WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ДЕЙНЕКА ВИКТОР ИВАНОВИЧ "ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ".

05.11.11 – хроматография и хроматографические приборы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Белгород 2008 г

Работа выполнена в Белгородском государственном университете Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор Ланин Сергей Николаевич МГУ им. М.В. Ломоносова доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна Санкт-Петербургский Государственный университет доктор химических наук, профессор Курбатова Светлана Викторовна Самарский Государственный университет Ведущая организация Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук

Защита состоится « 1 » июля 2008 года в 15 час 00 мин на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.259.04 при Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук по адресу:

119991, г. Москва, Ленинский пр-т, д.31, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук.

Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии в сети Интернет.

Автореферат разослан « » мая 2008 года.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат химических наук Л.Н. Коломиец

Общая характеристика работы

Актуальность. Биологически активные вещества (БАВ) растительного и животного происхождения в последнее время вызывают возрастающий интерес по нескольким причинам. Как природные продукты, используемые человечеством на протяжении всего времени его существования, они не таят неопределенности в последействии. Это - одно из важнейших различий между ними и синтетическими продуктами. Быстрая индустриализация общества за последние сто лет привела к коренным изменениям в рационе питания, приведшим к нехватке важнейших нутриентов, что не могло не отразиться на здоровье населения. Одним из важнейших источников БАВ являются различные части растений – от плодов до корней. Исследованиям в данном направлении посвящается заметная доля научных работ во всем мире, издается более десятка специализированных журналов, ежегодно проводится большое число симпозиумов и конференций. Известно, что для нормального развития любого растения необходим определенный комплекс условий произрастания, от которых может зависеть набор накопленных в них БАВ. С другой стороны исследования накопления биологически активных веществ в растительных объектах России, расположенной во многих чрезвычайно разнообразных климатических зонах, весьма ограничены. При этом данные по растениям Центрально-черноземного района, наиболее благоприятного для сельхозпроизводства, практически отсутствуют. Это определяет прикладной аспект актуальности настоящей работы.

С другой стороны, исследование БАВ относится к достаточно сложной задаче, требующей больших материальных и временных затрат. Это связано, в частности, с тем, что БАВ накапливаются в сложном многокомпонентном комплексе, в состав которого могут входить соединения широкого спектра липофильности, обычно включающие высоко лабильные соединения.

Очевидно, что одним из лучших методов, которые могут быть использованы для исследования таких объектов, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). Этот вид хроматографии в настоящее время остается одним из наиболее часто используемых при исследовании состава сложных смесей веществ. Это обусловлено его универсальностью, поскольку метод может быть применен для разделения практически любых соединений (кроме высокомолекулярных) – от гидрофобных липидов (таких, как, например, триглицериды) до гидрофильных полифенолов (например, антоцианов). Важно, что метод позволяет добиваться бльшей воспроизводимости хроматографических параметров по сравнению с нормально-фазовой хроматографией, что позволяет проводить периодические исследования в течение длительного времени – годового цикла растений – без существенных «поправок» в методиках анализа.

К настоящему времени выполнено и опубликовано огромное число работ по разделению биологически активных веществ с использованием ОФ ВЭЖХ.

Однако целый ряд теоретических проблем остается не решенным, включая, например, методы сопоставления данных, полученных на стационарных фазах различных производителей. Это связано с невозможностью при настоящем состоянии технологии получения стационарных фаз (и хроматографических колонок), идентичных выпущенным ранее даже для одного и того же производителя. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение новых методов, пригодных для сравнения результатов, полученных в различных лабораториях мира, позволит использовать огромный банк литературных данных по удерживанию в условиях ОФ ВЭЖХ разнообразных биологически активных соединений. Это обусловливает теоретический аспект актуальности работы.

Цели и задачи работы. Две основные цели исследования: а) поиск и исследование источников биологически активных веществ в растениях Белгородской флоры и б) разработка корреляционных методов, позволяющих обоснованно анализировать изменение удерживания сорбатов при варьировании хроматографических условий или строения сорбатов.

Основные задачи

исследования:

В области поиска БАВ в Белгородской флоре:

• поиск источников растительных масел, содержащих (в составе триглицеридов) эссенциальные жирные кислоты, кислоты с конъюгированными двойными связями;

• поиск источников ксантофиллов: лютеина, зеаксантина, астаксантина и др.;

• поиск источников антоцианов и некоторых других фенольных соединений.

В области разработки хроматографических методов:

• разработка, обоснование и экспериментальное подтверждение основных положений метода относительного анализа удерживания (метод ОАУ) и основанных на этом методе новых аспектов инкрементного подхода для идентификации и предсказания строения компонентов сложных смесей;

• разработка обобщенных методов анализа и сопоставления свойств хроматографических систем, включая анализ механизмов удерживания в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ;

• практическое применение разработанных методов к исследованию хроматографического поведения и к идентификации компонентов смесей гидрофобных (триглицеридов и каротиноидов) и гидрофильных (антоцианов) сорбатов в экстрактах растительных материалов;

• моделирование хроматографических процессов по методу «теоретических тарелок» с целью установления особенностей применения инкрементного подхода при работе в условиях градиентного элюирования, а также для уточнения методов расчета эффективности систем с идеальными и асимметричными хроматографическими пиками.

Научная новизна. В работе впервые получены данные о накоплении ряда биологически активных соединений в большом числе объектов Белгородской флоры, включающие:

• данные о видовом составе триглицеридов более 200 масел семян растений семейств Caprifoliaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Lamiales, Pinacea, Ranunculaceae, Rosaceae, Umbelliferae, и др.;

• имеющие технологическое значение данные о накоплении диэфиров ксантофиллов в лепестках цветков бархатцев различных сортов, в плодах физалиса декоративного и в плодах ряда других растений;

• данные о качественном составе и количественном уровне накопления антоцианов в плодах нескольких десятков видов и сортов плодов и цветков растений Белгородской флоры.

Разработан и обоснован новый подход к исследованию удерживания веществ в ОФ ВЭЖХ – метод относительного анализа удерживания (ОАУ), применимый для любых подвижных и стационарных фаз. С использованием данного метода:

• сокращено до минимума (до данных в двух составах подвижных фаз) время, необходимое для построения карты сорбатов сложных смесей в полном диапазоне составов подвижных фаз; показана возможность первичной классификации сорбатов по их строению;

• обосновано сопоставление хроматографических систем, нахождение общих свойств и различий; показана возможность переноса аналитического вида соотношения относительного удерживания малополярных сорбатов с одних хроматографических систем на другие системы, включающие стационарные фазы аналогичного типа других производителей, но при условии использования подвижных фаз одной и той же элюентной системы.

• предложен метод определения и учета активности остаточных силанольных групп на удерживание полярных сорбатов; показана возможность нивелирования этих взаимодействий выбором полярного сорбата сравнения.

На основе метода ОАУ обоснованы новые аспекты применения инкрементного подхода.

• При анализе инкрементных соотношений для хроматографического поведения пары сорбатов в соответствие с данным подходом найдено, что при отсутствии таутомерных равновесий или иных изменений в строении веществ (при варьировании состава подвижной фазы) между инкрементом и удерживанием сорбата сравнения существует линейная взаимосвязь.

o Экспериментально показаны и теоретически обоснованы особенности инкрементых соотношений внутри гомологических рядов; с использованием различия координат точек конвергенции для различных гомологических рядов объяснены особенности инкрементных соотношений для псевдогомологов, - групп веществ с одинаковым последовательным изменением структуры, не являющихся гомологами.

• Теоретически предсказано и экспериментально подтверждено то, что при отсутствии внутримолекулярных взаимодействий справедлива линейность межинкрементных соотношений, позволяющая переносить закономерности, полученные для исследования троек производных одного базисного соединения, на аналогичные тройки производных другого базисного соединения.

Предложен новый подход к оценке механизмов удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, основанный на сопоставлении удерживания сорбатов в идентичных условиях (по составу подвижной фазы и температуре), но на стационарных фазах с различной длиной привитых углеводородных радикалов.

Предложен и экспериментально подтвержден новый подход к использованию и оценке логарифма коэффициента распределения вещества между 1-октанолом и водой (lgP или LOGP) с использованием данных обращенно-фазовой ВЭЖХ, который может служить первой экспертной системой для оценки надежности программных продуктов, предназначенных для расчета LOGР.

Использование в работе компьютерного моделирования по методу «теоретических тарелок», позволило показать, что при оценке инкрементных соотношений вместо логарифма фактора удерживания сорбатов может быть использовано время удерживания сорбатов в специальных выбранных градиентах по составу подвижной фазы. Предложены уточненные уравнения для расчета эффективности хроматографических систем в условиях ВЭЖХ и новый метод исследования уширения пиков, выявляющий особенности хроматографического поведения некоторых сорбатов при изменении составов подвижных фаз.

Практическая значимость. В практическом приложении метода ОАУ к исследованию хроматографического поведения ряда биологически активных веществ показано, что во-первых, прекрасно соблюдаются основные закономерности относительного удерживания. Разработанные методы позволили провести поиск и обнаружить богатые источники биологически активных веществ в растениях Белгородской флоры:

• масел семян растений, содержащих в том числе и радикалы конъюгированных жирных кислот, обладающие (в отличие от традиционных эссенциальных кислот) ярко выраженной антиканцерогенной активностью и способностью регулировать жировой обмен;

• антоцианов в плодах целого ряда растений, включая редко культивируемые смородину золотистую и смородину американскую. При этом установлено, что существуют важные особенности технологии изготовления готовых форм (не всегда учитываемые при, например, производстве препаратов на основе черники), приводящие к значительным потерям антоцианов;

предложены новые варианты технологий, сохраняющие эти вещества;

• каротиноидов (в том числе ксантофиллов), которые могут быть использованы в пищевом дизайне. Это позволило создать отечественную кормовую добавку для обогащения ксантофиллами желтка куриных яиц (разработка отмечена серебряной медалью на VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций, Москва, 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты определения биологически активных веществ в растениях Белгородской флоры.

2. Метод относительного анализа удерживания (метод ОАУ) сорбатов как альтернатива известным методам исследования удерживания сложных смесей сорбатов, включая • экстра термодинамическое обоснование метода, основанного на линейности соотношений свободных энергий;

• способ построения и анализа карты разделения.

3. Методы использования ОАУ в анализе параметров прямолинейных зависимостей: относительного удерживания пар веществ, инкрементных зависимостей пар веществ, межинкрементных соотношений троек веществ.

4. Метод использования ОАУ для сопоставления свойств различных хроматографических систем, включая гидрофобные характеристики стационарных фаз и активность остаточных силанольных групп (принципиально может быть использован для сопоставления любых иных свойств систем).

5. Новый метод, основанный на сопоставлении удерживания специально выбранных сорбатов в идентичных условиях (по составу подвижной фазы и температуре), но на стационарных фазах с различной длиной привитых углеводородных радикалов и различными характеристиками исходных силикагелевых матриц, для определения механизмов удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.

6. Способ использования ОАУ для учета или расчета логарифма коэффициента распределения вещества между 1-октанолом и водой в обращенно-фазовой ВЭЖХ в рамках карты разделения с добавлением новой точки, координаты которой определяются соответствующим значениям lgP.

Этот подход является единственной к настоящему времени экспертной системой для анализа расчетных значений ClogP.

7. Результаты компьютерного моделирования хроматографических процессов по варианту «теоретических тарелок», включающие, новый подход к оценке уширения хроматографических пиков, новое эмпирическое уравнение для расчета эффективности хроматографических систем в условиях нелинейных изотерм сорбции.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийских и международных конференциях и симпозиумах. Основные результаты изложены более чем в 100 статьях в научных журналах, из них 60 - в журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, восьми глав, заключения и Приложения. Объем работы составляет 318 страниц, в том числе: 147 рисунков, 49 таблиц и список литературы из 2наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Биологически активные вещества Белгородской флоры Растительные масла. Постоянный интерес к поиску новых источников растительных масел, входящих в число важнейших продуктов питания, объясняется несколькими причинами. Триглицериды, составляющие основу большинства растительных масел, важны не только как источники энергии, но и как источники эссенциальных (незаменимых) жирных кислот, используемых организмом для синтеза простагландинов. Как показали многочисленные исследования, в ряде случаев важным оказывается поступление в организм и жирных кислот, не относящихся к эссенциальным (типа -линоленовой).

Особое внимание в последнее время уделяется жирным кислотам с конъюгированными двойными связями, которые обладают ярко выраженным антиканцерогенным действием и способностью нормализовать жирнокислотный обмен в организме. В результате проведенных многолетних исследований установлен жирнокислотный состав большого числа масел семян растений Белгородской флоры (из семейств: Berberidaceae, Caprifoliaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Lamiales, Pinacea, Ranunculaceae, Rosaceae, Umbelliferae, и др.) а также некоторых растений, которые могут быть интродуцированы в этом регионе, например, Thladianta dubia, Momordica charantia – прекрасные источники конъюгированных жирных кислот в дополнение к традиционным источникам такого типа кислот, таких как масло косточек вишни, черешни и черемухи, валерианы и календулы. Однако, в работе указывается, что результаты были получены хроматографическим методом после разработки новых методов обработки данных, изложенных в теоретических главах представленной работы.

Исследования также показали, что метод ОФ ВЭЖХ для исследования триглицеридного состава масел имеет ряд преимуществ перед официальным методом, включающим превращение триглицеридов в метиловые эфиры жирных кислот с их последующим определением методом газовой хроматографии. Показано, что не всегда такая пробоподготовка не затрагивает собственно жирные кислоты, особенно в случае высоко лабильных конъюгированных жирных кислот. Показано также, что официальный метод не учитывает специфичность распределения жирных кислот по радикалам, поэтому не чувствителен к целому ряду фальсификаций. Кроме того, как было установлено в процессе 5-ти летних исследований масел, хроматографический профиль масел (число пиков, их относительное расположение на хроматограмме и соотношение высот или площадей) лишь незначительно изменяется при изменении хроматографических условий. Это позволяет ввести в практику исследований метод «отпечатков пальцев» в варианте ОФ ВЭЖХ.

Так по методу отпечатков пальцев можно утверждать, что в подсолнечных маслах, хроматограммы которых представлены на рис. 1.1, нет добавок оливкового масла, а различия в профилях связаны с использованием различных сортов подсолнечника, в массе семян одного из которых накапливается повышенное количество радикалов олеиновой кислоты. При этом официальный метод анализа не позволит отклонить версию о добавках в подсолнечное масло оливкового. На рис.1.2 приведены хроматограммы типичного коровьего масла, профиль которого практически не зависит от страны производителя, и пальмового масла. При этом очевидно, что фальсификат сливочного масла, для которого также приведена хроматограмма, является лишь немногим модифицированным пальмовым маслом. Следует отметить, что такая фальсификации не таит угрозы здоровью, поскольку замена маргарина абсолютно безвредным пальмовым маслом является общемировой тенденцией последних лет.

