WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

КОРОТКАЯ Елена Валерьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ И НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ ХРАНЕНИИ

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Кемерово 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО «КемТИПП»)

Научный консультант: доктор технических наук, профессор Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Майоров Александр Альбертович доктор технических наук, профессор Помозова Валентина Александровна доктор медицинских наук, профессор, Громов Константин Георгиевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт экологии человека СО РАН

Защита диссертации состоится 14 марта 2012 г в 1300 на заседании диссертационного совета Д 212.089.01 при ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, бульвар Строителей, 47, ауд. 4 л., факс (3842) 39-68-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности».

С авторефератом можно ознакомиться на официальном сайте ВАК Минобрнауки РФ (http://vak.ed.gov.ru/ru/dissertation), сайте КемТИПП (http://www.kemtipp.ru/)

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Н.Н. Потипаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На современном этапе одной из важнейших задач государства является обеспечение населения качественными, полноценными и безопасными продуктами питания. Существенная роль в их обеспечении отводится ферментированным продуктам, которые как носители полезной для человека микрофлоры, не только снабжают организм пищевыми веществами, но и активно влияют на биохимические и физиологические функции человека, способствуют поддержанию здоровья, снижают риск возникновения заболеваний.

Качество производимых кисломолочных продуктов напрямую зависит от применяемой технологии, тщательной селекции, сохранения и последующего культивирования микрофлоры закваски. Кисломолочные продукты и применяемые для их производства микроорганизмы, имеют определенную этнокультурную и региональную специфичность. Исследования российских и зарубежных специалистов подтверждают генетическую предрасположенность людей к определенному типу бактерий. Поэтому в настоящее время при производстве продуктов питания, содержащих молочнокислые микроорганизмы, требуется не только тщательный анализ их биотехнологических свойств, но и поиск генов, отвечающих за адаптацию определённых групп микроорганизмов к жителям конкретных регионов. Следовательно, необходимо развивать производство бактериальных заквасок, содержащих микроорганизмы, адаптированные к местным генотипам.

Существующие на сегодняшний день методы консервации микроорганизмов заключаются в переводе их вегетативных клеток в анабиотическое состояние. Такие клетки лишены способности к погружению в эндогенный покой, и поэтому процедуры перевода их в экзогенный покой (с помощью высушивания, лиофилизации, замораживания и т.д.) и вывода из него создают стрессовые ситуации, которые вызывают гибель значительной части популяции микроорганизмов, а также приводят к фенотипическим и генотипическим изменениям.

Известно, что у клеток бактерий при холодовом шоке индуцируется нуклеаза, поэтому летальное действие низких температур связано с разрушением ДНК.

Вопросам производства бактериальных заквасок и концентратов посвящены работы отечественных ученых и исследователей в этой области:

Л.А.Банниковой, В.И. Ганиной А.В. Гудкова, Л.А. Забодаловой, С.А. Королева, Н.С. Королевой, Л.А. Остроумова, Т.М. Сидякиной, Н.А. Тихомировой, В.Д.Харитонова, И.С. Хамагаевой, А.А. Цуцаевой, Б.А. Шендерова и др.

Важное место в производстве бактериальных заквасок отводится технологиям их консервирования и низкотемпературного хранения. Использование низкотемпературных технологий в консервировании и хранении бактериальных заквасок обусловлено доступностью холодильных установок, способных надежно поддерживать низкие температуры в течение длительного времени, а также обеспечивать транспортировку замороженных бактериальных заквасок.

Изучению влияния низких температур на микроорганизмы, в том числе молочнокислые, посвящены труды таких исследователей как: Э. Алмаши, А.А.Болдырев, С.А. Большаков, Н.С. Королева, Т.М. Сидякина, В.Д. Харито нов, А.А. Цуцаева, G. Bryant, J. Wolfe и др.

Преимуществами технологий замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок по сравнению с другими методами консервирования являются их простота и удобство, минимум подготовительной работы, быстрое извлечение хранимого материала для восстановления после замораживания. В сравнении с высушиванием и лиофилизацией при замораживании культуры микроорганизмов оказываются менее поврежденными, имеют более высокий уровень жизнеспособности, к тому же при замораживании довольно редки генетические изменения.

Предполагается, что обеспечение генетической стабильности микроорганизмов в замороженных бактериальных заквасках обеспечит пищевую промышленность отечественными аналогами, имеющими следующие основные конкурентные преимущества: получение заквасок с высоким количеством жизнеспособных клеток; использование российских стартовых культур и их комбинации; российские закваски должны быть ориентированы на национальные, региональные, возрастные особенности жителей страны; закваски должны вырабатываться с учетом особенностей отечественного сырья.

Таким образом, разработка эффективных технологий консервирования бактериальных заквасок является перспективным направлением развития прикладной науки, которое имеет важное народнохозяйственное значение.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (государственный контракт П 2344).

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является исследование генетической стабильности молочнокислых микроорганизмов в бактериальных заквасках при их замораживании и низкотемпературном хранении, а также промышленная реализация низкотемпературного консервирования бактериальных заквасок с генетически стабильными микроорганизмами в производстве ферментированных молочных продуктов.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

– исследовать свойства коллодия и коллодиевых пленок и изучить адсорбцию ДНК молочнокислых микроорганизмов на коллодиевых пленках;

– разработать методы индикации и идентификации микроорганизмов на примере бактерий рода Lactobacillus в замороженных бактериальных заквасках с использованием полимеразной цепной реакции;

– определить теплофизические свойства бактериальных заквасок в жидком и замороженном состоянии;

– исследовать процесс кристаллизации влаги при замораживании бактериальных заквасок и определить криоскопические температуры бактериальных заквасок;

– разработать математическую модель процесса кристаллизации влаги при замораживании бактериальных заквасок;

– исследовать влияние режимов низкотемпературной обработки на энергетические затраты процессов замораживания бактериальных заквасок, а также исследовать эффективность различных способов производства искусственного холода для замораживания бактериальных заквасок;

– исследовать влияние режимов и условий замораживания на органолептические, физико-химические и микробиологические показатели бактериальных заквасок до и после замораживания и низкотемпературного хранения;

– исследовать стабильность ДНК молочнокислых микроорганизмов в бактериальных заквасках при замораживании и в процессе низкотемпературного хранения, определить оптимальные режимы замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок;

– разработать технологические принципы низкотемпературного консервирования и хранения бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов;

– использовать полученные в работе результаты для внедрения на предприятиях пищевой и биотехнологической промышленности.

Научная новизна работы. На основании проведенного комплекса теоретических и экспериментальных исследований:

– определена адсорбционная емкость коллодиевых пленок по нуклеиновым кислотам;

– раскрыты особенности идентификации и оценки стабильности ДНК микроорганизмов (на примере бактерий рода Lactobacillus и вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus) с использованием полимеразной цепной реакции, предложен метод выделения ДНК молочнокислых бактерий нуклеосорбцией на коллодиевых пленках;

– определены теплофизические свойства, а также физико-химические и микробиологические показатели бактериальных заквасок до и после замораживания;

– разработаны математические модели для определения теплофизических характеристик заквасок молочнокислых бактерий в зависимости от их состава и температуры, а также модель кристаллизации влаги при замораживании бактериальных заквасок;

– дана оценка энергетических затрат процессов замораживания бактериальных заквасок в холодильных машинах одноступенчатого, двухступенчатого сжатия, а также в каскадных холодильных машинах; доказано, что использование каскадных холодильных машин для замораживания заквасок в температурном диапазоне до минус 45 С обладает наилучшей энергетической эффективностью;

– исследовано влияние замораживания и низкотемпературного хранения на фенотипические признаки и стабильность ДНК молочнокислых микроорганизмов бактериальных заквасок;

– установлен режим низкотемпературной обработки и хранения бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов, обеспечивающий максимальную сохранность и жизнеспособность клеток заквасочных культур и оптимальные качественные показатели исследуемых заквасок: замораживание – температура минус 45° С в среде жидкого хладоносителя, низкотемпературное хранение при температуре минус 45° С – 270 суток, при температуре минус 18° С – 14 суток;

– разработаны математические модели изменения количества жизнеспособных микроорганизмов в зависимости от продолжительности и температуры хранения;

– разработаны научные принципы низкотемпературного консервирования и хранения заквасок молочнокислых бактерий.

Практическая значимость работы. В результате теоретических и экспериментальных исследований на основе оценки генетической стабильности разработана технология низкотемпературного консервирования бактериальных заквасок молочнокислых бактерий.

Разработаны технические условия и технологические инструкции для производства замороженных заквасок молочнокислых бактерий: закваска бактериальная замороженная L. bulgaricus (ТУ 9229-160-020683315-11); закваска бактериальная замороженная L. acidophilus (ТУ 9229-161-020683315-11); закваска бактериальная замороженная Str. termophilus и L. bulgaricus (ТУ 9229-162020683315-11); закваска бактериальная замороженная лактококков (ТУ 9229163-020683315-11); технология хранения замороженных бактериальных заквасок L. bulgaricus (ТИ 9229-160-020683315); технология хранения замороженных бактериальных заквасок L. acidophilus (ТИ 9229-161-020683315); технология хранения замороженных бактериальных заквасок Str. termophilus и L. bulgaricus (ТИ 9229-162-020683315); технология хранения замороженных бактериальных заквасок лактококков (ТИ 9229-163-020683315).

Разработана и утверждена методика определения значений теплофизических характеристик заквасок молочнокислых бактерий в зависимости от их компонентного состава и температуры. Методика позволяет определять значения теплофизических характеристик бактериальных заквасок аналитически с достаточной для инженерных расчетов степенью точности в диапазоне температур от минус 50 до 20 С.

Разработана и утверждена методика исследования процессов кристаллизации влаги при замораживании закваски, позволяющая определить параметры, характеризующие процесс замораживания закваски.

Разработана методика идентификации и оценки генетической стабильности микроорганизмов рода Lactobacillus и вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Результаты диссертационной работы используются на предприятиях биотехнологической промышленности. Результаты работы прошли апробацию и внедрены в производство на предприятиях биотехнологической и молочной промышленности Сибирского ФО. Материалы исследований используются в учебном процессе для подготовки студентов, обучающихся по специальностям 140504 «Холодильная, криогенная техника и кондиционирование», 2603«Технология молока и молочных продуктов».

Публикации и апробация работы. Основные результаты диссертации опубликованы в 46 печатных работах, в т.ч. – в трех монографиях (общим объемом 22,3 усл. п.л.), научно-технических отчетах (общим объемом 13,4 усл.

п.л.), в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований: «Молочная промышленность», «Техника и техноло гия пищевых производств», «Вестник КрасГАУ», «Хранение и переработка сельхозсырья», «Известия вузов. Пищевая технология», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Журнал прикладной химии», материалах конференций в Москве, Санкт-Петербурге, Софии, Магнитогорске, Екатеринбурге, Минске, Воронеже, Махачкале, Одессе, Кемерове, научных трудах институтов;

получен 1 патент.

