WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

МАРКУШЕВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ФЕНОЛА И ЕГО ХЛОРИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.02.03 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Уфа-2011


Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор          Еникеева Светлана Ахметовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор       Вахитов Венер Абсатарович

доктор биологических наук, профессор        Алимова Фарида Кашифовна

доктор биологических наук, профессор        Кураков Александр Васильевич

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Защита состоится «__ »____________ 2011 г. в _______ часов на заседании

Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан «___ »_____________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                Лукманова К.А.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Известно, что в современной биосфере микроорганизмы играют важную роль в вовлечении синтетических производных в естественный обмен веществ и энергии. Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которых они выполняют процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Именно поэтому в настоящее время применение микроорганизмов рассматривается как основа наиболее выгодных способов поддержания качества окружающей среды.

Существенную роль в конверсии синтетических органических соединений играют бактерии. Это связано с тем, что важной особенностью бактериальных клеток является их высокая приспособляемость к изменяющимся факторам среды, из-за которой они приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии большое число антропогенных производных, включая и опасные по отношению к другим живым системам.

Значительную часть стойких токсичных экотоксикантов составляют хлорорганические производные, входящие в категорию крупнотоннажных продуктов, производимых для нужд сельского хозяйства, химической, лакокрасочной, деревообрабатывающей промышленности, целлюлозно-бумажного производства, нефтеперерабатывающей и коксохимической отраслей. Источниками эмиссии поллютантов этой группы являются зоны производства, сточные воды и отходы, а также термические установки по их сжиганию, часто производящие еще более токсичные полихлордиоксины (Винокуров СВ. и др., 1995; Майстренко В.Н., Клюев Н.А., 2004; Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Реальную опасность представляют собой и места складирования. Например, к настоящему времени на территории «Уфахимпром» - накоплено 412,14 тыс.м отходов в 8 шламонакопителях и 100 тонн высокотоксичных отходов (в т.ч. хлорфенолов), условия хранения которых по оценкам специалистов не соответствуют санитарным и экологическим нормам (Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Появление в окружающей среде токсикантов связано также с недостаточным качеством очистки промышленных стоков. По сведениям о работе очистных сооружений, приведенным в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2001 году», из 123 биологических очистных сооружений в проектном режиме функционировали 19, остальные - работали неэффективно. Даже в ситуации, когда сброс стоков в поверхностные водные объекты снизился, в водной среде обнаруживаются все химические соединения, которые вырабатываются заводами химического профиля. В питьевой воде г. Уфы идентифицировано более 100 химических соединений-загрязнителей, в т.ч. фенол, бензол, безапирен, ряд пестицидов, включая 2,4-Д, ДДТ, изомеры гексациклогексана, летучие галогенсодержащие

з


углеводороды, 1,2-дихлорэтан, диоксины. Суммарное содержание опасных веществ в отдельные периоды года достигает критических значений (Винокуров СВ. и др., 1995; Ильин В.Г. и др., 1995).

Критические концентрации загрязнителей ароматического ряда обнаружены в Стерлитамаке, Кемерово, Славгороде, Перми, Дзержинске, Чапаевске, Волгограде и Павлодаре. В связи с высоким уровнем объемов накопленных отходов хлорорганического синтеза в 2010 году была организована инвентаризация и учет опасных объектов РФ с целью разработки мер по ликвидации экологического ущерба и определением механизмов их реализации, включая пилотные проекты отработки технологий утилизации загрязнителей (Хизбуллин Ф.Ф. и др., 2011).

Вместе с тем, анализ работ по проблеме утилизации синтетических соединений, показывает, что, несмотря на то, что современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные производные характеризуется выраженным практическим интересом к изучению микроорганизмов-деструкторов, число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии фенола и его производных, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillusи Sphingomonas(Козловский С. и др., 1993; Lang Е. et al., 1996; Prieto М. et al, 2002; Rehfuss M. et al, 2005; Gouda M., 2007; Agarry S. et al, 2008; Liu Y. et al., 2008; Wang C, 2008; Wasi S. et al., 2008; Плотникова E., 2010).

В настоящее время отсутствие системных исследований микробных деструкторов является сдерживающим фактором развития безопасных и экономически выгодных технологий для решений частных задач рационального использования и охраны природных ресурсов. Следует подчеркнуть, что биотехнологии примерно в 50 раз дешевле традиционных методов, при этом конверсию загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ, что позволяет исключить вторичную контаминацию среды. Кроме этого, появляется возможность решения проблемы уничтожения значительных объемов накопленных отходов и невостребованных препаратов.

Вместе с тем, изучение микроорганизмов, способных ассимилировать молекулы экотоксикантов, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений микробиологии, раскрывающим новые особенности роли микробов в круговороте веществ. Это направление связано с исследованием теоретических основ жизнедеятельности микроорганизмов в техносфере. Оно охватывает вопросы биоразнообразия, генетической изменчивости, механизмов метаболических взаимоотношений с факторами трансформированной среды, раскрывает процессы адаптации и (микро)эволюции живых систем в условиях сильного антропогенного пресса, включая и случаи прямого их уничтожения.