Наконец, простой анализ хроматографического профиля шести масел под названием «облепиховые», приобретенных в аптеках г. Белгорода, который выполняется по присутствию или отсутствию специфичных для этого объекта триглицеридов, показал, что три из этих масел не имеют отношения к Hippophaё rhamnoides, а являются раствором -каротина в подсолнечном масле.

mV Л3 Л2О mV Л2П 2А 110 Б В 0 5 мин 0 2 4 6 мин Рис.1.1. Хроматограммы подсолнечного Рис.1.2. Хроматограммы некоторых масел и масла различных марок фальсификата Сорта масел: 1 – Урожай солнца; 2 – Идеал; 3 – А – сливочное масло; Б – фальсификат сливочного масла; В – пальмовое масло. Колонка 2504 мм;

Слобода; 4 – Алтеро; 5 – Риф. Колонка 2504 мм;

Диасфер-110-С18, 5 мкм, 10 об. % ацетонитрила в Диасфер-110-С18, 5 мкм; элюент 100% ацетон, ацетоне; 1 мл мин, детектор RI 401.

скорость подачи элюента 1 мл/мин; детектор RI 401.

Антоцианы. Этот класс соединений был выбран по двум причинам.

Во-первых, антоцианы во всем мире рассматриваются в настоящее время как потенциальные колоранты для пищевой и медицинской промышленности.

Они, как показали многочисленные исследования последних лет, обладают высокой и разнообразной биологической активностью – от антиоксидантной до антиканцерогенной. Доклад ВВС Великобритании1 времен Второй мировой войны, в котором сообщалось о положительном влиянии черничного варенья на адаптацию зрительного аппарата к низкой освещенности ночного пространства во время традиционных ночных бомбардировок территории Германии, в конечном итоге привел к появлению на прилавках аптек большого числа препаратов на основе черники. Обнаружение так называемого «французского парадокса»2 - снижения вероятности заболеваний сердечно-сосудистой системы при культуре регулярного умеренного потребления сухого красного вина (как богатого источника именно антоцианов) усилило интерес исследователей к антоцианам. В то же время, несмотря на очевидную ограниченность в производстве винограда для регионов России, Белгородский регион позволяет культивировать альтернативные растения с интенсивной черно-красной окраской, являющейся признаком накопления этих соединений.

Muth E.R., Laurent J.M., Jasper P. // Altern. Med. Rev. 2000. v.5. P. 164-1 Renaud S., Delorgeril M. // Lancet i. 1992. P. 1523-15Во-вторых, антоцианы интересны как объекты для хроматографии как высокополярные соединения, присутствующие, как правило, также в виде комплексов различной сложности. Различие строения антоцианов может быть связанным как с изменением строения агликонов, так и с изменением состава гликозидных радикалов, с числом и положением гликозилирования.

Результаты исследований источников антоцианов среди растений Белгородской флоры, выполненные спектрофотометрическим методом и методами ОФ ВЭЖХ после разработки новой технологии анализа хроматографических данных, приведены в табл.1.1.

Таблица 1.1 – Антоцианы плодов растений, выращенных в Белгороде № Плоды растения Основные антоцианы *, мг/100 г 1 Amelanchier ovalia Cy-3-Gala, Cy-3-Ara, Cy-3-Glu 150-22 Aronia melanocarpa Cy-3-Gala, Cy-3-Ara, Cy-3-Glu 500-63 Berberis vulgaris Pg-3-Glu, Cy-3-Glu 20-4 Cerasus vulgaris (кожура) Cy-3-2GluRut, Cy-3-Rut, Cy-3-Sopho 5 Cerasus avium Cy-3-Rut, Cy-3-Glu 200-26 Fragaria ananassa Pg-3-Sopho, Cy-3-Glu 20-7 Lonicera caerulea (суш.) Cy-3-Glu, Cy-3-Rut 750-98 Mahonia aquifolia (Dp, Cy, Pt, Pn и Mv)-3-Glu и -3-Rut 160-49 Malus domestica (кожура) Cy-3-Gala 10 Morua alba (черноплодн.) Cy-3-Glu, Cy-3-Rut 120-111 Prunus domestica (кожура) Cy-3-Rut, Cy-3-Glu, Pn-3-Rut, Pn-3-Glu 600-812 Ribes nigrum 150-3Dp-3-Rut, Cy-3-Rut, Dp-3-Glu, Cy-3-Glu 13 R. nigrum (суш. кожура) 900-1614 R. americanum Cy-3-Rut, Cy-3-Glu, Dp-3-Rut, Dp-3-Glu 280-615 R. americanum (суш. кожура) Cy-3-Rut, Cy-3-Glu, Dp-3-Rut, Dp-3-Glu 3500-5516 R. rubrum (разл. гибриды) Cy-3-2GluRut, Cy-3-Rut, Cy-3-2XylRut 20-217 R. aureum Cy-3-Rut, Cy-3-Glu 18 Rubus idaeus Cy-3-Glu 20-19 R. nessensis Cy-3-Rut 80-120 Sambucus nigrum Cy-3-Sam, Cy-3-Glu 620-821 S. canadensis Cy-3-(Cum)Sam-5-Glu 750-822 Solanum nigrum Pr-3-(Cum)Rut-5-Glu 200-323 Viburnum opulus Cy-3-(Ara)Glu, Cy-3-Glu, Cy-3-Rut 22-*- в пересчете на цианидина-3-глюкозид Прекрасным источником антоцианов является широко распространенная в Белгородской области смородина черная: плоды растения окрашены благодаря 3-рутинозидам и 3-гликозидам цианидина и дельфинидина. Важно, что в плодах большинства сортов антоцианы сосредоточены в кожуре плодов, что позволяет разрабатывать технологии комплексной переработки плодов этого растения, поскольку из отделенных семян можно извлекать ценное жирное масло, в состав которого входит довольно редкая в растительном мире, но важная в биологическом отношении эссенциальная -линоленовая кислота.

В плодах смородины американской, выращиваемой в Ботаническом саду БелГУ, содержание антоцианов почти вдвое выше, чем в R. nigrum. Даже превосходят черную смородину по содержанию антоцианов плоды аронии черноплодной и, особенно, бузины обыкновенной и американской. А паслен садовый, накапливающий большое количество ацилированных производных петунидина, позволяет даже машинный сбор готовой продукции.

Каротиноиды. Из этого класса соединений до недавнего времени особым вниманием пользовался только -каротин. Но в настоящее время пристальное внимание уделяется некоторым ксантофиллам – лютеину и зеаксантину, нехватка которых отвечает за возрастную потерю зрения; а также астаксантину.

Каротиноиды представляют особый интерес для хроматографических исследований как соединения, в которых возможно варьирование структуры двух концевых групп при большом разнообразии их строения и практически исключенном внутримолекулярном взаимодействии.

Итогом исследований по поиску источников указанных ксантофиллов стал выбор наилучших сортов бархатцев и Physalis alkekengi для создания кормовой добавки (совместно со специалистами медицинского факультета), сбалансированной по соотношению лютеин – зеаксантин. Эта кормовая добавка предназначена для птицеводства – для получения куриных яиц с повышенным содержанием ксантофиллов в желтке. Как отмечалось ранее эта добавка отмечена серебряной медалью на VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций, Москва, 2008 г.

Глава 2. Обращенно-фазовая ВЭЖХ: Зависимость удерживания от состава подвижной фазы Особый интерес в хроматографии представляют закономерности типа «удерживание – состав подвижной фазы». В случае двухкомпонентных водноорганических подвижных фаз удерживание сорбата А при изменении концентрации органического модификатора подчиняется простому эмпирическому соотношению3:

lg k(A) = lg k(A)w - S (2.1) где lgk(A) – логарифм фактора удерживания сорбата А, lgk(A) – логарифм w фактора удерживания сорбата А в чисто водном элюенте; S – константа для данной хроматографической системы, Ф – объемная доля органического модификатора.

Использование полуэмпирической теории параметра растворимости позволило предсказать несколько более сложную – квадратическую зависимость удерживания от состава подвижной фазы4:

lg k(A) = a + b + c , (2.2) где константа b – отрицательное число, по модулю превосходящее положительную константу с. Впрочем, известны также варианты более сложных разложений суммарного удерживания по степеням 5.

Пусть удерживание сорбата А в обращенно-фазовой хроматографии определяется его распределением между двумя несмешивающимися фазами:

µ (A, sp) = µ (A, mp) Snyder L.R., Dolan J.W., Gant J.R. // J. Chromatogr. 1979. v.165. P. 3-30.

Schoenmakers P.J., Billet H.A.H., Tijssen R., de Galan L. // J. Chromatogr. 1978. v.149. P. 519-537.

Schoenmakers P.J., Billet H.A.H., de Galan L. // J. Chromatogr. 1981. v.218. P. 261-284.

Для любого элементарного участка хроматографической системы в любое время от ввода пробы фактор удерживания сорбата А равен соотношению его количеств, N (A), находящихся в стационарной (sp) и подвижной (mp) фазах:

i N(A, sp) k(A) =.

N(A,mp) N(mp) N(sp) Если и - полные количества моль веществ подвижной и стационарной фаз, то не только на элементарных участках перемещающейся зоны сорбата, но и во всей колонке вследствие пропорциональности данного отношения справедливо:

N(A, sp) X (A, sp) N(sp) k(A) = = , (2.3) N(A,mp) X (A,mp) N(mp) где X – мольные доли сорбата А в стационарной и подвижной фазах, соответственно. Соотношение (2.3) может быть преобразовано:

X (A, sp) N(sp) N(sp) k(A) = = KTh (A) . (2.4) X (A,mp) N(mp) N(mp) В этом выражении фактор удерживания вещества А связан с термодинамической константой распределения сорбата А выражением, которое можно назвать мольным соотношением колонки. При изменении состава подвижной фазы могут изменяться как термодинамическая константа, так и мольное соотношение колонки. И если изменение термодинамической константы с изменением состава подвижной фазы очевидно и не отрицается ни в одной из работ, то относительно мольного соотношения в уравнении (2.4) в литературе приняты едва ли обоснованные упрощения. Так в большинстве работ вместо мольного соотношения используют фазовое соотношение, :

V (sp) k(A) = K(A) = K(A) . (2.5) V (mp) где К(А) – «константа» равновесия, выраженная через мольные концентрации сорбата в обеих фазах. Но такая замена может быть действительно оправданной при исследовании удерживания различных веществ в одной и той же хроматографической системе - т.е. на одной и той же стационарной фазе и в одном и том же составе подвижной фазы (в этом случае =const).

Следовательно, в нелинейность зависимости удерживания сорбата от мольной доли органического модификатора может вносить вклад и не термодинамическая составляющая - нелинейность изменения количества моль стационарной фазы. Это говорит о большой сложности теоретического объяснения зависимости «удерживание - состав».

Для элюентов системы ацетонитрил – вода зависимости логарифмов факторов удерживания ряда сорбатов от объемной доли ацетонитрила очевидно нелинейны, рис.2.1. Перейдем к новому аргументу, квадратично связанному с предыдущим:

f ( ) = + q , где q – параметр, позволяющий линеаризовать зависимость «удерживание – состав подвижной фазы», рис.2.2.

0,п-нитробензол lgk(i) lgk(i) бензальдегид п-фторфенол фенол 0,6 f() 0 0 0,2 0,0 0,0, Рис.2.1. Зависимость логарифма фактора Рис.2.2. Зависимость логарифма фактора удерживания сорбатов от объемной доли удерживания сорбатов от ацетонитрила в подвижной фазе модифицированной функции объемной доли ацетонитрила в подвижной фазе Следует обратить внимание на то, что уравнение (2.2) часто используется для экстраполяции удерживания на чисто водные элюенты6. Однако линии трендов, во-первых, по квадратичной зависимости более чувствительны к погрешностям определения времен удерживания сорбатов (особенно на краях используемого диапазона) по сравнению с прямолинейной зависимостью. Вовторых, не термодинамический вклад (мольного соотношения колонки) только приближенно описывается квадратичной зависимостью. Поэтому надежность получаемых данных в лучшем случае не очевидна.

Глава 3. Метод относительного анализа удерживания Вместо исследования зависимостей «удерживание – состав подвижной фазы», анализ которых осложнен множеством трудноразрешимых проблем, может быть исследована принципиально иная зависимость, не включающая в явном виде состав подвижной фазы. Если ввести некоторую функцию состава подвижной фазы f(Ф), при которой для некоторого сорбата A базиса нелинейные соотношения lnk(A) vs Ф заменяются линейным соотношением lnk(A) vs f(Ф):

ln k(A) = p(A) + q(A) f ( ) (3.1) то линеаризация соответствующих соотношений выполняется и для всех остальных cорбатов исследуемого базиса (см. рис.2.2). Для сорбата B:

ln k(B) = p(B) + q(B) f ( ) (3.2) Тогда, исключая f(Ф) из уравнений (3.1) и (3.2), получаем основное соотношение метода относительного анализа удерживания:

ln k(B) = a(A, B) + b(A, B)ln k(A). (3.3) Для построения указанных зависимостей необходимо определить факторы удерживания набора (i) веществ для нескольких различных составов подвижных фаз избранной системы. Каждая точка на графике относительного удерживания строится по логарифму фактора удерживания вещества сравнения Kaliszan R. et al // J. Chromatogr. A., 1999. v.855. P. 455-486.

(А), lnk(A), - абсцисса точки, и по логарифму фактора удерживания вещества i, lnk(i) – ордината точки. Затем через точки для каждого вещества i, полученные для различных составов подвижных фаз, проводят линию – обычно прямую, рис.3.1 и табл.3.1.

Таблица 3.1. Сопоставление удерживания бензола и толуола в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ в элюентах системы метанол – вода Логарифмы факторов удерживания сорбатов № Объемная экспериментальные данные расчетные* точки на доля Отклонение lgk(бензол) lgk(толуол) рис.3.1 СН3ОН lgk(толуол) x y 1 0.5 0.815 1.153 1.152 -0.02 0.6 0.568 0.863 0.862 -0.03 0.7 0.233 0.464 0.470 0.04 0.8 -0.040 0.152 0.149 -0.0• - по уравнению прямой линии на рис.3.1.