Материалы диссертации докладывались на заседаниях ученого совета, а также научно-технического совета КемТИПП.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав основного текста, выводов, списка литературы и приложений. Основной текст работы изложен на 306 страницах, содержит 67 таблиц, 91 рисунок, 3источника литературы отечественных и зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

– результаты исследований влияния технологических факторов на генетическую стабильность микроорганизмов замороженных заквасок молочнокислых бактерий;

– теплофизические и физико-химические процессы, сопровождающие низкотемпературное консервирования заквасок молочнокислых бактерий;

– концепция создания технологий замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок, с исходными гено- и фенотипическими свойствами микроорганизмов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ. Изложена актуальность проблемы на современном этапе развития пищевой промышленности. Обоснована необходимость контроля генетической стабильности микроорганизмов при замораживании и низкотемпературном хранении бактериальных заквасок.

ГЛАВА 1. Анализ факторов, определяющих развитие технологий консервирования бактериальных заквасок молочной промышленности (аналитический обзор). Представлен анализ отечественной и зарубежной информации по теме диссертационного исследования. Рассмотрено значение кисломолочных продуктов в структуре питания современного человека. Описаны биохимические и микробиологические основы производства кисломолочных продуктов. Рассмотрено влияние заквасочной микрофлоры на органолептические, физико-химические и микробиологические показатели готовых продуктов.

Приведены методы и дана классификация существующих на сегодняшний день способов консервации бактериальных заквасок, а также рассмотрены преимущества и недостатки различных способов консервации и хранения микроорганизмов. Подробно рассмотрены методы низкотемпературного консервирования молочнокислых бактерий и влияние криопротекторных соединений на их жизнеспособность. Описаны причины возникновения генетических изменений микроорганизмов бактериальной закваски в результате низкотемпературного воздействия. Рассмотрены современные молекулярно-биологические методы анализа, позволяющие анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать от дельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов, а также исследовать влияние низких температур на генетическую стабильность микроорганизмов. Показано, что использование молекулярногенетических методов анализа для таксономической идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, генотипирования бактерий позволит отбирать лучшие культуры для промышленного применения и получения качественных и безопасных бактериальных заквасок и пищевых продуктов.

ГЛАВА 2. Обоснование основных направлений исследований, их цель и задачи. Определены направления исследований в разработке технологий замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок с с исходными гено- и фенотипическими свойствами, сформулирована цель и задачи собственных исследований.

ГЛАВА 3. Методология проведения исследований. Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема исследований приведена на рис. 1. Теоретические и экспериментальные исследования состояли из нескольких последовательных и взаимосвязанных этапов.

Первый этап исследований посвящен разработке методов индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus с использование полимеразной цепной реакции. Изучали фенотипические особенности различных штаммов L.

acidophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus. На основе анализа 11 полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК лактобактерий, представленных в международной базе данных GenBank, синтезированы родо- и видоспецифичные праймеры для индикации бактерий рода Lactobacillus и вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Проводили сравнение метода видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР и классического биохимического метода. Выделение ДНК из клеток молочнокислых бактерий проводили методом нуклеосорбции с использованием коллодиевых пленок. Для этого определены основные физико-химические характеристики коллодия (степень замещения, содержание азота, степень полимеризации), изучена адсорбция ДНК лактобактерий на коллодиевых пленках и предложена технология получения коллодиевых пленок для сорбции нуклеиновых кислот. Результатом первого этапа диссертационной работы стала разработка методов идентификации молочнокислых микроорганизмов в бактериальных заквасках и кисломолочных продуктах.

На втором этапе изучали теплофизические свойства бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов. Определены теплофизические характеристики заквасок до и после замораживания, химический состав заквасок молочнокислых бактерий и предложена методика расчетного определения их теплофизических характеристик.

На следующем этапе исследовали процесс кристаллизации влаги при замораживании бактериальных заквасок и определяли криоскопические температуры заквасок. Результатом второго и третьего этапов работы явилась разработка математической модели процесса замораживания бактериальных заквасок.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ И НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ ХРАНЕНИИ Изучение адсорбции ДНК мо- Разработка технологии лочнокислых бактерий на кол- получения коллодиелодиевых пленках вых пленок для конРазработка троля стабильности методов ДНК молочнокислых индикации и Исследование фенотипических бактерий идентификации особенностей молочнокислых бактерий рода бактерий Lactobacillus с Сравнение специфичиспользованием Конструирование универсаль- ности ПЦР и классичеПЦР ных праймеров для амплифика- ских биохимических ции гена 16S рРНК L. bulgari- методов индикации cus бактерий Исследование Экспериментальное определетеплофизических Разработка методов ние теплофизических характесвойств заквасок идентификации мористик заквасок до и после молочнокислых лочнокислых микроорзамораживания бактерий ганизмов в бактериальных заквасках Химический состав заквасок молочнокислых бактерий Методика расчетного Исследование определения теплофипроцесса кризических характериОпределение криоскопических сталлизации стик заквасок молочтемператур заквасок молочновлаги при замонокислых бактерий в кислых бактерий раживании зазависимости от их квасок температуры Определение холодопроизводительности холодильной машины, Моделирование пронеобходимой для замораживания цесса замораживания заквасок в зависимости от режиАнализ энергебактериальных мов низкотемпературной обратической эфзаквасок ботки фективности процесса замораживания бакОпределение энергетических Выявление энергоэфтериальных зазатрат производства искусст- фективных способов и квасок венного холода в зависимости режимов производства от режимов низкотемператур- искусственного холода ной обработки, типа холодиль- для замораживания ной машины и вида холодиль- бактериальных заквасок ного агента Исследование Органолептические, процессов заЗамораживание в воздушной физико-химические и мораживания и среде микробиологические низкотемперапоказатели, стабильтурного храненость ДНК бактерий ния заквасок замороженных молочнокислых Замораживание в среде заквасок бактерий хладоносителя Разработка технологии низкотемпературного консервирования заквасок молочнокислых бактерий Документация для низкотемпературного консервирования заквасок молочнокислых бактерий Рис. 1. Общая схема выполнения работы На четвертом этапе проведен анализ энергетической эффективности процесса замораживания бактериальных заквасок. Определена требуемая холодопроизводительность холодильной машины, необходимая для замораживания заквасок в зависимости от режимов низкотемпературной обработки. Исследованы энергетические затраты при различных способах производства искусственного холода в зависимости от режимов низкотемпературной обработки. Результатом исследований, проведенных на данном этапе, стало определение энергоэффективных способов производства искусственного холода для замораживания бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов.

Пятый этап работы посвящен изучению процессов замораживания и низкотемпературного хранения заквасок молочнокислых бактерий. Изучали характеристики процессов замораживания бактериальных заквасок при различных температурных режимах (-10, -25, -45° С) в воздушной среде и в жидком хладоносителе. Определяли скорости замораживания и продолжительность замораживания для исследуемых бактериальных заквасок при различных температурных режимах и условиях замораживания. Также на этом этапе исследовали изменения качественных показателей замороженных заквасок в процессе низкотемпературного хранения. Изучили влияние различных режимов низкотемпературного консервирования и хранения на стабильность ДНК, культуральноморфологические признаки, сахаролитические свойства, антагонистическую активность, а также жизнеспособность микроорганизмов закваски. В результате проведённых исследований определили оптимальный режим для низкотемпературного консервирования и хранения заквасок молочнокислых бактерий.

На заключительном этапе работы, основываясь на результатах исследований, разработаны технологические принципы производства замороженных бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов и их низкотемпературного хранения длительный период времени. Разработана технология низкотемпературного консервирования и хранения бактериальных заквасок с сохранением исходных гено- и фенотипических свойств микроорганизмов. На этом же этапе разрабатывали документацию и внедряли полученные результаты в производство.

При выполнении исследований использовали стандартные, общепринятые и оригинальные методы физико-химического, микробиологического, молекулярно-генетического, спектрального и органолептического анализа. Культуры микроорганизмов получали из коллекции ГосНИИгенетики.

ГЛАВА 4. Разработка технологии получения коллодиевых пленок для контроля стабильности ДНК молочнокислых бактерий. Важным этапом молекулярно-генетических методов анализа является выделение ДНК исследуемого объекта. Часто выделение ДНК осуществляют методом нуклеосорбции. В качестве сорбента молекул ДНК могут выступать пленки на основе нитрата целлюлозы – коллодиевые пленки, сочетающие хорошие эксплуатационные качества со сравнительно простой технологией получения.

Физико-механические и физико-химические свойства получаемых коллодиевых пленок в значительной степени зависят от таких характеристик полимера как молекулярная масса, степень полимеризации, массовая доля азота в исходном коллодии, степень замещения НЦ.

Молекулярная масса НЦ, определенная методом вискозиметрии, составила, степень P 536. СЗ коллодия определяли по данным ИКM 1221 спектров (рис. 2). Массовая доля азота в исследуемых коллодиевых пленках составила 12,2%, а степень замещения – 2,26. Полученные значения СЗ, массовой доли азота и степени полимеризации исследуемого коллодия отвечают требованиям, предъявляемым к НЦ, используемым для получения пленок.

В лабораторных условиях коллодиевые пленки получали в результате испарения растворителя двумя способами: методом отливания на неподвижной поверхности, а также на вращающейся цилиндрической поверхности.

Состояние 1, Т поверхности по0,лученных колло0,диевых пленок 0,исследовали с 0,помощью рас0,трового электронного микро0,скопа JSM–630,LV в режиме ре0,льефа. На рис. 0,показана поверх0,ность пленок, по4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5v, см-1 лученных методом отливания (а), и Рис. 2. ИК-спектры коллодиевых пленок:

пленок, получен— – пленка толщиной 51,3 мкм; — – пленка толщиной 36,7 мкм ных на вращаю- щейся цилиндрической поверхности (б) при близких значениях кратности увеличения.

Как видно из рисунка пленки, полученные с помощью центробежных сил, более однородны по толщине и не имеют полос (рис. 3, б).

б а Рис. 3. Электронные фотографии коллодиевой пленки с толщиной 27,6 мкм: ускоряющее напряжение – 30 kV; кратность увеличения (а – 220, б – 160); режим рельефа (SEI) Электронные фотографии пленок позволяют увидеть, что на поверхности пленок присутствуют произвольно расположенные поры неправильной формы размером до 10 мкм.

Общая пористость коллодиевых пленок, определенная по методу Манеголда, составила 12,50,3%. Максимальный размер пор коллодиевых пленок, определенный методом точки пузырька, составил 10,10,2 мкм, что подтверждает данные электронной микроскопии.

Следующим этапом работы было изучение адсорбции ДНК лактобактерий на коллодиевых пленках. На рис. 4 представлены изотермы адсорбции неденатурированных образцов ДНК из растворов различной ионной силы. Как видно из рисунка, наиболее эффективно процесс адсорбции идет из 1 М раствора NH4OAc, что согласуется с литературными данными о лучшей адсорбции ДНК из растворов с высокой ионной силой.

