WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ЯКУПОВ ТАЛГАТ РАВИЛОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ,  ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТУБЕРКУЛЕЗА И ЛЕЙКОЗА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Казань - 2011

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия

ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана»

Научный консультант:  доктор ветеринарных наук, профессор

  Алимов Азат Миргасимович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

  Юсупов Расых Халиулович

  доктор ветеринарных наук, профессор

  Байматов Валерий Нурмухаметович

  доктор медицинских наук, профессор

  Поздеев Аскар Кимович

Ведущая организация:  ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт бруцеллеза и туберкулеза животных

  Сибирского отделения Российской академии

  Сельскохозяйственных наук» (ГНУ «ВНИИБТЖ»)

Защита диссертации состоится «_____» ________2011 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.01 при ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» по адресу: 420029, г.Казань, ул.Сибирский тракт, д.35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана».

Автореферат разослан «____» _________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук А.К.Галиуллин

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота наиболее распространенные хронические инфекции в животноводстве и представляют собой важные проблемы не только ветеринарной медицины, животноводства, но  биологии и экологии в целом и имеющие непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. На современном этапе борьбы с туберкулёзом и лейкозом животных, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся своевременная и точная диагностика этих инфекций.

Огромный вклад в изучение эпизоотологии, диагностики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных внесли такие ученые как М.Н.Верещагин (1926), П.П.Вишневский (1935), М.К.Юсковец (1963), О.В.Мартма (1971), В.П.Урбан (1980), М.А.Сафин (1980), Д.Д.Новак (1984), Н.М.Колычев (1992), А.С.Донченко (1993, 1995), В.Г.Ощепков (2001), Н.А.Донченко (2008), А.Х.Найманов (2009) и другие.

Диагноз на туберкулез ставят комплексным методом на основе эпизоотологических, клинических, аллергических, патологоанатомических и лабораторных исследований. Однако не возможно выделить какой-либо один метод диагностики туберкулеза, имеющий значительные преимущества перед другими, скорее они могут взаимодополнять друг друга и поэтому имеют право на существование (С.И.Татьков и др.,2006; В.А.Сазонов и др. 1996). По мнению А.М.Лысенко (1987), Е.В.Маслова (1986), Armbrust А. (1988) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее перспективен иммуноферментный анализ, который позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных, прост в применении и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим, получение и изучение антигенных и иммуногенных характеристик микобактериальных антигенов, специфических антител, возможностей их использования для диагностики туберкулеза, дифференциации неспецифических реакций животных на туберкулин в иммунохимических реакциях являются актуальной задачей для ветеринарной практики в плане повышения эффективности диагностики, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза крупного рогатого скота.

Определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами противотуберкулезные антитела не достаточно используются для характеристики микобактериальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей (Л.Н.Черноусова и др., 1995, 2000). Разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных остается актуальной задачей научных исследований (А.Н.Шаров и др., 2000, 2003; М.С.Калмыкова,  2007). Более преспективной в этом отношении, наряду с методами иммуноферментного анализа, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время, в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота и идентификации микобактерий, интенсивно разрабатываются различные подходы по применению ПЦР и других приемов генодиагностики (С.Н.Радюк, Г.Р.Мацевич, 1997; Е.Б.Вишневская, 1998; А.Н.Шаров, В.А.Седов, 1998; А.М.Алимов, 1999; А.Х.Найманов и др., 2004; Н.А.Донченко, 2008 и др.).

В структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота в РФ занимает лидирующее место и составляет более 50% от других нозологий (М.И.Гулюкин, 2003; А.М.Смирнов, 2005). Широкая распространенность лейкоза крупного рогатого скота, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность научных исследований по этой проблеме (Г.А.Симонян, 1975; В.А.Бусол, 1983;  М.И.Гулюкин, 2003;  Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1985; В.М.Нахамсон, 1986; П.Н.Смирнов, 1986;  И.М.Донник, 1999; В.В.Храмцов, М.А.Амироков, 2005; А.М.Алимов, 2010).

Одним из приоритетных направлений исследований по изучению особенностей и закономерностей инфекционного процесса лейкоза крупного рогатого скота  является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики болезни (В.А.Бусол, 1997; Р.В; О.А.Верховский и др., 2002; М.И.Гулюкин, В.А.Храмцов, А.С, Донченко и др., 2002; В.И.Околелов и др., 2003; П.Н.Смирнов, 2008; М.И.Гулюкин, 2008; И.М.Донник и др., 2009).

В настоящее время, согласно стандартам МЭБ, узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффузии в геле агара и метод иммуноферментного анализа. 

Важным преимуществом иммуноферментных методов, наряду с более высокой чувствительностью и специфичностью, является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения, то ИФА для выявления специфических антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах (Nguyen V.K., Maes R.F., 1992; Sargeant J.M., Kelton D.F et al., 1997).

Весьма актуальной задачей является изучение иммунологических аспектов патогенеза лейкоза крупного рогатого скота. Определение динамики образования и спектра антител, идентификация и изучение состава иммунных комплексов способствуют расшифровке молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия вируса лейкоза с макроорганизмом и объяснению особенностей патогенеза.

Результаты подобных исследований явятся основой для разработки новых высокоспецифичных и ранних методов выявления инфицированности животных возбудителями туберкулеза и лейкоза, а также для создания более надежной системы мер борьбы с этими опасными инфекционными болезнями.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также средств индикации и идентификации возбудителей этих инфекций. В соответствии с целью решались следующие задачи:

- изучить антигенную структуру микобактерий и усовершенствовать способы получения антигенных препаратов;

- изыскать способы получения высокоспецифичных антигенов микобактерий и антител, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, и дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин методом ИФА;

- определить эффективность иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

-  определить диагностическую ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- изучить динамику образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота;

- разработать ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке, и определить его диагностическую ценность;

- изучить динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза;

Научная новизна. Иммунохимическими и биохимическими методами изучена антигенная структура микобактерий и разработаны способы получения высокоспецифичных антигенов из инактивированных культур и антител к ним, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что особенности антителогенеза, диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе являются важными факторами повышения эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые разработан способ получения антигенов микобактерий, обеспечивающих дифференциальную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа («Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» – положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 12.08.2010г., заявка №2009112145).

Показана высокая информативность разработанного ИФА для выяснения эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.

Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам, обеспечивающая индикацию и дифференциацию микобактерий в патологическом материале методом иммуноферментного анализа («Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M.bovis» – рационализаторское предложение №314-91 от 5.03.1991).

Разработан ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов в пробах («Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» – заявка на патент РФ №2010100016, приоритетная справка от 11.02.2010г.) и определена его диагностическая ценность. Установлено, что иммуноферментный анализ с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке увеличивает выявляемость инфицированных ВЛКРС животных на 20%.

Впервые изучена динамика образования и спектр свободных антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС в естественных условиях. Установлено, что при уменьшении титров свободных антител в сыворотке крови повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр антител меняется. Данные факты свидетельствует о том, что разовые серологические тесты, основанные на выявление антител против только одного антигена, в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Впервые методом полимеразной цепной реакции доказано присутствие в составе циркулирующих иммунных комплексов провирусной ДНК ВЛКРС, что расширяет представления о патогенезе инфекции и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы.  Разработанный способ выделения специфических микобактериальных антигенов повышает эффективность прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота иммунологическими  методами.

«Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале» позволяют выяснить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в хозяйствах, и рекомендуются для включения в комплексную систему мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота.

Разработанный иммуноблот анализ микобактериальных антигенов позволяет идентифицировать микобактерии и может быть использован в качестве дополнительного теста для диагностики туберкулеза.

Для повышения выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота целесообразно проводить ИФА с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в исследуемых пробах открывает широкие перспективы для диагностики данной инфекции методом иммуноферментного анализа молока.

Результаты научных исследований успешно апробированы и внедрены в хозяйствах Буинского, Дрожжановского, Зеленодольского, Черемшанского, Тюлячинского, Нижнекамского, Высокогорского, Арского и др. районов РТ. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, направленные на усовершенствование методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные НТС КГАВМ, ГУВ КМ РТ:

«Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

«Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные НТС ГУВ КМ РТ, протокол №1 от 21.01.2008г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 2 от 4.06.2009.  и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 3 от 8.10.2010г.

Методические рекомендации по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 5 от 15.12.10г. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 4 от 20.12.2010г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота представлены в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке.

Апрбация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на республиканских и Всероссийских научно-производственных конференциях по актуальным проблемам агропромышленного комплекса (Казань, 1989, 1990, 1991, 1993, 1999, 2004, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010); Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» (Н.Новгород, 1990); межвузовской научно-производственной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства» (Ставрополь, 1991); международной научной конференции посвященной 125-летию КГАВМ (Казань, 1998);  международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию членкора ВАСХНИИЛ В.Т.Котова (Воронеж, 1999); республиканских научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Казань, 1998, 2000); международной научной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2000); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); Международной научно-производственной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); II-м съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); IV-м съезде Российского общества биохимии и молекулярной биологии (Новосибирск, 2008). Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009).

Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 42 печатных работах, в том числе в 10 изданиях, рекомендованных ВАК, таких как «Ветеринарный врач», «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», «Ученые записки КГАВМ».

Основные положения, выносимые на защиту:

- изучением антигенной структуры микобактерий получены высокоспецифичные антигены и антитела для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

- полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ на основе очищенных антигенов и антител повышают эффективность диагностики туберкулеза и лейкоза, обеспечивают дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, а также индикацию и типизацию микобактерий в патологическом материале.

- инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота сопровождается синтезом антител к различным компонентам вируса, уровень которых варьирует в зависимости от стадии болезни.

- диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе повышают эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 296 страницах стандартного компьютерного набора, содержит 41 таблицу и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.

Библиографический список использованной литературы включает 394 источников, в том числе 180 на иностранных языках. Прилагаются акты производственных и комиссионных испытаний, акты внедрения, патенты на изобретение, методические рекомендации и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

Личный вклад соискателя.  Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н. В.П.Коксин, к.б.н. К.С.Хаертдинов, к.в.н. Усольцев, к.б.н. Зиннатов Ф.Ф.

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.в.н., профессору А.М.Алимову, д.в.н., профессору кафедры биохимии КГАВМ Н.З.Хазипову, ректору ФГОУ ВПО КГАВМ, д.в.н., профессору Г.Ф.Кабирову.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования по теме диссертации проводились в период с 1990 по 2010 гг. на кафедре неорганической и биологической химии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана», в лаборатории ОКИБ Республиканского центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ, в Республиканской ветеринарной лаборатории при ГУВ РТ, ООО «Правда» Высокогорского района.

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с установленными требованиями к эксперименту по подбору аналогов и постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных

Объем работы и методы исследований определялись в зависимости от поставленных задач. Пробы крови, сыворотки крови и молока от крупного рогатого скота получали из благополучных и неблагополучных по туберкулезу и лейкозу хозяйств республики Татарстан. Патологический материал (заглоточные, средостенные, брыжеечные лимфоузлы) получали от поступившего на Казанский мясокомбинат крупного рогатого скота и от проб, поступивших для анализа в республиканскую ветеринарную лабораторию.

Таблица 1 - Объем выполненных исследований

Вид исследований

Количество проб

ИФА для выявления антител к микобактериям в сыворотке крови

5273

ИФА для выявления антител к ВЛКРС в сыворотке крови

568

ИФА для выявления антител  к ВЛКРС в молоке

710

ИФА для выявления микобактериальных антигенов в патматериале

69

Проведение ПЦР

885

Проведение иммуноблот анализа

49

Автоклавированные культуры микобактерий M. bovis, M.avium, M.nonchromogenes, M.scotochromogenes получены из Курской биофабрики. В опытах был использован штамм M.bovis BCG – коммерческий, производство ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Иммуноферментный анализ ставили по стандартной методике в твердофазном неконкурентном варианте. Использовали микротитрационные планшеты для иммунологических реакций, изготовленные ВНИИ и МТ (г.Москва), а также планшеты полистироловые для иммуноферментного анализа производства «Медполимер» (г.Санкт-Петербург).

  Коньюгат. Использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченные пероксидазой, изготовленные МТО «Инциатива», прикладная биохимическая лаборатория г.Щелково, антитела диагностические проти IgG кролика, быка меченые пероксидазой, выпускаемые ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (фелиал «Медгамал»), Anti-Bovine IgG-Peroxidase, antibody produced in rabbit – производства фирмы «Сигма».

Иммуноферментный анализ для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, а также для изучения антигенной общности ВЛКРС и ВИЧ, проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)» производства НПО «Нарвак», и «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест». Учет результатов реакции проводили согласно инструкции диагностического набора.

Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали коммерческие тест-системы:

  1.Тест-система для индикации и дифференциации M.bovis и M.tuberculosis НПО «Нарвак» (г.Москва), «МТБ-com» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, г.Москва).

2. «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ – фирмы «АмплиСенс», Gene Pak (фирмы «Biokom).

Изучение спектра антител в исследуемых пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблот анализа. Иммуноблотинг проводили на тест-системе “New LAV BLOT” фирмы Bio Rad (США). Денситометрию результатов иммуноблоттинга проводили в отраженном свете на сканере “Sharp Ix-330”. В анализе денситограмм была использована программа “Image Master ID Prime” фирмы “Pharmacia Biotech.

Получение микобактериальных антигенов. Автоклавированную микобактериальную массу отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин 5 раз в физиологическом растворе. Для удаления свободных липидов, микробные клетки дважды обрабатывали ацетоном в соотношении 1:2, помещая их в термостат при 370С на 1,5 часа и периодически перемешивая. По истечении этого времени, методом центрифугирования при 5000 об/мин в течение 15 мин, микробные клетки отделяли и подсушивали на воздухе. Обработанные ацетоном микробные клетки заливали раствором диметилсульфоксида (ДМСО) подогретым до 370С, из расчета 6 мл на 1г бактерий и встряхивали в течение 30 мин при 370С, после чего микробные клетки отделяли центрифугированием в том же режиме. Экстракт диализировали против 0,01 М карбонатного буфера (рН 9,6) в течение двух суток. Диализат использовали в качестве антигена в дальнейших исследованиях (ДМСО-антиген).

Электрофоретическое фракционирование антигенов. Диск-электрофорез антигенов проводили по методу Laemli (1970) в пластинчатом полиакриламидном геле с использованием детергента додецилсульфата натрия и восстановителя разрыва по S-S связям - β мекркаптоэтанола. Молекулярные массы белков, содержащихся в антигенных препаратах, определяли в соответствии с разгонкой белковых стандартов (Broad range – изготовитель Сигма и био-Рад) по логарифмической кривой длины пробега маркеров по K.Weber, M.Osborn (1969) и Н.М.Филлипович (1978), а также инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирования с дальнейшей компьютерной обработкой данных с использованием программы Image master.

Хроматографическое фракционирование антигенов. Фракционирование проводили методом гель-хроматографии и ионообменной хроматографии

на базе ДЕАЕ-целлюлозы. Подготовка ДЕАЕ-целлюлозы проводилась по общепринятой методике. Использовали хроматографические колонки с внутренним объемом 300 см3. Параметры градиентного элюирования определялись опытным путем. Для гель-хроматографии использовали колонку 4,5 х 60 см с сефадексом G-100 и уравновешенную 0,05М Nа-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 0,1М NaCl. Процесс элюирования фракций и регистрация результатов производился с помощью УФ-детектора UVICORD –2, сбор фракций осуществлялся на коллекторе фракций FRAC –100.

Проведение иммуноблотинга. Электроперенос белков фракционированных в ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили по методике, описанной Towbin et al. (1989). Полиакриламидный гель погружали в трис буфер рН 10,5 на 30 минут, нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в трис-глициновом буфере рН 8,8 – 5 минут, по истечении этого времени собирали сендвич (фильтровальная бумага – гель – НЦМ – фильтровальная бумага) и помещали его между анодом и катодом. Перенос проходил в течение 2,5 часа при напряжении в 100 V  и силе тока 100мА на пластинку с охлаждением при помощи хладагентов (Coolpack MC-3 Iaminarmedica).

Иммуноблот анализ проводили следующим образом: нитроцеллюлозную мембрану нарезали на полоски – стрипы, маркировали, помещали их в пластиковые канавки, вносили 2 мл ФСР-Т, выдерживали 5 минут, вносили по 10 мкл исследуемых сывороток на стрип, выдерживали 2 часа при комнатной температуре на шейкере, 3 раза промывали раствором ФСР-Т с 5 минутной инкубацией, после каждой промывки раствор аспирировали в дезинфекционную емкость с 6% перекиси водорода, вносили конъюгат в рабочем разведении, инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере, стрипы  3 раза промывали раствором ФСР-Т, вносили субстратный, инкубировали до развития цветного окрашивания 15-30 минут, 3 раза промывали дистиллированной водой и высушивали. Учет реакции проводили визуально и инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирования по интенсивности окрашивания с использованием компьютерной программы Image master, версия 1.

Получение иммунных сывороток против микобактериальных антигенов.  В качестве продуцентов гипериммунной сыворотки использовали кроликов. Иммунизацию животных проводили по методу, описанному Harboe N., Ingild A. (1977). Готовили раствор антигена в концентрации 2-4 мг/мл с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. На 1-й, 14-й, 28-й и 43-й день иммунизации кроликам вводили раствор антигена в объеме 1 мл. Инъекцию производили в утолщенный участок кожи над лопаткой в 8-10 точках. На 50-й день отбирали кровь из ушной вены. Через каждые шесть недель брали очередную порцию крови, причем животному вводили стандартную смесь антигена за 8-10 дней до отбора крови. Специфичность полученных антисывороток изучали в динамике в РСК и ИФА с антигеном из гомологичных и гетерологичных бактериальных клеток.

Выделение микобактериальных антигенов из тканей патологического материала крупного рогатого скота. Проводили обработку патологического материала, с целью выделения микобактериальных антигенов, по методу описанному Хазиповым Н.З., Тюриковой Р.П., Нуруллиным А.А. (1986).

Для анализа брали 1-2 г лимфатических узлов (средостенных, заглоточных, брыжеечных и др.) и растирали их кварцевым песком в ступке. Разрушенную ткань суспендировали в гипотоническом растворе NaCl состоящем на 20 % от 0,05 %-го раствора MgCl2 и тщательно перемешивали. К полученной смеси добавляли равный объем физиологического раствора и перемешивали еще 10 мин. Суспензию сливали в узкогорлую колбу на 50 мл, добавляли 1 мл углеводорода (керосин), закрывали плотно резиновой пробкой и энергично встряхивали 10-15 минут. Добавляли в колбу дистиллированной воды до горлышка и оставляли смесь при комнатной температуре на 2 часа. По истечении этого времени с поверхности жидкости отбирали сливкообразный слой, помещали его в центрифужную пробирку, центрифугировали при 8000 об/мин 20 минут. Жидкую фазу сливали, а плотную (пленку) заливали, двойным объемом ацетона и выдерживали при 370С 30-40 минут. После центрифугирования при 4000 об/мин 20 минут ацетон сливали. Этот процесс повторяли дважды. Выделенные фракции после высушивания при комнатной температуре обрабатывали ДМСО и исследовали в ИФА.