Известно, что в случае обращенно-фазовой хроматографии заметный вклад в удерживание полярных соединений могут вносить их взаимодействия с остаточными силанольными группами неподвижной фазы. Но как показывает анализ экспериментальных данных, полученных разными авторами, это не сказывается на линейности соотношения относительного удерживания.

Для сорбатов с крутой зависимостью фактора удерживания от состава подвижной фазы таких, как (-)эпигаллокатехингаллат (EGCG) и (-)эпикатехингаллат (ECG)7, небольшие погрешности в приготовлении подвижных фаз могут сказаться на виде таких зависимостей, рис.3.3; однако в координатах метода ОАУ линейность сохраняется.

СH3CN ТГФ 0,0,-0,5 0,lgk(бензол) 0 0,5 -0,lgk(бензол) Рис.3.1. Удерживание толуола относительно Рис.3.2. Удерживание толуола относительно бензола бензола для различных модификаторов водно1,2, 3, 4 – номера точек из табл.2.1.

органических подвижных фаз Шафигулин Р.В., Буланова А.В., Ро К.Х. // Сорбционные и хроматографические процессы.

2006. т.6(5). С. 844-8lg k lgk (толуол) ( толуол ) lgk(ECG) Ф 0,0.30 0,lgk(EGCG) 0.15 Рис.3.3. Сопоставление удерживания некоторых компонентов экстракта зеленого чая в элюентах системы метанол – вода Известно, что проблема определения мертвого объема (или мертвого времени, t ) сложна и не определены даже однозначные подходы для ее решения. Неточности в определении мертвого объема приведут к погрешностям расчета логарифмов факторов удерживания. Пусть известно точное мертвое время (2 мин) тогда можно исследовать, как изменятся результаты расчетов при 5 %-ной ошибке в определении t. Как видно из представленных в табл.3.2 данных, только при положительных значениях lgk соблюдается линейность между истинным и расчетным значениями этой характеристики. Т.е., для построения надежных зависимостей относительного удерживания следует использовать только точки, построенные по неотрицательным значениям lgk.

В обращенно-фазовой хроматографии удерживание веществ зависит, в том числе, и от остаточных силанольных групп и от типа модификации сорбента (end-capping или embedding). По этой причине характер относительного удерживания пар веществ в нормально-фазовой хроматографии также представляет интерес.

Таблица 3.2. Влияние погрешностей определения t на значения lgk t0 = 2.0 мин t0 = 2.1 мин t0 = 1.9 мин tR, мин k lgk lgk lgk* lg lgk lgk* lg 10.0 4.00 0.602 0.575 0.575 <0.001 0.630 0.630 <0.08.0 3.00 0.477 0.449 0.448 <0.001 0.507 0.507 <0.06.0 2.00 0.301 0.269 0.269 <0.001 0.334 0.334 <0.04.0 1.00 0.000 -0.040 -0.04 0.007 0.043 0.038 -0.03.8 0.90 -0.050 -0.090 -0.08 0.008 0.000 -0.010 -0.03.5 0.75 -0.120 -0.180 -0.16 0.012 -0.070 -0.090 -0.03.0 0.50 -0.300 -0.370 -0.34 0.025 -0.240 -0.260 -0.02.5 0.25 -0.600 -0.720 -0.65 0.071 -0.500 -0.550 -0.0*- расчетные данные по уравнению прямой линии, проведенной через точки с положительными значениями lgk.

Пересчет данных, представленных в работе8, рис.3.4, где использованы только данные с факторами емкости больше единицы, подтверждает общий характер линейности относительного удерживания.

lgk(i) эвгенол А Б Этилацетат+Гк т 0,2-нафтол Диоксан+Гк lgk(фенол) 0,Рис.3.4. Удерживание сорбатов относительно фенола (НФ: Силасорб 600) Для выявления взаимозависимости между линейным соотношением величин удерживания в хроматографии и термодинамическими характеристиками распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами воспользуемся простейшей моделью. В условиях изократического элюирования при некотором составе подвижной фазы при предположении о равновесном распределении вещества i между неподвижной (sp) и подвижной (mp) фазами химические потенциалы вещества i в обеих фазах равны:

µ (i, sp) = µ (i,mp).

Коэффициент распределения вещества i равен отношению активностей сорбата i в обеих фазах.

a(i, sp) X (i, sp) 0 0 RT ln KTh (i) = RT ln = RT ln = µ (i, mp) - µ (i, sp) = µ (i), a(i, mp) X (i,mp) где - стандартные значения химических потенциалов, X - мольные доли µ вещества i в соответствующих фазах. Такое соотношение получено c учетом равенства единице коэффициентов активности сорбата i в обеих фазах, см.гл.1.

Все термодинамические параметры, включая свободную энергию сольватации сорбата А в обеих фазах, при этом входят в стандартные изменения химических потенциалов; для одного сорбата, А:

X (A, sp) RT ln KTh (A) = RT ln = µ (A).

X (A, mp) Для другого сорбата, В:

X (B, sp) RT ln KTh (B) = RT ln = µ (B).

X (B, mp) Рудаков О.Б., Седишев И.П., Рудакова Л.В. // Конденсированные среды и межфазные границы. 2003.

т.5. №3. С. 311-317.

Распространяя идею о линейном соотношении свободных энергий на изменения µ (i) при варьировании состава подвижной фазы, предположим соотношение:

0 µ (B) = a + b µ (A), откуда получается соотношение:

a ln KTh (B) = + b ln KTh (A). (3.4) RT Полученное соотношение можно считать термодинамическим обоснованием линейности по соотношению lnK (B) vs lnK (A). Однако Th Th KTh (A) k(A) коэффициент распределения вещества ( ) и фактор емкости ( ) не эквивалентны:

N(mp) ln KTh (i) = ln k(i) + ln. (3.5) N(sp) Подставляя выражения типа (3.5) для сорбатов А и В в уравнение (3.4), получаем:

a N(mp) ln k(B) = + b ln k(A) + (b - 1) ln. (3.6) RT N(sp) Следовательно, на пути использования идеи о линейном соотношении свободных энергий для объяснения экспериментально подтвержденной линейности по соотношению lnK (B) vs lnK (A) существует единственная Th Th преграда – последний член уравнения (3.6).

К сожалению, как отмечалось ранее, строгих методов расчета мольного соотношения в настоящее время не существует. В случае водно-органических подвижных фаз, следует учитывать, что вода является сильно ассоциированным растворителем. По этой причине, учет числа моль отдельных молекул и ассоциатов воды да еще и в присутствии органического модификатора составляет самостоятельную проблему. Однако при предположении о пропорциональности между указанной «добавкой» и факторами удерживания исследуемых веществ:

N(mp) ln k(A) = a'+ b' ln, (3.7) N(sp) исключением мольного соотношения, из уравнений (3.6) и (3.7), получаем линейное соотношение между факторами удерживания:

a* ln k(B) = + b* ln k(A), (3.8) RT где множители а* и b*, могут (если a’ и b’ не раны нулю) отличаться от множителей а и b в уравнении (3.6) при существовании указанной пропорциональности. Соотношение (3.7) не лишено основания, поскольку, например, при увеличении степени покрытия сорбента октадецилсилановыми лигандами на начальном участке графика “удерживание vs степень покрытия сорбента” (т.е. при увеличении числа моль стационарной фазы) логарифмы факторов удерживания ряда веществ также линейно увеличиваются9.

Engelhardt H., Jundheim M. // Chromatographia. 1990. v.29. P. 59-68.

Уравнение (3.8) является базовым уравнением относительного удерживания. Вычитая из обеих частей уравнения (3.8) логарифм фактора удерживания сорбата А, получаем уравнение (3.9), лежащее в основе относительного инкрементного анализа:

a*. (3.9) (A B) = ln k(B) - ln k(A) = + (b* - 1) ln k(A) RT Наконец, базисное уравнение для анализа межинкрементных соотношений:

(A B) = p + q (A C), (3.10) где термодинамический инкремент определяется как разность логарифмов коэффициентов распределения веществ между фазами:

(X Y ) = ln KTh (Y ) - ln KTh (X ) ;

уравнение (3.10) без оговорок справедливо для хроматографических параметров, поскольку мольные соотношения сокращаются:

N(mp) N(mp) (X Y ) = ln k(Y ) + ln - ln k(X ) - ln = ln k(Y ) - ln k(X ).

N(sp) N(sp) Отметим, что существует еще одна особенность применения метода ОАУ, принципиально важная для сопоставления данных полученных в различных условиях. Она связана с необходимостью использования при любых расчетах так называемого мертвого времени, являющегося одной из важных проблем хроматографии. В работе подробно обсуждается этот вопрос и отмечается, что определение точного мертвого времени экспериментально в общем случае, строго говоря, мало вероятно по различным причинам. Поэтому приходится довольствоваться некоторым простым методом, учитывая, что погрешности в определении факторов емкости практически неизбежны. Метод относительного анализа удерживания позволяет в значительной мере уменьшить влияние этих погрешностей на конечный результат.

В табл.3.3 представлены (кажущиеся) значения логарифмов факторов удерживания бензола, толуола и о-ксилола, рассчитанные с использованием мертвого времени, определенного по удерживанию нитрита натрия (для наглядности будем считать их истинными) и с 5%-ными погрешностями как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения этого параметра.

Таблица 3.3. Параметры удерживания бензола, толуола и о-ксилола Об. % Логарифмы факторов удерживания веществ при t0, мин СH3CN в Бензол Толуол о-Ксилол элюенте 1.62 1.80 1.98 1.62 1.80 1.98 1.62 1.80 1.80 0.105 0.064 0.024 0.247 0.211 0.176 0.365 0.332 0.370 0.298 0.264 0.231 0.463 0.433 0.403 0.599 0.571 0.560 0.513 0.484 0.455 0.704 0.677 0.651 0.860 0.835 0.850 0.740 0.713 0.688 0.966 0.941 0.917 1.15 1.126 1.1Колонка: 2504 мм, Диасфер-110-С18, 6 мкм При традиционном графическом представлении результатов различие в положении точек на графике lgk vs (где - объемная доля ацетонитрила в ацетонитрил - водных элюентах) в зависимости от использованного значения t M достаточно заметно, рис.3.5.

0,0,0,0 0,4 0,0,4 0,6 0,8 lgk(толуол) Рис.3.5. Зависимость логарифмов факторов Рис. 3.6 Зависимость относительного удерживания бензола от величины удерживания пары о-ксилол – толуол использованного значения t M Разность параметров удерживания на границе этого интервала, lgk, можно рассматривать как возможную «погрешность», связанную с неточностью определения t. Она возрастает для малых времен удерживания, M но и при относительно больших временах удерживания, она оценивается в лучшем случае величиной 0.050 логарифмических единиц. Нетрудно подсчитать, что при этом неопределенность в обратном пересчете на времена удерживания равна примерно 10 % для всего диапазона времен удерживания, т.е. t = 3.0 ± 0.3 мин; 10.0 ± 1.0 мин и т.д. Но применение метода анализа R относительного удерживания при этих же условиях существенно нивелирует указанные различия, рис.3.6.

Все точки с координатами по данным, приведенным в табл.3.3, располагаются около одной прямой (R2 > 0.99995 во всех трех случаях):

lgk(о-ксилол) = 0.1015 + 1.0873·lgk(толуол) (при t = 1.80 мин), (3.11) M lgk(о-ксилол) = 0.1085 + 1.0826·lgk(толуол) (при t = 1.62 мин), M lgk(о-ксилол) = 0.0944 + 1.0917·lgk(толуол) (при t = 1.98 мин).

M А общее уравнение для объединенного базиса данных:

lgk(о-ксилол) = 0.1021 + 1.0858·lgk(толуол) позволяет определять параметры удерживания с надежностью почти на порядок выше, чем по традиционному подходу. В диапазоне логарифмов фактора удерживания толуола (0 – 1 ед.) различие расчетных факторов удерживания о-ксилола при 10%-ной погрешности определения мертвого времени не превышает 0.007 ед. при погрешности определения собственно параметра удерживания порядка 0.002 единиц.

Если мольное соотношение в уравнении (2.5) для другой колонки будет вдвое больше, чем для первой, то относительное удерживание будет описываться другим уравнением:

lgk(о-ксилол) = 0.0753 + 1.0873·lgk(толуол) (при V = 1.80 мл), (3.12) lg k lg k (бензол) ( оксилол) Абсолютные значения кажущихся факторов емкости одного и того же вещества будут различаться уже на 0.300 единиц, что соответствует увеличению времени удерживания о-ксилола на 8 мин при t = 10 мин на R первой колонке. Но, сравнивая уравнения (3.11) и (3.12) можно убедиться в том, что различие составляет лишь 0.026 (т.е. примерно 0.40 мин). В действительности это различие не столь значительно для различных стационарных фаз, поэтому, линия тренда, рассчитанная по данным10, рис.3.6, по удерживанию пары толуол – о-ксилол для фазы ZorbaxSil ODS практически неотличима от уравнения (3.11).

Карта разделения многокомпонентных смесей сорбатов. В реальной хроматографической практике часто приходится сталкиваться со сложными смесями, в которых при изменении состава подвижных фаз происходит инверсия удерживания некоторых пар веществ. Это создает определенные трудности при исследовании многокомпонентных систем по традиционным методам представления результатов в координатах «свойство элюента - удерживание сорбатов» вследствие нелинейности данной зависимости. Метод ОАУ позволяет легко решать такие вопросы построением карты разделения.

Для составления карты разделения достаточно записать хроматограммы в двух составах элюентов (на границах приемлемого диапазона), и соединить соответствующие точки прямыми линиями, рис.3.7. Затем можно добавить группу точек посредине выбранного диапазона - для контроля правильности нанесения точек из первых двух серий, или для контроля грубых погрешностей определения координат первой пары точек.

На рис.3.7 имеются несколько инверсий порядка элюирования, но они легко предсказываются и не могут осложнить анализ сложной смеси.

При построении карты разделения сложной смеси нет даже необходимости знания строения веществ. Наоборот, по характеру хроматографического поведения можно проводить классификацию компонентов смеси. Например, при исследовании ацетоновых экстрактов семян наголоватки все компоненты смеси разделились на две группы веществ: одна группа содержала вещества, по изменению удерживания, аналогичные триглицеридам (пунктирные прямые линии на рис. 3.8), а во второй (главной) группе содержались вещества, напоминающие по характеру изменения удерживания сквален (сплошные линии).