Изотермы ад9,0E-сорбции образцов 8,0E-ДНК коллодиевыми 7,0E-пленками описывали 6,0E-используя уравнение 5,0E-Лэнгмюра 4,0E-K Cp 3,0E-A Amax K Cp 1, 2,0E-1,0E-где Amax – предельная 0,0E+адсорбционная ем0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,кость коллодиевой Равновесная концентрация ДНК, мкг/мкл пленки, мкг/мкг; K – константа равновесия Рис. 4. Изотермы адсорбции неденатурированной ДНК на адсорбционного проколлодиевой пленке из растворов разной ионной силы:

цесса, мкл/мкг, Cp – -- – H2O; -- – трис-буфера (рН 7,8); -- – 1М NH4OAc равновесная концент- рация ДНК в растворе, мкг/мкл.

Эффективность иммобилизации ДНК рассчитывали как отношение количества ДНК необратимо связавшейся с пленкой, к общему количеству ДНК, нанесенной на коллодиевую пленку. Установлено, что эффективность иммобилизации образцов ДНК на коллодиевых пленках при нагревании в вакууме и при облучении ультрафиолетом имеют достаточно близкие значения.

Проведенные исследования позволили сделать следующие выводы.

Структура поверхности коллодиевых пленок способна повлиять на величину адсорбции НК, поэтому лучше использовать пленки, полученные на вращающейся цилиндрической поверхности, так как они более равномерны по толщине, чем пленки, полученные методом отливания.

Коллодиевые пленки, используемые для адсорбции НК, также должны обладать определенной пористостью, водопроницаемостью, водопоглощением и иметь размер пор, не превышающий размеры адсорбируемых НК.

Адсорбция НК на коллодиевых пленках зависит от ионной силы раствора.

Так, эффективность адсорбции НК из раствора ацетата натрия в 1,25 раза больше, чем из водного раствора. Более высокая эффективность иммобилизации образцов ДНК на коллодиевых пленках из растворов с высокой ионной силой Адсорбция, мкг/мкг свидетельствует о том, что адсорбция ДНК осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий между основаниями ДНК и коллодиевой пленкой. Использование высушивания в вакууме и УФ-облучения приводит к увеличению величины иммобилизованной ДНК на 21%.

ГЛАВА 5. Разработка методов идентификации молочнокислых микроорганизмов с использованием полимеразной цепной реакции. Осуществление контроля за безопасностью и качеством продуктов питания требует применения современных экспресс-методов анализа, обладающих достаточными уровнями чувствительности и избирательности. В настоящее время в пищевой промышленности для индикации и идентификации различного рода микроорганизмов, как полезных, так и патогенных, применяют молекулярногенетические методы анализа.

Филогенетические связи между живыми организмами могут быть прослежены путем сравнения последовательностей генов и отдельных участков генов, кодирующих рибосомальные РНК. Метод сравнения последовательностей генов 16S рРНК часто используется для определения видовой принадлежности микрофлоры в молочных продуктах.

С целью конструирования видоспецифичных праймеров, с использованием программы ClustalW проведен сравнительный анализ 11 полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp.

bulgaricus, накопленных в GenBank (табл. 1).

Таблица Номера последовательностей гена 16S рРНК представителей рода Lactobacillus, депонированных в NCBI № Номер последовательности Название штамма п/п гена 16S рРНК в NCBI 1 FJ861093.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus KLDS 1.062 EU483107.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus LC 3 CP000412.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-34 EU642554.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus L5 FJ915706.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMAU4016 EU547306.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus BCS17 CP000033.3 L. acidophilus NCFM 8 FM878603.1 L. casei LB19 DQ480531.1 L. plantarum SK1.010 GU386757.1 L. paracasei B11 AM491821.1 L. rhamnosus R-326Одиннадцать использованных нами последовательностей гена 16S рРНК разных видов лактобактерий распределились в два кластера (рис. 5).

Согласно полученным данным, при анализе полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, гомология строения гена представителей рода Lactobacillus, входящих в первый кластер, составляет 97 99 %, во второй кластер – 84 99 %.

После тщательного анализа выровненных последовательностей генов 16S рРНК, имеющихся в современных банках данных, в них были выбраны наиболее консервативные участки, соответствующие позициям 33 – 14п.н. гена 16S рРНК L.

Рис. 5. Филогенетическое дерево, основанное на анаdelbrueckii subsp. bulgariлизе структур фрагментов гена 16S рРНК, отражаюcus FJ861093.1, подходящее родственные связи исследуемых штаммов молочщие для создания прайнокислых бактерий рода Lactobacillus меров.

Были синтезированы родоспецифичные праймеры:16S for: 5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG A и 16S rev: 5- ACG CTT GCC ACC TAC GTA TTA C для амплификации гена 16S рРНК длиной 566 н.п.

Специфичность синтезированной пары родоспецифичных праймеров (16S for – 16S rev) была подтверждена экспериментально на бактериальных заквасках и бактериальных концентратах, на штамме Bifidumbacterium bifidum №1, пробиотических продуктах, содержащих лактобактерии и кисломолочных продуктах (рис. 6).

Для видовой идентификации бактерий L. delbrueckii subsp. bulgaricus сконструированы праймеры: 16SbulF: 5'- CAA 8CAG AAT CGC ATG ATT CAA 6GTT TG (26) и 16SbulR: 5'- ACC GGA AAG TCC CCA ACA CCT A (22) для амплификации гена 16S рРНК длиной 675 п.н.

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплиСпецифичность данных фикации фрагмента ДНК гена 16S рРНК бактепар видоспецифичных праймерий рода Lactobacillus с использованием пары ров была подтверждена эксперодоспецифичных праймеров 16Sfor-16Srev: 1 – риментально на бактериальных БЗ-ТВр; 2 – БЗ для напитка «Южный» БЗ-СТБп заквасках и концентратах, на (Ю); 3 – БЗ-ТВ варенец; 4 – БК-КТСБ; 5 – БЗ для референтных штаммах бактейогурта БЗ-СТБп; 6 – БЗ БПНВ; 7 – БЗ АПВ; 8 – рий, включающих пять штаммов БК-СТв; 9 – Bifidobacterium bifidum №1; 10 – L. delbrueckii subsp. bulgaricus, E.coli; М – маркер размерности ДНК (п.н.) штамм Bifidumbacterium bifidum №1, пробиотических продуктах, содержащих лактобактерии и кисломолочных продуктах. При наличии в пробе положительной ДНК-мишени, регистрировали наличие полосы амплификата размером, совпадающим с расчетным – 675 п.н. (рис. 7).

Полученные данные позволяют утверждать, что сконструированная и исследованная нами система праймеров для выявления гена 16S рРНК может быть использована в ПЦР в качестве видоспецифической для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, и ее применение будет способствовать Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации расширению возможнофрагмента ДНК гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus с использованием видоспеци- стей исследователей при фичных праймеров 16SbulF-16SbulR: 1 – БЗ-ТВр; 2 – БК- молекулярноСТв; 3 – БЗ для варенца; 4 – БК-КТСБ; 5 – АПВ; 6 – генетической характериБПНВ; 7 – БЗ-СТБп; 8 – БЗ-СТБп (Ю); 9 – Bifidobacteстике лактобактерий.

rium bifidum № 1; 10 – E.coli; М – маркер размерности Для сравнения виДНК (п.н.) довой специфичности ПЦР с классическими биохимическими методами использовали пять штаммов микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus: ВКПМ В-3141, ВКПМ В-6545, ВКПМ В-3964, ВКПМ В-6515, ВКПМ В-6516.

По результатам проведенных исследований установлено, что при использовании классического биохимического метода идентификации лактобактерий лишь четыре штамма из пяти были однозначно идентифицированы как L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

При использовании методики на основе ПЦР в 100% случаев были получены однозначные результаты, которые свидетельствуют о специфичности реакции. В случаях, когда идентификация классическим методом не давала однозначных результатов, использование ПЦР-методики позволило точно установить вид исследуемой культуры.

Разработанная методика индикации микроорганизмов и комплексная схема их видовой идентификации могут быть использованы для характеристики изолируемых штаммов бактерий рода Lactobacillus и представлять практический интерес для использования в системе контроля качества продуктов питания, обогащенных лактобактериями.

ГЛАВА 6. Исследование теплофизических свойств в процессах низкотемпературной обработки заквасок молочнокислых бактерий. При проведении исследований теплофизических свойств важными исходными данными является информация о химическом составе исследуемого объекта. Поскольку бактериальные закваски являются многокомпонентным биологическим объектом, был изучен их химический состав (табл. 2), который также необходим при исследовании процессов замораживания бактериальных заквасок.

Таблица Химический состав заквасок молочнокислых бактерий Наименование бактериальной закваски Показатель Lac. Lac. cre- Lac. diace- Str. terАПВ АПНВ БПВ БПНВ lactis moris tylactis mophilus Массовая доля обще3,1 2,9 3,0 2,9 2,8 3,0 2,9 2,го белка, % (± 0,5%) Массовая концентрация молочной кисло- 18,7 12,7 16,1 11,5 9,6 8,9 2,6 6,ты, мг/см3 ( ± 0,5 %) Массовая доля сухих 12,5 11,7 12,3 11,2 11,8 12,1 12,4 11,веществ, % ( ± 0,5%) Следует отметить, что у вязких заквасок АПВ и БПВ содержание молочной кислоты было в среднем в 1,5 раза выше, чем у невязких АПНВ и БПНВ.

Наименьшее образование молочной кислоты отмечено у бактерий Lac.

diacetylactis. В остальном химический состав исследуемых бактериальных заквасок был близок, отличия в полученных значениях массовой доли сухих веществ и массовой доли общего белка находились в пределах погрешности измерений.

Исследование теплофизических характеристик бактериальных заквасок производили первым буферным методом двух температурно-временных интервалов. Для определения теплофизических характеристик лабораторных заквасок при температурах выше 0 С, температуру поверхности нагревателя задавали в пределах 22 25 С. При определении теплофизических характеристик замороженных заквасок температура поверхности нагревателя термостатировалась при температуре -22 -25 С.

В результате проведения теплотехнического эксперимента получаются термограммы (рис. 8), анализ которых позволяет определить коэффициенты теплопроводности и температуропроводности a исследуемых образцов (система уравнений (1)).

i b b н t t1 a 1 1 a erfc h hВ a 1 2 i 1 a 1 2 a1 tн t0 h aB b a 1 b i0 , (1) 1 ai tн t2 b b h hВ a 1 a 1 1 2 i a 1 erfc 2 a2 h aB tн t0 b a 1 b i0 где tн температура нагревателя, С; t1 температура в буферном слое теплоприемника, в момент времени, соответствующий I группе точек (рис. 2), С;

t0 температура свободного конца теплоприемника в начальный момент времени, С; коэффициент теплопроводности исследуемого образца, Вт/(мК); a коэффициент температуропроводности исследуемого образца, м2/с; b постоянная теплоприемника, b = 370,7 Втс0,5/К; aB коэффициент температуропроводности теплоприемника aB = 5,0810-8 м2/с; h толщина слоя исследуемого образца, h = 0,0135 м; h0 толщина буферного слоя, h0 = 0,005 м.

