WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

ГИЛЕВА Ирина Павловна

РЕКОМБИНАНТНЫЕ ЦИТОКИНЫ И ЦИТОКИН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ

БЕЛКИ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Кольцове - 2011


Работа     выполнена     в     Федеральном     бюджетном     учреждении     науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»


Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор


Щелкунов Сергей Николаевич



Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор


Загребельный Станислав Николаевич

Кратасюк Валентина Александровна

Меркулова Татьяна Ивановна


Ведущая организация: ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов», г. Санкт-Петербург.

Защита состоится «11» ноября 2011 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.: (8-383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».


Автореферат разослан


2011г.



Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор


Г.П. Трошкова


2


Актуальность проблемы. Гормоны и цитокины обеспечивают

согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем

человека в нормальных условиях и в ответ на патологические

воздействия. Недостаток гормонов и цитокинов является причиной

многих заболеваний человека (например, диабет при недостатке

инсулина или нарушение гемопоэза при недостатке гемопоэтических

факторов), коррекция которых возможна соответствующими

препаратами         экзогенного         происхождения.         Антивирусная,

иммуномодулирующая и антипролиферативная активность цитокинов -интерферонов, фактора некроза опухолей (TNF), факторов кроветворения - делает перспективными их использование в качестве лекарственных средств. Выделение биологически активных веществ (БАВ) белковой природы из природных источников (донорского материала или тканей животных) малоэффективно из-за низких концентраций целевых продуктов или невозможна из-за иммунологической несовместимости. С другой стороны, гиперпродукция цитокинов лежит в основе патогенеза многих тяжелых заболеваний человека (в случае гиперпродукции TNF - ревматоидного артрита, менингита, септического шока, кахексии и др.).

Фундаментальные достижения молекулярной биологии, молекулярной генетики и энзимологии легли в основу возникновения в 70-х гг. прошлого века генетической инженерии или технологии создания рекомбинантных молекул. Суть этой технологии состоит в соединении in vitro фрагментов ДНК из различных источников и последующем введении «искусственной» ДНК в живую клетку, где она способна реплицироваться, а кодируемая ею информация экспрессироваться. Наиболее наглядным примером успеха такой методологии   является   создание   новых   эффективных   лекарственных

3


средств на основе БАВ белковой природы - рекомбинантных гормонов и цитокинов.

К моменту начала работ по теме диссертации было показано, что экспрессия в клетках Escherichia coli генов цитокинов - интерферона ос-2 (Nagata et al, 1980; Goeddel D.V. et. al, 1981) или GM-CSF (Burgess A.W. et. al., 1987) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки. Сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская область) и Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина (г. Москва) методом прямого химического синтеза был получен и клонирован в бактериальной плазмиде (pLelFlac) синтетический ген ifn ?-2 человека (Колосов М.Н. и др., 1984). Необходимым продолжением этих работ является разработка стратегии создания высокопродуктивных штаммов E. coli, обеспечивающих синтез таких важнейших для медицины БАВ, какими являются интерферон и GM-CSF.

В работах ряда исследователей (Щелкунов С.Н., 1995; Alcami А., 2003; Lukas A., McFadden G., 2004) высказаны предположения о возможности использования вирусных иммуномодуляторных белков для антицитокиновой терапии. Получение таких белков в биологически активной форме возможно в ряде случаев только в эукариотических клетках. Удобной системой для решения этой задачи является бакуловирусная система экспрессии.

Настоящая диссертационная работа посвящена конструированию штаммов-продуцентов интерферона а-2Ь и GM-CSF человека на основе бактерии E. coli, а также рекомбинантных бакуловирусов, содержащих в своем геноме гены ортопоксвирусных TNF-антагонистов, и изучению свойств рекомбинантных белков, выделенных из бактериальных клеток и инфицированных клеток насекомых.

4


Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования

является         получение         бактериальных        штаммов-продуцентов

рекомбинантных цитокинов - интерферона а-2Ь человека (hIFNa-2b), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (hGM-CSF) и эукариотических продуцентов TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян (VARV-CrmB, CPXV-CrmB, MPXV-CrmB), а также изучение физико-химических и биологических свойств этих рекомбинантных белков.

Для  выполнения  поставленной  цели  необходимо   было  решить следующие задачи:

-сконструировать рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых генов в бактериальных клетках

E. coli;

-изолировать из вирусных геномов гены TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян и получить рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие гены вирусных TNF-связывающих белков в клетках насекомых;

-выделить из клеток штаммов-продуцентов и изучить физико-химические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков (hIFNa-2b, hGM-CSF, VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB);

-оценить терапевтический потенциал рекомбинантных белков hGM-CSF и VARV-CrmB.

