных и мезофильных морских люминесцирующих бактерий.

Кодируемые генами бактериальных /wx-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсикантов в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых


4 медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.

Цель и задачи исследований.

Целью данной работы являлось изучение механизмов регуляции /wx-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, а также исследование роли шаперонов в фолдинге и рефолдинге термолабильных белков на модели различающихся по термостабильности бактериальных люцифераз.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.

Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий,

Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.

Клонировать и секвенировать /wx-опероны бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Провести сравнение механизмов регуляции /wx-оперонов психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio.

Определить влияние на активность регуляторного белка LuxR АТФ-зависимых шаперонов и протеаз.

Исследовать роль N- и С-концевых доменов белка LuxR при взаимодействии с шапероном GroEL/ES и протеазой Lon.

Исследовать in vivo воздействие различных шаперонов на рефолдинг белков, различающихся по термостабильности на модели гомологичных бактериальных люцифераз, изолированных из люминесцирующих бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Сконструировать и показать эффективность применения /wx-биосенсоров, созданных на основе штаммов Е. coli, содержащих гибридные плазмиды с генами бактериальных люцифераз в качестве репортёрных, расположенных под контролем различных индуцируемых (стрессовых) промоторов.

Научная новизна работы.

Впервые определена структура /wx-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /wx-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена luxR, в /wx-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.


5

Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

Впервые показано, что АТФ-зависимая протеаза Lon участвует в негативной регуляции систем QS у морских бактерий. Доказано, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке нативной формы белка LuxR.

Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N -домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином GroEL, необходимым для сборки нативной структуры LuxR.

Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.

Показано впервые, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHsp (IbpAB).

Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

Сконструированы новые формы /wx-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и супероксид-анион).

Практическая значимость исследования.

Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных специфических /wx-биосенсоров. Использование транскрипционных слияний стрессовых и других индуцируемых промоторов с генами бактериальных люцифераз в качестве репортерных позволило создать набор биосенсоров, специфически реагирующих на различные токсиканты и другие биологически активные вещества. Данные биосенсоры в


6

настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, тестированию медицинских препаратов и для изучения механизмов воздействия на клетку различных токсикантов.

Полученные в работе данные о влиянии шаперонов и протеаз на активность белка LuxR могут быть использованы для создания более чувствительных биосенсоров для детекции аутоиндукторов первого типа. А также бактериальные люциферазы в настоящее время используются в качестве модели для изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены и обсуждались на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (16th ISBC April 19-23, 2010, Lyon, France), III съезде Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2001), Объединенном Съезде генетиков и селекционеров России, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, и Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров.. (ВОГИС с 21 по 28 июня 2009 г. Москва), конференции европейского биохимического общества (FEBS-IUBMB-2005 Conference in Budapest, Hungary) и других конференциях и семинарах. Диссертационная работа была апробирована на секции «Генетика микроорганизмов» Диссертационного совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 24 мая 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 статья в рецензируемых журналах.

Структура диссертации.

Диссертационная работа включает 6 глав, 151 страницу, 58 рисунков и 4 таблицы. В работе использовано 208 литературных источников.


7 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Бактериальные штаммы и плазмиды. Е. coli К12 TG-1; Е. coli МС1061; Е. coli АВ1899 - получены из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика; SKB178; OFB111 groEL673; groEL97; groES::Tn\0 - Georgopoulos СР. et al.,1973; MG1655 и PK202 - от Элизабет Крэйг (США); Е. coli SG20250 и Е. coli SG20100 clpff получены от S.Gottesman (США). Е. coli BW25113, JW3663 ibpB/.kan и JW3664 ibpA/.kan получены от Машко СВ. (Keio-collection). Штаммы A. fischeri MJ-1 и МГУ-6 - получены от А. П. Зарубиной (кафедра микробиологии МГУ им М. В. Ломоносова). Штаммы A. logei: ВМ1 и ВМ2 изолированы из кишечника керчака Myoxocephalus scorpius (акватория Белого моря); KChl и KCp, изолированы из кишечника керчака Myoxocephalus polyacanthocephalus и корюшки Osmerus mordax dentex, соответственно (Камчатка, акватории Охотского и Берингова морей).

Векторы: pUC19, pUC18, pUC12, pACYC184, pBluescript IIKS, pGEX-KG, pBR322 получены из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика; pDEW201 - получен от Т.К. Van Dyk.

Плазмиды: pFl (получена в 1991 г. Г.Б.Завильгельским и Т.А. Черновой) состоит из вектора pBR322 и 5адаН1-фрагмента хромосомы A. fischeri с полным /wx-опероном.

