WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Нечаев Андрей Юрьевич

ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ

ЖИВОТНЫХ НА ПРЕДУБОЙНОМ ЭТАПЕ И ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ МЯСА ПРИ ПИЩЕВЫХ ЗООНОЗАХ

06.02.05 – ветеринарная санитария, экология, зоогигиена

и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

  Санкт-Петербург – 2010

Работа выполнена  на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ  ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Научный консультант:  доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты:  доктор ветеринарных наук, профессор

Алтухов Николай Михайлович

доктор ветеринарных наук, профессор

Долгов Виктор Андреевич

доктор ветеринарных наук, профессор

Мухина Нина Васильевна

Ведущая организация  ФГОУ ВПО  «Московский  государственный университет  прикладной биотехнологии»

Защита диссертации состоится «___»  _____________  2010  г.  в  ___  часов  на заседании диссертационного совета Д 220.059.02  при  ФГОУ  ВПО  «Санкт-Петербургская  государственная академия ветеринарной медицины»  по адресу:  196084,  г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  ФГОУ  ВПО  «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» 

Автореферат  разослан «___»  _____________  2010  г. 

Ученый секретарь

диссертационного совета  Урбан  В.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

Актуальность темы. Пищевые зоонозы входят в число наиболее опасных для человека и животных заболеваний. Они распространены как на территории Российской Федерации, так и в странах ближнего и дальнего зарубежья (В.П. Сергеев, 2001; Е.Н. Морозова, 2003; В.А. Долгов, 2005; Г.Г. Онищенко, 2005).

Постоянно меняющаяся ситуация, связанная с экологическими проблемами внешней среды, изменением резистентности организма животных и адаптации возбудителей к условиям обитания требует разработки новых методических подходов, отражающих динамику перемен в сообществе живых организмов и природы (В.В. Макаров, А.М. Смирнов, В.В. Сочнев, А.А. Алиев, 2004).

Работами  F. Feldhusen, J. Hartung(1997), K. Fehlhaber, T. Alter (1999) показано, что изменения условий внешней среды, воздействия стрессовых и физических нагрузок снижают защитные функции организма животных и создают условия, стимулирующие жизнедеятельность патогенных микроорганизмов. В таком сообществе только за счет специфической и неспецифической резистентности живой организм способен сохранить гомеостаз и обеспечить в процессе эволюции своё видовое постоянство.

Подобные, но более кратковременные, внешние и внутренние повреждающие факторы воздействуют на животных на предубойном этапе. Установлено, что у 15 – 30 % животных в этот период снижается качество самых ценных частей туши (A. Schtte, 1994; K. Troeger, 1995; F. Feldhusen, J. Hartung, 1997; C. braham, 2006).

Пункт 1.2. «Правил ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983) определяет различное отношение к убою животных в зависимости от их состояния, однако, до настоящего времени объективные критерии для определения предубойного состояния животных отсутствуют.

В литературе имеются сведения о снижении резистентности в условиях воздействия различных повреждающих факторов, но исследования показателей гомеостаза у животных на предубойном этапе не проводились (N.N. Lizko, 1987; E. Fazio, A. Ferlazzo, 2003).

Современные требования к качеству и безопасности продуктов питания предполагают всестороннюю комплексную оценку факторов, воздействующих не только на состояние защитных функций животного, но и на здоровье человека. Наиболее значимой опасностью для благополучия населения является микробное загрязнение продуктов возбудителями инфекций с пищевым путем передачи. Предупреждение пищевых зоонозов требует разработки новых подходов и критериев в системе ветеринарно-санитарного контроля, в том числе и внедрение высокочувствительных и эффективных методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа (Б.Д. Маккреди, Д.А. Чимера, 1999; Ю.К. Ерофеева, К.С. Янковский, Ю.Г. Костенко, 2003; С.А. Шевелева, И.М. Нитяга и соавторы, 2005; Н.Р. Ефимочкина, 2008). 

С ростом  распространенности и опасности пищевых зоонозов связана необходимость совместных усилий по изучению и оценке методов их выявления. Существующая в России система контроля за качеством и безопасностью продуктов животноводства существенно отличается от системы, принятой в странах ЕС и США (ФЗ №184 – ФЗ  «О техническом  регулировании» от 27.12.2002; СанПин 2.3.2.1078 – 01;  Л.Г. Подунова, 1996;  Р.К. Шарма, 1999;  В.И. Белоусов, А.С. Герасимов, 2004; Е.Н. Морозова, 2005; А.Н. Иванкин, Т.Г. Кузнецова, 2005).

Для улучшения доступа животноводческой продукции  России на мировой рынок требуется совершенствование и гармонизация международных и национальных методов ветеринарно-санитарной экспертизы. Оценка мяса и мясопродуктов в системе международных координат позволит более эффективно решать задачи ветеринарно-санитарной экспертизы по обеспечению стабильного благополучия и безопасности здоровья населения. Объединяющей основой содружественного решения проблем  является разработка новых и использование унифицированных методов, основанных на достижениях биохимии, физиологии, патофизиологии, микробиологии, генетики и применении современного аппаратурного оснащения. Это и определяет актуальность темы. Настоящая работа является результатом выполнения научно-исследовательских тем Санкт-Петербургской  государственной  академии  ветеринарной медицины с 1998 по 2008 гг. по кафедрам оперативной хирургии и ветеринарно-санитарной экспертизы.

Цель работы. Целью проведенных исследований является обоснование методов функциональной диагностики для определения состояния животных на предубойном этапе и оценки безопасности мяса при пищевых зоонозах.

Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью в работе были определены следующие задачи:

1. Провести комплексное исследование функции систем и органов, определяющих их способность сохранять один из показателей гомеостаза (рН крови) у  животных в условиях функциональных нагрузок.

2. Определить степень и характер нарушений показателей кислотно-щелочного баланса (КЩБ) у животных при дозированных функциональных нагрузках на предубойном этапе.

3. Изучить механизмы компенсации физиологических систем и органов, обеспечивающих сохранение функционального гомеостаза;

4. По интенсивности развития нарушений установить факт наличия и степени недостаточности функциональных систем, обеспечивающих постоянство рН крови.

5. Разработать и обосновать методические подходы для проведения функциональных исследований у животных на предубойном этапе.

6. Определить взаимосвязь изменений показателей КЩБ при функциональных на-грузках с результатами бактериологических исследований мезентериальных лимфоузлов.

7. Исследовать влияние функциональных нагрузок, полученных животными на предубойном этапе,  на физико-химические показатели мяса.

8. Определить эффективность методов,  применяемых  при  экспертизе  мяса на Tr. spiralis при наличии слабой инвазии.

9. Провести сравнительную оценку методов по выявлению по выявлению L. monocytogenes и сальмонелл в мясе и мясопродуктах.

10. Сопоставить результаты первичных посевов для избирательного роста листерий  и определить возможности для количественного определения L. monocytogenes в колбасных изделиях и продуктах из мяса.

Научная новизна работы. Впервые на основании комплексного физиологи-ческого исследования  проведена оценка состояния функции систем и органов, обеспечивающих постоянство одной из важнейших констант организма – рН крови в условиях воздействия различных повреждающих факторов внешней и внутренней среды (физических, биологических, стрессовых и др.) на различных стадиях предубойного этапа, связанного с транспортировкой животных к месту убоя. Установлено, что количественная характеристика критериев, обеспечивающих кислотно-щелочной баланс, позволяет не только выявить факт нарушения функционального гомеостаза, но и определить градации степеней недостаточности функциональных систем и органов, обеспечивающих постоянство рН крови.

Впервые показано, что при различных функциональных нагрузках, обусловленных расстоянием от фермы (хозяйства) до убойного пункта и временем транспортировки, в организме животных имеет место тесная связь между соотношением аэробных и анаэробных механизмов энергообразования и величиной рН крови.

Установлена взаимосвязь между физиологическими параметрами, характеризующими функцию систем и органов, лимитирующих окислительные процессы в организме свиней в условиях различных нагрузок, и  физико-химическими и микробиологическими показателями мяса.

Впервые введены количественные и качественные критерии, позволяющие определить резистентность (устойчивость) систем и органов, опираясь на их функциональное состояние.  Это даст возможность предопределить  и  объективизировать

экспертное заключение о состоянии животного, своевременно устранить выявленные нарушения и в конечном итоге обеспечить выпуск качественной и безопасной мясной продукции.

Предложен унифицированный подход к результатам исследований, полученных различными методами, применяемыми для выявления трихинелл при слабой инвазии, сальмонелл  и  L. monocytogenes  на основе критериев эффективности, специфичности и чуствительности.

Определены пути совершенствования при выборе питательных сред для идентификации бактерий L. monocytogenes и их количественного определения в колбасных изделиях и продуктах из мяса в соответствии с международными требованиями.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Установленные функциональные критерии определения состояния животных и проведение сравнительной оценки методов по выявлению патогенных листерий, сальмонелл и трихинелл в мясе позволяют:

- в комплексе с клинической картиной выявить функциональные нарушения, обеспечивающие гомеостаз, и дать объективную оценку состояния резистентности животного;

- провести коррекцию выявленных нарушений физиологических систем, обеспечивающих постоянство рН крови, у животных до убоя под контролем показателей кислотно-щелочного баланса;

-  предупредить микробную контаминацию туш;

-  повысить качество и безопасность мяса;

- использовать функциональные методы в практике ветсанэкспертизы на пред-убойном этапе, ввести количественную характеристику показателей, определяющих функциональное состояние животного и устанавливать не только наличие факта недостаточности той или иной  физиологической системы,  ответственной за гомеостаз, но и определить степень нарушений;

- обобщить опыт, выбрать и усовершенствовать методы для выявления листерий и сальмонелл, а также для определения трихинелл в условиях слабой инвазии мяса.

Применение современного технического оснащения позволяет в полевых условиях контролировать функцию физиологических систем и органов животных, обеспечивающих резистентность организма. Их применение объективизирует заключение о состоянии животных и дает возможность провести мероприятия, направленные на предупреждение пищевых зоонозов. Суммы средств, вложенных на приобретение такой аппаратуры, значительно меньше, чем суммы затрат на рабочие и лабораторные издержки при выявлении возбудителей и значительно уступают экономическим потерям, связанным с борьбой и ликвидацией последствий  заболеваний.

По результатам исследования выпущены методические рекомендации:

  1. Исследование мяса и мясопродуктов на цистицеркоз и трихинеллез (утв. методическим советом Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (СПбГАВМ), протокол №4 от  19.06.2001 г.)
  1. Метод полимеразной цепной реакции (утв. методическим советом СПбГАВМ, протокол №1 от  30.11.2005 г.)

3.  Применение метода ПЦР в ветеринарной практике (утв.  методическим советом СПбГАВМ,  протокол № 1 от 30.11.2005 г.)

  1. Показатели кислотно-щелочного баланса и рН-метрия в практике ветеринарно-санитарной экспертизы (утв.  методическим советом СПбГАВМ, протокол №2 от 28.02.2007 г.)
  2. Оценка предубойного состояния животных на основе показателей кислотно-щелочного баланса (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 24.06.2009 г.).
  3. Количественное определение Listeria monocytogenes в колбасных изделиях и продуктах из мяса  (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН  24.06.2009 г.).

Материалы работы использованы в учебном процессе на кафедре ветеринарной санитарии и гигиены ФГОУ ВПО СПбГАВМ, на кафедре ветсанэкспертизы и акушерства Якутской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы Витебской ордена «Знак Почета» государственной академии ветеринарной медицины и Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Результаты исследований с положительным эффектом применяются в хозяйствах Ленинградской области и госветучреждениях Санкт-Петербурга при определении предубойного состояния животных и оценке методов выявления возбудителей пищевых зоонозов по критериям чувствительности и специфичности.