Рис. 8. Экспериментальные зависимости для определения теплофизических характеристик закваски БПНВ в замороженном состоянии: 1 – экспериментально полученная температура в буферном слое теплоприемника (t); 2 – теоретическая зависимость изменения температуры буферного слоя (t0), полученная по уже определенным значениям коэффициентов и a; 3 –температура поверхности нагревателя (tн); 4 – температура свободного торца теплоприемника (tc); I – первая группа точек для определения коэффициентов и a; II вторая группа точек для определения коэффициентов и a Для получения более достоверных значений теплопроводности и температуропроводности исследуемого материала на кривой 1 (рис. 8) выбирали две группы точек (группа I и группа II, рис. 8) в каждой из групп соответственно по шесть точек. Каждая из точек одной группы составляла пару с каждой точкой другой группы. Таким образом, получается 36 систем уравнений вида (1), в каждой из которых определяются значения теплопроводности и температуропроводности исследуемого материала. Эти значения несколько отличаются друг от друга, поэтому в качестве окончательных значений коэффициентов теплопроводности и температуропроводности принимали средние значения этих величин, определенных для каждой пары точек (рис. 9).

Определенные с помощью изложенной методики значения теплофизических характеристик исследованных заквасок в жидком и замороженном состоянии приведены в табл. 3, 4.

Из приведенных результатов видно, что значения теплофизических характеристик заквасок в наибольшей степени определяются массовой долей содержащейся в них влаги. При замораживании заквасок теплофизические характеристики значительно изменяются: температуропроводность возрастает в 6 7 раз, теплопроводность возрастает в 3 4 раза, теплоемкость уменьшается в 1,5 1,8 раза.

Рис. 9. Определение среднего значения коэффициента теплопроводности закваски БПНВ при температуре выше 0 С: Ii линии значений коэффициента теплопроводности закваски, определенные с помощью системы уравнений (1), первой координатой в которой является i ое значение первой группы точек Таблица Теплофизические характеристики бактериальных заквасок до замораживания температу- объемная теплопро- плотность массовая ропровод- теплоемкость теплоемкость водность , , Закваска ность cV 10-6, Вт/(мК) кг/м3 cm, Дж/(кгК) а107, м2/с Дж/(м3К) ( X ±5%) ( X ±2%) ( X ±5%) ( X ±5%) ( X ±5%) АПВ 1,35 0,532 3,93 1032,1 38АПНВ 1,35 0,535 3,96 1028,3 38БПВ 1,37 0,541 3,95 1029,7 38БПНВ 1,38 0,548 3,97 1027,1 38Lac. lactis 1,36 0,539 3,96 1028,1 38Lac. cremoris 1,35 0,534 3,95 1029,1 38Lac. diacetylactis 1,38 0,543 3,95 1030,1 38Str. termophilus 1,37 0,546 3,98 1031,1 38Теплофизические характеристики исследованных бактериальных заквасок отличаются друг от друга незначительно. Температуропроводность и теплоемкость незамороженных заквасок отличается в пределах 2 %, теплопроводность незамороженных заквасок в пределах 3 %. Отличия в измеренных значениях теплофизических характеристик различных заквасок исследованной группы находятся в диапазоне погрешностей измерения. Это объясняется тем, что закваски очень близки друг к другу по составу и структуре.

Таблица Теплофизические характеристики замороженных бактериальных заквасок Температу- Объемная Теплопро- Плотность Массовая ропровод- теплоемкость теплоемкость водность , , Закваска ность cV 10-6, Вт/(мК) кг/м3 cm, Дж/(кгК) а107, м2/с Дж/(м3К) ( X ±5%) ( X ±2%) ( X ±5%) ( X ±5%) ( X ±5%) АПВ 8,78 1,83 2,08 961,0 21АПНВ 8,87 1,85 2,09 955,9 21БПВ 9,11 1,9 2,08 957,8 21БПНВ 9,36 1,95 2,09 954,3 21Lac. lactis 9,22 1,92 2,09 956,2 21Lac. cremoris 8,82 1,84 2,09 957,1 21Lac. diacetylactis 9,16 1,91 2,08 958,1 21Str. termophilus 9,27 1,93 2,09 955,2 21Таким образом, при теплотехнических расчетах процессов низкотемпературной обработки бактериальных заквасок можно пользоваться усредненными теплофизическими характеристиками замороженных и не замороженных заквасок. Полученные результаты будут иметь точность, соответствующую требованиям, предъявляемым к инженерным расчетам.

Криоскопическая температура является необходимым параметром при проектировании процессов низкотемпературной обработки продуктов или материалов.

Следовательно, информация о криоскопических температурах имеет важное практическое значение. В технической литературе значения криоскопических температур заквасок молочнокислых микроорганизмов не встречаются в виду того, вероятно, что такая информация была бы востребована узким кругом специалистов. По этой же причине, возможно, такие специализированные исследования еще и не производились.

Исследования процессов кристаллизации растворов нами производилось на специализированном лабораторном комплексе, схематичное изображение которого представлено на рис. 10.

Лабораторный комплекс предназначен для определения криоскопических температур растворов с поддержанием заданной разности температур, между исследуемым раствором и охлаждающей средой (хладоносителем), это позволяет управлять процессом кристаллизации, производить исследования на качественно высоком уровне. В качестве хладоносителя использовался этанол. Лабораторный комплекс размещался в холодильной камере с температурой -45-50 С.

Определение криоскопических температур бактериальных заквасок производилось методом термического анализа, основанного на построении кривых время – температура (рис. 11).

Аналогичные кривые были получены при определении криоскопических температур других заквасок. Криоскопические температуры исследованных бактериальных заквасок представлены в табл. 5. Из таблицы видно, что у вязких заквасок АПВ и БПВ криоскопическая температура ниже, чем у невязких заквасок АПНВ и БПНВ.

Рис. 10. Схема лабораторного стенда для определения криоскопических температур:

1 – рабочая емкость; 2 – пробирка с исследуемым раствором; 3 – уравнительные трубопроводы; 4 – цилиндрическая колба; 5,6 – трубопроводы подачи хладоносителя; 7 – нагреватель; 8 – емкость охлажденного хладоносителя; 9 – емкость для отепленного хладоносителя; 10 – насос подачи отепленного хладоносителя; 11 - насос подачи охлажденного хладоносителя; 12 – модуль ввода МВА8; 13 – измеритель- регулятор ТРМ202;

14 – преобразователь интерфейса АС-4; 15 –ПК; 16 термопары -1,---0 20 40 60 80 100 1Время, мин Рис. 11. Определение криоскопической температуры закваски АПВ: 1 – температура закваски; 2 – температура хладоносителя Поскольку вязкие закваски имеют более высокое содержание растворенных веществ, они имеют более низкую криоскопическую температуру по сравнению с невязкими заквасками.

о Температура, С Таблица Криоскопические температуры бактериальных заквасок Наименование Lac. Lac. Lac. diace- Str. termoбактериальной АПВ АПНВ БПВ БПНВ lactis cremoris tylactis philus закваски Криоскопическая температу- -1,80 -1,60 -1,65 -1,40 -1,30 -1,25 -0,90 -1,ра, ° С ( ± 0,05) Процесс кристаллизации влаги при замораживании закваски молочнокислых микроорганизмов приблизительно соответствует процессу кристаллизации влаги в тройной системе лактоза – молочная кислота – вода. Кривые кристаллизации бинарных водных растворов компонентов, входящих в такую систему, приблизительно тождественны, отличаются они только эвтектическими температурами и концентрациями.

Зависимость температуры кристаллизации от концентрации раствора была обработана с помощью метода наименьших квадратов и получено уравнение регрессии, позволяющее определить криоскопическую температуру раствора (tкр, С) в зависимости от массовой доли молочной кислоты (р, %):

tкр=0,0168-0,1608р+1,76510-3р2-6,04410-5р3. (2) Среднеквадратичное отклонение результатов, полученных с помощью уравнения (2) от экспериментальных данных, составляет 0,11 С в температурном диапазоне минус 21 С 0 С; уравнение регрессии зависимости массовой доли молочной кислоты в растворе от температуры начала замерзания:

р=-0,196-7,771 tкр-0,374 tкр2-7,45910-3 tкр3, (3) среднеквадратичное отклонение результатов, полученных с помощью уравнения (3) от экспериментальных данных, составляет 0,41 % в температурном диапазоне минус 21 С 0 С.

Количество образовавшегося в результате замораживания льда (mл), в зависимости от температуры можно определить по формуле:

mл(t) = mвл-mс(1/р(t)-1), (4) где mл(t) – массовая доля образовавшегося льда при температуре (t); mвл – массовая доля влаги в исходной закваске; mс – массовая доля лактозы и молочной кислоты.

Для определения количества замерзшей воды формулой (4) следует пользоваться в температурном диапазоне от криоскопической температуры до температуры минус 21 С температуры замерзания эвтектического раствора лактозы. До криоскопической температуры вся влага, входящая в состав закваски, находится в жидком состоянии, ниже температуры минус 21 С в закваске остается некоторое количество влаги, порядка 1 3%, так называемой незамерзающей влаги, для кристаллизации которой требуются значительно более низкие температуры. Доля незамерзающей влаги определяется индивидуально для каждого вида закваски. При определении доли замерзшей влаги, в формулу (4) в температурном диапазоне от криоскопической до температуры минус 5,3 С следует подставлять вместо mс массовую долю лактозы и молочной кислоты, в диапазоне температур от минус 5,3 до минус 21 С только массовую долю лактозы.

В соответствии с формулами 2 4 рассчитали массовую долю замерзшей влаги (рис. 12) в диапазоне температур -24 0 С.

а) б) в) г) д) е) Рис. 12. Расчетные значения теплофизических характеристик бактериальных заквасок в зависимости от температуры: а) массовая доля замерзшей влаги; б) теплоемкость, в) энтальпия; г) теплопроводность, д) температуропроводность; е) плотность.

1 – АПВ; 2 – АПНВ; 3 – БПВ; 4 – БПНВ Удельную теплоемкость закваски (с) находили по правилу аддитивности:

n c c , (5) к к k где ск – теплоемкость компонента; к массовая доля компонента.

Для расчета удельных энтальпий закваски за нулевое значение энтальпии приняли теплосодержание закваски, соответствующее температуре -50 С. В диапазоне температур от минус 50 до 25 С приращение удельных энтальпий (i) в диапазоне t рассчитали по формуле:

i c t r , (6) л где r = 334 кДж/кг – удельная теплота плавления водного льда; - массовая доля расплавившегося льда в диапазоне температур t.