рАС16 содержит в векторе pACYC184 5адаН1-фрагмент хромосомы A. fischeri с полным /wx-опероном.

pVFRl (вектор pDEW201, содержащий luxK ген и регуляторную область lux-оперона A. fischeri) является биосенсорной плазмидой: /wxCDABE гены Photorhabdus luminescens (термостабильная люцифераза) транскрибируются в присутствии аутоиндуктора N-3-оксогексаноил-лактон L-гомосерина.

pSV16 аналогична pVFRl, но содержит /wxR2 ген и регуляторную область lux-оперона A. logei KChl.

pSV17 аналогична pSV16, но содержит luxR2 ген и регуляторную область lux-оперона штамма KCp.

pMVl аналогична pSV16, но содержит /wxRl ген и регуляторную область lux-оперона A. logei KChl.

pMV2 - ген luxR2 штамма KChl клонирован в векторе pACYC184.

Плазмиды pSV10,4 и pSV20 содержат фрагменты ДНК с полными /wx-оперонами штаммов A. logei ВМ1 и A. logei KChl соответственно, встроенные в вектор pTZ57R.

pSV18 - luxCD гены A. logei клонированы в вектор pTZ57R под контролем Plac промотора.


pSV19 - тоже что и pSV18, но - luxCD гены из A. salmonicida

pBRlon - вектор pBR322, содержит ген ???? - протеазы Lon (от Старковой Е.Н.).

pGroEL/GroES - вектор pACYC184 с генами groEL/ES под собственным промотором (получена от Грагерова А.).

pGEX-KG вектор со встроенным по ВатНУЕсоШ-сайтам геном luxR A. fischeri; Арг.

вектор pGEX-KG содержит 5 - делетированный фрагмент гена luxR; Арг. вектор pGEX-KG содержит 3 - делетированный фрагмент гена luxR; Арг.

pOMibpAB - вектор pZS33 содержит гены ibpAB, расположенные под промотором PLteto-ь Cmr

pAlkA-lux - ДНК-фрагмент, содержащий промотор PalkA и регуляторный участок, был получен при помощи ПЦР из генома Е. coli К12 MG1655 и встроен в беспромоторный мультикопийный вектор pDEW201.

pRecA-lux - аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена гесА.

pKatG-lux - аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена katG.

pSoxS-lux - аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена soxS.

pArsR-lux - аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена arsR (любезно предоставлена Расторгуевым СМ.).

Среды и условия роста бактерий. Морские светящиеся бактерии растили на среде SWTm, содержащей (%, в./об.): 0.5 триптона, 0.25 дрожжевого экстракта, 1.5 морской соли и 0.3 глицерина. Клетки растили при 15 С.

Бактерии Е. coli растили в бульоне Луриа-Бертани (LB). Агаризованные среды готовили с 1.5% агаром.

Выделение и очистка хромосомной и плазмидной ДНК, клонирование и рестрикционный анализ проводили стандартными методами согласно (Sambrook J. et al 2001). Определение нуклеотидной последовательности проводили методом Сэнгера (Sangeretal. 1977).

Выделение и очистка белков и электрофорез в полиакриламидном геле. Выделение белков проводили, используя рекомбинантные плазмиды, полученные на основе вектора pGEX-KG. Синтезируемые белки в этом варианте клонирования соединены чувствительным к тромбину линкером с глутатион -трансферазой. Очистка белков проводилась с помощью аффинной хроматографии на глутатион - агарозе, сорбирующей только GST - содержащие белки, с последующей элюцией раствором восстановленного глутатиона. Контроль за выделением белка осуществляли в 10%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.


Биолюминесценцию клеток измеряли на планшетном люминометре LMA01 ("Beckman") или на высокочувствительном кюветном люминометре «Биотокс7М».

Результаты. Сравнительный анализ "Quorum Sensing" систему психрофильных и мезофильных светящихся морских бактерий.

Впервые /wx-оперон A. fischeri был изолирован и клонирован в клетках Е. coli и детально анализирован в работе (Engebrecht J. et al., 1983). На рис. 1 приведена структура /wx-оперона A. fischeri /wxRICDABEG. Оперон состоит из двух частей: luxK с промотором Pi и /wxICDABEG с промотором Pr. (Meighen Е.А., 1991). Структурные гены luxAB определяют синтез а - и ? - субъединиц люциферазы. Гены /wxCDE определяют синтез трех-субъединичной редуктазы жирной кислоты (fatty acid reductase), ведущей восстановление жирной кислоты до альдегида (тетрадеканаль), являющегося субстратом люциферазы. Ген luxG определяет синтез т.н. "probably" флавин-редуктазы, которая, по всей видимости, не активна (Meighen Е.А., 1991; Tu S.-C, and Mager H., 1995).


Г~)|    CDABEG У

Синтез автоиндуктора

Деградация   /' Lon-протеаэой

fcj


lux-box


LuxR

Рисунок 1. Схема регуляции /wx-оперона A. fischeri.

Гены 1их\ и /wxR являются регуляторными. Белок Luxl -ацил-синтаза, ведущая синтез ацильного производного гомосеринлактона (N-AHL), ]Ч[-(3-оксогексаноил) лактон L-гомосерина (OHHL). Впервые структура N-AHL была определена в 1981 году (Eberhard А.,. 1981.). Впоследствии все аутоиндукторы - класса ацильных производных лактона L-гомосерина получили название аутоиндукторов первого типа (АИ).

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.