Постановка иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (ИФА) по определению специфических антител к микобактериям осуществляли в непрямом варианте на полистироловых планшетах для иммунологических реакций по методу, описанному Woller A. et al. (1976).

В лунки планшета вносили по 100 мкл растворов антигенов в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6) и инкубировали 16-18 часов при комнатной температуре. После 3-х кратного промывания раствором для промывки в лунки вносили по 100 мкл исследуемых и контрольных сывороток разведенных в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,3. Инкубировали 1 час при 370С и промывали 3-4 раза. После этого в лунки вносили по 100 мкл  конъюгата, разведенного в том же буфере. Инкубировали планшет в течение 30 мин при 370С, промывали лунки планшета не менее 5 раз и вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата. После выдерживания планшет в течение 15 минут при 370С, реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2н раствора серной кислоты в каждую лунку.

Учет результатов реакции ИФА проводили на вертикальном сканирующем спектрофотометре. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), который равняется отношению величины оптической плотности исследуемой пробы (ОП0) на величину оптической плотности контрольной пробы (ОПк). Положительно реагирующими считали пробы с К более 2 при разведении 1:200.

Выделение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Циркулирующие иммунные комплексы  были выделены методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ).  Пробы смешивали в соотношении 1 : 1 с 7% раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4оС в течение 72-х часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5%, 7% и 10,5% в боратном буфере. Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Комплексы разбивали с предварительной инкубацией проб при 50оС в течение 2 часов.

Результаты исследований подвергали математической обработке на ПК с использованием программного комплекса Microsoft Excel 2000. Уровень достоверности полученных данных определяли по критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Микобактериальные антигены и их свойства

Получены ДМСО антигены из автоклавированных клеток M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei, а также из живых микобактериальных культур M.bovis-14, M.bovis BCG, M.tuberculosis, M.intracellulare, M.avium, M.phlei. Оптимизирована техника выделения антигенных препаратов. Установлено, что наиболее специфичные  антигены получаются при вторичной обработке микобактерий с 10% -й ДМСО.

3.1.1. Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонентов микобактерий

Проводили сравнительное изучение электрофореграмм клеточных лизатов,  ДМСО-антигенов живых микобактерий, а также автоклавированных культур M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei.

Установлено, что электрофоретические фракции клеточных лизатов и ДМСО-антигенов живых микобактериальных культур в основном расположены в диапазоне от 10 до 125 кД, а их количество варьирует в зависимости от вида микобактерий. Интенсивно выраженные белковые компоненты расположены в диапазоне от 16 до 69 кД и количество их в этом диапазоне максимальное.  Антиген-экстракты автоклавированных микобактерий имеют четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 46,5 кД - 38,5 кД. Электрофореграммы ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий на 12 - 16 фракций содержат меньше чем у ДМСО-антигенов и клеточных лизатов живых культур. Видимо, в процессе автоклавирования часть белковых фракций, в частности, обладающие высокими молекулярными массами, денатурируют. Полученные результаты соответствуют имеющимся литературным данным. Так, по данным Власенко В.В. (1999), при нагревании антигенов при 1000С в течение 60 минут денатурируются групповые антигены, а видоспецифические сохраняются.

3.1.2. Иммуноблот анализ сероактивных компонентов микобактериальных антигенов

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ и изучение серологической активности электрофоретических компонентов проводили также после переноса белков на мембранные фильтры методом иммуноблот анализа. Использовали гипериммунные кроличьи антисыворотки к ДМСО-антигенам, а также сыворотки крови от больных туберкулезом людей и животных.

Иммуноблоты ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий с гипериммунными сыворотками против гомологичных антигенов показали, что большинство сероактивных фракций располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Количество иммуногенных фракций у разных антигенов по-разному, при этом – мажорных 5-6, а минорных до 10. Большинство общих для всех видов микобактерий антигенных фракций лежат в диапазонах 40-60кД и 20-35 кД. Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза.

Учитывая тот факт, что одной из основных проблем в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является дифференциация неспецифических туберкулиновых реакций, проводили иммуноблотинг ДМСО-антигенов микобактерий с антисывороткой к антигену M.bovis, полученной на кроликах. Аналогичные работы проводились и другими исследователями. Например, по данным Ахметова Т.М. (1990) в клеточном лизате и ДМСО-антигене живых клеток M.bovis сероактивными с родственной антисывороткой оказалось 7 фракций, среди которых специфической является фракция с молекулярной массой 30кД.

Иммуноблот анализ ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий проводился впервые. ДМСО-антигены живых и автоклавированных клеток M.bovis по молекулярным массам сероактивных компонентов не совпадают. Фракции с молекулярными массами 20, 30, 45, 50, 97 кД антигена автоклавированных культур являются общими для всех исследованных видов микобактерий: M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes. Фракция с Мм 60 кД является характерной только для антигена M.bovis. Однако, на иммуноблотах антигенов с сыворотками от больных туберкулезом людей такая сероактивная фракция обнаружена и у антигена M.tuberculosis.

Сведений об использовании антигена 60 или А 60 в серодиагностике туберкулеза достаточно много. По данным некоторых исследователей А60 является общим к большинству видов микобактерий, включая M.tuberculosis, M.bovis и M.avium. Однако в своих исследованиях мы у антигена M.avium сероактивную фракцию Мм 60 не обнаружили.

M.Amadori, S.Tameni et al., (1997), утверждают, что крупный рогатый скот, инфицированный M.bovis, имеет тенденцию к более выраженному иммунному ответу к антигенам c молекулярными массами 27, 60, 74кД. По результатам иммуноблота мы также обнаружили, что в ДМСО-антигене автоклавированных M.bovis присутствуют сероактивные фракции с Мм 27 и 74кД. Однако они являются общими для всех исследованных видов микобактерий и относятся к минорным фракциям.