Расчет коэффициентов теплопроводности производили методом аддитивности, по формуле Лихтнекера:

n, (7) V V эф k k k где эф – эффективный коэффициент теплопроводности продукта; k – коэффициент теплопроводности компонента; Vk – объем, занимаемый компонентом; V – полный объем продукта.

Расчетную физическую плотность закваски находили по уравнению:

n n k . (8) k k k 1 k С помощью формул 2 8 были также определены удельные теплоемкости, энтальпии, коэффициенты теплопроводности, коэффициенты температуропроводности, а также плотности (рис. 12) исследованных бактериальных заквасок в зависимости от температуры в диапазоне температур минус 45 25 С.

Для оценки адекватности разработанных методик были рассчитаны величины, характеризующие теплофизические свойства жидких и замороженных бактериальных заквасок, произведено сравнение расчетных результатов и результатов, полученных в эксперименте. Погрешности определения теплофизических характеристик расчетным способом по сравнению с экспериментальными данными составляют: для температуропроводности – 2,6 5,3 %; для теплопроводности – 3 4,9 %; для массовой теплоемкости до 3,8 %. Сравнение теплофизических характеристик бактериальных заквасок, определенных опытным и расчетным путем, в целом свидетельствует о применимости предлагаемой расчетной методики для определения теплофизических характеристик. Предлагаемую методику можно использовать для определения теплофизических характеристик жидких и замороженных заквасок, что необходимо для моделирования процессов их замораживания.

В заключении четвертой главы были определены удельные энергетические затраты, необходимые для замораживания заквасок в холодильных машинах одноступенчатого и двухступенчатого сжатия, а также в каскадных холодильных машинах (рис. 13). В качестве холодильного агента в этих установках рассматривались: аммиак, фреоны R-134a, R-22, R-404a, R-23.

Выявлено, что для производства искусственного холода в процессах замораживания и низкотемпературного хранения заквасок термофильных молочнокислых бактерий в температурном диапазоне от минус 20 до минус 50 С наи лучшие энергетические показатели имеют каскадные холодильные машины с R-23 в нижней и R-22 верхней ветви каскада.

R - 15131197531-50 -45 -40 -35 -30 -25 -Температура хладоносителя, 0 С а) R - 151311975300 1-50 -45 -40 -35 -30 -25 -Температура хладоносителя, 0 С б) R - 22 / R - 54321-50 -45 -40 -35 -30 -25 -Температура хладоносителя, 0 С в) Рис. 13. Расход энергии на привод одноступенчатой (а), двухступенчатой (б) и каскадной (в) холодильной машины (кДж/кг), необходимый для замораживания 1 кг бактериальной закваски L. bulgaricus невязкой от температуры 10 С до температуры хладоносителя в зависимости от температуры окружающей среды ГЛАВА 7. Исследование влияния замораживания и низкотемпературного хранения на закваски молочнокислых бактерий. Бактериальные закваски замораживали при трех температурных режимах: -10° С, -25° С, -45° С в Затраты энергии на замораживание закваски, кДж/кг Затраты энергии на замораживание закваски, кДж/кг Затраты энергии на замораживание закваски, кДж/кг воздушной среде и в жидком хладоносителе (этанол). Для замораживания заквасок использовали специальные низкотемпературные холодильные камеры.

Замораживание при температуре -45 С выполняли в низкотемпературном холодильном прилавке (рис. 14), при -25 С в низкотемпературном одноступенчатом холодильном ларе (рис. 15), при -10 С в низкотемпературной холодильной камере (рис. 16).

Рис. 14. Схема замораживания Рис. 15. Схема заморажива- Рис. 16. Схема замои хранения заквасок при тем- ния и хранения заквасок при раживания и хранения заквасок при пературе -45 С: температуре -25 С:

температуре -10 С: 1 замораживание в воздуш- 1 хранение замороженных ной среде при естественной заквасок в термоизолиро- замораживание в конвекции; 2 замораживание ванном контейнере; 2 за- жидком хладоноситемораживание в жидком хла- ле; 2 хранение зав жидком хладоносителе; 3 хранение замороженных за- доносителе; 3 заморажи- мороженных заквасок в термоизолированквасок в термоизолированном вание в воздушной среде при естественной конвек- ном контейнере; 3 контейнере; 4 охлаждаемый ции; 4 испаритель охлаж- замораживание в возобъем; 5 компрессор нижней душной среде при есветви каскада (Danfoss даемого объема; 5 холотественной конвекSC112C); 6 конденсатор- дильный агрегат ции испаритель Измерение температуры производилось посредством хромель-копелевых термоэлектрических преобразователей (термопар), сигнал которых воспринимался аналоговым модулем ввода МВА-8, преобразователем интерфейса АС-и фиксировался персональным компьютером. Измерительный комплекс был отградуирован по эталонному ртутному термометру с ценой деления 0,05° С в термостабильных условиях в диапазоне температур от -30° С до 0° С. Термограмма замораживания заквасок термофильных молочнокислых бактерий при температуре охлаждающей среды -45° С представлена на рис. 17.

На термограммах процессов замораживания явно выделяются 3 участка.

1 участок – процесс охлаждения, в течение которого температура стабильно понижается. Продолжительность этого процесса зависит от способа и температуры замораживания. Она составляет для закваски, замораживаемой в хладоносителе от 1,5 до 8 минут при температуре хладоносителя от -45 С до -10 С, для закваски, замораживаемой в воздушной среде при естественной конвекции от 7 до 65 минут при температуре воздуха от -45 С до -10 С.

2 участок – процесс кристаллизации влаги. Этот процесс начинается при криоскопической температуре, которой соответствовала изотермическая площадка на термограмме. Изотермические площадки практически незаметны на термограммах замораживания заквасок в хладоносителе при температурах -25 и -45 С. Продолжительность кристаллизации влаги составила от 40 до 90 секунд.

Изотермическая площадка, соответствующая кристаллизации влаги, выражена при замораживании в воздушной среде при всех температурных режимах, а также при замораживании в хладоносителе при температуре -10 С. Продолжительность кристаллизации влаги при замораживании на воздухе составила от до 70 минут, при замораживании в хладоносителе, при температуре -10 C продолжительность кристаллизации составила 8 минут.

3 участок – процесс охлаждения замороженной закваски. Этот процесс характеризуется достаточно высокой скоростью понижения температуры.

Здесь определяющим фактором является способ замораживания. При Рис. 17. Термограммы замораживания бактериальных заквасок замораживании в при температуре охлаждающей среды -45 С: замораживание в хладоносителе воздушной среде 1 – АПНВ, 2 – АПВ, 3 – БПНВ, 4 – БПВ; заугол наклона термораживание в хладоносителе 5 – АПНВ, 6 – АПВ, 7 – БПНВ, мограмм к оси 8 – БПВ абсцисс значительно круче, чем при замораживании в воздушной среде. По мере уменьшения разности температур между закваской и охлаждаемой средой термограмма замораживания становится более пологой.

Продолжительность замораживания для заквасок составила: при -10° С на воздухе от 5,5 до 6,5 часов, в хладоносителе от 4,5 до 5,5 часов; при -25° С на воздухе от 2 до 2,5 часов, в хладоносителе от 20 до 37 минут; при -45° С на воздухе от 90 до 110 минут, в хладоносителе – 13-15 минут.

Скорость замораживания заквасок для каждого температурного режима определяли по формуле:

= L / , где L – половина характерного размера (L = dпроб. / 2, где dпроб. – диаметр пробирки равный 1,5 см), см; - промежуток времени между моментами достиже ния 0° С на поверхности образца до температуры на 10° С ниже криоскопической в центре образца (t = tкр – 8° С), ч.

Значения скорости замораживания заквасок термофильных молочнокислых бактерий представлены в табл. 6.

Быстрое замораживание отмечено при замораживании бактериальных заквасок при температуре -25° С в среде жидкого хладоносителя (средняя скорость замораживания при данном температурном режиме – 9,37 см/ч). Наибольшие значения скорости замораживания заквасок (18,79 19,35 см/ч) получены при температурном режиме -45° С в жидком хладоносителе, что соответствует сверхбыстрому замораживанию. При быстром и сверхбыстром замораживании, кристаллизация влаги сопровождается образованием мелких вне- и внутриклеточных кристаллических структур, равномерно распределенных по всей толще замораживаемого объекта, что практически не оказывает разрушающего воздействия на бактериальные клетки заквасочных микроорганизмов.

Таблица Скорости замораживания бактериальных заквасок Наименование Скорость замораживания, см/ч бактериальной t = -10° С t = -25° С t = -45° С закваски воздух хладоно- воздух хладоно- воздух хладоноситель ситель ситель АПВ 0,17 0,23 0,79 9,42 1,48 18,АПНВ 0,19 0,25 0,78 9,38 1,38 18,БПВ 0,18 0,27 0,71 9,33 1,39 19,БПНВ 0,17 0,22 0,72 9,34 1,45 19,После замораживания пробирки с заквасками оставляли на хранение в термоизолированных контейнерах при температурах, соответствующих температурам замораживания. Замороженные закваски хранили в течение 9 месяцев.

Замороженные бактериальные закваски исследовали по органолептическим, микробиологическим и физико-химическим показателям.

Органолептическую оценку замороженных заквасок проводили по специально разработанной методике. Закваски после сквашивания имели белый, нежный и ровный сгусток с небольшим отделением сыворотки, у вязких заквасок АПВ и БПВ количество отделившейся сыворотки было немного больше, чем у невязких АПНВ и БПНВ. Полученные кисломолочные сгустки легко разбиваются и при перемешивании приобретают однородную консистенцию. Все закваски обладают приятным ароматом, имеют кисломолочный вкус, без посторонних привкусов и запахов. Более высокой органолептической оценкой (25-27) баллов после хранения обладали закваски, замороженные в среде хладоносителя при температуре -25° C и -45° C. У заквасок АПВ и БПВ после замораживания при всех температурных режимах органолептическая оценка была ниже, чем у АПНВ и БПНВ, что связано с заметным уменьшением вязкости бактериальных заквасок после замораживания.

Изменения структурно-механических свойств бактериальных заквасок под действием различных режимов замораживания оценивали по изменению относительной вязкости (рис. 18).

7,отн.

6,5,4,3,2,1,0,0 30 60 90 120 150 180 210 240 2сут.

Рис. 18. Влияние режимов замораживания на изменение относительной вязкости закваски АПВ: 1– замораживание в воздушной среде: –– -10° С; –– -25° С; –– -45° С; 2– замораживание в хладоносителе: –– -10° С; –– -25° С; –– -45° С На уменьшение относительной вязкости наибольшее влияние оказывает сам процесс замораживания, при этом относительная вязкость уменьшается в 1,5 – 6 раз в зависимости от вида заквасочной культуры и способа замораживания. Самое значительное уменьшение относительной вязкости (в 6 раз) отмечено для заквасок, замороженных в воздушной среде при -10° C, а наименьшее – для заквасок, замороженных в жидком хладоносителе при -45° C.