Апробация  работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (1997–2009гг.), на заседаниях методической комиссии и ученого совета СПбГАВМ (1998–2009гг.), на заседании издательских советов СПбГАВМ (2001–2009), на межкафедральных заседаниях  профессорско-преподавательского состава СПбГАВМ (2000–2008), на 48-й и 49-й международных научных конференциях «Гигиена продуктов животного происхождения» (Гармиш-Партенкирхен, Германия 25–28.09.2007г. и 29.09–02.10.2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. «Функциональная диагностика» – новое направление в проведении клинико-функционального заключения при оценке состояния животных на предубойном этапе.
  2. Методы функциональной диагностики обеспечивают индивидуальную оценку функционального состояния органов и систем, определяющих рН крови.
  3. Показатель гомеостаза рН крови позволяет оценить резистентность организма животного в меняющихся условиях внешней среды и воздействия различных повреждающих факторов.
  4. Имеется взаимосвязь между величиной рН крови у животного на предубойном этапе и безопасностью и качеством мяса.
  5. Информация о состоянии кислотно-щелочного баланса по поддержанию гомеостаза  позволяет провести коррекцию рН крови у животных на предубойном этапе.
  6. Критерии рациональных подходов и методов ветеринарно-санитарной экспертизы при оценке безопасности мяса:

- при слабой инвазии мяса личинками Tr. spiralis;

- при выборе методов для выявления в мясопродуктах сальмонелл и L.monocytogenes

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опублико-вано 40 научных работ, 10 из которых связаны с методами функциональной диагностики по определению состояния животных и возможности его коррекции при воздействии по-вреждающих факторов (оперативных вмешательств, физических, химических и стрессовых нагрузок), 30 посвящены вопросам оценки безопасности мяса при пищевых зоонозах, включая 2 статьи в зарубежных изданиях. Выпущено 1 учебное пособие и 6 методических рекомендаций. В изданиях, регламентированных ВАК РФ для докторских диссертаций, опубликовано 11 работ, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемой проблеме.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 291 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Список литературы включает 437 источников, в том числе 210 отечественных и 227 иностранных авторов. Материал иллюстрирован 44 таблицами и 25 рисунками.

  1. СОБСТВЕННЫЕ  ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты, методы  и  объемы  исследований. Работа выполнена  на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ  ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Для определения функциональных методов исследования при экспертном  заключении о состоянии животного было обследовано на различных стадиях предубойного этапа 96 молодых свиней. Свиньи относились к стресс-устойчивой белой латвийской породе и принадлежали фермерским хозяйствам Краславского района. Они были представлены различным полом (40– и 56–), подбирались по сходной зоотехнической характеристике: возрасту (от 6 до 9 месяцев) и массе (80 – 100 кг). В качестве дозированной по длительности и интенсивности функциональной нагрузки выбраны естественные физические и стрессовые факторы, действующие на животных при транспортировке к месту убоя. Животные транспортировались из ферм и хозяйств, находящихся в радиусе до 3 км; 50км и 70 км. Время в пути при этом составляло соответственно до 0,5 часа; 1,0 часа и 1,5 часа. По степени различали легкую, среднюю (умеренную) и тяжелую функциональную нагрузку и соответственно выделяли три группы свиней: I группу, получивших легкую нагрузку, составляли 35 животных; II группа, перенесших среднюю нагрузку, включала 31 животное; III группа, которым предъявлялась тяжелая нагрузка, состояла из 30 животных. 

  Для определения реакции физиологических систем и органов на функциональную нагрузку выбран комплекс функциональных показателей, который наиболее отчетливо характеризовали исследуемую систему или орган, отвечали цели исследования при работе с животными в естественных производственных условиях (табл.1).

Таблица 1

Комплекс функциональных показателей для характеристики физиологических систем и органов, обеспечивающих резистентность животных при транспортировке

Исследуемые физиологические реакции

Характеристика показателей

Резистентность организма

рН  крови

Уровень энергообмена

HL – концентрация молочной кислоты (ммоль/л)

НGl – концентрация глюкозы (ммоль/л)

ВЕ – дефицит буферных оснований (мэкв/л)

Степень оксигенации крови

SаO2 – насыщение  крови  кислородом (%)

РаО2 – напряжение кислорода крови (мм рт.ст.)

Эффективность

легочного газообмена

и кровообращения

РаСО2 – напряжение углекислого

  газа в крови (мм рт.ст.)

ЧД – частота дыхания в минуту

ЧП – частота пульса в минуту

Физиологические параметры регистрировали на каждой из стадий предубойного периода: перед транспортировкой (исходная стадия); после транспортировки – стадия прибытия на убойный пункт; предубойная стадия – непосредственно перед убоем. Продолжительность предубойной стадии составляла во всех группах  в среднем 1 час.

Резистентность организма животных оценивали по их способности сохранять один из интегральных показателей гомеостаза – рН крови. Зависимость рН от функции систем и органов, определяющих метаболический и дыхательный компоненты, представлена в формуле (1), вытекающей из уравнения Гендерсона-Гассельбаха:

[метаболический  компонент]

рН  (1)

  [дыхательный  компонент]

Это отношение отражает важность физиологических и химических буферных систем, обеспечивающих регулировку концентрации ионов водорода. О возможностях этих систем выполнить гомеостатическую задачу в условиях функциональных нагрузок судили по показателям кислотно-щелочного баланса в артериальной крови: напряжению углекислого газа (РаСО2, мм.рт.ст), дефициту буферных оснований (ВЕ, мэкв/л), отражающих соответственно дыхательный и метаболический компоненты в формуле (1).

Показатели КЩБ определяли микрометодом Аструпа в модификации Зиггард-Андерсона на газоанализаторе АВL – 520, позволявшим одновременно регистрировать  напряжение кислорода (РаО2, мм.рт.ст) в артериальной крови.

Взятие крови осуществлялось в гепаринизированные  микрокапилляры ( 0,7 мл) или шприцы ( 1,0 мл). В последнем случае вместо прокола кожи выполняли пункцию ушной артерии. После взятия проб крови капилляр или шприц герметизировали. Консервация проб гепарином позволяла проводить исследование в течение 24 часов после их отбора.

Источником энергии, обеспечивающим функцию органов и систем животного, являются окислительные процессы. Достаточность обеспечения окислительных процессов кислородом до и после функциональных нагрузок определяли по показателям насыщения крови кислородом(SaO2%) и напряжения кислорода (РаО2,мм.рт.ст) в артериальной крови. Для наблюдения за динамикой изменения величины SaO2% использовали пульсоксиметр.

Интенсивность окислительных процессов и соотношение аэробных и анаэробных механизмов энергообразования в условиях воздействия функциональных нагрузок оценивали по показателям лактатметра (Lactate Scout) и глюкометра (Smart Scan), определяющих концентрацию молочной кислоты (HL, ммоль/л) и концентрацию глюкозы (HGl, ммоль/л) в крови.

Таким образом, выбранные для функциональных исследований методы базировались на применении современной доступной и распространенной в медицине, но недостаточно используемой при обследовании животных, диагностической технике. Техническое исполнение многих из приборов предусматривало их применение в полевых условиях (рН-метр, газоанализатор КЩБ, пульсоксиметр, глюкометр, лактатметр). Возможность калибровки приборов, количественный характер регистрируемых био-параметров обеспечивали сравнение полученных данных на различных стадиях предубойного этапа. Применение стандартизированной аппаратуры  позволило провести унификацию подходов к анализу результатов исследования.

Результаты применения функциональных исследований в практике клинических и экспертных дисциплин в медицине (С.П. Боткин, 1888; С.С. Зимницкий, 1927; М.В. Черноруцкий, 1954; J.H. Comroe, 1957; И.И. Лихницкая, 1960), всё более широкое их использование в ветеринарии для решения задач, связанных с определением и коррекцией нарушений жизнеобеспечивающих систем и органов при неотложных состояниях и оперативных вмешательствах в условиях воздействия различных анестетиков (Б.С. Семенов, А.В. Яшин, А.Ю.Нечаев, 2000; М. Marahrens, 1994),  позволили  сформулировать следующие принципы применения функциональных методов для животных:

1. Функциональная нагрузка, дозированная по длительности и интенсивности, применяется там, где есть необходимость выяснения реакции физиологических систем или органа.

  1. Для учета реакции на функциональную нагрузку выбираются методы, которые наиболее отчетливо характеризуют исследуемую систему или орган.
  2. Трактовка данных функциональных исследований основана на сопоставлении нормативных (исходных) данных и физиологических параметров, полученных после функциональной нагрузки.

В целом при функциональном исследовании на различных стадиях предубойного периода у 96 животных  проведена регистрация 2870 физиологических параметров.

Для определения степени контаминации сальмонеллами проводилось бактериологическое исследование мезентериальных лимфоузлов 95 туш  сразу после убоя. Исследование осуществляли согласно  ГОСТ 30519 – 97/ ГОСТ Р 50480 – 93 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella», ГОСТ 21237 – 75 «Мясо. Методы бактериологического анализа»  и  международному стандарту ISO 6579 : 2002.

В послеубойный период было снято 475 физико-химических показателей мяса. Определение рН проводили потенциометром в водной вытяжке проб мяса по общепринятой методике с помощью лабораторного рН-метра «Статус». Для исследования брали пробы из m.semimembranosus. Измерения проводили в течение 24 часов  после убоя в  интервалах  0,5; 1; 2; 6; 24 часа у 95 туш. Данные измерений рН мяса в водной вытяжке сопоставляли с результатами исследований, полученных при определении  рН внутри куска мяса электропотенциальным методом  с помощью электрода, встроенного в клинок ножа (рН-метр «Статус-2»), применение которого позволяло исключить предварительную пробоподготовку и ускорить исследование.

С целью сравнительного анализа  и оценки эффективности различных методов, используемых в отечественной  и зарубежной практике ветсанэкспертизы, проводили лабораторные исследования 50 проб мяса и мясопродуктов на наличие бактерий рода Listeria и бактерий рода Salmonella. Материалом для определения листерий и сальмонелл служили образцы мясного сырья, мясных полуфабрикатов и готовых мясопродуктов. Отбор проб и их исследование на микробиологические показатели качества и безопасности оценивали по характеристикам, нормируемым ГОСТ 26668 – 85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов». В процессе работы применялись: культуральные методы с использованием хромогенных сред; иммуноферментный метод определения на автоматическом анализаторе VIDAS; молекулярно-биологический метод.

Оценка морфологических, культуральных и серологических признаков осуществлялась в соответствии с нормативными документами: ГОСТ 21237 – 75 «Мясо. Методы бактериологического анализа», ГОСТ 30519 – 97/ ГОСТ Р 50480 – 93 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella» и ГОСТ Р 51921–2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes». Подтверждение положительных результатов  и  идентификацию выделенных бактерий проводили с использованием биохимических панелей API  Listeria, API 20 E – Testkit («BioMerieux»)  и  Enterotube (ISO 6579 : 2002). Исследования выделенных культур на хромогенных средах XLD (Xylose-Lysin-Desoxycholat Agar)  и  ALOA (Agar Listeria Ottaviani Agosti) производства фирмы  «BioMerieux»  (Франция) выполняли  согласно инструкциям по их применению.

Иммуноферментный метод (фермент-связанного флуоресцентного анализа)  определения патогенных листерий и сальмонелл проводили на автоматическом анализаторе VIDAS с использованием наборов тестов VIDAS  Salmonella (SLM)  и  VIDAS Listeria monocytogenes II (LMO 2) производства фирмы  «BioMerieux» (Франция). 

