WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

На правах рукописи

Северин Федор Федорович

Молекулярная биология и физиология запрограммированной

смерти дрожжей

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

в виде научного доклада

Москва-2011


Работа выполнена в Макс-Планк Институте клеточной биологии и генетики в г. Дрезден (Германия) и в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова


Научный консультант

академик РАН, доктор биологических наук, профессор


Скулачев Владимир Петрович



Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор


Попов Василий Николаевич



доктор биологических наук


Кушниров Виталий Владимирович



доктор биологических наук, профессор


Виноградов Андрей Дмитриевич


Ведущая организация:          Государственный научно-исследовательский    институт

генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится 25 ноября 2011 г. в 11— на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.


Диссертация в виде научного доклада разослана


октября 2011 г.





Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук


И.А. Крашенинников.


2


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Программируемая клеточная смерть (ПКС) является важным физиологическим процессом, необходимым многоклеточным организмам для онтогенеза, поддержания тканевого гомеостаза и иммунной защиты. Механизм запрограммированной смерти клетки - фундаментальная теоретическая и практическая проблема. Дрожжи -примитивные эукариоты, а также классический объект генетических исследований. Наиболее базовые модули каскада запрограммированной смерти клеток высших эукариот есть и у дрожжей, поэтому данные, полученные на дрожжах, могут служить отправной точкой для исследования аналогичных процессов в клетках высших организмов.

Поскольку ПКС означает самоубийство для одноклеточного организма, то не совсем ясно, почему и как данный механизм сохранился в процессе эволюции дрожжей. В последнее время появляется все больше данных, что многоклеточные организмы имеют программу самоуничтожения (гипотеза феноптоза). Таким образом, исследование физиологического самоубийства дрожжевой клетки актуально в формате изучения программ саморазрушения у высших организмов. Данные, полученные в последние десятилетия, показывают, что запуск таковой программы у дрожжей направлен на увеличение приспособленности выживших клеток. Действительно, многие из вариантов естественных сценариев активации ПКС Saccharomyces cerevisiae, в том числе, гибель в стационарной культуре, в течение мейоза, при половом процессе, вызванная вирусами, зависят от плотности культуры клеток. Интересно, что и у высших организмов половой процесс также может вызывать гибель: самцы некоторых кальмаров умирают сразу же после спаривания, а самцы сумчатых крыс умирают через две недели после гона от избытка собственных феромонов. Как известно, многие виды лососевых рыб также умирают сразу после нереста.

Быстрая запрограммированная смерть многоклеточных не обязательно сопряжена с размножением. Смерть больного организма ради выживания окружающих может быть выгодна потому, что препятствует распространению инфекции. Оказалось, что у высших животных существует механизм, убивающий их в ответ на появление Грам-отрицательных бактерий в крови. Введенные в кровь экспериметальных животных липополисахариды (LPS) клеточной стенки бактерий токсичны. Эта токсичность резко снижается при блокировании специализированного LPS-связывающего белка в крови, а

3


также при ингибировании специализированных клеточных рецепторов LPS-белкового

комплекса.

Недавно был предложен термин для описания этого явления на заключительной стадии

жизненного цикла - быстрый феноптоз.

Кроме того, в терминах гипотезы феноптоза старение многоклеточных организмов (то есть возраст-зависимая дегенерация) - основная контр-продуктивная программа, «медленный феноптоз». Дрожжи являются удобной моделью для исследования старения. Они тоже стареют: материнская клетка может произвести ограниченное количество дочерних (20-30), после чего умирает. В процессе старения клетка накапливает маркеры окислительного стресса, мутации в ядерной и митохондриальной ДНК и другие повреждения. Интересно, что механизм старения дрожжей во многом схож с таковым у высших эукариот. Например, ортологи гена деацетилазы гистонов SIR2 присутствуют у всех эукариот включая дрожжи. У дрожжей он называется SIR2, у млекопитающих -SIRT1. Активность этого белка у высших животных ингибирутся инсулин-подобными гормонами. Подавление активности инсулинового каскада с помощью методов генной инженерии, голодания или фармакологического вмешательства (резвератрол) приводит к увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных (мыши, черви С. elegcms, мухи-дрозфилы). Введения дополнительной копии этого гена в ДНК дрожжей достоверно увеличивает продолжительность жизни. По-видимому, молекулярной основой этого явления служит то, что при повреждении (разрыве) ДНК дрожжей SIR2 уходит со специфических для себя мест на хромосомах, перемещается в места разрыва и там каким-то образом поддерживает целостность хромосом. Интересно, что SIRT1 делает то же самое при повреждении ДНК культивируемых клеток животных.

Недавно группой Ангелики Амон (Amon) было показано, что гаметогенез или активация транскрипции поздних генов гаметогенеза ведет к «обнулению» репликативного возраста и увеличению продолжительности жизни. Следовательно, стареющие дрожжи, имея возможность избавится от возраст-зависимых повреждений, отнюдь не всегда ее используют. Этот факт легко объясним в рамках гипотезы феноптоза.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования было найти физиологический индуктор запрограммированной смерти дрожжевой клетки, а также исследовать механизм этого процесса, при этом наиболее детально - роль митохондрий и активных форм кислорода.