Значительное снижение относительной вязкости бактериальных заквасок, замороженных в воздушной среде и в хладоносителе при -10° C можно объяснить тем, что при медленном замораживании происходит образование крупных кристаллов льда вне клеток, при этом изменяется первоначальное соотношение объемов межклеточного и внутриклеточного пространства за счет перераспределения влаги и фазового перехода воды, что приводит к сжатию и образованию складок в оболочке, в результате чего происходит механическое повреждение протоплазмы. Нарушение структуры замораживаемого объекта приводит к резкому уменьшению его вязкости.

Быстрое замораживание (температурные режимы -25 °С и -45° C) предотвращает значительное диффузионное перераспределение влаги и растворенных веществ и способствует образованию мелких, равномерно распределенных кристаллов льда, что способствует максимальному сохранению структуры объекта.

Также были определены синеретические свойства сгустков. После 9 месяцев хранения количество выделившейся сыворотки в заквасках, замороженных при температуре –10 °C, в среднем составило 42,1 47,0 %, в зависимости от условий замораживания. У заквасок, замороженных при –25 °C в жидком хладоносителе и при –45°C в воздушной среде, количество выделившейся сыворотки составило в среднем 21 22% соответственно. Все закваски, замороженные при -45 °C в жидком хладоносителе, сохранили высокую влагоудерживающую способность в течение всего периода хранения – количество отделив шейся сыворотки составило менее 14,3 %. Необходимо отметить, что вязкие бактериальные закваски были более чувствительны к замораживанию и имели меньшую относительную вязкость и влагоудерживающую способность.

Температура и скорость замораживания способны в значительной степени повлиять на выживаемость микроорганизмов (рис. 19). На протяжении всего периода хранения наилучшая выживаемость микроорганизмов отмечена в бактериальных заквасках, замороженных в хладоносителе при -45° C. Через 9 мес.

хранения она составила в среднем 12,4 % для АПВ и АПНВ, 12,0 % для БПВ и БПНВ, и 11,2 % для симбиотической закваски (L. bulgaricus и Str. thermophilus) от исходного количества микроорганизмов. Выживаемость микроорганизмов в заквасках, замороженных на воздухе при -45° C, несколько ниже – через 9 мес.

количество микроорганизмов в среднем составило 6,9 % от исходного количества (рис. 20).

16,100,14,80,0 12,10,60,8,40,0 6,4,20,2,хладоноситель 0,0 хладоноситель 0,воздух -АПВ воздух АПНВ -БПВ -БПНВ Рис. 19. Выживаемость клеток L. aci- Рис. 20. Выживаемость микроорганизdophilus (АПВ) в зависимости от темпе- мов заквасок, замороженных при температуры и условий замораживания ратуре –45° С через 9 мес. хранения Количество микроорганизмов в бактериальных заквасках, замороженных при -25° C, составило 1,8 9,0 % от исходного в зависимости от режима замораживания. Наименьшая выживаемость микроорганизмов отмечена в бактериальных заквасках, замороженных при -10° C.

Более высокие показатели выживаемости микроорганизмов, замороженных в жидком хладоносителе, обусловлены более эффективным теплоотводом и, соответственно, значительно большей скоростью кристаллизации влаги по сравнению с кристаллизацией в воздушной среде. При таких условиях замораживания сведены к минимуму деструктивные факторы, сопровождающие кристаллизацию влаги в клетках и межклеточном пространстве, которые являются основной причиной гибели микроорганизмов закваски. Изменение количества жизнеспособных микроорганизмов было аппроксимировано методом наименьших квадратов в зависимости от продолжительности и температуры хранения.

Для всех бактериальных заквасок, замороженных и хранящихся в воздушной среде и в жидком хладоносителе, были получены уравнения регрессии вида:

N = Аt2 –Bt3 – Ct2 – Dt + Et – F2t – G + H2 – I3. (9) Количество жизнеспособных микроорганизмов n = N · 109 КОЕ/г; продолжительность хранения, суток; t температура замораживания и хранеВыживаемость,% Выживаемость, % ния, С; A, B, C, D, E, F, G, H, I – коэффициенты полинома, значения которых для различных заквасок и условий замораживания (воздушная среда, жидкий хладоноситель) представлены в таблице 7.

Таблица Коэффициенты полинома уравнения (9) За- Условия Коэффициенты полинома кваска заморажиA106 B105 C103 D E104 F107 G102 H105 I1вания воздух 1,032 2,857 2,592 0,085 1,45 1,403 0,9073 4,937 7,4АПВ жидкость 1,52 60,66 1,011 0,056 1,606 1,268 0,5842 3,285 4,8воздух 4,322 87,83 0,332 0,08 4,656 3,681 1,62 0,136 0,27АПНВ жидкость 6,03 1,855 0,162 0,084 5,606 3,553 1,73 14,77 0,29воздух 9,128 39,2 2,297 0,212 0112 0,112 3,5 0,284 0,56БПВ жидкость 8,716 0,123 0,0012 0,397 7,663 3,538 5,32 0,362 0,6воздух 2,302 91,94 1,279 0,093 4,18 4,849 1,7 0,1367 0,2БПНВ жидкость 2,636 2,32 2,329 0,12 4,179 4,415 1,97 0,1498 0,29Результаты расчетов содержания жизнеспособных микроорганизмов, определенные по формуле (9), приведены на рис. 21, 22.

Рис. 21. Содержание микроорганизмов Рис. 22. Линии уровня для определения содержания микроорганизмов АПВ n = АПВ n = N109 КОЕ/г в зависимости от температуры замораживания и хранения N109 КОЕ/г в зависимости от температуt, С и продолжительности хранения, , ры замораживания и хранения t, С и суток в воздушной среде продолжительности хранения, , суток в жидком хладоносителе Высокая выживаемость молочнокислых микроорганизмов после замораживания не является гарантией сохранения полноты их свойств и жизнеспособности. О функциональной активности бактерий изучаемых заквасок судили по интенсивности кислотообразования.

Представленные в табл. 8 данные об активности кислотообразования заквасок молочнокислых бактерий после 9 мес. хранения, свидетельствуют о том, что после хранения у заквасок замороженных при температуре -10° С в хладоносителе и на воздухе отмечалось увеличение продолжительности сквашива ния. Бактериальные закваски, замороженные при температуре -25° С в хладоносителе при температуре -45° С на воздухе, обладают такой же активностью что и исходные сухие закваски. Активность кислотообразования у заквасок, замороженных при температуре -45° С в хладоносителе, была выше по сравнению с исходными сухими заквасками – продолжительность сквашивания молока уменьшилась на 10 15%, это можно объяснить меньшим адаптационным периодом бактерий в замороженных заквасках.

Таблица Изменение активности кислотообразования замороженных заквасок Наименование Активность сквашивания, ч ( ± 0,5) бактериальной t = -10° С t = -25° С t = -45° С закваски воздух хладоноситель воздух хладоноситель воздух хладоноситель АПВ 10 10 9 8 8 АПНВ 16 16 15 14 14 БПВ 10 10 9 8 8 БПНВ 18 18 17 16 16 Генетическую стабильность молочнокислых микроорганизмов в бактериальных заквасках, замороженных при различных температурах и условиях замораживания, оценивали по сохранению морфологических и биохимических свойств, антагонистической активности, а также по сохранению молекулярного веса и числа фрагментов ДНК бактерий с помощью родоспецифичных праймеров (16S for – 16S rev).

Была исследована антагонистическая активность штаммов L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lac. cremoris, и L. diacetylactis, входящих в состав заквасок, замороженных при температуре -45° С в среде жидкого хладоносителя и хранившихся в течение 9 мес. Все исследуемые штаммы сохранили высокую антагонистическую активность, зона задержки роста тест-микробов изменилась назначительно – в среднем на 1 2 мм ( табл. 9).

Таблица Антагонистическая активность заквасочных культур после замораживания Название микроорганизма Зона задержки роста, мм (±1,0) E. coli Sh. flexneri S. aureus Proteus Proteus vulgaris mirabilis L. acidophilus В-5863 13 11 13 10 L. acidophilus В-6552 20 24 21 21 L. bulgaricus В-3964 20 - 24 20 L. bulgaricus В-6516 11 10 7 18 L. cremoris 10 11 9 - L. diacetylactis 9 11 8 - В дальнейшем изучалась морфология клеток молочнокислых микроорганизмов L.bulgaricus и L.acidophilus после замораживания (рис. 23).

а) в) б) г) д) е) Рис. 23. Морфология клеток L. acidophilus и L. bulgaricus после замораживания и хранения в течение 9 мес.

замороженные в воздушной среде: а) БПВ при -10° С, в) АПНВ при -45° С;

замороженные в среде хладоносителя: б) АПВ при -45° С, г) АПНВ при -25° С, д) БПНВ при -10° С, е) БПНВ при -45° С Значительное изменение морфологических свойств было отмечено у всех заквасочных культур после замораживания в воздушной среде при всех температурных режимах, а также при температуре -10° С в хладоносителе. Микроорганизмы имели искривлённые клеточные оболочки, располагались в основном поодиночке (рис. 23 а, в, д). А у заквасочных культур БПНВ волютиновые зёрна исчезали и встречались очень редко (рис. 23 д).

После замораживания в хладоносителе при температуре -25° С и -45° С микроорганизмы с изменением клеточных оболочек встречались редко, в основном у вязких бактериальных заквасок, располагались поодиночке и цепочками, иногда были удлинённые формы палочек (рис. 23 б, г, е), что свидетельствует о соблюдении щадящих режимов и условий замораживания и низкотемпературного хранения.

Проведены исследования влияния низких температур на стабильность ДНК микроорганизмов бактериальных заквасок, замороженных в среде хладоносителя при -25° C и -45° C и хранившихся в течение 9 месяцев. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК (с использованием родо- и видоспецифичных праймеров) молочнокислых микроорганизмов бактериальных заквасок, замороженных при -45° C, представлена на рис.

24. На рис. 25 представлена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК (с использованием родоспецифичных праймеров) молочнокислых микроорганизмов бактериальных заквасок, замороженных при -25° C.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что молекулярный вес и число фрагментов ДНК исследуемых бактерий после замораживания и хранения в течение 9 мес. не изменился и, следовательно, молочнокислые бактерии должны сохранить свои морфологические и биохимические свойства.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 700 7300 3Рис. 24. Электрофореграмма продуктов Рис. 25. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК молочнокислых бактерий: 1 – АПВ; рРНК молочнокислых бактерий: 1 – 2 – АПНВ; 3 – БПВ; 4 – БПНВ; 5 –штамм АПВ; 2 – АПНВ; 3 – БПВ; 4 – БПНВ; 5 – L.acidophilus.1k из коллекции ВКПМ № штамм L.acidophilus.1k из коллекции В-194; 6 – штамм L. delbruesckii ssp. bulga- ВКПМ № В-194; 6 – штамм L. delricus Л20/2; 7 – маркер молекулярного ве- bruesckii ssp. bulgaricus Л20/2; 7 – маркер са «Медиген» молекулярного веса «Медиген» Таким образом, для сохранения высокой биохимической активности заквасок, для лучшего сохранения бактериальных клеток и предотвращения генетических изменений заквасочных микроорганизмов необходимо использовать сверхбыстрое замораживание в среде жидкого хладоносителя при низких температурах. Для обеспечения стабильности качественных показателей в процессе длительного, низкотемпературного хранения необходимо хранить закваски при температуре -25-45° C в жидком хладоносителе; колебания температур в процессе хранения недопустимы, так как это приводит к разрушению бактериальной клетки и гибели микроорганизмов. Рекристаллизация – увеличение кристаллов влаги, происходящая при колебаниях температуры в процессе хранения приводит к тем же последствиям, которые возникают в результате медленного замораживания: разрушению клеточной оболочки, изменению морфологии и гибели микроорганизмов заквасок.