Познание и освоение потенциала прокариот, обладающих особыми свойствами, а именно, способностью осуществлять контроль над содержанием загрязнителей в окружающей среде и представляющих собой в этом смысле

4


ценный    микробиологический    ресурс,    -    важная    часть    исследований современной биологии в целом.

Цель работы

Выявление   новых   природных   бактерий-деструкторов   фенола   и   его хлорированных   производных,   их   сравнительный   анализ   и   определение возможности практического применения. Задачи исследования

  1. Выделить новые бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы.
  2. Идентифицировать штаммы-деструкторы в соответствии с культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и молекулярными критериями систематики.
  3. Исследовать пути метаболизма молекул ксенобиотиков и получить количественные и качественные характеристики процессов их конверсии.
  4. Изучить роль экстрахромосомных элементов в генетическом контроле этапов ассимиляции хлорароматических производных.
  5. Выявить уровень гомологии ДНК геномов изучаемых штаммов с ранее изученными генетическими системами конверсии хлорфеноксикислот бактерий.
  6. Определить возможности практического применения вновь выделенных штаммов - деструкторов.

Научная новизна исследования

Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот.

Филогенетическое положение штаммов определено в соответствии с результатами исследования культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК и белкового профилирования. Согласно филогенетической обособленности штаммы Citrobactersp. 36 4СРА, Stenotrophomonassp. ЗЗТ и Xanthomonassp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonasи Xanthomonas.

Впервые выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonas.

Впервые установлено, что бактерии родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonasвыполняют оригинальные реакции ассимиляции хлорфеноксикислот с образованием феноксиуксусной кислоты с последующим раскрытием ароматического кольца.

5


Выявлено, что генетические системы, детерминирующие метаболизм хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов родов Citrobacter, Stenotrophomonasи Xanthomonas, располагаются на плазмидах.

Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПНР-анализа с применением олигонуклеотидных праймеров установлено, что системы генетического контроля катаболизма молекул хлорфеноксикислот имеют существенные отличия от известных кластеров tfd- и //?-генов штаммов CupriavidusnecatorJMP134 и BurkholderiacepaciaAC 1100.

Теоретическое и практическое значение работы

Получены новые данные о разнообразии природных штаммов-деструкторов фенола и его хлорированных производных. Данные о деструкторах внесены в Консолидированный каталог культур микроорганизмов Российских немедицинских коллекций (Consolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L. V. Kalakoutskii - Vol. I. Bacteria, 2001.P. 3915-4077. Режим доступа: http://www.vkm.ru/eCatalogue.htm/).

Последовательности генов 16S рРНК вновь выделенных штаммов депонированы в международную базу нуклеотидных последовательностей данных GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022,DQ333356).

Установлены оригинальные пути ассимиляции моноароматических галогенидов и локализованы генетические элементы их контроля.

Показана принципиальная возможность применения новых штаммов-деструкторов в области защиты среды обитания человека.

Сведения о деструкторах, культуры деструкторов, а также их генетические элементы доступны для использования в научных и практических целях.

Результаты работы используются в образовательном процессе в курсах общебиологических дисциплин БГПУ им. М.Акмуллы и УГАТУ (биология, микробиология, экология, биохимия, генетика и биотехнология), а также при подготовке спецкурсов для магистров и бакалавров.

Практические рекомендации

Штаммы-деструкторы рекомендуются для очистки водной среды и почвы в условиях предприятий нефтехимического профиля.

Штаммы-деструкторы Bacillussubtilis(Патент РФ № 1742226), Arthrobacterglobiformis(Патент РФ № 2076523), Agrobacteriumtumefaciens(Патент РФ № 2077575) и Serratiamarcescens(Патент РФ № 2074254) рекомендуются для ремедиации объектов окружающей среды с целью утилизации фенолов в стоках нефтехимических предприятий Северного промузла Республики Башкортостан.

Штаммы-деструкторы Bacilluscereus(Патент РФ № 2129605J, и Gluconobacteroxydans(Патент РФ №2130067,) рекомендуются для утилизации фенолов и его хлорированных производных в почве.

6


Генетические ресурсы штаммов-деструкторов рекомендуются для создания новых штаммов с заданными свойствами invitro(Патенты РФ №№ 2064501, 2130074 и 2125263).