Научная новизна и практическая значимость результатов исследования. Впервые получены рекомбинантные бакуловирусы BTRI67 и BTRz96, детерминирующие в клетках насекомых линии S/21 синтез TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян    (белков    VARV-    и   MPXV-CrmB),    и   впервые   проведено

5


сравнительное изучение свойств белков VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB in vitro. Впервые оценен TNF-нейтрализующий потенциал белка VARV-CrmB относительно некоторых TNF -антагонистов (клеточных TNF-рецепторов, поликлональных антител, TNF-нейтрализующего моноклонального антитела МАК 195, коммерческого препарата Ремикейд) на клетках мышиных фибробластов линии L929. Впервые показана TNF-нейтрализующая активность белка VARV-CrmB in vivo: увеличение количества выживших животных в экспериментальной модели эндотоксического шока и снижение MuTNF-индуцированной подвижности дендритных клеток кожи мышей линии Balb/c. Впервые показана нейтрализация белком VARV-CrmB эффектов MuTNF на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c.

Сконструированы оригинальные рекомбинантные ДНК, обеспечивающие эффективный синтез в клетках E.coli продуктов экспрессии синтетических генов z/wa-2b и gm-csf человека. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов высокоэффективный штамм E.coli SG20050/pIF16 (В-5809) - продуцент рекомбинантного интерферона а-2Ь человека с выходом целевого продукта 3-4 x 10 МЕ/мл/10 кл. На основе этого штамма в ГНЦ ВБ «Вектор» разработана технология получения субстанции интерферона а-2Ь и его лекарственных форм. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов штамм E.coli SG20050/p280GM (В-6613) - первый отечественный продуцент рекомбинантного GM-CSF человека, обеспечивающий выход целевого продукта в количестве 20-50 мг/л клеточной суспензии. Показано, что продукт экспрессии синтетического гена gm-csf в клетках E.coli видоспецифически стимулирует гранулоцитарно-макрофагальную дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток и дендритных клеток. Получен штамм-продуцент и

6


препарат рекомбинантного MuTNF, что позволило использовать этот рекомбинантный белок в экспериментальных моделях при изучении терапевтического потенциала поксвирусных TNF-антагонистов.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международный симпозиум «Регуляция трансляции», Рига (1989); Ш-я Всесоюзная конференция «Макромолекулы и клетки», Москва, Россия (1989), 2nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retro viruses, St. Petersburg, Russia (1992); XI Poxvirus and Iridivirus Meeting, Toledo, Spain (1996); 2nd Russian Principal Investigator Conference, Holland (2001); Международная школа - конференция «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, Россия (2002); 1st International Congress BIOTECHNOLOGY- state of the art&prospects of development, Moscow, Russia (2002); Workshops "Review of Cooperative Biodefense Research Projects, Serpukhov, Russia (2002), St. Petersburg, Russia (2003); International conference "Chemical and biological problems of proteomics", Novosibirsk, Russia (2004); CBR annual review conference, St. Petersburg, Russia (2004); 12th International Congress of Immunology, Montreal, Canada, (2004); XVth International Poxviral and Iridoviral Symposia, Oxford, UK (2004); Всероссийский научный симпозиум с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, Россия, (2005); 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary (2006); Научно-практическая конференция «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики», Харків, України, (2006); 17 International Poxvirus and Iridoviras Conference, Grainau, Germany, (2008); XIV International congress of virology, Istanbul, Turkey (2008); Всеросийская научно-практическая конференция «Современные представления об иммунокоррекции», Пенза, Россия, (2008); 18-я Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье»,

7


Санкт-Петербург, Россия (2009); Всероссийская научная конференция «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, Россия (2010).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список работ, опубликованных по теме диссертации, и библиографический список. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста и включает 126 рисунков и 50 таблиц. Библиографический список содержит 643 источника.

Положения, выносимые на защиту:

1.    Экспрессия генов в составе искусственных полицистронных

оперонов с сопряженной трансляцией позволила создать бактериальные

суперпродуценты рекомбинантных белков:

-интерферона а-2Ь человека с продуктивностью около 60% от суммарного клеточного белка;

-гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека с продуктивностью 15% от суммарного клеточного белка;

-фактора некроза опухолей мыши с продуктивностью 15-20% от суммарного клеточного белка.

2. Гены сгтВ вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян в

составе генома рекомбинантных бакуловирусов детерминируют синтез в

клетках насекомых белков, ингибирующих цитотоксическое действие

TNF на клетках мышиных фибробластов дозозависимым образом.

3.          Видоспецифические         отличия         в          аминокислотных

последовательностях белков VARV-CrmB, CPXV- CrmB и MPXV-CrmB

обуславливают   различия   их    физико-химических   и    биологических

свойств.

8


4. Белок VARV-CrmB обладает TNF-нейтрализующей активностью in

vivo.

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.