На иммуноблотах ДМСО-антигена M.bovis с сыворотками от коров, реагирующих на ППД туберкулин, из 12  проб только 3 реагировали, образуя мажорные фракции с антигеном Мм 60. Еще у 3 проб – минорные фракции в этой области. Остальные пробы проявили на иммуноблотах фракции  различной интенсивности в диапазоне 20-30 и 70-200 кД, что больше соответствует иммунным сывороткам против микобактерий птичьего вида и нехромотогенной группы.

Таким образом, иммуноблот анализ ДМСО-антигенов автоклавирован-ных микобактерий, успешно может быть использован в прижизненной диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, а также туберкулеза у людей.

3.1.3. Антигенные свойства ППД туберкулинов и  ДМСО-антигенов

На первом этапе работы проводили фракционирование  и изучение антигенных свойств фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов.

Для фракционирования микобактериальных антигенов выбрали ионообменную хроматографию на базе ДЕАЕ-целлюлозы. С каждого антигена получены более 100 фракций. Градиентное элюирование фракций антигенов с увеличением ионной силы раствора давало на регистраторе до 5 малых пиков, градиентное элюирование с увеличением рН раствора дало также до 5 малых и от одного до 3-х больших пиков.

Изучение специфичности полученных больших пиков в реакциях ИФА, с гипериммунными кроличьими сыворотками, показало наличие между ними выраженных перекрестных реакций. Следовательно, эти пики хроматограмм представляли собой неспецифические, балластные белковые фракции антигенов. Наибольшей активностью в ИФА обладали пики, полученные при градиентной элюции, связанной с увеличением ионной силы раствора. Наиболее специфичными у антигенов M.bovis является 25-я; M.scotochromogenes – 31-я; M.nonchromogenes – 38-я; M.avium – 46-я фракция. Они позволяли дифференцировать иммунные сыворотки к гомологичным микобактериальным антигенам в ИФА с коэффициентом специфичности более 5.

Секретируемые белки микобактерий играют важную роль в защитном иммунитете. Они связаны с клеточной стенкой и входят в состав пептидогликанового комплекс и могут быть использованы для идентификации микобактерий в двухмерном электрофорезе культуральной жидкости и методом вестерн-блоттинга (Ohara N,  H.Kitaura et al., 1995).

Если учесть, что ППД-туберкулины представляют собой культуральные белки, то сравнительное изучение иммуногенности фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов представляют собой определенный практический интерес. В этих целях использовали гельфильтрацию на сефадексе G-200.

По данным Новак Д.Д., Шакенов Б.Н. (2005), при разделении ППД-туберкулина для млекопитающих методом последовательной хроматографии на двух марках сефадексов (G-50 и G-150) полного отделения специфических компонентов не происходит. Авторы проводили «групповое разделение» и получили 2 основные фракции. В нашем случае также получились 2 большие группы полипептидов, но с фракционированием внутри каждой группы.

Молекулярные  веса полученных фракций составили: для фракций ДМСО – антигена от 10 до 100 кД ППД-туберкулина для млекопитающих – от 4 до 55 кД и для ППД-туберкулина для птиц – от 4 до 60 кД.

Методом непрямого твердофазного ИФА определяли специфичность каждой фракции.  Наибольшей специфичностью обладали фракция №16 ДМСО-антигена М.Bovis, фракции №14 и 15 ППД-туберкулина для млекопитающих и фракция №18 ППД-туберкулина для птиц. Коэффициенты специфичности этих фракций со специфическими антителами составили от 3,5 до 3,8 и показывали перекрестные реакции с К не более 2. Молекулярные массы у них составляет около 15 кД, т.е. они представляют собой низкомолекулярные белки, полипептиды.

Таким образом, гель-хроматография позволяет избавиться от балластных белков и выделить специфичные, иммуногенные фракции антигенов. Полученные специфичные фракции ППД-туберкулинов могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза животных.

Против ДМСО-антигенов и ППД туберкулинов получали гипериммунные сыворотки на кроликах. Специфичность антисывороток изучали в ИФА против гомологичных антигенов. Результаты показали, что иммунизация животных ППД-туберкулинами не позволяет получать специфичные иммунные сыворотки. Антисыворотки, против ДМСО антигенов микобактерий, хотя и обладали специфичностью, между некоторыми видами наблюдались значительные перекрестные реакции.

При иммунизации кроликов против гомологичных микобактериальных антигенов образуются различные по специфичности антитела. Наиболее специфичные антитела образуются в более поздних сроках иммунизации, в нашем случае на 170 день. В начальных стадиях иммунизации  титры неспецифических антител примерно на одном уровне со специфическими.

3.2. Иммуноферментный анализ для выявления микобактериальных антигенов в патологическом материале

Огромный практический интерес представляет возможности иммуноферментного анализа при обнаружении и типизации микобактериальных антигенов в патологическом материале. ИФА является потенциально ценным для ускоренного обнаружения микобактерий и их антигенов в тканевых пробах при отрицательных результатах гистологических исследований. Разноречивые литературные данные о диагностической ценности ИФА связано качеством используемых антигенов и низкой специфичностью применяемых иммунных сывороток.

3.2.1. Иммуносорбентная очистка иммунных сывороток

Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам. Для этой цели использовали белково-глутаральдегидный иммуносорбент, приготовленный на основе методик Avrameas S., Ternynck T. (1969), Friemel H. (1984). На белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M.bovis получено удостоверение на рационализаторское предложение № 314-91 от 5.03.1991. По этому методу берутся целые микробные клетки всех видов, кроме тех, против которых истощается сыворотка. Предварительно микобактериальную массу отмывали от питательной среды и обрабатывали ацетоном (см. «Получение антигена»). После подсушивания микробных клеток на воздухе протирали их в ступке и отбирали в химический стакан на 50 мл навеску 500 мг., добавляли из расчета 1:4 бычий сывороточный альбумин. Полученную массу растворяли в 25 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0. К раствору по каплям, при постоянном перемешивании  добавляли 7,5 мл 2,5% раствора глутарового альдегида. Через 3 часа при комнатной температуре образуется гель. Гель гомогенизировали в 200 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,3. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 1000 g. Частицы белка отмывали фосфатным буфером до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280нм не стало менее 0,01. Затем гель трижды суспендировали в 200 мл 0,1 М глицин-НCl буфере с рН 2,8 и вновь в 200 мл фосфатного буфера. Процесс повторяли до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280 нм не стала равной нулю. Отмытый гель переносили в центрифужную пробирку и добавляли соответствующее количество антисыворотки. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре оставляли на 2 часа в термостате при 370С. Надосадочной фракцией повторяли эту процедуру со свежим иммуносорбентом 5 раз.