Основные положения, выносимые на защиту

  1. В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных.
  2. Деструкторами хлорфеноксикислот являются представители родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonas.
  3. Ассимиляция хлорфеноксикислот у культур деструкторов происходит через процессы дегалогенирования ароматического кольца с последующим его раскрытием.
  4. Штаммы-деструкторы обладают оригинальными генетическими кластерами, детерминирующими катаболизм молекул хлорфеноксикислот и их можно применить для создания новых штаммов-деструкторов invitro.
  5. Генетические детерминанты, контролирующие процессы катаболизма хлорфеноксикислот в клетках бактерий-деструкторов, могут располагаться на плазмидах.
  6. Вновь выделенные бактерии-деструкторы рекомендуется использовать в качестве действующих элементов технологий очистки водной среды и почвы от фенола и его хлорированных производных, включая 2,4-дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались и обсуждались на международных научных мероприятиях, в частности, на Экологическом Конгрессе (Япония, 1990), I Конгрессе европейских микробиологов (Словения, 2000), симпозиумах ELSO (Германия, 2003, Франция, 2004), Сахаровских чтениях (Республика Беларусь, 2006, 2009); на 1 Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), II С.-Петербургском международном экологическом форуме (2008); съездах: XVI Менделеевском (1998), Всероссийского общества генетиков и селекционеров (2000, 2004, 2008), Биохимического общества (Москва, 2002), Общества биотехнологов (Москва, 2006); в ходе работы в научно-практических конференций, направленных на решение экологических проблем: «Экологический императив сельского хозяйства РБ» (Уфа, 1998), «Реновация: отходы-технологии-доходы» (Уфа, 2004), «Актуальные экологические проблемы» (Уфа, 2007), «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий  от  чрезвычайных  ситуаций»   (Уфа,   2009),   а  также  в  рамках

7


профильных конференций: «Микробиологические методы защиты окружающей среды» (Пущино, 1988), «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), «Наука-Бизнес-Образование» (Пущино, 2005), «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Микробное разнообразие» (Пермь, 2008), «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), «Факторы экспериментальной эволюции» (Киев, 2010). Материалы исследований были обсуждены на межлабораторном научном семинаре Института биологии Уфимского научного центра и расширенном заседании диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Уфа, 2011).

Публикации

Основные научные результаты диссертации изложены в 136 печатных работах, в том числе: 14 публикациях, указанных в Перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК Министерства науки и образования РФ, 9 патентах, в 1 работе, депонированной в ВИНИТИ, в 1 монографии, 7 публикациях в научных электронных изданиях, 32 работах в научных сборниках и 72 - в материалах всероссийских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 62 рисунка и 20 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Библиография включает 417 источников (89 - отечественных и 318 - зарубежных).

В приложении размещены последовательности нуклеотидов генов 16S рРНК, депонированные в международной базе данных GenBank, описания физико-химических свойств фенола и его хлорированных производных, использованных в исследованиях, акты испытаний, а также сведения о ранее изученных штаммах-деструкторах фенола и его хлорированных производных.

Связь работы с крупными научными программами

Работа выполнена в соответствии с планами НИР ИБ УНЦ РАН, а именно, в рамках научно-исследовательских тем «Механизмы деградации хлорароматических соединений у прокариот» (№ гос. регистрации 012 00607440) и «Биоразнообразие природных микроорганизмов-деструкторов хлорароматических производных» (№ гос. регистрации 01200903470). Исследования поддерживались научно-техническими программами Академии

8


наук Республики Башкортостан, в том числе, «Биотехнология Башкортостана» (1993-1995), «Проблемы физико-химической биологии в области медицины, сельского хозяйства и технологии живых систем в РБ» (1999-2001), РФФИ-Агидель № 02-04-97911, а также ГНТП «Экологически безопасные процессы химии и химической технологии» (1992-1993), ГНТП РФ «Приоритетные направления генетики» (1993-1995), ФЦНТП «Исследования науки и техники гражданского назначения» (1999-2001). В настоящее время НИР проводятся при содействии Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (2006-2011).

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность коллегам по работе: к.б.н. Журенко Е.Ю., к.х.н. Галкину Е.Г., к.б.н. Коробову В.В., к.б.н. Жариковой Н.В., к.б.н. Ясакову Т.Р., м.н.с. Анисимовой Л.Г. и сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН к.б.н. Колгановой Т.В. и к.б.н. Кузнецову Б.Б., за сотрудничество, а также коллективу Института биологии УНЦ РАН за многолетнюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.

Автор искренне признателен профессору Kazuhito Itoh (Shimane University, Япония) и профессору Sabine Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия) за образцы штаммов бактерий, любезно предоставленные для сравнительного анализа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования являлись штаммы бактерий, выделенные из образцов смешанных микробных популяций почв Северного промышленного узла города Уфы, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства, включая действие ряда высокотоксичных и канцерогенных синтетических производных ароматического ряда.

Штамм Burkholderiasp. M38-VN3-2W был получен от профессора К. Itoh (Shimane University, Япония). Культура Cupriavidus necator JMP134 предоставлена профессором S. Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия).

Чистые культуры штаммов-деструкторов выделяли по методу Коха (Теппер Е.З. и др., 1976) с небольшими модификациями.

Визуализацию клеток бактерий осуществляли с помощью электронного микроскопа Н-300 фирмы Hitachi (Япония) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия). При АСМ-микроскопии сканирование препаратов на подложке из слюды типа мусковит вели в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантилеверов CSG01 фирмы NT-MDT с радиусом кривизны зонда 10 нм по методике, рекомендованной изготовителем.

9

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.