WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМТИНА И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

КИРЕЕВ ИГОРЬ ИГОРЕВИЧ

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ

ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЭУКАРПОТ

И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой

степени доктора биологических наук

Москва-2011


Работа выполнена в Отделе электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН, профессор В.П. Скулачёв) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна, доктор биологических наук, профессор Коломиец Оксана Леонидовна, доктор биологических наук, профессор Зеленин Александр Владимирович.

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Защита диссертации состоится   «       » __________    2011 г. в ____ часов на

заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан «     »_________ 2011г.

Калистратова Е.Н.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук


1. ВВЕДЕНИЕ

Значительное увеличение размеров и сложности генома в процессе эво­люции повысило важность решения проблемы упорядоченной пространствен­ной организации генетического материала и его аккуратной сегрегации в ходе деления клетки у высших эукариот. Это достигается многоуровневой упаков­кой ДНК в сложный нуклеопротеидный комплекс — хроматин. Вершиной та­кой упаковки являются митотические хромосомы, степень компактизации ДНК в которых на стадии метафазы достигает 104. Важную роль в упорядоченной укладке ДНК в составе хроматина играют как гистоны, так и негистоновые бел­ки, причем до недавнего времени считалось, что гистоны выполняют исключи­тельно структурную роль, обеспечивая упаковку ДНК на низших уровнях компактизации - в составе нуклеосом и 30-нм фибрилл хроматина. Дальнейший способ упаковки 30-нм фибриллы и формирование т.н. высших уровней орга­низации хроматина до сих пор остаются предметом дискуссий. Неполнота и противоречивость сведений о пространственной организации хроматина суще­ственно осложняют адекватную интерпретацию биохимических и генетических данных о молекулярных механизмах, лежащих в основе процессов компактиза-ции/декомпактизации хроматина. Например, прогресс в исследовании функцио­нальной роли «архитектурных» негистоновых хромосомных белков, таких как топоизомераза II и белки конденсинового комплекса, существенно тормозится из-за того, что изучение характера их взаимодействия с хромосомами проводи­ли преимущественно в системах in vitro, а также в условиях искусственной де-конденсации хромосом (Earnshaw, Heck, 1983; Hirano, Mitchison, 1994; Maeshi-ma et al, 2005). Поскольку данные об ультраструктурной локализации этих важ­нейших структурных компонентов хромосом в контексте нативного хроматина практически отсутствуют, многие аспекты структурно-функциональной органи­зации и динамики хромосом в митозе остаются непонятными.

Следует отметить, что сложности в исследовании структуры хромосом обусловлены не в последнюю очередь особенностями их организации. Так, вы­сокая плотность упаковки хроматина не позволяет непосредственно проследить характер укладки хроматиновых фибрилл разного уровня в составе компактизо-ванных метафазных хромосом. Это обстоятельство и является главной причи­ной популярности экспериментальных подходов, использующих различные ме­тоды декомпактизации хроматина (Paulson, Laemmli, 1977; Brinkley et al, 1980; Zatsepina et al., 1983). В то же время, значительные структурные перестройки хроматина, происходящие даже в достаточно узком диапазоне изменений со­става окружающей среды, могут не отражать истинной природы хромосом, а сами эти подходы могут служить потенциальным источником артефактов. Это особенно актуально для высших уровней организации хроматина, демонстриру­ющих высокую лабильность в системах in vivo и in vitro. В связи с этим, особое значение приобретает разработка методических подходов, направленных на ис­следование организации хроматина в его нативном состоянии. Дополнительные