Качество полученных антисывороток изучали в ИФА. В результате проделанной работы нам удалось в несколько раз повысить специфичность иммунных сывороток. Перекрестные реакции между различными видами антисывороток в ИФА на гомологичные микобактериальные антигены наблюдали только в разведениях 1:100 – 1:150, в то время как специфические сыворотки против соответствующих антигенов работали при иммуноферментном анализе, в разведениях свыше 1:30000.

Применение антисывороток к ДМСО-антигенам, истощенных белково-глутаральдегидным иммуносорбентом в ИФА, позволяло дифференцировать микобактериальные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5, что является достаточно высоким показателем позволяющим использовать их при типизации этих штаммов.

3.2.2. Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале

Известно, что чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента. Поэтому выбор оптимальной концентрации реагентов и определение основных условий для постановки реакции ИФА, обеспечивающих достижения максимальной точности и чувствительности анализа, имеет важное значение (Дзантиев Б.Б., 1979, Miller D.A., Williams E.D, 1980  и др.).

Исходя из имеющихся данных, указывающих на то, что адсорбция на полистирол определяется количеством и строением молекулы используемого антигена, было проведено исследование по определению оптимальной концентрации ДМСО-антигена при адсорбции в лунки иммунологического планшета. Установлено, что максимальная величина коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена в концентрации 2 мкг/мл. Для полного представления возможностей ИФА при выявлении микобактерий M.bovis в патологическом материале определили чувствительность метода, что составляет 100 микробных клеток на мг ткани.

Результаты работ по изучению возможностей использования ИФА для выявления возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в патологическом материале, а также по определению чувствительности метода проверялись межвузовскими комиссионными испытаниями (акт от 05.01.90). В опытах использовали кроличьи гипериммунные сыворотки к ДМСО-антигенам истощенные белково-глутаральдегидным иммуносорбентом. В качестве испытуемого материала брали ткани заглоточных, средостенных и брыжеечных лимфоузлов от заведомо здоровых и больных туберкулезом коров.

Комиссия заключила, что антиген, полученный из инактивированной бактериальной массы M.bovis, позволяет получать видоспецифическую сыворотку, пригодную для выявления возбудителя туберкулеза в патологическом материале крупного рогатого скота методом ИФА. Метод иммуноферментного анализа с использованием иммунной сыворотки к антигену M.bovis пригоден для обнаружения и типизации возбудителя туберкулеза в патологическом материале крупного рогатого скота.

На основании полученных результатов сконструирована тест-система иммуноферментная для индикации и дифференциации микобактерий в патологическом материале. Тест-система состоит из следующих компонентов: планшеты полистироловые для иммунологических реакций; положительные контрольные антигены – ДМСО-антигены M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei; положительные сыворотки – кроличьи антисыворотки против указанных микобактерий; отрицательная сыворотка; компоненты буферных растворов для разведения реагентов тест-системы; конъюгат, антивидовой иммунопероксидазный против антител кролика; ортофенилендиамин и стоп-реагент. Разработаны методические рекомендации по приготовлению реагентов тест-системы, постановке реакции, оценке и интерпретации результатов анализа, которые утверждены на научно-техническом Совете КВИ (протокол №5 от 22.05.92).

Апробируя данную методику, проводили исследование патологического материала от 69 голов крупного рогатого скота, убитых на Казанском мясокомбинате. 33 пробы получены от реагирующих и 36 проб от нереагирующих на ППД туберкулин, но имеющие высокие  титры сывороточных антител против M.bovis в ИФА.

При убое 33 голов крупного рогатого скота из группы положительно реагирующих на туберкулин, у 18 обнаружены характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения, а при анализе методом ИФА патматериала дополнительно было выявлено еще 5 голов животных больных туберкулезом. В 5 случаях из тканей органов, с выраженным туберкулезным процессом, не удалось выделить микобактериальный антиген.

12 проб сыворотки крови этих же 33 животных показали отрицательные результаты при иммуноферментном анализе сывороток крови. Результаты паталогоанатомического исследования и ИФА патматериала показали отсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них. В двух случаях были обнаружены характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения в средостенных лимфоузлах.

При убое 36 голов нереагирующих на туберкулин коров, но имеющих высокие титры специфических антител против M.bovis при ИФА, у 18 голов обнаружены характерные для туберкулеза изменения в лимфоузлах. В 11 случаях без видимых патологоанатомических изменений реакция в ИФА на обнаружение антигена M.bovis была положительной. Полученные данные подтверждены бактериологическими исследованиями в Республиканской ветеринарной лаборатории.

3.3. Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

Изучая эффективность ИФА, и определяя его место в комплексе диагностических мероприятий при туберкулезе, исследовали пробы сывороток крови коров из различных по эпизоотической ситуации хозяйств.

Всего исследовано 3723 пробы, в том числе из благополучных по туберкулезу хозяйств – 1063, из неблагополучных - 2670. В 23 хозяйствах, где за последние три года не выявлено ни одного животного реагирующего на туберкулин, результаты иммуноферментного анализа были отрицательными.

2425 проб сыворотки крови из неблагополучных хозяйств были исследованы иммуноферментным методом в сравнении с результатами аллергической пробы у тех же животных, в том числе 643 проб – от  реагирующих и 1782 – от не реагирующих на туберкулин животных.

При иммуноферментном анализе проб сывороток крови от реагирующих на туберкулин коров, в 297 обнаружены противотуберкулезные антитела в высоких титрах, а в 346 пробах получены отрицательные результаты (46,2% и 53,8% соответственно).

При анализе методом ИФА для выявления антител в пробах сывороток крови от нереагирующих на туберкулин коров получены следующие результаты: 158 проб (8,86%) – с положительной реакцией, 1624 проб (91,14%) – с отрицательной реакцией.

Для определения степени достоверности полученных данных производился контрольный убой животных и бактериологические исследования в Республиканской ветеринарной лаборатории.

Результаты патологоанатомических исследований 36 коров нереагирующих на туберкулин, но положительные в ИФА,  показали, что у 18 голов имеются характерные для туберкулеза изменения в лимфоузлах. Результаты патологоанатомического исследования и бактериоскопии патматериала от 12 коров реагирующих на туберкулин, но отрицательные в ИФА подтвердили  отсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них.