Молекулярно-биологический метод в реакции полимеразно-цепной реакции (ПЦР) использовали для индикации сальмонелл и патогенных листерий. При выполнении метода Real-Time PCR применяли праймеры (iQ-Check-Salmonella Kit; iQ-Check- Listeria monocytogenes Kit)  и реагенты фирмы «Bio-Rad», Германия.

Для сравнения эффективности регламентированных методов по выявлению трихинелл при слабом заражении мяса исследовано 144 мышечных пробы. Пробы отбирали из жевательных мышц, ножек дифрагмы, межреберных мышщ, мышц живота, мышц сгибателей и разгибателей плечевого пояса инвазированной трихинеллами свиной туши.  Исследования проводили согласно МУК по лабораторной диагностике трихинеллёза животных (утв.  Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 28.10.1998 г.)  и  Предписания Комиссии ЕС № 2075/2005 от 5.12.2005 г.

При компрессорной трихинеллоскопии из исследуемых проб по ходу мышечных волокон вырезались срезы (56 срезов с каждой пробы) величиной с овсяное зернышко (20 мм2), которые раздавливали между стеклами компрессориума и просматривали под микроскопом при 60-кратном увеличении.

Для исследования методом переваривания в искусственном желудочном соке была использована принятая в странах ЕС в качестве стандартной методика автоматического переваривания в аппарате для выделения личинок трихинелл Trichomatic–35®. Одновременно в аппарате исследовались до 35 мышечных проб массой 1,0 г. Состав искусственного желудочного сока был следующим: медицинский пепсин – 7г., 8,5% соляная кислота – 30 мл, вода – 400мл. Время переваривания составляло 10 минут. По истечении этого времени под микроскопом исследовалось наличие личинок трихинелл на мембранном фильтре аппарата.

В целом при сравнительном анализе и оценке различных методов для выявления возбудителей трихинеллеза, сальмонеллеза, листериоза в исследуемых пробах было использовано 5 методик, принятых в отечественной и зарубежной практике ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов.

Результаты проведенных исследований обрабатывались с использованием методов вариационной статистики на персональном компьютере с использованием программы:  Microsoft Excel 2003, «БИОСТАТ». Достоверность различий показателей в сопоставляемых результатах определялась по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при значениях р‹0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Комплексная функционально-диагностическая оценка показателей дыхания, кровообращения и энергообмена у свиней на предубойном этапе

В соответствии с принципами проведения функциональных исследований на всех стадиях предубойного этапа проведена сравнительная оценка физиологических показателей, характеризующих возможности органов и систем животных по обеспечению постоянства рН крови в условиях различных дозированных нагрузок, связанных с транспортировкой к месту убоя.

Полученные исходные физиологические параметры (перед транспортировкой) и их динамика по прибытии на убойный пункт и перед убоем у животных, получавших легкую (I группа), умеренную (II группа) и тяжелую нагрузку (III группа), представлены в таблице 2.

Содержание глюкозы в крови перед транспортировкой составляло у свиней I группы 5,1 ± 0,1 ммоль/л, во II группе – 4,7 ± 0,3 ммоль/л, в III группе – 5,3 ± 0,2 ммоль/л. Статистическая достоверность между значениями I-й и II-й групп составляла p>0,05 при tSt=1,38, I-й и III-й групп – p>0,05 при tSt=1,16, II-й и III-й групп p>0,05 при tSt=1,66. Таким образом, существенных различий в исходной концентрации глюкозы в крови у животных всех групп до транспортировки не выявлено.

Таблица 2

Функциональные показатели физиологических систем и органов у свиней

на различных стадиях предубойного этапа

  Стадии  пред-

  убойного

  этапа

Показатели

Перед транспортировкой– А

По прибытии  на  убойный пункт – В

Перед

убоем –

С

Достоверность

различий

А–В  А–С В– С

НGl, ммоль/л

HL, ммоль/л

ВЕ, мэкв/л

ЧД  в 1 мин.

РаСО2, мм рт.ст.

ЧП  в 1 мин.

РаО2, мм рт.ст.

SаO2, %

Л  Е  Г  К  А  Я Н  А  Г  Р  У  З  К  А

5,1 ± 0,1

5,6 ± 0,1

-0,3 ± 0,28

14 ± 0,6

41,5 ± 0,7

69 ± 1,0

96,4 ± 0,1

97,7 ± 0,07

8,0 ± 0,2

7,7 ± 0,3

-1,6 ± 0,24

28 ± 0,7

38,7 ± 0,9

88 ± 1,0

92,7 ± 0,2

95,1 ± 0,13

7,4 ± 0,4

6,4 ± 0,1

-0,9 ± 0,32

21 ± 0,4

39,5 ± 0,7

77 ± 1,0

94,6 ± 0,2

96,4 ± 0,18

* *  * *  NS

* *  * *  * *

* *  NS  NS

* *  * *  * *

* * NS

* *  * *  * *

* *  * *  * *

* *  * *  * *

НGl, ммоль/л

HL, ммоль/л

ВЕ, мэкв/л

ЧД  в 1 мин.

РаСО2, мм рт.ст.

ЧП  в 1 мин.

РаО2, мм рт.ст.

SаO2, %

У  М  Е  Р  Е  Н  Н  А  Я Н  А  Г  Р  У  З  К  А

4,7 ± 0,3

5,5 ± 0,1

-0,4 ± 0,26

15 ± 0,4

42,3 ± 0,4

70 ± 1,3

96,4 ± 0,1

97,5 ± 0,07

8,4 ± 0,3

10,2 ± 0,3

-1,8 ± 0,64

36 ± 1,3

37,6 ± 2,3

94 ± 0,8

91,4 ± 0,1

94,8 ± 0,05

7,0 ± 0,2

12,9 ± 0,4

-1.2 ± 0,57

27 ± 1,0

38,1 ± 1,0

80 ± 0,9

93,8 ± 0,1

96,1 ± 0,07

* *  * *  * *

* *  * *  * *

* * NS

* *  * *  * *

* * *  NS

* *  * *  * *

* *  * *  * *

* *  * *  * *

НGl, ммоль/л

HL, ммоль/л

ВЕ, мэкв/л

ЧД  в 1 мин.

РаСО2, мм рт.ст.

ЧП  в 1 мин.

РаО2, мм рт.ст.

SаO2, %

Т  Я  Ж  Е  Л  А  Я Н  А  Г  Р  У  З  К  А

5,3 ± 0,2

5,8 ± 0,3

-0,3 ± 0,40

14 ± 0,5

40,7 ± 0,4

70 ± 1,1

96,6 ± 0,1

97,7 ± 0,08

10,0 ± 0,1

12,9 ± 0,4

-2,2 ± 0,54

45 ± 1,8

34,4 ± 1,6

98 ± 1,1

89,1 ± 0,3

94,3 ± 0,18

8,4 ± 0,2

9,1 ± 0,4

-1,7 ± 0,39

29 ± 0,6

37,1 ± 0,7

84 ± 1,0

91,3 ± 0,1

94,8 ± 0,13

* *  * *  * *

* *  * *  * *

* *  NS  NS

* *  * *  * *

* *  * *  NS

* *  * *  * *

* *  * *  * *

* *  * *  *

Уровни значимости: NS – p 0,05 – незначимый; * –  p < 0,05 – значимый;

  * * – p < 0,01 – высокозначимый

По прибытии на убойный пункт во всех трех группах отмечалось увеличение содержания глюкозы в крови. После легкой функциональной нагрузки (I группа) концентрация глюкозы составляла 8,0 ± 0,2 ммоль/л. Во II группе животных, перенесших среднюю нагрузку величина НGl увеличилась до 8,4 ± 0,3 ммоль/л. Наиболее существен-ное увеличение концентрации глюкозы в крови отмечалось после интенсивной и длительной нагрузки, связанной с транспортировкой, у свиней III группы. Содержание глюкозы составляло 10,0 ± 0,1 ммоль/л. В  I группе концентрация глюкозы в крови повысилась на 56,8% (p < 0,01 при tSt=13,18), во II группе – 78,7% (p < 0,01 при tSt=8,81), в III группе животных превышение величины НGl составляло 88,7% (p < 0,01 при tSt=21,36).

Полученные данные свидетельствуют о высоко значимых (p < 0,01) превышениях исходных значений величины содержания глюкозы в крови в каждой из трех групп животных после транспортировки. При этом наибольшее увеличение (на 88,7%) отмечалось у свиней, получавших тяжелую нагрузку.

Такая динамика изменений концентрации глюкозы в крови связана с возрастающими  энергетическими  потребностями  организма свиней. По данным W. Kraft, N. M. Drr (1999), T. Horsch (2003), Hambrecht et al. (2004) выброс в кровь дополнительного количества глюкозы происходит за счет усиления печеночного гликолиза и направлен на увеличение мышечного гликогена. Последний необходим для более интенсивного метаболизма в мышечной ткани у животных, получавших длительные физические и стрессовые нагрузки.

Результаты исследований показали, что через час после транспортировки во всех трех группах концентрация глюкозы в крови упала в среднем на 13,7%, но оставалась достоверно выше средних исходных величин. В первой группе животных показатель  HGl оставался на 45,1% (р<0,01 при tSt= 5,61), во второй – на 48,9% (р<0,01 при tSt= 6,39) и в третьей – на 58,5% (р<0,01 при tSt= 11,07) выше исходных значений.

Таким образом, и после транспортировки окислительные процессы находились на более высоком энергетическом уровне.

Но для окислительных процессов, обеспечивающих аэробное энергообразование и нормальное функционирование органов и тканей в условиях нагрузок, необходимо достаточное количество кислорода. Кислород в организм животных поступает за счет легочного газообмена, кислородсвязывающей функции крови и системы кровообращения.

Приведенные в таблице 2 данные показывают, что частота дыхания у животных по мере увеличения времени в пути и расстояния до убойного пункта возросла в I группе в 2 раза, во II-й –  в 2,4 раза, в III-й – в 3,2 раза по сравнению с исходными величинами до транспортировки. Но наблюдаемое изменение частоты дыхания у животных  в ответ на физические  и стрессовые нагрузки не указывает на повышение эффективности легочного газообмена.

Как свидетельствуют ранее проведенные работы, наиболее информативным показателем эффективности газообмена в условиях воздействия на животных повреждающих факторов является величина напряжения углекислого газа в артериальной крови (Д.П. Дворецкий, 1994; Б.С. Семенов, А.Ю. Нечаев, 2002).

Проведенные исследования показали, что у всех животных увеличение нагрузки сопровождалось различной степенью снижения напряжения СО2 (РаСО2) в артериальной крови. Наиболее статистически достоверные различия в динамике этого показателя выявлены у свиней III группы (табл.2). По сравнению с исходным значением (40,7 ± 0,4 мм рт.ст.) величина РаСО2 в этой группе составляла после транспортировки 34,4 ± 1,6 мм рт.ст., p < 0,01 при tSt=3,82. За период восстановления показатель РаСО2 увеличился до 37,1 ± 0,7 мм рт.ст., но достоверные различия сохранились только с исходной величиной (p<0,01 при tSt=4,50). Анализ динамики величины РаСО2 свидетельствует об изменении функции внешнего дыхания у животных при тяжелой нагрузке в сторону гипервентиляции, более выраженной сразу после транспортировки.

О гипервентиляционном сдвиге в функции легких при предъявлении животным легких и средних нагрузок указывают достоверное снижение показателя РаСО2. В I группе величина напряжения углекислого газа снизилась после транспортировки по сравнению с исходной величиной на 2,8 мм рт.ст. (р<0,05 при tSt=2,46), а во II группе на 4,7 мм рт.ст. (р<0,05 при tSt=2,07). В этих группах, как и при тяжелой нагрузке, уровень вентиляции оставался повышенным и не восстановился до исходного уровня перед убоем.