Задачи исследования:

4


  1. Проверка гипотезы о том, что половой феромон может индуцировать запрограммированную смерть дрожжевой клетки.
  2. Определение роли митохондрий в запрограммированной смерти дрожжей, вызванной избытком феромонов.
  3. Доказательство возможности «мягкого разобщения» с помощью липофильных катионов на интактных клетках дрожжей.
  4. Сравнительный анализ защитного и повреждающего действия активных форм кислорода при генотоксическом стрессе клеток дрожжей.
  5. Изучение взаимосвязи образования белковых агрегатов и дефектов в функционировании циклосомы при индукции запрограммированной смерти дрожжей.

Научная новизна работы.

В работе впервые исследованы механизм физиологической клеточной смерти дрожжей вызванный избытком полового феромона. Установлено, что гиперполяризация митохондрий играет ключевую роль в этом процессе, а именно инициирует генерацию активных форм кислорода (АФК).

Показано, что искусственное снижении мембранного потенциала митохондрий с помощью разобщителей снижает эффективность индукции запрограммированной смерти дрожжей. На основе этого наблюдения разработана экспериментальная система для тестирования физиологического эффекта разобщителей.

Произведен сравнительный анализ обычных разобщителей и проникающих катионов типа SkQ. Впервые показано, что проникающие катионы оказывают селективный протонофорный эффект на внутреннюю мембрану митохондрий, и при этом разобщение является «мягким», то есть его эффективность падает с падением потенциала на внутренней мембране.

Обнаружено, что АФК, которые генерирует клетка при генотоксическом стрессе, могут быть как защитными (при относительно небольшом повреждении), так и способствовать гибели клетки при относительно сильном стрессе.

Показано, что накопление полиглутамин-зависимых белковых агрегатов в дрожжевой клетке вызывает задержку клеточного цикла и частично активирует каскад запрограммированной смерти. Выживание клетки в этих условиях можно улучшить с помощью генетического нокаута ряда белков-субстратов циклосомы.

Научно-практическое значение работы.

5


Проведенные исследования открывают физиологические закономерности принятия решения «жизнь или смерть» на уровне одноклеточного организма, а также характеризуют роль митохондрий и АФК в принятии и исполнении этого решения. Данные, полученные в разработанной экспериментальной модели клеточной смерти, позволили разработать новые вещества - мягкие разобщители, которые в перспективе могут быть использованы для лечения широкого спектра заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Избыток полового феромона индуцирует запрограммированную смерть дрожжей путем повышения концентрации кальция в клетке.
  2. Избыточный кальций вызывает гиперполяризацию митохондрий, что увеличивает генерацию активных форм кислорода и смерть клетки.
  3. Проникающие катионы обладают разобщающим действием и при этом менее токсичны при передозировке, чем анионные протонофоры.
  4. Активные формы кислорода являются защитными при слабом генотоксическом стрессе и повреждающими при относительно сильном стрессе.
  5. Причина токсичности белковой агрегации в дрожжевой модели полиглутамин-зависимых заболеваний - неспособность клетки расщеплять субстраты циклосомы.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2008-2010), европейской биоэнергетической конференции ЕВЕС (Москва 2006), конференции Гордона «Апоптоз» (2006), европейской конференции по клеточной смерти ECDO (2004, 2010), международной конференции по апоптозу дрожжей (Майами, 2005; Левен, 2008; Грац, 2009), конференции американского общества клеточной биологии (2007).

Публикации.

Основные положения диссертации опубликованы в 52 печатных работах (включая 7 обзоров) в журналах, рекомендованных ВАК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Половой феромон как индуктор смерти дрожжей

В последние десятилетия дрожжи стали популярным объектом для исследования запрограммированной   клеточной   смерти.    Так,    исследовалось   появление   маркеров

6


апоптоза после жестких воздействий на дрожжевые клетки. Эти работы воспринимались с долей пессимизма исследователями апопотоза у высших организмов, которые считали этот феномен лабораторным артефактом. Действительно, не совсем очевиден биологический смысл самоубийства в ответ на перекись, уксусную кислоту или осмотический шок. Мы поставили цель найти «мягкий» индуктор физиологического самоубийства дрожжей. Мы исходили из предположения, что физиологическое самоубийство имеет смысл только в сообществе организмов: в этом случае смерть одной клетки может быть каким-либо образом скомпенсирована выигрышем в приспособленности ее ближайших родственников или клонов. Иными словами, искомый индуктор должен каким-то образом зависеть от плотности клеток в культуре. Концентрация полового феромона, который секретируется дрожжами, естественно зависит от их плотности. Гаплоидная дрожжевая клетка может обладать либо а, либо альфа типом спаривания, и секретировать либо а, либо альфа-фактор, соответственно. Оба феромона - схожие по структуре пептиды. Надо отметить, что в лабораторной практике альфа-фактор часто используется для синхронизации культуры в клеточном цикле. Под действием феромона клетки задерживаются в фазе G1 и отращивают отростки (так называемые шму). В методических указаниях по работе с дрожжевыми культурами отмечается, что передозировка альфа-фактора может быть токсична: в частности, она может замедлить выход из ареста после отмывки феромона.

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.