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что иммуноферментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям. Повышается эффективность диагностических мероприятий, что выражается в увеличении достоверности выявления больных туберкулезом животных до 93%.

На основании полученных результатов приготовлен «Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА», который предназначен для исследования сывороток крови животных с целью выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу в хозяйствах.

Набор препаратов включает в себя все необходимые компоненты для постановки ИФА и 5 планшетов с адсорбированными на них антигенами M.bovis. К набору препаратов прилагается упаковочный лист и наставление по применению. Срок хранения иммунологических планшет определен экспериментально и составляет 1 год при 40С.

На основании приказа по Казанскому ордена Ленина ветеринарному институту им.Н.Э.Баумана от 16.01.91 за № 2 пригодность «Набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» проверялась межвузовским комиссионным испытанием.

На основании анализа результатов комиссионных испытаний, комиссия заключила, что предлагаемый авторами «Набор для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» пригоден по своему целевому назначению и метод ИФА может служить для получения дополнительной информации к аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

3.3.1. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Разработан способ получения микобактериальных антигенов для прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций вызванных атипичными микобактериями методом ИФА (ДМСОм-антиген). Предлагаемый нами модифицированный способ получения антигенов позволяет избавиться от большинства неспецифических белковых фракций. Об этом свидетельствует и результаты электрофоретического фракционирования белковых компонентов. На диск-электрофорезе в 12,5% ПААГ, ДМСО-м антигены показали четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 30 50 кД. Электрофореграммы окрашивали азотнокислым серебром. В электрофореграммах окрашенных кумасси G 250 четко выраженных белковых фракций антигенов выявить не удалось.

В целях производственного испытания эффективности полученных антигенов в дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота проводили ИФА для выявления антител в сыворотках крови, реагирующих на туберкулин коров, из различных хозяйств РТ. Всего исследовано 852 пробы. Для подтверждения полученных данных совместно с ГУВ РТ и Республиканской ветеринарной лабораторией были проведены дополнительные лабораторные исследования.

В пробах сывороток крови коров из 5 хозяйств («Урожай», «Яш-Куч», «Чачаклинский», «Акбаш», «Каракашлы»), благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, не обнаружены антитела против ни одного вида микобактериальных антигенов. Следовательно, причиной положительных туберкулиновых реакций животных являются не микобактерии туберкулеза, что подтверждался лабораторными исследованиями.

  В ряде благополучных по туберкулезу хозяйств, в сыворотках крови коров обнаружены в высоких титрах антитела против атипичных микобактерий.

В КП «Алан» Тюлячинского района причиной туберкулиновых реакций животных являлась зараженность микобактериями птичьего вида. Парааллергические реакции на туберкулин, обусловленные сенсибилизацией организма атипичными микобактериями, аналогичным способом было установлено ещё в 3-х хозяйствах «(Камско-Устьинский» Камско-Устьинского, КП «Уют» Сабинского, «Нижнекамский» Нижнекамского районов).

  В 4-х хозяйствах  (КП «Память Ленина» Буинского, КП «Южный» Бавлинского, КП «Овощевод» и КП «Зеленодольский» Зеленодольского районов) проведенные исследования показали, что в основе туберкулиновых реакций у животных лежит паразитарные заболевания. Однако большая часть положительных в ИФА проб реагировали скотохромогенной группы микобактерий.

  Подтверждая наши результаты бактериологическими методами был установлен туберкулез крупного рогатого скота в 6 хозяйствах («Волга», «Искра» Буинского, «Красный Октябрь» Новошишминского, АПХ им.Горького Камско-Устьинского, «Ерсубайкино» Альметьевского и в совхозе-техникуме Чистопольского районов).

В 3-х  хозяйствах  («Екатериновский», «Агроснаб», «Нур» Спасского района) несколько проб сывороток крови положительно реагировали с антигеном M.bovis, однако результаты наших исследований не нашли подтверждения.

  В целом, обобщая полученные результаты, можно сказать, что иммуноферментный анализ с использованием микобактериальных антигенов, полученных по нашему способу, успешно может быть использован в прижизненной дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Специфичность  составляет более 90%.

3.4 Диагностическая ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота

Диагностическая ценность ИфА была изучена в сравнении с ПЦР с применением ДМСО(м)-антигенов микобактерий и набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза. Всего исследовано 698 проб сывороток и крови крупного рогатого скота.

В целях сравнительного изучения эффективности ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза исследовано 88 проб сыворотки  и крови от одних и тех же животных реагирующих на туберкулин.

На основании полученных результатов совместно с ГУВ и Республиканской ветеринарной лабораторией в хозяйствах «Ерсубайкино» и «Красный Октябрь» Новошишминского района был установлен туберкулез крупного рогатого скота.

Из благополучных по туберкулезу хозяйств (КП «Овощевод» и КП «Тукай» Зеленодольского района) все пробы были отрицательные как в ИФА, так и в ПЦР.  2 пробы, из 21 исследованных по КП «Агроснаб» Спасского района,  дали положительные результаты на M.bovis в ИФА, а в ПЦР все пробы были отрицательные.

Изучая сравнительную эффективность аллергической пробы, ПЦР и ИФА, с использованием ДМСОм-антигенов, исследовали 605 проб. Из благополучных по туберкулезу хозяйств - 288 проб сывороток и крови коров реагирующих на ППД, в т.ч. 50 – с отрицательной реакцией и 233 – с положительной реакцией в ИФА на атипичные микобактерии. Результаты ИФА  и ПЦР в целом, совпали.  Так,  50 проб отрицательные в ИФА в ПЦР также были отрицательные. Из 233 проб с положительной реакцией в ИФА на атипичные микобактерии 21 проба сывороток крови из 3-х хозяйств положительно реагировали на M.bovis.  ПЦР крови от этих же животных показала положительные результаты только в пробах из хозяйства «Искра» Буинского района. Контрольно-диагностический убой коров и лабораторные исследования подтвердили результаты ПЦР.

Из неблагополучных по туберкулезу хозяйств было исследовано 322 пробы, в том числе 251 проба – от реагирующих и 71 – от нереагирующих на туберкулин животных. В данном случае результаты ИФА сывороток крови и ПЦР проб крови, совпали.

Полученные данные свидетельствуют о том, что по обнаружению противотуберкулезных сывороточных антител методом ИФА, не всегда удается диагностировать туберкулез. ПЦР в этом отношении является более чувствительным и специфичным. Однако, иммуноферментный анализ может помочь в определении статуса стада коров по туберкулезу, позволяя исключить туберкулез у части реагирующих на ППД, а также выявить больных туберкулезом из числа не реагирующих на ППД коров.