Обобщение полученных данных по исследованию респираторного компонента, определяющего величину рН крови (формула 1), свидетельствует о том, что регулирующие механизмы в условиях различных дозированных нагрузок стремятся за счет увеличения частоты дыхания и гипервентиляции легких обеспечить сохранение постоянства рН крови животных.

Вторым функциональным звеном, обеспечивающим в процессе дыхания доставку кислорода к тканям, является кровь. Для характеристики крови как газотранспортной системы у животных проведено исследование частоты сердечных сокращений (ЧСС), напряжения кислорода в артериальной крови (РаО2) и степени насыщения крови кислородом (SаО2) на различных стадиях предубойного этапа (табл. 2).

Данные, полученные при исследовании ЧСС, указывают  на высокодостоверную разницу в величине пульса до и после транспортировки. Наиболее значимое различие отмечалось у свиней, преодолевших наибольшее расстояние до убойного пункта. У них частота сердечных сокращений увеличилась на 40% (с 70 ± 1,1  до  98 ± 1,1, p < 0,01 при tst=17,94). По мере снижения функциональной нагрузки отмечалось меньшее увеличение величины ЧСС: во II группе на 34% (с 70 ± 1,3  до  94 ± 0,8, p < 0,01 при tst=15,69), в I группе на 28% (с 69 ± 1,0  до 88 ± 1,0, p < 0,01 при tst=13,48). Такую динамику физиологических параметров подтверждает опыт других исследователей, свидетельствующий о том, что регистрация того или иного показателя в условиях нагрузок в процентах исходной величины дает возможность наиболее точно выражать результаты функциональных исследований (Н.А. Агаджанян, А.И. Ефимов, 1986).

Анализ данных, представленных в таблице 2, свидетельствуют о прямой зависимости увеличения частоты пульса от величины нагрузки. Следует отметить, что после тяжелой нагрузки у животных не происходило восстановление ЧСС до исходного уровня. После восстановительного периода (перед убоем) его величина оставалась достоверно выше исходного уровня (84 ± 1,0  против  70 ± 1,1, p < 0,01  при tst=10,74), то есть оставалось компенсаторное напряжение системы кровообращения, связанное с необходимостью дополнительного снабжения тканей кислородом.

Результаты исследования напряжения кислорода в крови, полученные у свиней после транспортировки, показали изменение её величины по мере возрастания функциональной нагрузки. Различия в сторону уменьшения по сравнению с исходными величинами были выявлены у всех групп животных. В I группе наблюдалось падение величины РаО2 на 3,8% (с 96,4 ± 0,1 мм рт. ст. до 92,7 ± 0,2 мм рт.ст., p < 0,01 при tst=16,82), во II группе РаО2 уменьшилось по прибытии на убойный пункт на 5,2% (с 96,4 ± 0,1 мм рт. ст. до 91,4 ± 0,1 мм рт.ст., p<0,01 при tst=35,71). При тяжелой нагрузке отмечалось наиболее значимое уменьшение показателя напряжения кислорода в крови и составляло 7,8% (с 96,6 ± 0,1 мм рт. ст. до 89,1 ± 0,3 мм рт.ст., p < 0,01 при tst=23,44). 

Таким образом, с возрастанием нагрузки уменьшалась величина  РаО2.  Наибольшие изменения отмечались у свиней, перенесших при транспортировке наиболее тяжелую нагрузку.

Анализируя полученные данные, следует отметить, что все регистрируемые физиологические параметры (частота дыхания, напряжение углекислого газа в артериальной крови, частота сердечных сокращений, напряжение кислорода в артериальной крови) характеризуют реакцию органов и систем, составляющих функциональные звенья, определяющие уровень насыщения крови кислородом. Сравнительный анализ динамики изменения полученных показателей по количественным характеристикам позволяет выделить гипердинамическую и гиподинамическую реакцию органов и систем в ответ на предъявленную организму нагрузку. Реакцию легких, малого и большого круга кровообращения по полученным физиологическим параметрам следует оценить как гипердинамическую. Она направлена на пополнение возросших потребностей организма в кислороде в условиях нагрузки и стресса и свидетельствует о наличии резервных возможностей органов и систем, обеспечивающих доставку кислорода к тканям.

Но резервы органов и систем ограничены. Снижение функциональных возможностей организма животных связано как с явной и скрытой патологией, так и с тяжестью перенесенных нагрузок.

Полученные результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что на фоне выраженной гипердинамической функциональной реакции звеньев, обеспечивающих напряжение кислорода в крови при тяжелой нагрузке, наблюдается достоверное различие в сторону снижения этого показателя с исходным значением после восстановительного периода. Величина РаО2 перед убоем у животных после тяжелой нагрузки составляла 91,3 ± 0,1 мм рт.ст. и достоверно (p < 0,01 при tst=37,86) отличалась от исходного уровня (96,6 ±0,1 мм рт.ст.). За период нахождения на убойном пункте величина РаО2 не восстановилась до начального значения.

У животных, перенесших легкую и среднюю нагрузку, за восстановительный период показатель достоверности различий напряжения кислорода  в  крови  соответст-венно  составлял tst = 8,18 и tst = 18,57 и  отличался от исходной величины (p < 0,01).

Такое различие в величине РаО2 перед убоем указывает на гиподинамическую реакцию и связано со снижением функциональных возможностей у свиней по мере возрастания нагрузок.

Одним из механизмов компенсации, направленном на достаточное обеспечение тканей кислородом, в условиях изменения величины РаО2 является доставка его к тканям не за счет растворения в крови, а путем связывания с гемоглобином.

Принимая во внимание S-образную форму кривой диссоциации оксигемоглобина с очень крутым подъемом (между РаО2 10–15 мм рт.ст.) и пологой частью (между РаО2 70–100 мм рт.ст.), можно ожидать, что взаимоотношение колебаний между величинами РаО2 и SаО2 будет определяться пологой частью.

Исследования SаО2 подтвердили такое предположение. Средний уровень насыщения артериальной крови кислородом у животных I группы после транспортировки снизился на 2,5% (р<0,01 при tSt= 16,00), II группы – на 2,8% (р<0,01 при tSt= 31,40) и III группы на 3,5% (р<0,01 при tSt= 17,9) по сравнению с исходными значениями в каждой группе.

Сравнение динамики изменений величины напряжения кислорода и насыщения крови кислородом показывает, что в последнем случае во всех группах наблюдается в меньшей степени выраженная вариабельность. Сопоставление полученных данных показывает, что при одной и той же функциональной нагрузке большему изменению по величине РаО2  соответствует меньшее изменение SаО2.

Таким образом, величина напряжения кислорода более чувствительна к нагрузкам, получаемым животным при транспортировке, чем степень насыщения крови кислородом.

Такая форма зависимости по мнению И.И. Лихницкой(1973), В.А. Березовского (1975), М.А. Гриппи (1997),  J.N. Cameron (1989) обеспечивает достаточную оксигенацию тканей, даже если РаО2 снизится до 70 мм рт.ст.

Полученные и представленные в таблице 2 результаты свидетельствуют, что при стрессовых и физических нагрузках, воздействующих на свиней при транспортировке, увеличиваются требования к физиологическим системам и органам, обеспечивающим доставку глюкозы и кислорода. Возрастание энергетических потребностей у животных осуществляется двумя путями окислительного распада глюкозы: аэробным и анаэробным энергообразованием. Конечным компонентом энергообразования является молочная кислота. По изменению её концентрации в крови определялось соотношение аэробных и анаэробных реакций.

При кратковременных нагрузках, в условиях достаточного кислородного обеспечения и запаса мышечного гликогена в работающих мышцах, энергообразование идет в основном за счет аэробного гликолиза. Это определило увеличение концентрации молочной кислоты в крови [HL] у животных I группы на 37,5% и её возрастание с 5,6 ± 0,1 ммоль/л в исходном состоянии до 7,7 ± 0,3 ммоль/л (р<0,01 при tSt= 6,56).

По мере увеличения тяжести функциональных нагрузок в организме животных происходило ограничение резервных возможностей кровообращения, компенсаторное напряжение вентиляции и снижение насыщения крови кислородом. Такая перестройка физиологических систем и органов обусловила сдвиг энергообразования в сторону анаэробного пути. В условиях недостаточного окисления молочная кислота накапливается в мышцах. Выбросом её в кровь объясняется увеличение HL в 1,8 раза у свиней II группы и в 2,2 раза у животных III группы по сравнению с исходными значениями. Величина концентрации молочной кислоты после транспортировки соответственно составляла 10,2 ± 0,3 ммоль/л и 12,9 ± 0,4 ммоль/л. Разность между этими величинами оставалась статистически достоверной (р<0,01 при tSt= 5,40), хотя была значительно меньше, чем их отличие от исходных показателей.

Накопление недоокисленных продуктов обмена веществ определило достоверность изменений показателя дефицита оснований в крови (ВЕ) при различных нагрузках по сравнению с исходными данными.

В I группе свиней дефицит оснований увеличился с -0,3±0,28 мэкв/л перед транспортировкой до -1,6±0,24 мэкв/л по прибытии на убойный пункт (р<0,01при tSt= 3,59). У животных III группы за счет поступления в кровь кислых продуктов дефицит оснований увеличился ещё больше с -0,3±0,40 мэкв/л до -2,2±0,54 мэкв/л (р<0,01 при tSt=2,73). Во II группе показатель ВЕ по прибытии на убойный пункт составил  -1,8±0,64 мэкв/л против -0,4±0,26 мэкв/л в состоянии относительного покоя до транспортировки (р<0,05 при tSt=2,02).

Таким образом, у животных после транспортировки наблюдалось накопление недоокисленных продуктов, что повлияло на увеличение величины дефицита оснований в крови свиней во всех группах.

Анализ величины дефицита оснований у животных перед убоем  показал, что средние значения во всех группах были выше исходных величин, хотя достоверного различия в I группе животных не выявлено (табл.2). Достоверная разница р<0,05 при tSt=2,51 величины ВЕ в восстановительный период (-1,7±0,39 мэкв/л) по сравнению с исходным значением (-0,3±0,40 мэкв/л) отмечалась у свиней III группы и у животных, перенесших среднюю нагрузку. В последнем случае показатель ВЕ за время пребывания на убойном пункте не успел восстановиться и составлял -1,2±0,57 мэкв/л, что достоверно (р<0,05 при tSt=2,03) отличалось от исходного значения (-0,4±0,26 мэкв/л).

Полученные данные свидетельствуют, что реакция на нагрузку, связанную с транспортировкой к месту убоя, по показателю ВЕ, отражающему метаболический компонент рН (формула 1), выражена у всех групп животных, но у свиней, перенесших среднюю и тяжелую нагрузку, количество недоокисленных продуктов обмена перед убоем оставалось высоким и не восстановилось до исходного уровня.

Обобщение результатов исследования физиологических параметров, представленных в таблице 2,  указывает на то, что по мере возрастания функциональных нагрузок, то есть увеличения времени транспортировки и расстояния до убойного пункта, растет напряжение физиологических систем и органов, обеспечивающих дыхательный и метаболический компонент рН крови.

Анализ величин, характеризующих динамику физиологических параметров, свидетельствует, что увеличение функциональной нагрузки переводит организм животного на анаэробное энергообразование, сопровождается несоответствием поступления кислорода с интенсивностью обменных процессов, что и определяет изменение величины метаболического компонента. Но наличие в крови кислых продуктов, в частности молочной кислоты, снижает способность гемоглобина связывать кислород в крови. Об этом свидетельствует снижение уровня насыщения крови кислородом, особенно у свиней III группы. Такой физиологический механизм у животных, получивших тяжелую нагрузку, способствует более полной отдаче кислорода мышечной ткани.