В случае антоцианов – 3-гликозидов цианидина тангенсы углов наклона линий трендов по уравнению:

lgk(i) = a + blgk(Glu) для моногликозидов (рис.3.9, табл.3.4), 3-дигликозидов и 3–тригликозидов заметно различаются, что позволяет проводить предварительную дифференциацию антоцианов по числу гликозидных фрагментов в 3положении молекулы.

Шатц В.Д, Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. – Рига: Зинатне. – 1988. – 390 с.

о-ксилол Л2О Лlgk(i) пропилбензоат толуол этил(р-нитробензоат) этил(фенилбензоат) этилбензоат 0,этил(р-гидроксибензоат) 0,lgk(Л3) lgk(бензол) 0 0,Рис.3.7. Удерживание некоторых веществ 3.8. Карта разделения компонентов относительно бензола ацетонового экстракта семян Urinea sp.

Колонка: 2504 мм Кромасил С18; элюенты системы Л О – дилинолеат-олеат глицерола; Л – 2 СH CN – H O. трилинолеат глицерола 3 Сопоставление карт разделения для различных стационарных фаз.

Исследования, выполненные в данной работе, показали, что относительное удерживание малополярных веществ практически совпадает для ряда стационарных фаз. Это очень важное свойство относительного удерживания, поскольку абсолютные значения параметров удерживания могут различаются не только для однотипных стационарных фаз различных производителей, но и для различных партий сорбентов одного и того же производителя.

Таблица 3.4. Удерживание Cy-3-Gly относительно Сy-3-Glu 3-гликозид a b sr*, (n=7) Gala Галактозид -0.093 0.937 0.00Ara Арабинозид 0.145 0.948 0.00Rut Рутинозид 0.064 1.144 0.00Sam Самбубиозид -0.071 1.087 0.00Sopho Софорозид -0.218 1.053 0.002GRut 2’-глюкозилрутинозид -0.235 1.248 0.002XRut – 2’-ксилозилрутинозид -0.057 1.226 0.00• - среднеквадратичное отклонение.

Пусть уравнение удерживания сорбатов А и В для некоторой стационарной фазы (1) записывается в соответствие с уравнениями:

ln k1(A) = p1(A) + q1(A) f ( ), ln k1(B) = p1(B) + q1(B) f ( ).

ln k1(B) = a1(A, B) + b1(A, B) ln k1(A). (3.13) Пусть другая стационарная фаза (2) химически отличима от стационарной фазы (1), но это отличие может быть описано простым масштабированием коэффициентов q(i) (введением множителя k):

ln k2 (A) = p2 (A) + k q1(A) f ( ), ln k2 (B) = p2 (B) + k q1(B) f ( ).

lg k ( i) q1(B) q1(B) ln k2 (B) = ln k2 (A) + p2 (B) - p2 (A).

q1(A) q1(A) ln k2 (B) = a2 (A, B) + b1(A, B)ln k2 (A). (3.14) 0.0.-0.0.1 0.3 0.logk(Glu) Рис.3.9. Зависимость удерживания глюкозидов цианидина (i) от удерживания Cy-3-Glu 1 – Cy-3Ara; 2 – Cy-3Gala; 3 – Cy-3Rut; 4 – Cy-3Sam; 5 – Cy-3Sopho; 6 – Cy-32XRut; 7 – Cy-32GRut.

В уравнениях (3.13) и (3.14) одинаковы углы наклона прямолинейных зависимостей, следовательно, возможность масштабирования коэффициентов распределения сорбатов эквивалентна изменению мольного соотношения колонки.

Рассмотрим данные для удерживания этилбензола относительно толуола для 41 стационарной фазы различных фирм производителей, представленные в Standart Reference Material87011, в элюенте, предложенном для стандартизации хроматографических колонок. При этом получается практически идеальная линейная зависимость для всех без исключения стационарных фаз, рис.3.10, даже несмотря на включение в базис данных с отрицательными значениями логарифмов факторов удерживания сорбатов.

Уравнение этой зависимости (P=0.95, n=41, R2 = 0.9977) имеет вид:

lg k(ethylbenzene) = 0.1416 ± 0.0037 + (1.0393 ± 0.0162)lg k(toluene).

Важно также то, что все точки с положительными значениями координат (из рассмотренного базиса данных) хорошо укладываются на прямую линию относительного удерживания этилбензола относительно толуола, построенную для метанол – водных элюентов из работы3, рис.3.11. Впрочем, через эти точки можно провести другую линию тренда, несколько отличающуюся от первой. Ее появление может быть связано (в том числе и) с особенностями определения «мертвого» времени. В стандарте США в качестве метчика “мертвого” объема Certificate of Analysis. SRM 870, Column Performance Test Mixture for Liquid Chromatography, National Institute of Standards and Techology, Gaithersburg. MD. 2000.

) (i k og l рекомендуется урацил, а в работе3 использовано “унифицированное” для всех составов подвижных фаз время 125 с; при увеличении этого времени на 7 % все точки на графике (рис.3.13, пунктирная линия) совпадают в пределах 0.0логарифмических единиц. Кстати, вследствие возможного влияния на удерживание остаточных силанольных групп корректность использования урацила как универсального метчика мертвого объема проблематична.

Следовательно, полученная линия тренда является хорошим приближением для всех использованных колонок даже, несмотря на то, что приведенном выше сопоставлении не учитывалось возможное различие в мольных соотношениях колонок.

lgk(толуол) 0,-1 -0, -0,0,-0,0 0,4 0,8 lgk(толуол) Рис.3.10. Удерживание этилбензола Рис.3.11. Удерживание этилбензола относительно толуола относительно толуола Данные для 41 стационарной фазы в элюенте 80 % - данные работы3, - данные стандартаметанола и 20 % фосфатного буфера (рН = 7)Полученные результаты позволяют сделать два важных вывода:

а) изменение мольных отношений для реальных хроматографических колонок не приводит в ряде случаев к существенным искажениям относительного удерживания по крайней мере для малополярных соединений и использованных в цитированных работах стационарных фаз;

б) при строгом анализе следует сравнивать между собой данные, полученные с использованием одинакового метода определения t.

M В подтверждение примерной общности линий трендов для относительного удерживания малополярных соединений рассмотрим данные по удерживанию этилбензоата и гексилбензоата относительно бензола, полученные на стационарных фазах Кромасил-130-С18 и Диасфер-110-Сстандартного размера колонок (2504 мм) и микроколонок (Диасфер-110-С18, 802 мм). Общность соответствующих линий тренда была очевидной, но удивительно то, что данные по удерживанию этилбензола, полученные для принципиально иного типа обращенной фазы – С8, оказались на линии тренда для С18 фаз.

В таком случае уравнения относительного удерживания пар веществ, полученные на одной колонке, могут быть перенесены на другую. В подтверждение данного тезиса была исследована зависимость удерживания нlg k lg k (этилбензол) ( этилбензол ) пропил- и н-бутилбензоатов относительно этилбензоата на колонке размером 2504 мм с сорбентом Диасфер-110-С18:

lg k(пропилбензоат) = - 0.1065 + 0.9810 lg k(этилбензоат), lg k(бутилбензоат) = 0.0246 + 1.0736 lg k(этилбензоат).

С использованием этих уравнений по экспериментально определенному удерживанию этилбензоата в условиях микроколоночной хроматографии на колонке 1202 мм с сорбентом Сепарон SGX С18 рассчитано удерживание пропил- и бутилбензоата - в элюенте с объемным соотношением ацетонитрил – вода 20:3 и пропилбензоата при соотношении растворителей 20:4. Полученные значения 6.40, 7.96 и 18.10 мин близки к экспериментальным: 6.44, 7.68 и 18.мин, соответственно. Это соответствие можно считать достаточно удовлетворительным, поскольку вследствие конструкционных особенностей внеколоночные объемы в случае Милихрома весьма значительны.

Возможность смены стационарных фаз в случае липофильных соединений удобна при исследовании триглицеринового состава растительных масел, поскольку в литературе имеется обширная информация по результатам исследования этих важнейших компонентов пищи. На рис.3.12 и 3.представлены результаты разделения смесей, содержащих некоторые триглицериды и сквален на двух стационарных фазах с различающейся примерно в два раза удерживающей способностью, но практически неразличимым относительным удерживанием всех компонентов. Это позволило в данной работе исследовать состав более 200 масел семян различных растений без использования труднодоступных стандартов.

Известно, что остаточные силанольные группы и способ их нейтрализации (энд-кеппинг) могут вносить большой вклад в суммарное удерживание полярных соединений. И если, как отмечалось выше, точки, построенные по данным работы14 для неполярных соединений на стационарной фазе различных марок укладываются на одну прямую линию (рис.3.10), то для хинизарина и амитриптилина, содержащих высоко активные по отношению к образованию водородных связей и хелатированию катионов металлов группы, линейная корреляция не обнаруживается. Это является следствием существенных различий использованного набора стационарных фаз по активности остаточных силанольных групп. Что и подтверждается использованным в работе тестом.

Однако если выбрать соединения, в которых вклад в суммарное удерживание за счет образования водородных связей одинаков или близок, то линейная корреляция относительного удерживания может сохраниться даже при определенных различиях в активности остаточных силанольных групп. Это подтверждается анализом данных работы12 по удерживанию 3-фенил-пропанола и пара-пентиланилина относительно бензилового спирта на десяти колонках, заполненных различными обращенными фазами, рис.3.14.

Wilson N.S. et al // J. Chromatogr. A. 2002. v.961. P. 171–193.

lgk(Z) mV 2 0,Б 0,A 0,25 0,lgk(Л3) 0 5 мин Рис.3.12. Удерживание триглицеридов и Рис.3.13. Разделение смеси сквалена и сквалена относительно Л3 триглицеридов смеси подсолнечного и Z = триолеат (1), линолеат-диолеат (2); дилинолеатоливкового масел олеат (3); (-линоленоат-дилинолеат (4); ди-Элюент: 10 об.% ацетонитрила в ацетоне, 1 мл/мин.

линоленоат-линолеат (5); сквален (6). 0 – 1 – сквален, 2 – Л ; 3 – Л О; 4 – ЛО ; 5 – О.

3 2 2 координатная биссектриса. Незаполненные знаки – Стационарные фазы: А – Диасфер-110-С18, 5 мкм; Б стационарная фаза Диасфер-110-С18; заполненные – Сепарон-130-С18 SGX, 5мкм.

знаки: Сепарон-130-С18 SGX.

0,lgk(БС) -0,Рис.3.14. Удерживание 3-фенилпропанола (ФП) и пара-пентиланилина (ПА) относительно бензилового спирта (БC) Сопоставление свойств компонентов подвижных фаз. По физическому смыслу метод анализа относительного удерживания веществ соответствует отказу от исследования закономерностей изменения удерживания в нелинейных координатах «удерживание – состав подвижной фазы». В предлагаемом пространстве графика lgk(B) как функции lgk(A) каждая точка соответствует конкретной сумме энергий всех видов взаимодействий, характеризующих всю хроматографическую систему. При изменении состава подвижной фазы точка для выбранной пары веществ будет перемещаться в данном пространстве. Причем положение точки и характер ее перемещения ПА lg k ( i ) ФП должен зависеть от типа модификатора подвижной фазы, если изменение типа модификатора приводит к изменению вклада различных видов взаимодействий (дисперсионных, ориентационных, индукционных, образования водородных связей и т.д.) в суммарный энергетический эффект. Так как для различных типов модификаторов этот вклад различен, то и линии тренда могут быть различными.

Например, для относительного удерживания триглицеридов, образованных радикалами -линоленовой (Лн), линолевой (Л) и олеиновой кислот (О), различия поведения в системе ацетон – ацетонитрил и ацетон – метанол очевидны (рис.3.15). Можно заметить, что различия увеличиваются пропорционально изменению числа двойных связей в молекулах, что, вероятно, соответствует изменению вкладов -взаимодействий, отсутствующих при введении метанола, но имеющих место при введении ацетонитрила в подвижную фазу.

Удерживание триглицеридов в элюентах на основе ацетона с добавками ацетонитрила или метанола при увеличении их концентрации () возрастает, а параметр q соответствует тангенсу угла наклона этой зависимости:

lg k(A) = p + q .

1 - lgk(ЛО2) 2 - lgk(Л2О) 3 - lgk(Л3) 4 - lgk(ЛнЛ2) 5 - lgk(Лн2Л) СH3CN Х - - - - СH3OH lgk(Л3) 0 Рис.3.15. Зависимость удерживания триглицеридов от lgk(Л3) Колонка: 2504 мм, Кромасил С18. Ацетон + Х Пусть в сорбате А содержится n С=С- связей, а увеличение концентрации n метанола приводит к увеличению удерживания, причем это увеличение пропорционально уменьшению числа двойных связей (т.е. замена групп: – СН=СН- на –СН 2-СН 2-):

d lg k(An ) = qn. (3.15) d Если при этом в сорбате A содержится n-1 С=С-связей, то, аналогично:

n-d ln k(An- 1) = qn- (3.16) d Отсюда с учетом увеличения q при уменьшении n:

d ln k(An- 1) qn- = > d ln k(An ) qn CH OH lg k ( i ) Ацетонитрил в отличие от метанола способен к -взаимодействиям с сорбатами, поэтому производные (3.15) и (3.16) должны уменьшаться пропорционально числу двойных связей. Отметим, что уменьшение в данном случае связано с тем, что и ацетонитрил и метанол используются как добавки к лучшему растворителю – ацетону, а не к худшему – в случае обычных вводноорганических подвижных фаз. Пусть такое уменьшение равно r на каждую двойную связь, тогда:

d ln k(An- 1) qn- 1 - r(n - 1) =. (3.17) d ln k(An ) qn - r n CH3CN Нетрудно убедиться в том, что при любых (положительных) значениях n и r выполняется соотношение, табл.3.5:

d ln k(An- 1) d ln k(An- 1) >.

d ln k(An ) d ln k(An ) CH CN CH OH 3 Тогда, во-первых, становится понятным ход прямых на рис.3.15, а, вовторых, появляется новая возможность для количественного сопоставления свойств растворителей. Отметим, что производные логарифмов факторов удерживания триглицеридов по удерживанию трилинолеата равны тангенсам углов наклона прямых относительного удерживания. Используя экспериментальные значения тангенсов углов наклонов прямых на рис.3.15 для метанола в качестве модификатора ацетонового элюента методом наименьших квадратов было найдено значение r* = 0.013, которое достаточно хорошо согласует экспериментальные и расчетные параметры для всех четырех триглицеридов, табл.3.5.