Использование замороженных бактериальных заквасок обеспечивает стабильность культур микроорганизмов и позволяет интенсифицировать производство кисломолочных продуктов.

ГЛАВА 8. Практическая реализация результатов работы. Результаты исследований, приведенные в предыдущих главах, позволили обосновать и разработать технологии замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов, обеспечивающие наибольшую выживаемость микроорганизмов, сохранение их биохимических свойств, морфологических признаков и генетической стабильности.

Производство заквасок должно осуществляться в стерильных условиях в лабораториях, изолированных от производственных помещений, и специальных ламинарных боксах, позволяющих получить асептические условия внутри бокса. Технологическая схема процесса низкотемпературного консервирования бактериальных заквасок термофильных молочнокислых бактерий приведена на рис. 25.

Приёмка и оценка качества молока-сырья,очистка, резервирование t = 4 ± 2° С Нормализация, гомогенизация при температуре 60 ± 2° С, давлении 15 ± 2,5 МПа Стерилизация при температуре 121 ± 2° С, давлении 0,1 МПа в течение 10 ± 2 мин.

Внесение Охлаждение до температуры 38 ± 1° С заквасочных и заквашивание культур Сквашивание (ферментация) смеси при температуре 41 ± 1° С Охлаждение и перемешивание молочнокислого сгустка Розлив, упаковка в асептических условиях и охлаждение до температуры 4 ± 2° С Замораживание при температуре минус 45° С в среде хладоносителя Низкотемпературное хранение при температуре минус 45 °С и реализация Рис. 25. Блок-схема производства замороженных бактериальных заквасок Транспортирование бактериальных заквасок производится в специализированных изотермических контейнерах, сохраняющих температуру не выше минус 45° С. Использование сухого льда в контейнерах такого типа позволяет поддерживать требуемый температурный уровень в течение нескольких суток.

Разработанные технологии замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов являются научно обоснованными, конкурентоспособными и экономически целесообразными. На все изученные бактериальные закваски молочнокислых микроорганиз мов разработаны комплекты технической документации. Технологии замораживания и низкотемпературного хранения бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов апробированы и внедрены на предприятиях Кемеровской области и Алтайского края.

Важным этапом проведенных исследований стало выделение ДНК молочнокислых бактерий с использованием коллодиевых пленок и последующая разработка тест-системы для индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus.

Тест-система представлена в виде готовых пробирок с реакционной смесью, в которые вносится образец ДНК. Такая форма снижает вероятность ошибок оператора и риск контаминации реактивов при приготовлении смеси, повышает воспроизводимость результатов, а также уменьшает время и трудоемкость анализа. Результат анализа оформляется в виде готового протокола исследования. Каждый пользователь получает подробные иллюстрированные инструкции. Тест-система для идентификации молочнокислых бактерий позволяет провести все этапы анализа (рис. 26): выделение ДНК молочнокислых бактерий; обнаружение геномной ДНК молочнокислых бактерий; электрофорез в агарозном геле; анализ и интерпретация результатов.

Рис. 26. Этапы идентификации молочнокислых бактерий с помощью тест-системы Тест-система разработана специально для выделения, обнаружения и идентификации геномной ДНК молочнокислых бактерий, входящих в состав бактериальных заквасок, используемых для производства кисломолочных продуктов. В наборе для очистки ДНК используется кремниевый сорбент или коллодиевые пленки. Данная тест-система позволяет провести как качественный, так и количественный анализ молочнокислых бактерий. Отличительными особенностями набора является быстрота выделения ДНК и наличие высокоспецифичных и уникальных праймеров, специально подобранных для лактобактерий.

Потенциальными потребителями тест-системы являются: лаборатории, занимающиеся выделением и идентификацией новых культур с целью применения их как заквасок в молочной промышленности; крупные компаниипроизводители пробиотических продуктов, в том числе коммерческие поставщики штаммов микроорганизмов; испытательные лаборатории Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

ВЫВОДЫ 1. Проведены исследования влияния низкотемпературной обработки на генетическую стабильность молочнокислых микроорганизмов. Установлено, что сверхбыстрое замораживание (скорость замораживания 19 см/ч) и хранение в термостабильных условиях при температуре -45° С не вызывает генетических изменений молочнокислых микроорганизмов в бактериальных заквасках.

2. Разработан метод идентификации бактерий рода Lactobacillus и вида Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus с использованием полимеразной цепной реакции. Выделение ДНК молочнокислых бактерий осуществляли методом нуклеосорбции на коллодиевых пленках. Разработана технология изготовления коллодиевых пленок для осуществления идентификации лактобактерий. Изучена адсорбция ДНК молочнокислых бактерий на коллодиевых пленках. Установлено, что эффективность иммобилизации образцов ДНК на коллодиевых пленках возрастает с увеличением ионной силы раствора, что свидетельствует о том, что адсорбция ДНК осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий между основаниями ДНК и коллодиевой пленкой. Проведенная нами сравнительная оценка видовой специфичности полимеразной цепной реакции с классическими биохимическими методами идентификации молочнокислых бактерий показала полное совпадение результатов идентификации.

3. Определены теплофизические характеристики (удельная и объемная теплоемкость, теплопроводность, температуропроводность, плотность, криоскопические температуры) для 8 видов бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов в жидком и замороженном состоянии.

4. Исследован процесс кристаллизации влаги при замораживании заквасок. Установлено, что процесс кристаллизации влаги при замораживании заквасок соответствует кристаллизации влаги в водном растворе сахаров и молочной кислоты. На основании проведенных исследований разработана методика расчетного определения теплофизических характеристик жидких и замороженных заквасок термофильных молочнокислых бактерий, а также изменение этих показателей в процессе замораживания в зависимости от температуры.

5. Определены удельные энергетические затраты, необходимые для замораживания заквасок в холодильных машинах одноступенчатого и двухступенчатого сжатия. А также в каскадных холодильных машинах. Выявлено, что для производства искусственного холода в процессах замораживания заквасок термофильных молочнокислых бактерий в температурном диапазоне от минус 20 до минус 50° С наилучшие энергетические показатели имеют каскадные холодильные машины с R-23 в нижней и R-22 в верхней ветви каскада.

6. Определены оптимальные параметры процесса замораживания за квасок термофильных молочнокислых микроорганизмов L acidophilus и L. bulgaricus: продолжительность и скорость замораживания в зависимости от режимов низкотемпературной обработки в воздушной среде при естественной конвекции и в жидком хладоносителе.

7. Изучено влияние замораживания на молочнокислые микроорганизмы бактериальных заквасок при их низкотемпературном консервировании при различных температурных режимах в диапазоне от минус 10 до минус 45° С и условиях замораживания (в воздушной среде при естественной конвекции и в жидком хладоносителе). Определены физико-химические и микробиологические показатели бактериальных заквасок в жидком и замороженном состоянии.

Исследована динамика изменения этих показателей в процессе хранения в течение 270 суток. Установлено, что замораживание и низкотемпературное хранение бактериальных заквасок при температуре минус 45° С в среде жидкого хладоносителя не вызывает генетических изменений культур молочнокислых бактерий и обеспечивает наилучшую сохранность жизнеспособности микроорганизмов и исходных свойств заквасок.

8. Определена продолжительность хранения заквасок молочнокислых микроорганизмов, замороженных при температуре минус 45° С в среде жидкого хладоносителя. Срок низкотемпературного хранения в термоизолированном контейнере при температуре минус 45° С составляет не более 270 суток. При использовании на молочных предприятиях холодильного оборудования с температурой хранения минус 18° С, закваски рекомендуется хранить не более суток. В течение этого времени закваски сохраняют необходимую активность сквашивания.

9. На основании проведенных исследований разработаны технологические принципы низкотемпературного консервирования бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов. Проведен сравнительный анализ продолжительности ферментации молока с использованием замороженных и сухих бактериальных заквасок. Установлено, что продолжительность ферментации молока при использовании замороженных заквасок – на 10 – 15 % меньше, чем при использовании сухих бактериальных заквасок.

10. Разработана технология низкотемпературного консервирования и хранения бактериальных заквасок молочнокислых микроорганизмов и нормативная документация. Разработанные технологические решения прошли апробацию на предприятиях биотехнологической промышленности.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Монографии 1. Короткая, Е.В. Криоконсервирование бактериальных препаратов молочной промышленности: монография / Е.В. Короткая, А.Ю. Просеков. – Кемерово, 2010. – 160 с.

2. Короткая, Е.В. Биосенсоры на основе коллодиевых пленок: монография / Е.В. Короткая. – Кемерово, 2011. – 131 с.

3. Короткая, Е.В., Коллоидно-химические аспекты и методы контроля качества пищевых продуктов / Е.В. Короткая, Н.В. Розаленок. – Кемерово, 2008. – 66 с.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК 4. Короткий, И.А. Применение метода двух температурно-временных интервалов для определения теплофизических характеристик пищевых продуктов и материалов / И.А.Короткий, Е.В. Короткая // Известия вузов. Пищевая технология. – 2008. – № 2-3. – С.109–111.

5. Просеков, А.Ю. Использование тест-систем в молочной промышленности / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных // Молочная промышленность. – 2009. – № 11. – С. 70–72.

6. Короткая, Е.В. Изучение свойств коллодиевых пленок / Е.В. Короткая, А.М. Осинцев // Техника и технология пищевых производств. – 2010. – №1. – С.

51–54.

7. Беспоместных, К.В. Конструирование родоспецифичных и видоспецифичных праймеров для индикации и идентификации Lactobacillus bulgaricus / К.В.

Беспоместных, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств. – 2010. – №1. – С. 64–8. Просеков, А.Ю. Методы определения восстановленного молока в питьевом / А.Ю. Просеков, О.В. Мудрикова, Е.В. Короткая // Молочная промышленность. – 2010. – № 2. – С. 70–72.

9. Короткая, Е.В. Модификация поверхности коллодиевых пленок для повышения эффективности иммобилизации нуклеиновых кислот: исследование кинетики процесса адсорбции ионов Co2+, Cu2+, Pt2+ // Техника и технология пищевых производств. – 2010. – № 2. – С. 88–92.