Таким образом, динамичность физиологических функций, систем и органов, определяющих у животных респираторный и метаболический компоненты, обеспечивает постоянство величины рН крови и её устойчивость к воздействию различных физических, химических и биологических факторов. Опыт практического использования подтверждает, что при трактовке патофизиологических состояний у животных, связанных с изменением концентрации ионов водорода в крови, важно учитывать не их абсолютную величину, а соотношение этих компонентов (Л.Л. Шик, Н.Н. Канаев, 1980; Б.С. Семенов, А.Ю. Нечаев, 2000; J.N. Cameron, 1989).

  2.2.2. рН крови как показатель резистентности организма

  при функциональных нагрузках

Количественное представление, стандартность и технологичность принципов измерения показателей КЩБ и их аналогичная техническая реализация в различных странах дают возможность гармонизировать результаты исследований и выработать единые количественные критерии для объективной оценки состояния резистентности животного на предубойном этапе.

В ходе проведенных исследований показателя рН крови в условиях относительного покоя не выявлено достоверной разницы в его величине в зависимости от пола. У хрячков этот показатель составлял 7,42 ± 0,007 против 7,43 ± 0,009 (р>0,05 при tSt= 0,91) у свинок. Не обнаружилось различия и по возрастным группам. Средние величины рН крови у свиней 6-7 месячного и 8-9 месячного возраста составляли соответственно 7,42 ± 0,008  и  7,43 ± 0,010 (р>0,05 при tSt= 0,76).

В исходном состоянии до транспортировки к месту убоя величина рН крови колебалась от 7,36 до 7,55 и в среднем по всем группам составляла 7,43 ± 0,01.

Полученные данные, обобщение накопленного материала и опыта зарубежных коллег позволило выделить следующие градации в изменении параметров рН крови, показателей респираторного (рСО2) и метаболического (ВЕ) компонентов (Д. Робинсон, 1969; Р. Хашен, Д. Шейх, 1981; А.Ю. Нечаев, 2001). Наличие этих трех показателей дает возможность определить величину и генез нарушений. Отклонения нормальных величин КЩБ представлены в таблице 3.

Соответственно значениям рН выделяются ацидоз компенсированный (рН=7,55–7,35); субкомпенсированный (рН=7,34–7,30); декомпенсированный (рН=7,29–7,21) и алкалоз компенсированный (рН=7,35–7,55); субкомпенсированный (рН=7,56–7,60); декомпенсированный (рН=7,61–7,68).

При клиническом осмотре и результатам исследования показателей рН крови в условиях относительного покоя у 95 обследованных животных перед транспортировкой на убойный пункт отклонений от нормы выявлено не было.

Таблица 3

Отдельные показатели кислотно-щелочного баланса крови

у свиней в норме и при патологии

Показатели

Норма

Степень нарушений

Ацидоз

Алкалоз

рН

7,35 – 7,55

умеренная

выраженная

тяжелая

7,34 – 7,30  7,29 – 7,21  7,20 и ниже

7,56 – 7,60  7,61 – 7,68  7,69 и выше

рСО2, мм рт. ст.

35,0 – 45,0

умеренная

выраженная

тяжелая

45,1 – 50,0  50,1 – 60,0  61,0 и ниже

34,9 – 28,0  27,9 – 20,0  19,9 и ниже

ВЕ, мэкв/л

+2,5 – - 2,5

умеренная

выраженная

тяжелая

-2,6 – - 5,2  -5,3 – -7,5 -7,6 и ниже

+2,6 – + 6,5  +6,6 - +12,0  +12,1 и выше

Анализ полученных данных после транспортировки показал, что только у 36 животных (38%) постоянство рН крови обеспечивалось без дополнительного привлечения резервных возможностей физиологических систем и органов, то есть все показатели КЩБ находились в пределах нормы. В 41 случае (43,1%) при нормальном значении рН крови наблюдались изменения дыхательных и метаболических компонентов, то есть имели место компенсированные нарушения систем и органов, обеспечивающих постоянство этого показателя гомеостаза. Субкомпенсированные нарушения величины рН наблюдались у 18 животных (18,9%).

Компенсированный дыхательный ацидоз отмечался в 16 случаях, компенсированный дыхательный алкалоз зарегистрирован у 18 свиней и в 7 случаях имел место компенсированный метаболический ацидоз. При компенсированных расстройствах КЩБ (рН в норме) одновременно наблюдались две противоположно направленных формы сдвигов, из которых одна причинная, другая компенсаторная. Так метаболический ацидоз компенсировался дыхательным алкалозом, дыхательный ацидоз – метаболическим алкалозом. Для определения тяжести предубойного состояния животных, возможности коррекции и прогноза учитывалось, какие из этих нарушений являются причиной, а какие следствием. Заключение основывалось на том, что причинные сдвиги КЩБ выражены значительнее, чем компенсаторные. Так, у одного из животных после транспортировки рН=7,36; РаСО2=32,9 мм рт.ст.; ВЕ = –5,5 мэкв/л, то есть при нормальном рН сдвиг метаболического компонента ВЕ выражен больше, чем дыхательного показателя РаСО2. В другом случае по прибытии на убойный пункт у поросенка зарегистрированы следующие показатели: рН=7,47; РаСО2=27,2 мм рт.ст.; ВЕ = –3,1 мэкв/л. В этом случае выражено увеличение РаСО2, а метаболический параметр ВЕ изменен умеренно. Таким образом, в первом наблюдении имеется метаболический ацидоз, компенсированный дыхательным алкалозом, а во втором – дыхательный алкалоз, компенсированный метаболическим ацидозом.

Проведенные исследования показали, что количество и степень изменений рН крови находятся в прямой зависимости от величины и степени функциональной нагрузки. Чем дальше расположены фермы от убойного пункта и больше время нахождения в пути, тем значительнее выражены сдвиги в величине рН крови (рис.1).

 

Рис. 1. Степень и типы нарушений кислотно-щелочного баланса

у свиней после дозированных функциональных нагрузок

В I-й группе из 35 свиней, перенесших легкую функциональную нагрузку, в 83% случаев отсутствовали изменения и только в 6 случаях (17%) при нормальном рН крови отмечены сдвиги метаболического и респираторного компонентов. Во II-й группе животных отсутствие нарушений отмечено только у 7 животных, в остальных 23 случаях отмечались компенсаторные нарушения. У всех свиней III группы, перенесших тяжелую функциональную нагрузку, наблюдались нарушения физиологических систем и органов, обеспечивающих постоянство рН крови. Из 30 животных этой группы в 12 случаях имели место компенсированные, в остальных – субкомпенсированные нарушения величины рН крови.

Сопоставление клинических симптомов и полученных показателей КЩБ позволяет объективизировать заключение о состоянии животных и дать индивидуальную количественную и качественную характеристику его реакции на воздействие повреждающих факторов на всех стадиях предубойного этапа.

Применение функционально-диагностических методов исследования позволяет врачу-ветсанэксперту обосновать свое заключение о состоянии резистентности животного не только опираясь на клиническую симптоматику, но и с учетом степени нарушений физиологических систем и органов, выполняющих гомеостатическую задачу по обеспечению постоянства рН крови, что позволяет своевременно провести коррекцию выявленных нарушений.

Полученные данные подтвердили, что при метаболическом ацидозе основным компенсирующим органом являются легкие. Установлено, что компенсация осуществляется за счет избыточного выведения СО2. Это снижает концентрацию респираторного компонента (РаСО2 в крови пациента) и, следовательно, делает рН крови менее кислым. При респираторном алкалозе наблюдалось снижение напряжения углекислого газа в артериальной крови (как результат гипервентиляции альвеол).

Основной задачей, которую должно разрешить любое функциональное исследование, является выяснение резервных возможностей достаточности функции изучаемой системы, определение способности организма животного отвечать адекватной реакцией на предъявляемые к ней требования.

В ходе проведенных исследований показано, что у 95 из 96 животных физиологические системы и органы, обеспечивающие поддержание постоянства рН крови, могут выполнять эту задачу в условиях покоя. При предъявлении дополнительных требований в виде различных по степени тяжести и интенсивности функциональных нагрузок, связанных с транспортировкой животных к месту убоя, только у 36 животных (38%) не обнаружено нарушений, а у 59 (61%) выявлены признаки недостаточности систем и органов (рис.1).

По интенсивности выявленных нарушений физиологических систем и органов, определяющих резистентность организма, и по их способности решать гомеостатическую задачу по поддержанию постоянства рН крови полученные результаты позволили выделить и обосновать три степени функциональной недостаточности. 

Недостаточность I степени – неспособность систем и органов осуществлять функцию по поддержанию постоянства рН крови не обнаруживается в покое, а определяется лишь при предъявлении значительных требований к системе, то есть при максимальных нагрузках. В проведенных исследованиях о такой степени недостаточности указывают компенсированные и субкомпенсированные изменения рН крови, выявленные соответственно у 12 и 18 животных при тяжелой нагрузке.

Недостаточность II степени – нарушение способности системы осуществлять функцию определяется при выполнении умеренной нагрузки, но не обнаруживается в покое. Такая степень недостаточности в виде компенсированных нарушений выявлена в 29 случаях.

Недостаточность III степени – неспособность организма осуществлять функцию по поддержанию рН крови обнаруживается при любой нагрузке, то есть при предъявлении любых повышенных требований, а в покое выявляется ограниченная способность поддерживать постоянство рН. С III степенью недостаточности было выявлено только  одно животное.

В ходе проведенных исследований установлено, что величина рН крови является интегральным показателем состояния функции многих взаимосвязанных систем и органов. Поэтому функциональные исследования КЩБ позволяют не только определить степень нарушений функции поврежденной системы, оценить резервные возможности компенсирующих систем и органов, но и распознать преморбидную фазу начинающегося заболевания.

Проведенные исследования по определению способности организма животных сохранять постоянство рН крови не дают  представления ни о патологоанатомическом, ни о бактериологическом диагнозе. Они показывают насколько меняется резистентность организма животных, обеспечивающая постоянство его внутренней среды в зависимости от функциональных нагрузок.

По данным ряда авторов установлено, что резистентность позвоночных животных при воздействии повреждающих факторов определяется неспецифическим и специфическим иммунитетом (Задорожин П.А., 1996; Петров А.М., 2006). Для определения степени влияния физических и стрессовых факторов на ослабление иммунитета свиней  при различных функциональных нагрузках  было проведено бактериологическое исследование продуктов убоя на контаминацию их сальмонеллами.

2.2.3. Контаминация мезентериальных лимфоузлов

  сальмонеллами после функциональных нагрузок

При выбранных функциональных нагрузках различной степени тяжести обследованные животные подвергались одновременному воздействию стрессовых, физических факторов и меняющихся условий внешней среды.

Для выявления, насколько тяжесть перенесенных функциональных нагрузок способствует активности возбудителей пищевых зоонозов, было проведено бактериологическое исследование проб мезентериальных лимфоузлов с целью выявления в них сальмонелл.

  Рис.2.  Зависимость количества контаминированных сальмонеллами проб

от величины функциональной нагрузки на предубойном этапе

Из 95 обследованных проб, взятых после убоя клинически здоровых животных, сальмонеллы были выявлены в 16 (16,8%) случаях (рис.3). По серологическим свойствам культуры были отнесены к следующим серотипам:  S. tуphimurium – 8,  S. enteritidis – 7 и S. anatum – 1 культура.