3


сложности в решении данной задачи связаны с тем, что структурная организа­ция хроматина не монотонна: различные участки генома различаются по харак­теру упаковки ДНК, и эти различия связаны с функциональным состоянием генных локусов. Классическим примером может служить подразделение интер-фазного хроматина на слабо компактизованный, транскрипционно активный эухроматин и плотно упакованный, инертный в отношение экспрессии генети­ческой информации гетерохроматин. Различия в структурном состоянии эу- и гетерохроматина становятся менее очевидными при переходе от интерфазы к митозу, однако фундаментальные особенности структуры этих фракций генома по-видимому, сохраняются. В связи с этим особенно важно иметь возможность исследовать особенности структурной организации индивидуальных хромосом­ных локусов в составе нативного хроматина. Для решения такой задачи требу­ются новые методические подходы, поскольку используемые в настоящее вре­мя методы гибридизации in situ не позволяют в должной степени сохранить ин-тактной тонкую структуру хромосом. Одним из таких подходов является конструирование искусственных хромосомных локусов, визуализуемых при по­мощи системы 1ас-опреатор/1ас-репрессор как in situ, так и in vivo (Robinett et al, 1996).

Однако биологическое значение высших уровней организации хромосом эукариот не ограничивается необходимостью компактизации длинных молекул ДНК для аккуратной трансмиссии генетической информации в процессе кле­точного деления. Сложно организованный и плотно упакованный хроматин неизбежно создает топологические проблемы при репликации ДНК, что требу­ет точной координации процесса синтеза ДНК со структурными преобразова­ниями реплицирующегося хроматина. Отсутствие детальной информации об организации хроматиновых структур высшего порядка ограничивает выработку единой точки зрения на пространственно-временную организацию процесса синтеза ДНК и механизмы пострепликативной сегрегации сестринских хрома-тид.

Структурное состояние хроматина также является важным элементом си­стемы эпигенетической регуляции экспрессии генов. Роль упаковки хроматина проявляется как на уровне контроля доступности ДНК для связывания транс­факторов за счет ограничения диффузии (John et al, 2011), так и на уровне моду­ляции их взаимодействий с хроматиновой матрицей через посттрансляционные модификации гистонов (Allis et al, 2007). В последнее время становится все бо­лее очевидным, что и высшие уровни компактизации хроматина, и даже пози­ционирование хромосомных локусов или целых хромосом в трехмерном про­странстве интерфазного ядра представляют собой дополнительные уровни эпи­генетического контроля, однако механизмы реализации такого рода регуляции, и способы поддержания эпигенетических состояний, связанных с про­странственной организацией интерфазного хроматина, в ряду клеточных деле­ний или остаются гораздо менее исследованными. Очевидно, что ответы на эти

4


вопросы не могут быть даны без полного понимания принципов структурной организации хроматина на этих надмолекулярных уровнях.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было исследование формирования высших уров­ней организации хроматина в процессе митотическои компактизации хромосом и роли «архитектурных» белков хромосом в этом процессе, а также изучение взаимосвязи структурной организации хроматина и его функционального со­стояния, в первую очередь, в отношение транскрипционной и репликативнои активности.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

- 1) провести сравнительный ультраструктурный анализ и исследовать осо­бенности высших уровней компактизации ДНК в хроматиновых доменах с различным генетическим статусом (эухроматин, факультативный и конститутивный гетерохроматин), используя инактивированную Х-хро-мосому и прицентромерный гетерохроматин (хромоцентры) в качестве модели.

  1. исследовать динамику высших уровней организации хроматина в про­цессе репликации ДНК и характер пострепликативных структурных преобразований хроматина.
  2. изучить топологию рано реплицирующегося, транскрипционно актив­ного эухроматина и поздно реплицирующегося, молчащего гетерохроматина в митотических хромосомах
  3. исследовать на ультраструктурном уровне структурные преобразова­ния хроматина при активации транскрипции, используя в качестве модели искусственные генные локусы, визуализуемые in vivo.

5)    изучить динамику митотическои компактизации хроматина на

ультраструктурном уровне и процесс формирования высших уровней ор­

ганизации хроматина в ходе естественной компактизации.