Таблица 3.5. Параметры уравнения (3.17) относительно Л d ln k(An- 1) d ln k(An- 1) Триглицерид d ln k(An) CH3CN d ln k(An) CH3OH Состав n экспер. расч.* О Л 4 1.072 1.108 1.1ОЛ 5 1.036 1.056 1.0ЛнЛ 7 0.971 0.951 0.9Лн Л 8 0.944 0.916 0.9n – число двойных связей в триглицериде; * - расчетное значение при оптимальном значении r (0.013) По формуле (3.17) параметр r* указывает на количественное соотношение между суммарной гидрофобностью и парциальным вкладом -взаимодействий между ацетонитрилом и двойными связями триглицеридов.

Глава 4. Инкрементный подход Аддитивные схемы, основанные на парциальных составляющих, по надежности получаемых данных могут превосходить, например, квантовохимические методы13. Структурные парциальные параметры определяют при исследовании свойств специально подобранной группы веществ известного молекулярного строения – «тренировочного ряда». В хроматографии в качестве удобного структурного дескриптора был предложен инкремент, сопоставляющий данному изменению структуры вещества разность соответствующих логарифмов факторов удерживания:

(A B) = lg k(B) - lg k(A). (4.1) В таком случае если вещество С является продуктом последовательного замещения функциональных групп в ряду:

A B1 B2 ... Bn C с известными для каждой из стадий превращений инкрементами, то удерживание вещества С при выполнении аддитивности свойств13 может быть найдено по простой схеме:

lg k(C) = lg k(A) + (A B1) + (B1 B2 ) +... + (Bn C). (4.2) Очевидно, что обязательное требование для рассматриваемых структур - отсутствие внутримолекулярных взаимодействий. При этом отличие экспериментального инкремента от полученного для тренировочного ряда может свидетельствовать об особенности строения исследуемого соединения, например, о наличии внутримолекулярной водородной связи.

Значительные успехи школой А.В. Киселева были достигнуты в газовой хроматографии при исследовании сорбции веществ на графитированной саже14.

В жидкостной хроматографии, к сожалению, достижения в области количественной взаимосвязи между строением и хроматографическими характеристиками сорбатов несопоставимо скромнее. Инкрементам (или вкладам функциональных групп) в начале развития ВЭЖХ было посвящено множество работ, см. обзор15 и ссылки в нем. Однако у авторов работ не было обоснованного метода оценки или сопоставления результатов. Поэтому, к сожалению, результатом этих работ, по сути, было не более чем простое перечисление полученных численных данных и неуверенные попытки их сопоставления. Также, к сожалению, обычно в этих работах отсутствовали данные, необходимые для применения метода относительного анализа.

Вероятно, поэтому в настоящее время вместо инкрементного подхода предложены совершенно другие варианты исследований под названиями QSRR (количественная взаимосвязь между строением и удерживанием веществ) или LFER (линейная взаимосвязь между свободными энергиями).

При графическом представлении инкрементных соотношений по методу ОАУ можно исследовать положение линии для вещества В, относительно i координатной диагонали (т.е относительно удерживания сорбата сравнения, А), т.е на карте разделения. Возможно также по оси ординат откладывать инкремент для пары сорбатов В и А.

Баскин И.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2.Химия. 2001. Т.42. № 6. С.

387-389.

Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. – М.: Химия, 1986. – 272 с.

Smith R.M. // J. Chromatogr. A. 1993. v.656. P. 381-415.

Метиленовая селективность относится к числу наиболее важных и наиболее часто исследуемых параметров хроматографических процессов. Этот параметр имеет принципиальное значение в обращенно-фазовой (т.е.

гидрофобной) хроматографии по понятной причине – основными функционально активными поверхностными группами сорбента в этом случае являются именно алкильные радикалы. Все остальные поверхностные группы в случае обращенно-фазовой хроматографии рассматриваются как, к сожалению, неизбежные артефакты.

Метиленовая селективность рассчитывается по параметрам удерживания двух веществ, различие в строение которых состоит в добавлении одной метиленовой группы: (А = R-R ) и (В = R-CH ), двумя способами:

1 2-R k(B) (CH ) = 2 и lg (CH2 ) = (A B) = lg k(B) - lg k(A).

k(A) Отметим, что метиленовая селективность входит в число параметров, определяемых при характеризации стационарных фаз16.

Метиленовая селективность в пределах одного ряда гомологов. Для исследования инкрементов удобнее воспользоваться концентрационной зависимостью параметров удерживания с аргументом, выраженным через логарифм активности компонентов подвижной фазы по уравнению, предложенному в главе 1:

G ln k(A) = ln K(A) + + ln fmp (A) - n1 ln a(S1) - n2 ln a(S2 ) - ln N(mp), RT где учитывается также изменение свободной энергии поверхности сорбента (G ) при сорбции сорбата, активности воды (S ) и органического модификатора (S ) и числа сольватации сорбата этими компонентами, n и n, 2 1 соответственно.

Если вещество A – следующий член гомологического ряда, то:

G ' ' ln k(A') = ln K(A') + + ln fmp (A') - n1 ln a(S1) - n2 ln a(S2 ) - ln N(mp).

RT и инкремент, соответствующий введению метиленовой группы, равен:

(A A') = ln k(A') - ln k(A) = ln K(A') - ln K(A) + ln fmp (A) - n1 ln a(S1). (4.3) Соотношение (4.3) выведено при предположениях о том, что • метиленовые группы сольватируются только молекулами неполярного компонента подвижной фазы – S, (n) – изменение числа таких молекул при добавлении СН -группы в структуру сорбата А;

• поскольку (и если) эта группа будет внедрена в обращенную фазу, то ее влиянием на изменение избыточной поверхностной энергии можно пренебречь.

Если предположить, что и сольватация (во второй координационной сфере) сольватного комплекса А(solv.) равномерно изменяется при последовательном добавлении CH 2-групп в ряду гомологов, т.е. lnf (A) = mp const, то при равенстве последовательных n можно предполагать равенство последовательных инкрементов.

Яшин Я.И. Физико-химические основы хроматографического разделения. М.: Химия. 1976. 216 с.

Но для равенства последовательных инкрементов необходимо, прежде всего, равенство разностей последовательных термодинамических параметров сольватации членов гомологического ряда в обеих фазах. В полуэмпирических расчетах термодинамических свойств веществ достаточно строго одинаковые вклады вносят только атомы одинакового вида. А в ряду бензол – толуол – этилбензол – пропилбензол -… добавляемые СН 2-группы являются группами одинакового вида только начиная с пары этилбензол – пропилбензол. Поэтому обычно по хроматографическому поведению бензол выпадает из ряда гомологов, и, строго говоря, из него следует исключить и толуол. Эти выводы в данной работе подтверждены сопоставлением литературных термодинамических данных (по энтальпии переноса) и хроматографических параметров поведения алкилбензоатов в системе ацетонитрил - вода на стационарной фазе Kromasil C18 в элюенте состава 80 % ацетонитрила в воде.

Инкремент, приходящийся на одну метиленовую группу, был рассчитан по удерживанию пары веществ н-пропилбензоат и н-бутилбензоат. Применяя полученное значение для прогнозирования удерживания н-гексилбензоата, получили расчетное значение логарифма фактора удерживания, равное 0.745.

Экспериментально определенный lgk(н-гексилбензол) оказался равным 0.743, что сопоставимо с погрешностью определения этого параметра удерживания.

Это позволяет использовать указанную выше пару в качестве количественного дескриптора метиленовой селективности. Аналогичная зависимость была получена для метил, этил, пропил и бутилбензоатов в более «медленном» элюенте. При определении инкремента (0.166) по удерживанию пропил и бутилбензоатов расчетный параметр удерживания этилбензоата (lgk(этилбензоат) = 0,250) оказался лишь на 0.001 меньше экспериментального значения, хотя для метилбензоата расхождение достигает 0.0логарифмических единиц. Отметим, что определенные в тех же условиях инкременты, соответствующие замене метильного радикала на этильный для других основ – толуола и анизола, - имеют другие значения: 0.144 и 0.158, соответственно.

Однако не только при малом количестве метиленовых групп следует ожидать неодинаковости метиленовых инкрементов в ряду гомологов. В работе17 при анализе квадратичной селективности ( = kn+ / kn- ) как функции n 1 в гомологических рядах обнаружена нелинейность. Точка перегиба найдена при n 12 - 13 даже в достаточно гидрофобных элюентах (составленных из хлороформа и ацетонитрила). Для объяснения полученных данных авторы использовали «эффект проникновения» в стационарную фазу. Однако, как было установлено в данной работе при анализе удерживания рядов гомологов на различных стационарных фазах (включая такие, для которых «эффект проникновения» лишен смысла) влияние возможных конформационных превращений сорбатов в подвижной фазе представляется более вероятным. При этом очевидно, вследствие снижения гидрофобности элюентов (при переходе к Martin M., Thevenon G., Tchapla А. // J. Chromatogr. 1988. v.452. P. 157-173.

водно-органическим подвижным фазам) точка перегиба должна смещаться в сторону уменьшения n.

Метиленовая селективность в гомологических рядах: некоторые особенности. Вероятно, наибольший прогресс в методе обращенно-фазовой хроматографии был достигнут при исследовании удерживания гомологических рядов соединений при разнообразных вариациях хроматографических условий.

При выполнении этих работ был обнаружен целый ряд важнейших закономерностей удерживания таких соединений. Прежде всего, к общим закономерностям можно отнести найденную зависимость удерживания от числа атомов углерода в алкильных радикалах трех рядов гомологов: алканов, алкилбензолов и метиловых эфиров жирных кислот18:

lg k(n) = p n + q. (4.4) При этом величины коэффициента p были, в общем случае, различными для различных гомологических рядов, а соотношения между ними зависели от составов метанол – водной подвижной фазы. В следующем сообщении19 был расширен набор гомологов и органических модификаторов подвижных фаз, но единственным результатом стала нелинейность метиленовой селективности от состава подвижной фазы. Но наиболее интересными представляются выводы работы20, в которой показано пересечение всех прямых линий для данного типа гомологов, полученных для различных соотношений органический модификатор – вода, в одной точке. Эта точка названа точкой конвергенции.

Существенно то, что ордината точек конвергенции для различных рядов гомологов (метиловых эфиров, алканов и алкилбензолов) имела примерно одно и то же значение для всех рядов гомологов. К сожалению, авторы работы отказались от выяснения физического смысла абсциссы этой точки, да и физический смысл ординаты оказался спрятанным за рассуждения об индексах взаимодействия.

В работе21 предложено уравнение, учитывающее установленные факты линейности не только по числу атомов углерода в алкильных радикалах, но и линейности зависимости удерживания от массовой доли воды:

lg k(n) = A + B n + C x + D n x.

где x – массовая доля воды в элюенте, а A, B, C и D – константы для данного гомологического ряда. Указанное уравнение предполагает также пересечение всех линий зависимости типа (4.4) в одной точке для данной хроматографической системы. Важно, что в этой работе предложен физический смысл точки конвергенции – как точки с отсутствием различий между двумя фазами по отношению к некоторому условному члену гомологического ряда.

Этот очень важный момент предлагалось использовать для характеризации колонок (стационарных фаз). Поскольку удерживание сорбатов на реальных стационарных фазах определяется не только привитой фазой, но целым рядом других свойств, включая определенную активность остаточных силанольных Colin H., Guiochon G. // J. Cromatorg. Sci. 1980. v.18. P. 54-63.

Colin H. et al // J. Chromatogr. Sci. 1983. v.21. P. 179-184.

Colin H. et al // Chromatorgaphia. 1983. v.17. P. 9-15.

Engelhardt H. // Pure Appl. Chem. 1989. v.61(11). P. 2033-2036.

групп, то не следует рассчитывать на равенство абсцисс точек конвергенции различных гомологических рядов.

На рис. 4.1 представлены линии трендов для логарифмов факторов удерживания ряда ароматических производных в «линеаризованных» концентрационных координатах по уравнению (3.1) на колонке 802 мм, Сепарон SGX C18 в подвижных фазах системы «метанол-вода». Точки пересечения имеют, как и следовало ожидать, примерно равные ординаты, но заметно смещены по оси абсцисс.

lgk(i) 0,6 0,8 f(CH3CN) -lgk(бензол) --Рис.4.1. Зависимость факторов Рис.4.2. Относительное удерживание удерживания ряда соединений от функции некоторых веществ относительно бензола.

1 – бензол, 2- толуол, 3 – этилбензол, 4 – 2состава подвижной фазы.

метилфенол, 5 – фенол. Элюенты системы 1 - фенол; 2 - р-крезол, 3 - этилбензоат; 4 – пропил«ацетонитрил - вода»6.

бензоат; 5 – бутилбензоат; 6 - бензол, 7 – толуол Общая тенденция смещения точки конвергенции – абсцисса тем меньше, чем выше полярность вещества, что не противоречит предложенному физическому смыслу точки. Действительно, чем выше полярность молекулы, тем меньше требуется органического модификатора для подавления гидрофобности вещества. Кстати, в методе относительного анализа удерживания различие координат точек конвергенции для различных гомологических рядов проявляется в виде смещения точек также по оси абсцисс, если в качестве образца сравнения во всех относительных параметрах используется одно и то же вещество, рис.4.2.

Подчеркнем, что между однотипными инкрементами (на одну СН группу) для различных гомологических рядов существуют сложная взаимосвязь. Так, в работе24 для метанола в качестве элюента инкременты оказались равными 0.100, 0.110 и 122 для алкилбензолов, алканов и метиловых эфиров жирных кислот, соответственно. Но для элюента, содержащего 90 об. % метанола они сравнялись – по 0.151; и вновь для следующего состава подвижной фазы (80 об. % метанола) стали различными: 0.183, 0.198 и 0.201 в том же порядке. Инкременты не совпадают при любом составе подвижной фазы для данных, приведенных на рис.4.1. Не одинаковы также и разности в углах наклона соответствующих прямых для пар веществ: 0.486 для пары lg k ( i ) бензол – толуол; 0.454 – пары фенол - п-крезол, 0.505 (этилбензоат – ппропилбензоат) и 0.559 (п-пропилбензоат – п-бутилбензоат).

В настоящей работе при исследовании диэфиров ряда каротиноидов, образованных жирными кислотами, содержащими более 10 углеродных атомов углерода в цепи, найдено хорошее совпадение инкрементной разности для диэфиров лютеина, образованных кислотами от лауриновой до стеариновой, рис. 4.3 и 4.4.