Проведенными исследованиями установлено, что в 8% случаев у животных, перенесших при транспортировке легкую нагрузку, в пробах из мезентериальных лимфоузлов были выявлены возбудители сальмонеллеза. После средней нагрузки количество контаминированных сальмонеллами проб составляло 13%, а после тяжелой нагрузки – 30%. Такой результат указывает на повышение частоты выявления контаминированных сальмонеллами проб по мере увеличения стресса и физического напряжения.

Полученные данные согласуются с литературными источниками, свидетельствующими, что эмерджентные пищевые зоонозы связаны в первую очередь с сырьем и продукцией, полученными от клинически здоровых животных, и подтверждают существующее мнение о влиянии повреждающих факторов на равновесие во взаимоотно-

шении хозяин-паразит (В.И. Покровский, Б.Л. Черкасский, 1993; А.В. Куликовский, 2002).

По мнению исследователей, любые меняющиеся условия ведут к изменению динамического равновесия в отношениях хозяин-паразит, снижая защитные силы организма и стимулируя жизнедеятельность патогенных микроорганизмов, как проживающих в животных, так и обитающих в окружающей среде (N.N. Lizko., 1987; К. Fehlhaber, Т. Alter, 1999).

Сопоставление количества контаминированных проб с характером изменения КЩБ позволило отметить, что по мере нарушения рН крови увеличивается количество случаев выявления сальмонелл. Взаимосвязь частоты выявления контаминированных сальмонеллами проб и изменений  величины рН крови указывает на зависимость этих показателей от резистентности организма животных. Отмечено, что в 75% эти случаи наблюдались при дыхательном алкалозе. Вероятно, более благоприятные условия для стимуляции жизнедеятельности сальмонелл в организме облигатного хозяина обеспечиваются при сдвиге рН крови в щелочную сторону.

Установленная взаимосвязь частоты выявления контаминированных сальмонеллами проб и изменениями величины рН крови у свиней после функциональных нагрузок, связанных с транспортировкой к убойному пункту, определяется зависимостью этих показателей от резистентности организма животного. Таким образом, ещё раз подтверждается точка зрения, определяющая устойчивость организма к повреждающим факторам (биологическим, химическим, физическим и т.д.) как способность сохранять свой гомеостаз.

Являясь интегральным показателем постоянства внутренней среды организма, количественная и качественная характеристика рН крови как индикатор отражает адекватность доставки кислорода и потребность в нем всех систем и органов, обеспечивающих как жизнедеятельность животных, так и их защиту при воздействии повреждающих факторов.

Проведенные исследования показали, что интенсивность окислительных процессов  аэробного и анаэробного энергообразования влияет на рН крови и работающих мышц в зависимости от величины функциональных нагрузок, полученных свиньями перед убоем. Для определения влияния таких нагрузок на биохимические свойства мяса, состоящего на 60 – 80% из мышц, выполнялись измерения рН мяса в период его созревания.

2.2.4. Влияние функциональных нагрузок на изменение рН мяса

в период его созревания

Несмотря на то, что при ветеринарно-санитарной экспертизе мяса рН-метрии отводится дополнительное место, главное достоинство определения показателя рН в комплексе регламентированных исследований – его количественная оценка. Сравни-тельный анализ результатов измерения рН в m.semimembranosus (рН m.s.) сразу после убоя показал разницу в её величинах в зависимости от длительности и интенсивности функциональных нагрузок, полученных животными на предубойном этапе.

При длительной (тяжелой) нагрузке у животных III группы рН m.s. имело среднюю величину 6,72 ± 0,12, показатель рН m.s. от животных I группы, получивших кратко-временную (легкую) нагрузку, составлял 6,42 ± 0,10  и  во II группе, перенесших среднюю нагрузку,  рН m.s. имел  значения  6,61 ± 0,09.  Разность  средних  величин  показателей рН m.s., полученных сразу после убоя, была статистически достоверной между всеми группами животных. Наиболее выраженной достоверность определялась между  I и III (р<0,01 при tSt= 15,00) и I и II группами (р<0,01 при tSt= 10,02). Менее выраженные, но достоверные отличия оставались в этот период у животных II и III групп (р<0,01 при tSt=4,28). Во всех случаях мясо от животных, перенесших тяжелую и умеренную функциональную нагрузку, характеризовалось сдвигом рН m.s. в сторону алкалоза.

Наиболее выраженное снижение величины рН m.s. выявлено в первый час  после убоя. В среднем при легкой нагрузке кислотность увеличилась на 15% в мясе животных, перенесших умеренную и тяжелую нагрузку, соответственно на 18% и 9%. В показателях рН m.s. достоверные различия за этот период сохранялись только между I и III (р<0,01 при tSt= 21,92)  и  II и III групп (р<0,01 при tSt= 20,71).

В остальные временные отрезки периода созревания отмечалось медленное, но стабильное снижение рН m.s. во всех группах. При этом по мере увеличения функциональных нагрузок сохранялась тенденция к гипоацидным реакциям в мышце..

В конечном итоге за весь период созревания снижение величины рН m.s.  по сравнению с исходным уровнем составило в среднем во всех группах 20%. Временная характеристика изменений рН m.s. за этот период графически приближалась к гиперболической зависимости. Такая динамика определяет качество мяса, смещая его в зону  PSE мяса. При этом у животных, перенесших тяжелую нагрузку, в конце периода созревания сохраняется достоверно выраженный сдвиг рН m.s. в сторону оснований (5,55 ± 0,08) относительно рН m.s. 5,36 ± 0,06  от животных  I  группы (р<0,01 при tSt= 11,89).

Таким образом, при длительном воздействии на свиней стресса и физического напряжения наблюдается сдвиг рН мяса в сторону алкалоза. Отмечено, что такие изменения не только влияют на качество мяса, но и благоприятствуют развитию в мясе микроорганизмов и предопределяют его меньшую стойкость при хранении.

Результаты проведенных исследований позволяют дать не только количественную характеристику биохимическим процессам, но и прогнозировать качество и безопасность мяса с учетом изменения величины его рН. Полученные данные свидетельствуют, что наиболее динамичные изменения величины рН мяса происходят в первые часы его созревания, поэтому коррекция в этот период аутолиза наиболее эффективна.

2.2.5. К оценке методов выявления возбудителей пищевых зоонозов

  при ветеринарно-санитарной экспертизе  мяса и мясопродуктов

2.2.5.1. Результаты исследования проб мяса со слабым уровнем инвазии трихинеллами

С учетом международных и отечественных требований  безопасности мяса  и различного отношения к методам выявления трихинелл в условиях слабой инвазии (от 2 до 6 личинок в 1 гр. мяса)  проведено сравнение эффективности регламентированных методов компрессорной трихинеллоскопии и искусственного переваривания по критериям специфичности и чувствительности.

Результаты исследования, представленные в таблице 4,  свидетельствуют о низкой чувствительности метода КТ(компрессорной трихинеллоскопии). Так, ложноотрицательные

Таблица 4

Результаты сравнительных исследований проб мяса

со слабым уровнем инвазии трихинеллами

Метод компрессорной

трихинеллоскопии

(личинок на 1 гр.)

Метод искусственного переваривания

И т о г о

положительный

отрицательный

Отрицательный

51 (56,7%)

39 (43,3%)

90 (100%)

Положительный

0 – 2

2 – 4

4 – 6

17 (73,9%)

16 (88,9%)

12 (92,3%)

6 (26,1%)

2 (11,1%)

1 (7,7%)

23 (100%)

18 (100%)

13 (100%)

И т о г о

96 (65,7%)

48 (34,3%)

144 (100%)

результаты отмечены в 56,7%  от  всех отрицательных ответов. Такое количество ложноотрицательных результатов говорит о низкой чувствительности  метода – 46,9%. Ложноположительные ответы при КТ составляли 16,7% от всех положительных случаев. Специфичность метода составляла 81,2%. По мере увеличения уровня зараженности специфичность КТ возрастала и при инвазии 4 – 6 личинок в 1 гр. мышц достигала 97,5%.

Таким образом, простой и широко применяемый на практике метод КТ недостаточно эффективен при слабом заражении мышц личинками трихинелл. Такой результат обосновывает необходимость обязательного применения метода искусственного переваривания при ветеринарно-санитарной экспертизе мяса и мясопродуктов на трихинеллез, так как слабые инвазии являются причиной поражения людей и животных значительно чаще, чем интенсивные и умеренные.

2.2.5.2. Сравнительный анализ методов контроля мясопродуктов

  при сальмонеллезе и листериозе

Для повышения диагностической достоверности при идентификации возбудителей сальмонеллеза и листериоза были сопоставлены современные методы, применяемые в отечественной и зарубежной практике ветсанэкспертизы при контроле безопасности мяса и мясопродуктов.

В процессе проведения сравнительного анализа различных методов выявления бактерий рода Salmonella было исследовано согласно ГОСТ 30519–97  и международному  стандарту ISO 6579 : 2002  50 проб мяса и мясопродуктов в вакуумной упаковке.

Сравнительная оценка культурального, иммуноферментного (VIDAS SLM) и молекулярно-биологического (Real-Time PCR) методов выявления сальмонелл показала, что число положительных результатов в пробах мясопродуктов, полученных при применении  полимеразно-цепной реакции (PCR) превышает число позитивных ответов, полученных другими методами. Такой результат объясняется высокой чувствительностью данного метода и его способностью выявлять не только живые, но и нежизнеспособные сальмонеллы, не дающие рост на питательных средах. Поэтому наибольшее совпадение результатов исследований (98%) определялось при выявлении сальмонелл культуральным и иммуноферментным (VIDAS SLM) методами, наименьшее (94%) – между культуральным и молекулярно-биологическим (Real-Time PCR) методами.

Наибольшая специфичность (97,92%) была отмечена при выявлении  сальмонелл культуральным и иммуноферментным методами. Исследования с применением молекулярно-биологического  и  иммуно-ферментного методов характеризовались высокой автоматизацией процесса исследования и быстротой получения конечного результата.

Согласно отечественным и международным нормативным документам по определению сальмонелл положительные результаты, полученные упомянутыми методами, не являются окончательными и требуют подтверждения. При проведении исследований для подтверждения принадлежности выделенных культур к сальмонеллам использовались биохимические панели системы API 20Е (фирмы «BioMerieux»). Положительные результаты по выявлению сальмонелл в исследуемых мясопродуктах отмечались в одном случае в свежих пробах и такое же количество случаев в пробах с истекшим сроком реализации.

В процессе проведения сравнительного анализа различных методов выявления бактерий рода Listeria было исследовано согласно вышеупомянутому ГОСТ Р 51921–2002  и международному  стандарту ISO 11290-1  50 проб мясопродуктов в вакуумной упаковке.

Из 50 исследованных образцов листерии были выявлены в 11 случаях. При этом 9 из 11 положительных проб были с истекшим сроком реализации продукта. В ходе биохимической идентификации выделенных микроорганизмов рода Listeria, проведенной с помощью стрипов API Listeria, была определена L.monocytogenes в 3-х случаях, в 6-ти – L. welschimeri  и  в 2-х – L.innocua. Наличие гемолиза на кровяном агаре (SB) и характерная реакция в виде зоны просветления на хромогенной среде ALOA позволяла дифференцировать L.monocytogenes от непатогенных видов листерий. Применение  среды ALOA позволило также подавить рост сопутствующей микрофлоры и сократить временные затраты в процессе качественного и количественного определения L.monocytogenes. В отечественной практике ветсанэкспертизы не проводится количественное определение в пищевых продуктах L.monocytogenes, хотя в странах ЕС оно регламентировано ISO 11290-2 и установлена допустимая концентрация Listeria monocytogenes в пищевых продуктах не более 100 КОЕ/г. Известно, что листериоз, как многие инфекционные заболевания, возникает в условиях микробной ассоциации, связанной с постоянным присутствием разнообразных микроорганизмов. Результаты исследований по определению наличия роста сопутствующей микрофлоры на различных питательных средах, используемых в работе для выделения листерий, представлены в таблице 5.