  1. исследовать роль Са++ в формировании высших уровней компактиза­ции хроматина в живых клетках
  2. исследовать топологию основных архитектурных белковых компонен­тов хромосом - конденсинового комплекса и топоизомеразы II в ход митотическои компактизации хроматина и установить их связь с фор­мирование высших уровней компактизации хромосом.
  3. исследовать динамику конденсинового комплекса при искусственно индуцированных изменениях характера компактизации хромосом в жи­вых клетках
  4. исследовать топологию конденсинового комплекса в мейотических хромосомах.

5


1.3. Научная новизна работы.

В работе было впервые проведено детальное ультраструктурное исследова­ние динамики формирования высших уровней компактизации хромосом млекопитающих в профазе митоза. Обнаружено, что митотическая компактиза-ция происходит с образованием как минимум двух промежуточных уровней — хроматиновых фибрилл диаметром 200-250 нм и 400 нм.

Впервые исследована трехмерная организация доменов факультативного гетерохроматина, соответствующих неактивной Х-хромосоме человека. Показа­но, что инактивация сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении доступности внутренних областей Xi для транс-факторов.

Показано, что репликативные кластеры в поздно-реплицирующемся гете-рохроматине соответствуют хроматиновым доменам диаметром 250-300 нм. Репликация не требует глобальной деконденсации плотно упакованных доме­нов, и репликативные комплексы распределены равномерно в объеме реплицирующегося домена, не формируя репликативные фабрики.

Исследована динамика основных архитектурных белков хроматина топо-изомеразы II и конденсинов в процессе профазной компактизации хромосом, а также в экспериментальных условиях, вызывающих изменение степени компак­тизации хромосом in vivo. На основании полученных данных предложена новая модель структурной организации митотических хромосом.

Впервые продемонстрирована локализация субъединиц конденсина в тель­цах Кахаля, а также явление независимой локализации индивидуальных субъединиц конденсинового комплекса в различных структурно-функциональ­ных доменах ядра.

Разработан новый метод in vivo иммуномечения клеточных белков наноча-стицами золота, и с помощью данного метода впервые удалось визуализовать на ультраструктурном уровне характер упаковки индивидуальных хромосом­ных локусов в виде хроматиновых фибрилл высшего порядка в интактных клетках.

Разработан метод индукции линейной и поперечной дифференциации митотических хромосом и впервые продемонстрированы различия в организа­ции рано- и поздно реплицирующихся хроматиновых доменов относительно хромосомной оси.

Впервые в интактных клетках показано, что индукция транскрипции эухро-матиновых генов сопровождается частичной деконденсацией высших уровней организации хроматина. В то же время, транскрипция может осуществляться на плотно упакованной хроматиновой матрице.

Впервые прижизненно прослежена динамика ассоциации генов с кластера­ми интерхроматиновых гранул при активации транскрипции, а также продемонстрирована  высокая  локальная  мобильность  транскрибирующихся

6


хромосомных локусов. На основании полученных данных предложена новая модель организации процесса транскрипции в контексте нативного хроматина.

1.4. Научно-практическая ценность работы.

Настоящая работа является фундаментальным научным исследованием. В ходе ее выполнения получены новые данные об организации генетического аппарата высших эукариот и о структурных перестройках высших уровней упа­ковки ДНК в хромосомах, сопровождающих протекание фундаментальных биологических процессов, связанных с экспрессией, репликацией и сегрегацией генетического материала клетки. Эти данные позволяют расширить наши пред­ставления о структурно-функциональной организации генома, а также в перспективе использовать полученные сведения для разработки подходов для коррекции различных патологических процессов, связанных с нарушениями структурного состояния хроматина.

Разработанные автором методы фотостабилизации хроматина, in vivo-им-муномечения могут быть использованы и уже успешно применяются в различных цитологических исследованиях (Kanazawa et al, 2011)

Результаты работы включены в учебные курсы для студентов Биологиче­ского факультета, факультета биоинформатики и биоинженерии, химического факультета МГУ, для слушателей научно-образовательного центра по нанотех-нологиям МГУ, Биологического факультета Университета штата Иллинойс (Урбана-Шампейн, США).