Lu(14+16) A Lu(16+16) Lu(14+14) 0,-1,5 -0,5 0,lgk(Lu(14+14)) Lu(16+18) Lu(12+14) -0,Lu(12+14) Lu(14+16) Lu(16+16) Lu(16+18) -1,10 0 tR, мин Рис.4.3. Разделение диэфиров лютеина Рис.4.4. Удерживание диэфиров лютеина лепестков цветков Tagetes sp. относительно Lu(14+14) Колонка: 2504 мм, Кромасил-С18, 5 мкм. Подвижные фазы системы ацетон – ацетонитрил. Lu Подвижная фаза: ацетон – метанол (68 : 32 об.%), – лютеин. Цифры – число атомов углерода в 1 мл/мин., детектор: 450 нм радикалах жирных кислот.

Важно, что лепестки бархатцев любой окраски (от желтой до оранжевой) содержат в качестве основных каротиноидов только диэфиры лютеина, поэтому удобны для использования для расчетов инкрементных соотношений.

Найденные с использованием такого образца эфиров ксантофиллов инкременты могут быть использованы для поиска различных рядов гомологов в других, обычно более сложных смесях ксантофиллов, экстрагируемых из лепестков других цветков, Неравенство однотипных (метиленовых) инкрементов для различных гомологических рядов в данной работе объяснено сольватационными эффектами. В качестве основной причины указанных различий предлагается учесть особенности энтропии сольватации молекул сорбатов, что экспериментально подтверждается основным вкладом именно неравенства энтропийных составляющих свободных энергий переноса членов различных гомологических рядов. Сольватная оболочка членов гомологических рядов не гомогенна, поэтому энтропия сольватации сорбатов в подвижной фазе меньше по сравнению со случаем гомогенного распределения компонентов подвижной фазы на энтропию смешения сольватной оболочки. Показано также, что выводы, получаемые при таком допущении, качественно согласуются с экспериментальными данными. Тогда очевидно, что для различных рядов высоко липофильных гомологов метиленовая разность должна быть достаточно близкой.

lg k (i) Это положение было экспериментально подтверждено в настоящей работе при исследовании хроматографического поведения каротинидов различных природных объектов. Более того, оказалось, что внутри рядов гомологов соблюдалось подобие жирнокислотного состава диэфиров, рис.4.5.

A 1.0.Б 0 0 tR, мин 5 10 5 10 t Рис.4.5. Моделирование разделения диэфиров ксантофиллов в условиях ОФ ВЭЖХ Образец: смесь экстрактов лепестков цветков Senecio sp. и Tagetes sp. Условия: 2504 мм, Кромасил С18, подвижная фаза CH3CN – CH3COCH3 17:83 об., 1.0 мл/мин.

Моделирование разделения диэфиров различных гомологов и Б - суммарной хроматограммы. На хроматограмме А выделены пики диэфиров лютеина и зеаксантина из экстракта Tagetes.

Справедливость предложенного выше подхода была подтверждена в настоящей работе также с использованием двухмерной хроматографии.

Разделение сложной смеси в условиях нормально-фазовой ТСХ (на пластинах с силикагелем) определяется числом активных по отношению к образованию водородных связей полярных групп и практически не зависит от длины углеводородного радикала (для достаточно длинных радикалов). Поэтому возможно разделение ксантофиллов по числу функциональных групп - с последующей записью хроматограммы для гомологов в условиях обращеннофазовой ВЭЖХ. Например, для экстрактов плодов красного перца были получены «индивидуальные» хроматограммы диэфиров зеаксантина, капсантина и капсорубина – с близкими «метиленовыми» инкрементами, а также некоторых моноэфиров, с инкрементной разностью уже заметно (и предсказуемо) отличавшейся от полученной для диэфиров.

Существенно то, что для рядов веществ, с последовательным одинаковым изменением структуры, но не относящихся к одному ряду гомологов, названных в данной работе «псевдогомологами», равенство последовательных инкрементов, строго говоря, не очевидно.

К таким рядам можно отнести, например, ряд триацилглицидов: О, ЛО, 3 Л О и Л – от триолеата с последовательной заменой по одному радикалу 2 олеиновой кислоты на радикал линолевой кислоты – до трилинолеата. Эти четыре вещества относятся к различным рядам гомологов. Но, как было показано ранее, абсциссы точки конвергенции в таком ряду (постепенное добавление одной двойной связи) изменяются на одинаковое значение.

Тогда не трудно подсчитать, что ЛmV при одинаковом изменении тангенса угла наклона линий Л2О относительного удерживания ЛО1(вследствие одинакового Л2С+ изменения сольватации молекул в ЛОП ОЛ2П подвижной фазе) инкременты в ЛОС+ рассмотренном ряду должны также ЛП2 О2П быть примерно равными. На этом 0 5 10 15 основании инкрементный подход tR, мин был применен для расчета состава Рис.4.6. Разделение триацилглицеролов триглицеридов, причем в качестве подсолнечного масла своеобразных стандартов для Колонка 2504 мм, Диасфер-110-С18, 5 мкм, расчета инкрементов могут быть Элюент: 10 об.% ацетонитрила в ацетоне, 1 мл/мин.

использованы повсеместно доступные дешевые растительные масла, например, подсолнечное масло, рис.4.6.

Таблица 4.1. Инкрементные соотношения между триглицеридами подсолнечного масла Состав Параметр удерживания Инкременты № ТАГ t, мин lgk (ЛО) (ОП) (ПС) R 1 Л 8.21 0.42 Л О 9.95 0.573 0.109 (12) 3 Л П 10.5 0.601 0.028 (23) 4 ЛО 12.2 0.683 0.110 (24) 5 Л С 12.6 0.7 0.099 (35) 6 ЛОП 12.9 0.710 0.109 (36) 0.028 (56) 7 ЛП 13.7 0.741 0.030 (67) 8 О 15.1 0.791 0.109 (48) 9 ЛОС 15.7 0.809 0.109 (59) 0.099 (89) 10 О П 16.0 0.820 0.110 (610) 0.028 (810) 11 ЛПС 16.6 0.838 0.029 (911) 0.097 (711) 12 О С 19.5 0.919 0.110 (610) 0.099 (1012) Найденный в данной работе состав триглицеридов всегда совпадал по порядку элюирования и по относительной интенсивности пиков на хроматограммах с описанным в литературе и полученным с использованием масс-спекрометрических детекторов. В ряде случаев жирнокислотный состав подтверждали выделением фракций индивидуальных триглицеридов, омылением их и определением жирных кислот после получения фенацильных производных. Присутствие в масле радикалов необычной кислоты Х легко детектируется по сопоставлению инкрементов с данными, полученными при исследовании масел с известным составом. Например, масла семян калины и нигеллы дамасской имеют как одинаковые, так и различающиеся триглицериды, табл.4.2. X - в данном случае радикал 11-цис,13-цис-эйкозеновой кислоты, довольно редкой, специфичной для нигеллы кислоты.

Таблица 4.2. Параметры удерживания масел семян калины и нигеллы Масло семян: Инкременты № Состав калины нигеллы tR, мин lgk (ЛО) (ЛХ) (ОП) (ПС) 1 Л 5.00 4.99 0.22 Л Х 5.47 0.274 0.03 Л О 5.70 5.69 0.299 0.04 Л П 5.95 0.329 0.05 ЛОХ 6.30 0.365 0.06 ЛО 6.57 6.55 0.389 0.07 ЛОП 6.89 0.419 0.08 О Х 7.29 0.453 0.09 О 7.64 7.63 0.479 0.010 ЛОС 7.84 0.495 0.011 О П 8.05 0.510 0.012 ОП 8.54 0.544 0.013 О С 9.24 0.587 0.014 ОПС 9.78 0.618 0.0Глава 5. Методы стандартизации хроматографических систем В данной главе рассмотрены важнейшие методы стандартизации хроматографических систем и предложены новые, основанные на методе ОАУ.

Для стандартизации удерживающей способности предлагается использовать пересечение линий относительного удерживания гомологов в одной точке – в точке конвергенции. Например, для удерживания толуола, оксилола и псевдокумола13 тенденция пересечения соответствующих прямых линий в одной точке очевидна для различных систем подвижных фаз, рис.5.1 и рис.5.2.

Общность линий трендов для алкилбензолов и вероятная их общность для обращенных фаз различных производителей позволяет ввести количественную шкалу гидрофобности колонок, основанную на свойствах пучка лучей, исходящих из одной точки. Для этого в тестовую систему следует ввести не один состав подвижной фазы, а два, что позволит найти точку пересечения линий трендов гомологов, (x ;y ) на графике lgk(этилбензол) vs 0 lgk(толуол) (с координатной диагональю).

При этом количественная мера удерживающей способности колонки, CS (column strength), может быть найдена для некоторого, избранного в качестве стандартного, состава подвижной фазы по соотношению:

CS = lg k(толуол) - y. (5.1) Очевидно, что для такого способа индексация удерживающей способности хроматографической системы (а при стандартизации подвижной фазы – стационарной фазы) следует стандартизовать и набор гомологов. Кроме того в данном случае этот параметр не чувствителен также и к активности остаточных силанольных групп, т.е. для стандартизации подходит любой набор гомологов вне зависимости от строения начального члена гомологического ряда.

1 – толуол 0,lgk(бензол) -2 – о-ксилол 3 – псевдокумол lgk(бензол) --0,--0,-Рис.5.1. Удерживание алкилбензолов Рис.5.2. Удерживание алкилбензолов относительно бензола относительно бензола Элюенты системы CH CN – H O Элюенты системы C H ОН – H O 3 2 2 5 Уравнение (5.1) предполагает использование координат точки конвергенции, которые получают экстраполяцией далеко за диапазон экспериментальных данных. Но результаты экстраполяционной процедуры весьма чувствительны к погрешностям определения параметров базисных точек. С учетом равенств нулю логарифма «метиленовой селективности» в точках конвергенции и простых соотношений отрезков, получаемых пересечением лучей угла параллельными прямыми можно предложить иной подход к сопоставлению гидрофобности (CS) колонок, заполненных различными стационарными фазами. Для этого можно воспользоваться отношением однотипных инкрементов, найденных в одинаковых подвижных фазах:

CS1 (A B) = (5.2) CS2 (A B) Именно этот прием (уравнение 5.2, но без обоснования) был использован в работе15 для расчета относительных параметров гидрофобности различных обращенных фаз. Возражение вызывает только выбор пар веществ – в качестве веществ В (отнесенных к «идеальным», при А - этилбензол) использованы не только другие алкилбензолы, но и полярные соединения, среди которых анизол и бензонитрил, чувствительность которых к полярным взаимодействиям со стационарной фазой легко подтверждается сопоставлением относительного удерживания соответствующих пар сорбатов.

Оценка активности остаточных силанольных групп. Известно, что для полностью гидратированного силикагеля поверхностная концентрация силанольных групп составляет 4.8 групп/нм2, а при модифицировании силикагелей монохлорсиланами плотность прививки якорных групп в лучшем случае лишь немногим превосходит 2.0 групп/нм2, т.е. более половины lg k ( i ) lg k ( i ) исходных ОН-групп оказываются свободными в готовой обращенной фазе. В общем случае остаточные силанольные группы проявляют активность в отношении разделяемых молекул, способных к образованию водородных связей. Эта активность, которая во многом определяется условиями синтеза обращенных фаз, является одной из причин неэквивалентности (или некоторой невоспроизводимости) свойств готовых фаз не только для различных марок, но и среди различных партий одних и тех же марок сорбентов.

Если для пар сорбатов, не склонных к образованию водородных связей общность относительного удерживания уже была продемонстрирована ранее, то аналогичный подход для пар веществ (фенол – анилин), склонных к образованию водородных связей, приводил иному результату, рис.5.3.

0,0, А 0,0 0,lgk(фенол) 0,2 0, lgk(фенол) Рис.5.3. Удерживание анилина относительно Рис.5.4. Удерживание анилина относительно фенола: фенола на двух стационарных фазах:

1 – данные полученные для одной колонки в трех 1 – с и 2 – без эндкеппинга различных составах элюента, 2 – координатная биссектриса; ( ) –данные из работы22.

С использованием двух стационарных фаз (Диасфер-110-С18) с и без эндкеппинга было установлено, что включение полярных взаимодействий хорошо аппроксимируется параллельным переносом прямых линий на графике относительного удерживания, рис.5.4. При этом найдено, что, • во-первых, более чувствительной (по сравнению с парой «феноланилин») является, например, пара сорбатов «р-крезол – р-толуидин»;

• во-вторых, более полная характеристика может быть получена при использовании пары сорбатов, один из которых обязательно относится к малополярным;

• в-третьих, предложен и подробно исследован иной подход, свободный от неопределенности, связанной с неучетом различий в мольных соотношениях сопоставляемых стационарных фаз по изложенному выше подходу.

Глава 6. Общие вопросы обращенно-фазовой ВЭЖХ В главе рассмотрены два общих вопроса, касающиеся теории обращеннофазовой ВЭЖХ.

Sndi ., Szepesy L. // J. Chromatogr. A. 1998. v.818. P. 1-17.

lg k lg k (анилин) (анилин) О механизмах удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ. В данной главе известный в литературе метод сопоставления свойств различных стационарных фаз, модифицирован специальным выбором сорбатов для получения прямых ответов на поставленные вопросы. Предлагается использовать несколько различных стационарных фаз, некоторые из которых построены на одной и той же силикагелевой матрице, но отличаются длиной привитого алкильного радикала кремнийорганического модификатора, а некоторые должны быть построены на другой силикагелевой матрице (для наблюдения за ролью удельной поверхности или пористости).

Логарифмическая форма уравнения (1.4) для удерживания сорбата (i) на стационарной фазе А, k(i,A), при данном составе подвижной фазы имеет вид:

N(sp, A) lg k(i, A) = lg Kth (i, A) + lg. (6.1) N(mp) При том же составе подвижной фазы на другой стационарной фазе, В:

N(sp, B) lg k(i, B) = lg Kth (i, B) + lg. (6.2) N(mp) Эквивалентность химических свойств стационарных фаз А и В обозначает равенство термодинамических констант уравнений (6.1) и (6.2), поэтому исключением этих членов, получаем простое соотношение:

N(sp, B) N(sp, A) lg k(i, B) = lg k(i, A) + lg - lg.