В процессе исследований было определено соотношение роста листерий и сопутствующей микрофлоры (Л/С) на средах Oxford,  PALCAM  и  ALOA. На среде PALCAM обнаружен менее интенсивный рост сопутствующей микрофлоры (соотношение Л/С=1,5–1,8), чем на Oxford-агаре (соотношение Л/С=1,0–1,1). Наиболее обильным рост сопутствующей микрофлоры был на Oxford-агаре, её рост одновременно с ростом листерий отмечался во всех чашках свежих проб (6/6), и в 8 чашках из 9 (9/8) проб с истекшим сроком реализации. Наличие сопутствующей микрофлоры на среде ALOA было наименьшим (соотношение Л/С = 2,0–3,0), что подтверждает её более высокую специфичность.

Таблица 5

Рост бактерий рода Listeria и сопутствующей микрофлоры на средах  Oxford,  PALCAM  и  ALOA

  Виды питательных сред

Соотношение листерий и сопутствующей микрофлоры (Л/С)

В свежих пробах

В  пробах с истекшим

  сроком реализации

Oxford

6/6 (1,0)

9/8 (1,1)

PALCAM

3/2 (1,5)

9/5 (1,8)

ALOA

2/1 (2,0)

9/3 (3,0)

В ходе работы была проведена сравнительная оценка методов выявления L.monocytogenes: культурального, иммуноферментного (VIDAS LMO 2) и молекулярно-биологического (Real-Time PCR).

Данные, представленные в таблице 6, показывают, что не  все Real-Time PCR-положительные  результаты  подтверждались культуральным методом и тестом VIDAS (LMO2), что объясняется высокой чувствительностью метода ПЦР и его возможностью выявлять патогенные листерии в пробах с низким уровнем контаминации, а также не только живые, но и нежизнеспособные L.monocytogenes, не дающие роста характерных колоний на питательных средах (K. Rantsious et al, 2008).

Таблица 6

Частота выявления L.monocytogenes различными методами

Вид

продукта

Число

образцов

Listeria monocytogenes

PCR L.mono Kit+

VIDAS LMO2

+

Культураль-ный метод

+

Мясо-свинина

(свежее)

8

3 (6%)

0

0

Готовые

мясопродукты (свежие)

17

9 (18%)

2 (4%)

2 (4%)

Готовые

мясопродукты (с истекшим сроком реализации)

25

20 (40%)

0

1 (2%)

Общее количество

50

32 (64%)

2 (4%)

3 (6%)

Наибольшая специфичность была отмечена при выявлении  L.monocytogenes культуральным и иммуноферментным методами. Исследования с применением молекулярно-биологического  и  иммуноферментного методов характеризовались высокой автоматизацией процесса исследования и быстротой получения конечного результата. Согласно отечественным и международным нормативным документам по определению патогенных листерий положительные результаты, полученные упомянутыми методами, не являются окончательными и требуют подтверждения. При проведении исследований для подтверждения принадлежности выделенной культуры к патогенному виду L.monocytogenes использовались биохимические панели системы API Listeria (фирмы «BioMerieux»). В результате положительные результаты по выявлению L.monocytogenes в исследуемых мясопродуктах отмечались в 2-х случаях в свежих пробах и в 1-м случае в пробах с истекшим сроком реализации.

Проведенные сравнительные оценки методов по критериям чувствительности и специфичности при выявлении возбудителей трихинеллеза, сальмонеллеза и листериоза показывают, что для дифференцированного подхода к результатам исследования необходимо стандартизировать  методы и питательные среды, применяемые в различных странах. Обобщение накопленного международного опыта позволит повысить диагностическую достоверность и состоятельность результатов исследования, выработать единые критерии для оценки безопасности мяса и мясопродуктов.

ВЫВОДЫ

1. Обоснованы, разработаны и применены функциональные методы исследования с использованием современной техники для проведения мониторинга физиологических параметров, обеспечивающих постоянство важнейшего показателя гомеостаза – рН крови, с целью оценки функционального состояния органов и систем, определяющих устойчивость организма свиней при транспортных нагрузках на предубойном этапе.

2.  Установлены изменения величины рН крови свиней по мере возрастания дополнительных требований (нагрузки), связанной с увеличением времени и расстояния при транспортировке к убойному пункту.

При легкой нагрузке у 82,8% свиней нарушений гомеостаза не наблюдалось, в 17,2% случаев постоянство величины рН крови обеспечивалось компенсаторным напряжением буферных систем организма свиней. При умеренной нагрузке у 22,6% свиней отмечалась устойчивость гомеостаза, в 74,2% случаев наблюдались компенсаторные нарушения и в одном случае у свиноматки имели место декомпенсированные изменения величины рН крови. При тяжелой нагрузке у всех свиней по прибытии на убойный пункт наблюдались нарушения гомеостаза. В 40% случаев изменения величины рН крови носили компенсированный характер, в 60% - субкомпенсированный.

3. Мониторинг показателей кислотно-щелочного баланса свиней в условиях  транспортных нагрузок по прибытии на убойный пункт выявил изменения как респираторного, так и метаболического компонентов рН крови. Напряжение углекислого газа крови, составляющее респираторный компонент рН крови, уменьшилось по сравнению с исходными значениями во всех группах животных: при легкой нагрузке – на 7,8%, при умеренной нагрузке – на 11,2%, при тяжелой нагрузке на 15,5%. Дефицит оснований, составляющих метаболический компонент рН крови, увеличился по сравнению с исходным состоянием (–0,3 ± 0,28 мэкв/л) при легкой нагрузке до –1,6 ± 0,24 мэкв/л, а при умеренной нагрузке до –1,8 ± 0,64 мэкв/л. При тяжелой нагрузке накопление кислых продуктов обмена в крови свиней увеличило дефицит оснований до –2,2 ± 0,54 мэкв/л. Различные соотношения респираторного и метаболического компонентов опреде-лили разные типы нарушений кислотно-щелочного баланса крови: у 32% свиней наблю-дался дыхательный ацидоз, у 45%-дыхательный алкалоз и у 23% - метаболический ацидоз.

4. Установлено увеличение концентрации молочной кислоты в крови свиней на 37,5%  после легкой нагрузки, на 85,4% после умеренной нагрузки, на 22,4% после тяжелой нагрузки, которое сопровождалось уменьшением недоокисленных продуктов обмена в мясе в постмортальном периоде. У свиней, перенесших тяжелую нагрузку, наблюдался статистически достоверный сдвиг рН мяса в конце периода созревания в сторону оснований по сравнению с животными, перенесшими легкую нагрузку (5,55 ± 0,08 против 5,36 ± 0,06; p < 0,01).

Таким образом,  функциональные исследования энергообмена у свиней установили, что увеличение транспортной нагрузки на предубойном этапе снижает резервы аэробного энергообразования, уменьшает количество кислот и гликогена в мышцах и приводит к снижению пищевой ценности мяса, приближая его к свойствам  DFD – мяса, благоприятствуя развитию в  нём микроорганизмов, предопределяя его  меньшую стойкость при хранении.

5.  Результаты бактериологического исследования мезентериальных лимфоузлов в постмортальном периоде установили, что у свиней, получивших легкую нагрузку, сальмонеллы выделены  в 8% случаев,  у получивших умеренную нагрузку количество контаминированных сальмонеллами проб составляло 13%, а у перенесших тяжелую нагрузку – 30%.  Учитывая, что обсемененные пробы выявлены только у свиней с нарушениями гомеостаза, то исследование рН крови позволит на предубойном этапе прогнозировать вероятность контаминации мяса патогенными микроорганизмами.

6. Применение мониторинга состояния функции органов и систем, определяющих величину рН крови организма свиней на предубойном этапе, позволяет контролировать качество и безопасность мяса на начальных звеньях пищевой цепочки в процессе производства (животноводческие фермы, убойные пункты и т.д.), когда не затрачены средства и усилия на получение готового продукта, и есть возможность влиять на его качество, реализуя принцип «Здоровое животное – безопасное мясо».

7. Сравнительный анализ регламентированных методов определения возбудителей трихинеллеза при слабой инвазии выявил низкую чувствительность (46,9%) и эффективность (58,3%) метода компрессорной трихинеллоскопии. Специфичность этого метода по мере снижения уровня инвазии от 4-6; 2-4 и 0-2 личинок в 1г. мышц соответственно уменьшалась от 96,7%, 95,1% и 86,7% относительно метода группового ферментативного переваривания. Результаты исследования свидетельствуют, что наиболее эффективным методом с позиций предупреждения трихинеллеза является метод выделения трихинелл, основанный на ферментативном переваривании мышечных проб.

8. Сравнительная оценка культурального, имунноферментного (VIDAS) и молекулярно-биологического (Real-Time PCR) методов выявления сальмонелл и патогенных листерий в мясопродуктах по критерию эффективности характеризовалась наименьшим  совпадением результатов между культуральным и молекулярно-биологическим методами,  составлявшим соответственно 94% и 42%. Наибольшее совпадение результатов (98%) отмечали при применении культурального и иммуно-ферментного методов. Иммуноферментный метод (VIDAS) позволяет наиболее быстро обнаружить возбудителя в пищевой продукции, что и определяет возможность его применения в экспресс-диагностике сальмонеллеза и листериоза.

9. Сопоставление результатов первичных посевов на питательные среды: ALOA-агар по Оттавиани-Агости, PALCAM-агар и Oxford-агар, применяемых для избирательного роста листерий, показало, что величина соотношения листерий и сопутствующей микрофлоры (Л/С) на этих средах в пробах свежих мясопродуктов, соответственно равнялась 2,0; 1,5 и 1,0, а в пробах с истекшим сроком реализации соответственно 3,0; 1,8 и 1,1, что свидетельствуют о надежности хромогенной среды ALOA-агар по Оттавиани-Агости при идентификации патогенных штаммов листерий и служат основанием её применения для количественного определения L.monocytogenes в мясопродуктах после прямого посева.

10. Унифицированный подход к оценке международных методов и национальных стандартов, применяемых для выявления возбудителей пищевых зоонозов при ветеринарно-санитарной экспертизе мяса и мясопродуктов, на основе критериев эффективности, чувствительности и специфичности позволит обобщить опыт и повысить достоверность и состоятельность результатой исследований.

Автор признателен сотрудникам продовольственно-ветеринарной службы Краславского района Латвии за создание оптимальных условий при содружественном решении проблем, связанных с транспортировкой свиней на убойный пункт, выражает благодарность сотрудникам Института гигиены и технологии продуктов животного происхождения  г. Мюнхен (Германия), а также коллективу лаборатории микробиологии и гигиены производства ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова за содействие  и большую помощь при выполнении данной работы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Применение функциональных методов диагностики дает возможность с учетом  клинической симптоматики определить компенсаторные возможности организма и представить индивидуальное клинико-функциональное экспертное заключение о состоянии животного согласно методическим рекомендациям «Оценка предубойного состояния животных на основе показателей кислотно-щелочного баланса», утвержденным Отделением ветеринарной медицины Российской академией сельскохозяйственных наук 24 июня 2009 г.,  и  данным, изложенным в методическом пособии «Показатели кислотно-щелочного баланса и рН-метрия в практике ветеринарно-санитарной экспертизы», утвержденном  методическим советом Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (СПбГАВМ), протокол №2 от 28 февраля 2007 г.