1.5. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Европейском совещании по структуре и функции ядра памяти В.Бернара (1989, 1999, 2003); Конгрессе Европейского общества по фотобиологии (Кембридж, Великобритания, 1995); Съезде Британского общества клеточных биологов (Кентербери, 1995); Сове­щании ЕМВО по структуре и функции клеточного ядра (Прага, Чехия, 1999). Европейского конгресса по клеточной биологии (Прага, Чехия, 1994); Конфе­ренциях Американского общества клеточных биологов (2001, 2002, 2008); 52 Симпозиуме Европейского общества гистохимии (Прага, Чехия, 2010), 17 Меж­дународной хромосомной конференции (Бун, США, 2009), 3 Конференции памяти Марии Кюри по архитектуре генома в связи с патологией (Эдинбург, 2009), Всесоюзных (всероссийских) симпозиумах "Структура и функция кле­точного ядра" и «Биология клетки в культуре» (1990, 1997, 2010), 1-ом Съезде Российского общества клеточных биологов (С-Петербург, 2003), а также на се­минарах Московского общества клеточных биологов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Биологического факультета Университе­та Ренна (Франция), Департамента клеточной биологии и биологии развития

7


Университета Палермо (Италия), кафедры цитологии и гистологии Биологиче­ского факультета МГУ.

2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Принятые сокращения: AT - антитела; ИФ - иммунофлуоресценция; ЭМ - электронная микроскопия; BrdU - бромдезоксиуридин; EdU - этинилдезокси-уридин; FISH - флуоресцентная гибридизация in situ, PBS - физиологический фосфатный буферный раствор, GFP - зеленый флуоресцирующий белок.

В работе были использованы несколько типов клеточных культур, включая клетки человека (HeLa, WI-38), свиньи (СПЭВ), шпорцевой лягушки (XL2), мыши (эмбриональные фибробласты), китайского хомячка (СНО К1, СНО DG-44). Также были получены субклоны линии СНО, несущие интегрированные в геном трансгенные конструкции, содержащие тандемные повторы lac-операто­ра. Визуализация трансгенных локусов in vivo осуществлялась при помощи экспрессии в этих клетках GFP-Lac-репрессора (Robinett et al., 1996). Культиви­рование клеток и процедуры сихронизации клеточных популяций осуществлялись по описанным ранее методам (Li et al., 1998, Uzbekov et al., 1998). Получение препаратов распластанных зародышевых пузырьков ооцитов Xenopus laevis и иммунофлуоресцентный анализ хромосом типа «ламповые щетки» проводили по стандартной методике (Beenders et al, 2003).

Приготовление препаратов для иммунофлуоресцентной микроскопии и FISH, а также методы флуоресцентной ЗО-микроскопии описано в нескольких публикациях (Uzbekov et al, 2003; Kireeva et al, 2004; Rego et al, 2008; Hu et al, 2009). Электронномикроскопический анализ проводили на ультратонких срезах по стандартной методике, а также с использованием микроинъекции первичных антител, коньюгированных с наночастицами золота. Микроинъекцию осуще­ствляли с помощью микроинъектора IM300 (Nikon, Япония) и микроманипулятора MO-202U (Narishige, Япония), смонтированного на инвер-тированом флуоресцентном микроскопе IMT-2 (Olympus, Япония). Электронно микроскопические исследования проводили на микроскопах HU-11B, HU-12 и Н-700 (Hitachi, Япония). Анализ ЗО-организации хроматина проводили метода­ми реконструкции по серийным ультратонким срезам (регистрация и препроцессинг изображений и создание трехмерных моделей проводились при помощи ImageJ и Matlab) или по угловым проекциям полутонких (500-нм) сре­зов при 200кВ в микроскопе Philips СМ200 (FEI, Нидерланды), оборудованном гониометром с большими углами наклона (Gatan, США) и CCD-камерой Тет-Cam-F224 (TVIPS, Германия).

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.