10. Разумникова, И.С. Перспективы использования молока трансгенных животных / И.С. Разумникова, Е.В. Короткая, А.Ю. Просеков // Молочная промышленность. – 2011. – № 1. – С. 62–63.

11. Короткая, Е.В. Исследование свойств криоконсервированных заквасок // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – № 1. – С. 31–35.

12. Беспоместных, К.В. Исследование биохимических и морфологических свойств штаммов бактерий рода Lactobacillus / К.В. Беспоместных, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – № 2.– С. 94–96.

13. Короткая, Е.В. Технология получения и свойства коллодиевых пленок // Техника и технология пищевых производств. – 2011. – № 2. – С. 109–112.

14. Короткая, Е.В. Изучение адсорбции нуклеиновых кислот на коллодиевых пленках // Журнал прикладной химии. – 2011 – Т. 84. – № 10. – С. 1625-1629.

15. Короткая, Е.В. Исследование влияния режимов замораживания и низкотемпературного хранения на качественные показатели молочнокислых заквасок / Е.В. Короткая, И.А. Короткий, Е.А. Ибрагимова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – №7. – С. 196–200.

16. Короткая, Е.В. Разработка технологии низкотемпературного консервирования термофильных молочнокислых заквасок // Техника и технология пище вых производств. – 2011. – № 3. – С.61–66.

17. Беспоместных, К.В., Идентификация подвидов Lactobacillus bulgaricus / К.В. Беспоместных, Е.В. Короткая, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2011. – № 5. – С. 60–61.

18. Короткая, Е.В. Идентификация бактерий рода Lactobacillus c использованием ПЦР-тест-системы / Е.В.Короткая, К.В. Беспоместных // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2011. – № 7–8. – С. 109–117.

Материалы конференций, симпозиумов, конгрессов, сборников научных работ и тезисов докладов 19. Короткий, И.А. Градуировка электронного устройства контроля температуры УКТ38 / И.А. Короткий, Е.В. Короткая, М.И. Ибрагимов, А.В. Томиленко // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: сборник научных работ. – Кемерово, 2002. – С. 98.

20. Просеков, А.Ю. Генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы для производства пищевых продуктов / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: сборник научных работ. – Кемерово, 2009. – Вып. 18. – С.91–93.

21. Просеков, А.Ю. Применение полимеразной цепной реакции для определения генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: сборник научных работ. – Кемерово, 2009. – Вып. 18. – С.94–95.

22. Короткая, Е.В. Анализ ДНК методом полимеразной цепной реакции / Е.В.

Короткая, А.Ю. Просеков // Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производства: материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. – Кемерово, 2009. – С. 87–89.

23. Просеков. А.Ю. Использование тест-систем в молочной промышленности / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных // Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах: материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. – Кемерово, 2009. – С. 64–67.

24. Салищева, А.В. Оптические методы определения дисперсности гетерогенных систем / А.В. Салищева, О.В. Ковалевич, Л.И. Холохонова, Е.В. Короткая, Н.Е. Молдагулова, Н.В. Розаленок // Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах: материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. – Кемерово, 2009. – С.

20–24.

25. Короткая, Е.В. Использование полимеразной цепной реакции для оценки качества молочных продуктов / Е.В. Короткая, А.Ю. Просеков // Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах:

материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. – Кемерово, 2009. – С. 90–91.

26. Короткая, Е.В. Оценка качества молочных продуктов методом полимеразной цепной реакции / Е.В. Короткая, А.Ю. Просеков // Качество продукции, технологий и образования: материалы V Всероссийской научно-практической конференции. – Магнитогорск, МГТУ им. Г.И. Носова. – 2010. – С.76–78.

27. Ибрагимова, Е.А Криоконсервирование как способ сохранения молочнокислых заквасок / И.А. Короткий, Е.В. Короткая //Качество продукции, технологий и образования: материалы V Всероссийской научно-практической конференции. – Магнитогорск, МГТУ им. Г.И. Носова. – 2010. – С. 191–192.

28. Короткая, Е.В. Коллодиевые пленки для адсорбции нуклеиновых кислот / Е.В. Короткая, А.М. Осинцев // Международная заочная научно-практическая конференция «Наука в XXI веке: традиции и инновации». – Екатеринбург, 2010. – С. 43–46.

29. Короткая, Е.В. Экстракция ДНК из пищевых продуктов / Е.В. Короткая, И.С. Разумникова, А.Ю. Просеков // IV Международная конференция: каталог докладов. – Воронеж. – 2010. – С. 206.

30. Короткая, Е.В. Сохранение термофильных молочнокислых микроорганизмов методом криоконсервирования / Е.В. Короткая, И.А. Короткий, Е.А.

Ибрагимова // Сб. науч. трудов по материалам Международной научнопрактической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2010».– Одесса: Черноморье, 2010.

– Т.6. – С. 68–70.

31. Короткая, Е.В. Определение режимов криоконсервирования молочнокислых заквасок / Е.В. Короткая, И.А. Короткий, Е.А. Ибрагимова // «Современные проблемы устойчивого развития агропромышленного комплекса России»: материалы седьмой Всероссийской дистанционной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных. – ДонГАУ, пос. Персиановский, 2010. – С. 102–104.

32. Короткая, Е.В. Криоконсервирование заквасок термофильных молочнокислых бактерий / Е.В. Короткая, И.А. Короткий, Е.А. Ибрагимова // Повышение качества и безопасности пищевых продуктов: сборник материалов Всероссийской научной конференции – Махачкала, 2010. – С. 41–42.

33. Короткая, Е.В. Генетическое разнообразие штаммов бактерий вида Lactobacillus bulgaricus / Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных, О.О. Бабич // Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологии: материалы II Всероссийской научно-практической (заочной) конференции.– М.: Издательско-полиграфический комплекс НИИРРР.– 2010, – С. 67–70.

34. Беспоместных, К.В. Идентификация микроорганизмов в кисломолочных продуктах / К.В Беспоместных, Е.В. Короткая // VII Специализированный конгресс: Молочная промышленность Сибири.- Барнаул, 2010. – С. 23–25.

35. Беспоместных, К.В. Ферментационная активность штаммов и БЗ болгарской палочки / К.В. Беспоместных, Е.В. Короткая // Качество продукции, технологий и образования: материалы VI Всероссийской научно-практической конференции. – Магнитогорск, МГТУ им. Г.И. Носова, 2011. – С. 48–51.

36. Короткая, Е.В. Исследование процессов замораживания заквасочных культур Lactobacillus bulgaricus и Lactobacillus acidophilus / Е.В. Короткая, И.А.

Короткий, Е.А. Ибрагимова // I Международная научно-практическая конференция «Техника и технология: новые перспективы развития». – М., 2011. – С.

42–45.

37. Короткая, Е.В. Влияние низких температур на стабильность ДНК L.acidophilus / Е.В. Короткая // V Международная научно-техническая конференция, «Низкотемпературные и пищевые технологии в ХХI веке». – СанктПетербург, 2011. – С. 22–24.

38. Короткая, Е.В. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации бактерий рода lactobacillus / Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных // «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока»: сб. науч. трудов с междунар. участием. – Барнаул, 2011. – С. 195–202.

39. Короткая, Е.В. Влияние замораживания на свойства бактериальных заквасок, содержащих L.acidophilus и L.bulgaricus / Е.В. Короткая // Материали за VII международна научна практична конф. «Найновите постижения на европейската наука - 2011». – София «БаялГРАД БГ» ОДД, 2011. – Том 38. Селско стопанство – С. 58–60.

http://www.rusnauka.com/16_ADEN_2011/Agricole/4_87429.doc.htm 40. Короткая, Е.В. Кислотообразующая активность L.bulgaricus, входящих в состав замороженных бактериальных заквасок / Е.В. Короткая // «КУЗБАСС:

ОБРАЗОВАНИЕ, НАУКА, ИННОВАЦИИ». – Кемерово, 2011. – С. 19–20.

41. Короткая, Е.В. Исследование влияния режимов замораживания на свойства заквасок термофильных молочнокислых бактерий / Е.В. Короткая // Инновационные технологии в пищевой промышленности: материалы Х Междунар.

науч.-практ. конф., 5-6 октября 2011 г., г. Минск / ред. колл. В.Г. Гусаков [и др.]. – Минск: РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию», 2011. – С. 325–332.

Патенты и заявки на выдачу патентов РФ 42. Патент RU 2 413 419 С1. Способ производства ферментированного напитка /А.Ю. Просеков, И.С. Разумникова, А.В. Крупин, Е.В. Короткая. – Заявл.

15.09.2009. Опубл. 10.03.2011. Бюл. № 7.

43. Заявка на получение патента РФ «Метод получения коллодиевой пленки» № 2011109729/05 от 15.03.2011 / Е.В. Короткая, А.Ю. Просеков.

Отчеты о научно-исследовательской работе 44. Исследование закономерностей сорбции нуклеиновых кислот на коллодииевых пленках [Текст]: Научно-техн. отчет о выполнении 1 этапа Гос. контракта № П2344 от 17.ноября 2009 г. / ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»; рук. Короткая Е.В. – Кемерово, 2009. – с. – ГРНТИ 31.15.37. – Инв. № 01.08-04.07-1.

45. Исследование закономерностей сорбции нуклеиновых кислот на коллодииевых пленках [Текст]: Научно-техн. отчет о выполнении 2 этапа Гос. контракта № П2344 от 17.ноября 2009 г. / ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»; рук. Короткая Е.В. – Кемерово, 2010. – с. – ГРНТИ 31.15.37. – Инв. № 13.10-04.07-1.

46. Исследование закономерностей сорбции нуклеиновых кислот на коллодии евых пленках [Текст]: Научно-техн. отчет о выполнении 3 этапа Гос. контракта № П2344 от 17.ноября 2009 г. / ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»; рук. Короткая Е.В. – Кемерово, 2011. – с. – ГРНТИ 31.15.37. – Инв. № 01.08-04.07-1.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ АПВ – ацидофильная палочка вязкая; АПНВ – ацидофильная палочка невязкая; БЗ – бактериальная закваска; БЗ-ТВр – бактериальная закваска для ряженки; БК-КТСБ – бактериальный концентрат термофильного стрептококка и болгарской палочки; БК-СТв – бактериальный концентрат стрептококка термофильного вязкого; БПВ – болгарская палочка вязкая; БПНВ – болгарская палочка невязкая; ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; НК – нуклеиновые кислоты; НЦ – нитрат целлюлозы; ПЦР – полимеразная цепная реакция; рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота; СЗ – степень замещения.

Подписано в печать г. Формат 60х841/16. Тираж 120 экз. Объем 2,625 п.л.

Заказ № 59. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 650056, г.Кемерово, б-р Строителей, 47.

Отпечатано в лаборатории множительной техники КемТИППа, г. Кемерово-10, ул. Красноармейская,







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.