2. Определение функциональных возможностей организма свиней сохранять свой гомеостаз на всех стадиях предубойного этапа позволяет оценить адекватность реакции органов и систем животного на воздействие повреждающих факторов, связанных с транспортировкой к месту убоя. Полученные данные положены в основу для оптимального решения о выборе места расположения убойного пункта среди близлежащих свиноводческих хозяйств Краславского района (Латвия).

3. Установленная взаимосвязь основных физиологических параметров, определяющих функцию жизнеобеспечивающих систем и органов с кислотно-щелочным балансом (КЩБ) организма животного, дает возможность определить исходную базу для мониторинга функциональных показателей в условиях воздействия повреждающих фак-торов и проведения своевременной коррекции величины рН крови. Мероприятия (отдых, кормление, содержание, уход), направленные на восстановление выявленных нарушений в предубойном периоде, в конечном итоге повышают качество и безопасность мяса.

  4. Применение результатов проведенных функциональных исследований в ветеринарных учреждениях г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области показало их эффективность при восстановлении гомеостаза у животных, оказавшихся в чрезвычайных условиях (хирургическое вмешательство, стресс, неотложные и критические состояния).

5. Опыт сопоставления результатов исследований по диагностике пищевых зоонозов, полученных в отечественных и зарубежных лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы, по критериям чувствительности и специфичности  позволяет гармонизировать методы выявления возбудителей пищевых зоонозов в общепринятой системе международных координат и применять их при ветсанэкспертизе мяса и мясопродуктов согласно  методическим рекомендациям: «Исследование мяса и мясопро-дуктов на цистицеркоз и трихинеллез» (утв. методическим советом СПбГАВМ, протокол №4 от 19.06.2001 г.), «Метод полимеразной цепной реакции» (утв. методическим советом СПбГАВМ, протокол №1 от 30.11.2005 г.), «Применение метода ПЦР в ветеринарной практике» (утв.  методическим советом СПбГАВМ,  протокол № 1 от 30.11.2005 г.).

6. Материалы исследований, изложенные в методических рекомендациях  «Количественное определение Listeria monocytogenes в колбасных изделиях и продуктах из мяса», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Российской академией сельскохозяйственных наук 24 июня 2009 г., определили подходы для введения количест-венных критериев выявления L. monocytogenes в соответствии с международным стандар-том ISO 11290-2, регламентирующим методы подсчета бактерий  Listeria monocytogenes.

7. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры ветеринарной гигиены и санитарии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы Витебской ордена «Знак Почета» государственной академии ветеринарной медицины, на кафедре ветсанэкспертизы и акушерства Якутской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ  ПО  ТЕМЕ  ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных  ВАК Минобразования и науки РФ

1.  Нечаев А.Ю. Послеубойная диагностика трихинеллеза / А.Ю. Нечаев, С.А. Серко // Мясная индустрия. – М., 2003. – №6. – С. 40 – 42.

2. Нечаев А.Ю. Применение автоматического анализатора mini VIDAS для определения сальмонелл /А.Ю. Нечаев, Д.С. Батаева // Все о мясе.– М., 2006. – №3.– С. 35 – 36.

3. Нечаев А.Ю. Проблемы диагностики трихинеллеза в свиноводстве / А.Ю. Нечаев // Свиноводство. – М., 2006. – №4. – С.23 – 25.

4.  Нечаев А.Ю. Диагностические возможности ветсанэкспертизы мяса при трихинеллезе / А.Ю. Нечаев // Все о мясе. – М., 2007. - №1. – С. 26 – 28.

5.  Нечаев А.Ю. К оценке эффективности выявления патогенных листерий в пищевых продуктах / А. Ю. Нечаев // Ветеринарная патология. – М., 2007. – № 1. – С. 141 – 143. 

6.  Нечаев А.Ю. Оценка предубойного состояния животного / А.Ю. Нечаев // Ветеринария.  – М., 2007. – №3. – С. 54 – 55.

7. Нечаев А.Ю. Применение рН-метрии в процессе  ветеринарно-санитарной экспертизы мяса / А.Ю. Нечаев // Мясная индустрия.– М., 2007.– №6.– С.58 – 60.

8.  Нечаев А.Ю. Применение ускоренных микробиологических методов определения патогенных листерий в мясе /А.Ю. Нечаев, Д.С. Батаева // Все о мясе. – М., 2007. - №3. – С.27 – 28.

9.  Нечаев А.Ю. Экспресс-методы для определения листерий в мясе и мясных продуктах / А.В. Яшин, А.Ю. Нечаев // Мясная индустрия. – М., 2008. – №8. – С. 51 – 54.

  10.  Нечаев А. Ю. Сравнительный анализ результатов выявления Listeria monocytogenes в мясе и мясопродуктах /А.Ю. Нечаев // Международный вестник ветеринарии. – СПб., 2009. – № 3. – С. 13 – 17.

  11.  Нечаев А.Ю. Определение сальмонелл  в  мясе и мясных продуктах / А.Ю. Нечаев // Мясная индустрия. – М., 2009. – №7. – С. 25 – 28.

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов,

материалах конференций и других изданиях

12. Нечаев А.Ю. Методика определения состояния вентиляции и кровотока в легких у животных с помощью оксигемометрии / А.Ю. Нечаев, М.В. Куляко // Материалы 54-й конф. молодых ученых и студентов. – СПб., 2000. – С. 64–65.

13. Нечаев А.Ю. Исследование мяса и мясопродуктов на цистицеркоз и трихинеллез / А.Ю. Нечаев. – СПб., 2001. – 32 с.

14. Нечаев А.Ю. Цистицеркоз крупного рогатого скота и свиней /А.Ю. Нечаев, С.А. Серко // Практик. – СПб., 2001. – №5. – С. 6–8.

15. Нечаев А.Ю. К диагностике сальмонеллеза / А.Ю. Нечаев // Практик. – СПб., 2003. – №3/4. – С. 14–15.

16. Нечаев А.Ю. Выявление сальмонелл на пищевых предприятиях методом ПЦР / А.Ю. Нечаев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб. научн. тр. СПбГАВМ. – СПб., 2003 – №135.– С. 78 – 79.

17. Нечаев А.Ю. Ветсанэкспертиза мяса и мясопродуктов при цистицеркозе и трихинеллезе / А.Ю. Нечаев. – СПб., 2003. – 44 с.

18. Нечаев А.Ю. Перспективы внедрения метода ПЦР в ветеринарную практику / А.Ю. Нечаев // Материалы конф. проф.-преп. состава СПбГАВМ. – СПб., 2004.– С. 92–93.

19. Нечаев А.Ю. Современные методы оценки мясной продукции в кролиководстве /А.Ю. Нечаев, С.А. Серко // Международный вестник ветеринарии – СПб., 2004 – № 2.– С.79–82.

20. Нечаев А.Ю. О дополнительных мерах по предупреждению трихинеллеза / А.Ю. Нечаев // Материалы конф. проф.-преп. состава СПбГАВМ. – СПб., 2006.– С. 74.

21. Нечаев А.Ю. К вопросу о безопасности продукции на мясном рынке России / А.Ю. Нечаев, С.А. Серко // Материалы конф. проф.-преп. состава СПбГАВМ. – СПб., 2006.– С. 99–100.

22. Нечаев А.Ю. Метод полимеразной цепной реакции / А.Ю. Нечаев, А.А. Сухинин, О.Г. Кузьмина. – СПб., 2006. – 18 с.

23. Нечаев А.Ю. Применение метода ПЦР в ветеринарной практике / А.Ю. Нечаев, А.А. Сухинин, О.Г. Кузьмина, Ю.Н. Соколова.– СПб., 2006.– 26с.

24. Нечаев А.Ю. Идентификация листерий в пищевых продуктах методом флуоресцентного анализа / А.Ю. Нечаев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб. научн. тр. СПбГАВМ. – СПб., 2006 – №138.– С. 62–64.

25. Нечаев А.Ю. О возможностях рН-метрии при ветеринарно-санитарной оценке мяса /А.Ю. Нечаев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб. научн. тр. СПбГАВМ. – СПб., 2006 – №138.– С. 64–65.

26. Нечаев А.Ю. Оценка эффективности выявления патогенных листерий в пищевых продуктах / А.Ю. Нечаев // Ветеринарный консультант. – М., 2006. – №19. – С. 21–22.

27. Нечаев А. Ю. Ускоренные методы определения сальмонелл и листерий в практике ветеринарно-санитарной экспертизы / А.Ю. Нечаев // Материалы конф. проф.-преп. состава СПбГАВМ. – СПб., 2007.– С. 57–58.

28. Нечаев А.Ю. Показатели кислотно-щелочного баланса и рН-метрия в практике ветеринарно-санитарной экспертизы / А.Ю. Нечаев. – СПб., 2007. – 15 с.

29. Нечаев А.Ю. рН-метрия на различных этапах ветсанэкспертизы мяса / А.Ю. Нечаев // Практик. – СПб., 2007. – №5. – С. 20–25.

30. Нечаев А.Ю. Применение показателей рН для ветеринарно-санитарной оценки мяса / А.Ю. Нечаев // Материалы 2-й научн.-практ. конф. «Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение» СПбГАВМ. – СПб., 2007.– С. 48–49.

31. Нечаев А.Ю. Кислотно-щелочной баланс как метод оценки функционального состояния животного / А.Ю. Нечаев // Материалы 2-й научн.-практ. конф. «Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение» СПбГАВМ. – СПб., 2007. – С. 46–47.

32. Нечаев А.Ю. К оценке эффективности выявления трихинелл с низким уровнем инвазии / А.Ю. Нечаев, С.А. Серко // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб. научн. тр. СПбГАВМ. – СПб., 2007 – №139.– С. 78–79.

33. Нечаев А.Ю. Крупный рогатый скот: содержание, кормление, болезни, диагностика и лечение: учеб. пособие / А.Ю. Нечаев, А.Ф. Кузнецов, Г.М. Андреев и др.–СПб: Изд-во«Лань», 2007.– 624с.

34. Нечаев А.Ю. Оценка предубойного состояния животных на основе показателей кислотно-щелочного баланса / А.Ю. Нечаев. – СПб., 2008. – 17 с.

35. Нечаев А.Ю. Особенности ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов на листериоз /А.Ю. Нечаев, А.В.  Яшин // Практик. – СПб., 2008. – №5. – С. 14–19.

36. Нечаев А.Ю. Nachweis von Listeria monocytogenes in Vakuum verpackten Fleischerzeugnissen mittels PCR, VIDAS und kulturellen Methoden / А. Netschajew, M. Fredriksson-Ahomaa,  B. Sperner  und  A. Stolle. In: Amtstierrztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle. – Abstractband zur 49 Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene. – Garmisch-Partenkirchen, 2008. – S. 141.

37.  Нечаев А.Ю. Особенности ветсанэкспертизы мясопродуктов на листериоз /А.Ю. Нечаев, А.В.  Яшин // Известия СПбГАУ. – СПб., 2008. – № 11  – С. 101 – 104.

38.  Нечаев А.Ю. Detection of Listeria monocytogenes in vacuum-packed meat products using real-time PCR, immunoassay and culturing / А. Netschajew, M. Fredriksson-Ahomaa,  B. Sperner  und  A. Stolle // Archives for Food Hygiene. – 2009. – Vol. 60. – Р. 12 – 17.

39. Нечаев А.Ю. Количественное определение  Listeria monocytogenes в колбасных изделиях и продуктах из мяса / А.Ю. Нечаев, Д.С. Батаева. – СПб., 2009.–12 с.

40. Нечаев А.Ю. Коррекция нарушений резистентности поросят по показателям кислотно-щелочного баланса / А.Ю. Нечаев, К.В. Племяшов // Материалы конф. проф.-преп. состава СПбГАВМ. – СПб., 2009.– С. 84 – 85.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.