N(mp) N(mp) Логарифмы мольных соотношений могут быть не равными, особенно, если стационарные фазы синтезированы на различных силикагелевых матрицах. При изменении состава подвижных фаз логарифмы мольных соотношений сопоставляемых колонок пропорционально изменяются, поэтому их разность превращается в константу (а), так что следует предполагать прямолинейную зависимость удерживания сорбата i на стационарной фазе В относительно стационарной фазы А:

lg k(i, B) = a + lg k(i, A). (6.3) Если хроматографическое поведение вещества i на стационарной фазе В отличается от поведения на стационарной фазе А, то в простейшем случае можно предположить масштабирование термодинамической константы распределения с коэффициентом :

lg Kth (i, B) = lg Kth (i, A).

Подставим это соотношение в уравнения (6.1) и (6.2) и исключим термодинамическую константу, получая соотношение:

N(sp, B) N(sp, A) lg k(i, B) = lg k(i, A) + lg - lg.

N(mp) N(mp) Несмотря на то, что при этом разность членов, связанных с мольными соотношениями колонок, уже не полностью компенсируется при изменении составов подвижных фаз, относительное изменение удерживания вещества на колонке В по сравнению с колонкой А может быть представлено в линейной форме по уравнению 6.4:

lg k(i, B) = a + b lg k(i, A). (6.4) Основание такого предположения – обычно близкая к линейной зависимость фактора удерживания сорбата от состава подвижной фазы. В уравнении (6.4) константа b учитывает не только масштабирование термодинамической константы распределения при переходе от фазы А к фазе В (), но и некоторое изменение разности фазового соотношения при изменении составов подвижных фаз.

Для сильно полярных соединений, вероятность погружения которых в глубь обращенной фазы мала, следует ожидать независимости сорбционных характеристик стационарных фаз от длины привитого радикала. Это должно соответствовать b 1 в координатах уравнения (6.4), и примерному постоянству а для стационарных фаз, построенных на одних и тех же силикагелевых матрицах и, наоборот, другому значению а при переходе к фазам, построенным на других матрицах. При использовании резвератрола (транс-3,5,4’-тригидроксистильбена), который по строению не должен внедряться в стационарную фазу, действительно, получены результаты, соответствующие высказанным предположениям:

lg k(i,С4) = 0.888 lg k(i,C18) - 0.066 lg k(i,C8) = 0.928 lg k(i,C18) - 0.0;.

Здесь С4 (бутильная) и С8 (октильная) фазы построены на одном и том же силикагеле (марка Диасорб), а фаза С18 (октадецильная) – на другом (марка Диасфер). Отклонение от единицы соответствующего коэффициента может быть связано с усиливающимся влиянием остаточных силанольных групп или поля полярного силикагеля с уменьшением толщины углеводородного слоя на поверхности. Близкие интерсепты свидетельствуют о примерно одинаковой удельной поверхности сорбентов, построенных на Диасорбе, при этом существенно отличающейся от удельной поверхности для сорбента на основе Диасфера.

Триглицеридами называются сложные эфиры глицирина и высших жирных кислот, составляющие (как правило) основу масел семян растений.

Триглицериды относятся к сильно гидрофобным веществам – они не растворяются не только в воде, но даже и в ацетонитриле. Для них проникновение молекул внутрь иммобилизованной обращенной фазы кажется весьма вероятным, тогда удерживание триглицеридов может зависеть от длины иммобилизованного углеводородного радикала.

Удерживание трех основных триглицеридов масла – Л - трилинолеата, Л О – дилинолеат-олеата и ЛО – линолеат-диолеата, на использованных фазах 2 в этом случае оказалось весьма различным: если состав подвижной фазы хорош (факторы удерживания в диапазоне 4 - 10) для разделения триглицеридов на С18 - фазе, то в том же составе подвижной фазы удерживание триглицеридов на колонках С8 и С4 было небольшим. При снижении элюирующей силы подвижной фазы до достижения приемлемых факторов удерживания по триглицеридам на фазе С4 (или С8) удерживание этих сорбатов на фазе Сстановилось слишком большим с заметным искажением форм пиков.

Это неудобно в первую очередь тем, что велика погрешность определения параметров удерживания сорбатов по крайней мере на одной из сопоставляемых колонок. Результаты исследований, выполненных с использованием ацетон - ацетонитрильных фаз, суммированы в уравнениях:

lg k(Л3,С4) = 0.570 lg k(Л3,C18) - 0.637 lg k(Л3,C8) = 0.680 lg k(Л3,C18) - 0.3;.

lg k(Л2О,С4) = 0.620 lg k(Л2О,C18) - 0.722 lg k(Л2О,C8) = 0.746 lg k(Л2О,C18) - 0.4;.

lg k(ЛО2,С4) = 0.635 lg k(ЛО2,C18) - 0.706 lg k(ЛО2,C8) = 0.764 lg k(ЛО2,C18) - 0.4;.

В данном случае тангенсы углов наклона прямых линий весьма далеки от единицы, причем они уменьшаются при переходе от С18 к С4 - фазе. Это находится в полном соответствии с высказанным выше предположением о проникновении молекул в объем стационарных фаз. Более того, анализ полученных результатов показал, что по величине параметра b можно установить длину привитого радикала по линейной зависимости между этими параметрами.

Существенно, что исследование хроматографического поведения пары «толуол – этилбензол» на этих же стационарных фазах показало нечувствительность относительного удерживания к длине привитого радикала стационарной фазы.

Роль и место CLOGP в ОФ ВЭЖХ. В поисках взаимосвязи между удерживанием вещества в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ (или ТСХ) и его биологической активностью или его строением (QSRR или QSAR) большое значение уделяется корреляции между величинами удерживания веществ и логарифмами коэффициентов распределения этих веществ (lоgP) между 1октанолом и водой. Для полуэмпирического расчета этого параметра предложено несколько программных продуктов, в том числе СLogP, SciLogP, KOWWIN, XLogP, ACD/LogP и ряд других. При этом корреляцию между параметрами ищут в простейшем случае в виде линейной зависимости13,23:

lgk(i) = a + b log P(i)(6.5) или log P(i) = a + b lgk(i) (6.6) Однако, надежность такого метода не высока, что не удивительно.

Например, хорошо известно, что для ряда веществ наблюдается инверсия порядка элюирования при изменении состава подвижной фазы (даже без изменения состояния ионизации), которая не может быть предсказана по уравнениям (6.5) и (6.6) поскольку LogP = const. Стандартизация условий в виде аппроксимации времен удерживания на чисто водные подвижные фазы7, кажется частично оправданной. Но возникают, например, проблемы в надежности аппроксимации, поскольку данные для водно-метанольных и водно-ацетонитрильных элюентов различаются7, мягко говоря, существенно.

Метод быстрого градиента25 также является оригинальной стандартизацией без использования экстраполяции.

Cunha S.C., Oliveira M.B.P.P. // Food Chem. 2006. v.95. P. 518-5 logP (вместо lgP) – общепринятое в иностранной литературе обозначение десятичного логарифма коэффициента распределения вещества между октанолом-1 и водой.

Donovan S.F., Pecsatore M.C. // J. Chromatogr. A. 2002. V.952. P.47-Параметры удерживания группы гомологов (lgk(A )), построенных на i некоторой основе А (А, А,…A ), в зависимости от линеаризованной функции 1 2 n состава подвижной фазы укладываются на прямые линии (для удерживания при различных соотношениях компонентов выбранной системы подвижной фазы, например, метанол - вода), которые пересекаются в одной точке – точке конвергенции. Тогда, выполнение соотношения (6.5) и (6.6) эквивалентно выполнению в некотором гипотетическом (*) составе подвижной фазы другого соотношения:

LogP(i) = lg k(i) * + a *. (6.7) В работе обсуждаются возможные причины неравенства нулю параметра a*, в том числе и в зависимости от типа органического модификатора подвижной фазы. Так, экспериментально было подтверждено, что для хроматографического метода определения logP не рекомендуется систему метанол – вода заменять на систему ацетонитрил – вода28; действительно, для ацетонитрила пренебрежение -взаимодействиями (отсутствующими в случае 1-октанола) вряд ли можно считать обоснованным. Но если между веществами существует соотношение:

lg k(i) = a + b lg k(A) (6.8) то, подставляя параметры из уравнения (6.8) в уравнение (6.7), получаем:

log P(i) = a + b log P(A) + a *(b - 1) (6.9) Если а* невелико или равно нулю, то точка, определенная по уравнению 6.9 принадлежит прямой по уравнению 6.8! Это предположение является основой предлагаемого в данной работе нового метода, который не включает аппроксимаций по сложным криволинейным законам и для получения результата требует чрезвычайно ограниченный набор экспериментальных результатов – достаточно данных, полученных в двух (!) составах подвижных фаз. Обратная сторона метода при его справедливости - для построения графика относительного удерживания достаточно данных, полученных в одном составе подвижной фазы! Отметим, что при заранее известных координатах точек конвергенции – вообще не нужны предварительные экспериментальные данные.

На рис. 6.1 приведены линии трендов для удерживания толуола и этилбензола относительно бензола, построенные по литературным данным3.

Все данные по logP, использованные в данной работе, получены интерактивным расчетом на сайте http://146.107.217.178/lab/alogps/.

Отклонение линий трендов от точек LogP* не превышает 2,5 %. Что не так уж и велико, если учесть известные сложности в экспериментальном определении logP и заметный разброс экспериментальных значений logP для одного и того же соединения. Кстати, из набора данных по удерживанию веществ, не относящихся к одному ряду гомологов, представленных в работе3, хорошее (с погрешностью не более 2,5 %) совпадение линий трендов с точками LogP* получено для 10 веществ при использовании в качестве реперного соединения бензола.

Известно, что основной проблемой при работе с обращенными фазами являются остаточные силанольные группы сорбента.

Это является причиной большого расхождения между расчетными и табличными значениями LogP для полярных веществ (в диапазоне от 20 до 50 %) при использовании в качестве вещества дифенил сравнения бензола. Однако, при замене этилбензол бензола на бензиловый спирт (или введением толуол поправки на полярное взаимодействие) 0 lgk(бензол) достигнуто отличное совпадение Рис.6.1. Удерживание веществ хроматографических и экспериментальных относительно бензола значений LogP для полярных соединений.

Глава 7. Некоторые аспекты применения метода теоретических тарелок в хроматографии Данная глава посвящена исследованию применения компьютерного моделирования хроматографического процесса для решения целого ряда фундаментальных вопросов. В основе моделирования использована методология пошаговой модификации в варианте метода теоретических тарелок. Особенностью разработанного подхода стала возможность моделирования процессов в условиях любого профиля градиента подвижной фазы при любой криволинейной зависимости удерживания от состава подвижной фазы. В главе рассмотрены и подтверждены методом моделирования некоторые аспекты инкрементных характеристик в условиях градиентного элюирования а также методы определения эффективности в жидкостной хроматографии в том числе при асимметрии пиков вследствие нелинейности изотерм адсорбции.

Глава 8. Применение метода АОУ и инкрементного подхода Данная обширная глава посвящена практическому приложению предложенных в работе методологий.

Вначале с позиций ОАУ и инкрементного подхода рассмотрено хроматографическое поведение триглицеридов растительных масел и жирных кислот, их образовавших. Показано достаточно строгое выполнение инкрементных и межинкрементных соотношений, отличающихся большей общностью по сравнению с традиционно используемым в мировой практике подходом (различные варианты эквивалентных углеродных чисел).

Тщательный анализ полученных инкрементов в данном случае показал высокий потенциал метода в отношении взаимосвязи структура – удерживание. Метод ОАУ позволил предложить чисто хроматографический способ определения числа двойных связей в молекуле триглицерида. При этом показано, что инкрементных подход позволяет рассчитывать триглицеридный состав масел без использования догостоящего оборудования. Показана также возможность lg k (i) LogP lg k (i) предсказания изменения удерживания триглицеридов при изменении положения двойных связей по инкрементному подходу. Прикладная значимость работы в этом отношении состоит в обнаружении источников эссенциальных жирных кислот (включая кислоты с конъюгированными двойными связями) среди растений Белгородской флоры.

Затем рассматривается хроматографическое поведение каротиноидов.

При этом акцент сделан на ксантофиллы, имеющие особое значение в настоящее время как профилактические и лечебные субстанции. В растениях Белгородской флоры обнаружены богатые источники лютеина, зеаксантина, астаксантина и некоторых других каротиноидов. Показано хорошее выполнение инкрементных соотношений, позволяющее проводить идентификацию компонентов сложных смесей без предварительного омыления.

Полученные выводы подтверждены использованием двухмерной хроматографии.

Наконец, большое внимание уделено исследованию хроматографического поведения антоцианов, вызывающих все больший интерес, как натуральные красители с широким спектром лечебного действия. Установлены стандартные и необычные инкрементные соотношения, позволяющие выполнять анализ сложных смесей без труднодоступных стандартных веществ но с использованием данных, полученных в других лабораториях мира и найденных закономерностей удерживания. В исследованиях по данному направлению также определены наиболее важные источники антоцианов среди растений Белгородской флоры.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1. Показано, что введение модифицированного аргумента f(Ф) (функции состава подвижной фазы) позволяет линеаризовать зависимость удерживания всех сорбатов исследуемой выборки, lgk(i), от f() в условиях обращенофазовой хроматографии.

2. Впервые представлены основные положения метода относительного анализа удерживания (ОАУ), особенность метода – уход от прямой взаимосвязи параметров удерживания каждого индивидуального соединения от состава подвижной фазы. Линейность удерживания всех сорбатов относительно одного из них, выбранного в качестве реперного, позволяет сократить до минимума (до набора данных для двух составов подвижных фаз) необходимый базис данных для построения карты разделения сорбатов сложных смесей. Характер соотношений относительного удерживания позволяет проводить предварительную классификацию сорбатов и сопоставлять свойства органических модификаторов подвижных фаз.

3. На основе найденных закономерностей предложен системный подход к использованию инкрементов и инкрементных соотношений как альтернатива существующим вариантам QSRR. Предложен также усовершенствованный подход к расчету и использованию логарифма распределения вещества между октанолом-1 и водой в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4. Разработаны системные методы стандартизации стационарных фаз и сорбатов по гидрофобности и по активности остаточных силанольных групп в обращенно-фазовой ВЭЖХ.

5. Предложена оригинальная методология выяснения механизма удерживания сорбатов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, основанная на сопоставлении удерживания липофильных (с длинноцепочечными радикалами) и гидрофильных сорбатов на наборе стационарных фаз с изменяющейся длиной алкильных радикалов.

6. Использование компьютерного моделирования хроматографических процессов впервые позволило сопоставить инкрементные соотношения в градиентных и изократических условиях а также предложить альтернативный вариант исследования причин уширения пиков. Предложены формулы для расчета эффективности хроматографических систем в условиях относительно большого объема вводимой пробы, и в случае асимметричных пиков.

7. В рамках установления количественной взаимосвязи между строением и свойством сорбатов исследованы частные инкрементные и межинкрементные соотношения на примере удерживания триглицеридов, жирных кислот, каротиноидов и антоцианов. Предложен хроматографический метод, построенный на методологии метода ОАУ, позволяющий определять число двойных связей в радикалах кислот триглицеридов и предсказывать удерживание триглицеридов. Предложена система распознавания состава диэфирных фракций ксантофиллов, экспериментально подтвержденная методом двухмерной хроматографии. Найдены основные закономерности элюирования антоцианов в условиях изократической ОФ ВЭЖХ, позволяющие с высокой эффективностью устанавливать состав многокомпонентных смесей.

8. Применение предложенного метода анализа хроматографического поведения веществ позволило без использования труднодоступного оборудования выявить среди растений Белгородской флоры богатые источники биологически активных веществ: эссенциальных и конъюгированных жирных кислот, эфиров важнейших ксантофиллов – лютеина, зеаксантина и астаксантина, и антоцианов, возможное использование которых – медицинская и пищевая промышленности, кормление животных (птицеводство) для реализации программы пищевого дизайна.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Результаты данной работы опубликованы в более чем 100 публикациях (доложены на 22 конференциях и симпозиумах); из них в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Дейнека В.И., Староверов В.М., Фофанов Г.М., Балятинская Л.Н. Инкрементный подход при определении состава триглицеридов // Хим.-фарм. ж. 2002, Т36. №7. С. 44-47.

2. Дейнека В.И., Фофанов Г.М., Хлебников В.А., Балятинская Л.Н. Инкрементный подход в расчете жирнокислотного состава триглицеридов // Хранение и переработка сельхозсырья. 2002. №11. С.20-23.

3. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Габрук Н.Г.. Фофанов Г.М., Манохина Л.А., Сидельникова Н.А. Анализ растительных масел с использованием ВЭЖХ // Ж. аналит. химии. 2003.

Т.58. №12. С. 1294-1299.

4. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Староверов В.М., Борзенко О.Н. Инкрементный подход в анализе антоцианов // Химия природн. соединен. 2003. №2. С. 137-139.

5. Дейнека В.И. Эффективность хроматографических колонок в ВЭЖХ // Ж. физ. химии.

2004. Т.78. №1. С. 144-147.

6. Дейнека В.И., Григорьев А.М. Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина // Ж. физ. химии. 2004. Т. 78. №5. С.923-926.

7. Дейнека В.И., Савотченко С.Е., Фофанов Г.М., Балятинская Л.Н. Метод компьютерного моделирования процесса в ВЭЖХ с градиентным элюированием компонентов сложных смесей // Ж. физ. химии. 2004. Т. 78. №11. С..2054 –2058.

8. Дейнека В.И., Григорьев А.М. Определение антоцианов методом ВЭЖХ. Некоторые закономерности удерживания // Ж. аналит. химии. 2004. Т.59. №3. С. 305-309.

9. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Фофанов Г.М., Балятинская Л.Н. Идентификация жирных кислот в составе триглицеридов масел семян растений с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ // Растит. ресурсы. 2004. Т.40. №1. С. 104-112.

10. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Борзенко О.Н., Староверов В.М., Трубицын М.А. ВЭЖХ в анализе антоцианов: исследование цианидиновых гликозидов плодов растений рода Prunus // Хим.-фарм. ж. 2004. Т.38. №8 С.29-31.

11. Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Анализ растительных масел методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Ж. аналит. химии 2004. Т.59. №9.

С.895-898.

12. Дейнека В.И., Григорьев А.М. Исследование удерживания антоцианов в элюентах системы ацетонитрил – муравьиная кислота – вода // Ж. физ. химии. 2005. Т.79. №5. С.

900-903.

13. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Дейнека Л.А., Ермаков А.М., Сиротин А.А., Староверов В.М. Анализ компонентного состава антоцианов плодов и жирных кислот масел семян некоторых видов семейства Rosaceae методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Растительные ресурсы. 2005. Вып.1. С. 91 -98.

14. Дейнека В.И. Экспериментальное обоснование метода относительного анализа удерживания в ВЭЖХ // Ж. физ. химии. 2006. Т.80. №3. С. 507-510.

15. Дейнека В.И. Карта хроматографического разделения и инкрементные зависимости в методе относительного анализа удерживания в ВЭЖХ // Ж. физ. химии. 2006. Т.80. №3.

С. 511-516.

16. Дейнека В.И. Метод относительного анализа удерживания в ВЭЖХ. Сопоставление инкрементных зависимостей //Ж. физ. химии. 2006. Т.80. №4. С. 704-708.

17. Дейнека В.И. Метод относительного анализа удерживания в ВЭЖХ и термодинамика процессов разделения // Ж. физ. химии. 2006. Т. 80. №7 С. 1333-1335.

18. Дейнека В.И. Метод анализа относительного удерживания в ВЭЖХ. Определение, применения и роль параметра lgP системы н-октанол – вода // Ж. физ. химии. 2006. Т.80.

№6. С. 1083-1088.

19. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Дейнека Л.А., Шапошник Е.И., Староверов В.М.

Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе // Зав. лаб. 2006.

№3. С. 16-20.

20. Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Инкрементный подход в анализе каротиноидов методом ОФ ВЭЖХ. Разделение диэфиров ксантофиллов // Сорбц. и хроматограф. процессы. 2006. Т.6.

№3. С. 366-375.

21. Дейнека В.И. Некоторые термодинамические аспекты поведения веществ в условиях обращенно-фазовой хроматографии // Сорбц. и хроматограф. процессы. 2006. Т.6. №4. С.

571-580.

22. Дейнека В.И. Метод относительного анализа удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Стандартизация колонок // Сорбц. и хроматограф. процессы. 2006. Т.6. №4. С. 596-601.

23. Дейнека В.И. Гидрофобность стационарных фаз и сорбатов в обращенно-фазовой ВЭЖХ // Сорбц. и хроматогр. процессы. 2006. Т.6. Вып.6. ч.4. С. 1439-1449.

24. В.И. Дейнека Оценка влияния остаточных силанольных групп на суммарное удерживание в обращенно-фазовой хроматографии // Ж. физ. химии. 2007. Т.81. №3 С.

473-476.

25. Дейнека В.И. Метиленовая селективность в условиях обращенно-фазовой хроматографии одного ряда гомологов // Сорбц. и хроматогр. процессы. 2007. Т.7. Вып.2. С. 236-243.

26. Дейнека В.И. Новый метод оценки влияния остаточных силанольных групп на суммарное удерживание в обращенно-фазовой ВЭЖХ // Ж. аналит. химии 2007. Т.62. №7. С. 740744.

27. Дейнека В.И. Моделирование формы хроматографического пика по методу теоретических тарелок. // Ж. физич. химии. 2008. Т.82. №1. С. 120-124.

28. Дейнека В.И., Габрук Н.Г., Дейнека Л.А., Манохина Л.А. Триглицеридный состав масел косточек семи родов семейства розовых // Химия природн. соединен. 2002. №5. С. 333335.

29. Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Исследование триглицеридного состава масла Pinus Sibirica Du Tour // Химия природн. соединен. 2003. №2. С. 126-128.

30. Дейнека В.И., Маслов А.М., Борзенко О.Н., Сиротин А.А., Дейнека Л.А. Изменение триглицеридного состава масел семян Cucurbitaceae и Taraxacum officinalis по мере созревания // Химия природных соединений. 2003. №4. С. 255-256.

31. Дейнека В.И., Маслов А.В., Староверов В.М., Дейнека Л.А. Исследование масел из семян растений семейства Cucurbitaceae //Масложировая промышленность, 2003. №1. С. 34-35.

32. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Староверов В.М., Сиротин А.А. Основные антоцианы некоторых растений семейства Grossulariaceae // Химия природных соединений 2003.

№4. С. 324-325.

33. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Староверов В.М., Фесенко В.В. Основные антоцианы лепестков семи сортов Tulipa // Химия природных соединений 2003. №5. С. 414.

34. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Ермаков А.М. Антоцианы некоторых растений Белгородской флоры // Химия природных соединений 2003. №5. С. 412-413.

35. Дейнека В.И. Триглицеридный состав масел семян некоторых растений // Химия природных соединений 2003. №6. С. 433-436.

36. Deineka V.I., Deineka L.A. Triglyceride Types of Seed Oils. I. Certain Cultivated Plants of the Solanaceae Family // Chemistry of Natural Compounds. 2004. V.40. №2. Р. 184-185.

37. Deineka V.I., Deineka L.A. Type Composition of Triglycerides from Seed Oils. II.

Triglycerides from Certain Cultivated Plants of the Rosaceae Family // Chemistry of Natural Compounds. 2004. V.40. №3. Р. 293-294.

38. Deineka V.I., Sirotin A.A., Ospishcheva N.V. Type Composition of Triglyceride Seed Oils. III.

Triglycerides from Certain Plants of the Ranunculaceae Family // Chemistry of Natural Compounds. 2004. V.40. №.3. Р. 295-296.

39. Дейнека В.И., Хлебников В.А., Симаков С.В., Шапошников А.Ю., Савотченко С.Е.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ некоторых производных индола // Ж. физ. химии. 2004. Т. 78.

№10. С.1886-1890.

40. Староверов В.М., Дейнека В.И., Григорьев А.М., Прохода Е.Ф., Покровский М.В., Иванов В.В. ВЭЖХ-анализ водорастворимых витаминов в составе поливитаминного сиропа «Олиговит» // Хим.-фарм. ж. 2004, Т.38. №3. С. 54-56.

41. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Староверов В.М. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов.

Определение рутина // Хим.-фарм. ж. 2004. Т.38. №9 С.31-33.

42. Владимиров В.Л., Шапошников А.А., Дейнека Д.В., Вострикова С.И., Дейнека В.И.

Исследование каротиноидного состава желтка куриных яиц // Доклады РАСХН. 2005.

№6. С. 46-48.

43. Deineka V.I., Sorokopudov V.N., Deineka L.A., Shaposhnik E.I., Koltsov S.V. Anthocyans from Fruit of Some Plants of the Caprifoliaceae Family // Chemistry of Natural Compounds.

2005. v.41. №2. P. 162 – 164.

44. Deineka V.I., Deineka L.A., Sirotin A.A. Anthocyans from Fruit of Certain Plants of the Genus Prunus // Chemistry of Natural Compounds. 2005. v.41. №.2. P. 230 – 231.

45. Сорокопудов В.Н., Хлебников В.А., Дейнека В.И. Антоцианы некоторых растений семейства Berberidaceae // Химия растительного сырья. 2005. №4. С. 57-60.

46. Сорокопудов В.Н., Дейнека В.И., Лукина И.П., Дейнека Л.А. Антоцианы плодов некоторых видов рода Rubus L. из коллекции ботанического сада БелГУ // Химия растительного сырья. 2005. №4. С.61-65.

47. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Шапошник Е.И., Сорокопудов В.Н. Сиротин А.А.

Антоцианы черной смородины: экстракция и сушка // Известия Вузов. Сер. Химия и химическая технология. 2006. Т.49. вып.11. С. 77-80.

48. Сорокопудов В.Н., Хлебников В.А., Дейнека В.И. Опыт интродукции магонии падуболистной и перспективы ее использования // Вестник РАСХН. 2006. №3. С. 35-36.

49. Дейнека Л.А., Сорокопудов В.Н., Дейнека Л.А., Сиротин А.А., Шапошник Е.И., Головков А.В. Антоцианы плодов растений: опыт экстракции и сушки // Хранение и переработка сельхозсырья. 2006. №4. С.28-31.

50. Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Кедровое масло (масло семян Pinus sibirica): анализ и установление фальсификации методом ВЭЖХ // Химия растительного сырья. 2006. №3.

С. 21-26.

51. Дейнека В.И., Сиротин А.А., Дейнека Л.А., Сиротина С.С., Шаркунова Н.А. Сезонная динамика накопления астаксантина в лепестках Adonis aestivalis (Ranunculaceae) при выращивании в условиях черноземной зоны России (г. Белгород) // Растительные ресурсы. 2007. Т.43. №4. С.75-82.

52. Дейнека В.И., Хлебников В.А., Перистый В.А., Гостищев И.А., Проворная Т.В.

Особенности хроматографического поведения берберина в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ // Сорбц. и хроматогр. процессы. 2007. Т.7. Вып.2. С. 228-235.

53. Дейнека В.И., Лебедева О.Е., Лазебная М.А., Анисимович И.П. Сорбция солей органических азотистых оснований на глинистых минералах // Сорбц. и хроматогр.

процессы. 2007. Т.7. Вып.3. С. 473-480.

54. Дейнека В.И, Сорокопудов В.Н., Дейнека Л.А., Третьяков М.Ю. Исследование цветков Tagetes sp. как источника лютеина // Хим.-фарм. ж. 2007. Т.41. №10. С. 30-32.

55. Дейнека В.И., Хлебников В.А., Чулков А.Н., Дейнека Л.А., Перистый В.А., Сорокопудов В.Н. Антоцианы и алкалоиды: Особенности сорбции природными глинистыми минералами // Химия растительного сырья. 2007. № 2. С. 63-66.

56. Дейнека В.И. «Распределение или адсорбция» как основная дилемма ОФ ВЭЖХ // Ж.

физ. химии. 2008. т. 82. №6 С. 1028-1032.

57. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Анисимович И.П., Перистый В.А., Туртыгин А.В.

Использование обращенно-фазовой ВЭЖХ в установлении подлинности жиров и масел // Зав. лаб. 2008. Т.74. №3. С. 15-19.

58. Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Туртыгин А.В.. Обращенно-фазовая ВЭЖХ триацилглицеролов масел таману и ши //Масложировая промышленность, 2008. №1. С.

17-19.

59. Дейнека В.И., Хлебников В.А., Сорокопудов В.Н., Анисимович И.П. Хлорогеновая кислота плодов и листьев некоторых растений семейства Berberidaceae // Химия растительного сырья. 2008. № 1. С. 57-61.

60. Дейнека В.И., Сорокопудов В.Н., Дейнека Л.А., Третьяков М.Ю., Фесенко В.В.

Исследование плодов Physalis alkekengi L. как источника ксантофиллов // Хим.-фарм.

Журнал. 2008. Т.42. № 2. С. 36-37.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.