3.5. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

Диагностические исследования ВЛКРС-инфекций в РФ представлены, главным образом, реакцией иммунодиффузии в геле (РИД), тогда как в странах Европы и Америки широко применяется иммуноферментный анализ.

Важным преимуществом иммуноферментных методов перед РИД является то, что ИФА будучи более чувствительным позволяет выявлять специфические антитела в пробах молока и сборного молока. Если учесть простоту и доступность данного метода, то ИФА для выявления антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах.

3.5.1. Диагностическая ценность ИФА для выявления антител в сыворотке крови и молоке  при лейкозе крупного рогатого скота

В целях сравнительного изучения эффективности РИД и ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота исследовали 139 проб сыворотки крови, в том числе 96 проб положительные и 43 пробы отрицательные по РИД.  5 проб отрицательные по РИД оказались положительными в ИФА, что свидетельствует о более высокой чувствительности иммуноферментного анализа.

Проводили сравнительный анализ эффективности ИФА для выявления специфических антител в пробах сыворотки крови и молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота относительно РИД исследованиям. Всего исследовано 35 проб сыворотки крови и молока от одних и тех же коров из хозяйств «Шингальчи» Нижнекамского района и «Кургуза» Верхне-Услонского района.

Полученные результаты свидетельствуют о более низкой эффективности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота по сравнению с ИФА сывороток крови. ИФА для выявления специфических антител в молоке менее чувствителен и по сравнению с РИД анализом.

3.5.2. Диагностическое значение иммунных комплексов при лейкозе крупного рогатого скота

Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота – РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae. При хронических инфекциях, вызванных вирусами этого семейства, в биологических жидкостях организма появляются иммунные комплексы «антиген-антитело». Эти иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецепторами поглощаются макрофагами, в которых вирус восстанавливает свою инфекционность (Абелян А.В., 1977). Вполне возможно, что одна из причин «феномена рецидивов» ВЛКРС инфекций в ранее оздоровленных стадах именно в этом.

Для исследований по обнаружению ЦИК, методом случайной выборки были отобраны, из числа положительно реагирующих в ИФА, по 30 проб сыворотки крови и молока. Циркулирующие иммунные комплексы были выделены методом преципитации в ПЭГ. Действие ПЭГ на белковые растворы сходно с действием органических растворителей, которые могут вызвать осаждение наряду с иммунными комплексами и свободных иммуноглобулинов. Поэтому проводили исследование по определению титра анти-ВЛКРС антител в пуле сывороток крови и молока до и после обработки с ПЭГ-6000. В результате было установлено, что после осаждения ЦИК из пула сывороток крови и молока 7%-ным раствором ПЭГ титры противолейкозных антител в ИФА не изменялись и были равны титрам антител в исходной пробе.

С целью выяснения структуры выделенных иммунных комплексов проводили ПЦР анализ на наличие в них провирусной ДНК с использованием двух тест-систем. Всего было исследовано 51 проба от серопозитивных животных. Из них 38 – с использованием тест-системы «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ – фирмы «АмплиСенс, Gene Pak (фирмы «Биоком»), 13 – с использованием тест-системы «Лейкоз» для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) методом полимеразной цепной реакции, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва.  Согласно инструкциям тест-систем положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 444 и 294 п.н. большей или меньшей интенсивности соответственно. 24 пробы иммунных комплексов из 38 исследованных первой тест-системой и 8 из13 исследованных второй тест-системой содержали провирусную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Факт обнаружения иммунных комплексов, включающие в себя провирусные ДНК, выявляет новые аспекты патогенеза данного заболевания. Возможно, открыт новый способ распространения инфекции в организме. Провирус в составе ЦИК может путем фагоцитоза попасть в клетку и в процессе очередного кроссинговера ДНК встроиться в геном клетки. В результате таких событий зона поражения инфекцией организма путем митоза клетки может быстро расшириться.

Согласно исследованиям, проведенным Митиным Ю.А. (1997) подобные иммунные комплексы обладают низкой температурной устойчивостью и могут разрушаться в диапазоне от +38°С до +40°С (время инкубации от 30 минут до 2-х часов). Учитывая этот факт и целью выявления «скрытых» противовирусных антител, которые до этого находились в составе циркулирующих иммунных комплексов, мы в своей работе инкубировали пробы молока и сыворотки крови при 500С в течение 2-х часов и определяли изменение титров антител.

Предварительные исследования, проведенные на 6 пробах сыворотки крови и молока от одних и тех же коров, показали, что после инкубирования во всех пробах  титры свободных антител увеличились, и показания в ИФА повысились от 2 до 41 единицы.

В целях проверки достоверности полученных результатов были проведены исследования на большем количестве производственного материала.

Исследованы пробы сыворотки крови и молока коров из хозяйств Зеленодольского и Нижнекамского районов. Процент инфицированности животных  в этих районах составляет, соответственно, 18,8 и 44%, а больных 2,9 и 2,3%. Пробы сывороток крови и молока получены от одних и тех же коров. Всего исследованы по 92 пробы.

53 пробы сыворотки крови были положительные в ИФА до и после термической обработки. Однако внутри этой группы обнаруживается увеличение титров анти-ВЛКРС антител после инкубации. Только в трех случаях титры антител до и после инкубации остались неизменными. Пробы молока от этих же коров показали положительные результаты только в 45 случаях. Однако, после инкубации при 50оС в течение 2-х часов все пробы молока оказались положительными в ИФА. Таким образом, в данном случае чувствительность ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота составила, по сравнению с ИФА сывороток крови, 85%.

Из 38 проб сывороток крови с отрицательной реакцией в ИФА  после инкубирования 13 стали положительными. 33 проб молока от этих же 38 коров до нагревания также были отрицательные. После нагревания 28 - отрицательные, 10 - положительные.

Увеличение титров свободных антител после инкубирования можно объяснить диссоциацией иммунных комплексов и спецификой динамики образования антител и иммунных комплексов при лейкозе.

Определение специфичных антител в составе иммунных комплексов позволяет увеличить достоверность выявления больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения свободных антител в сыворотке крови и молоке. Диссоциация иммунных комплексов, проведенная при температуре 50оС в течение 2-х часов, обеспечивает повышение чувствительности ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке на 20%. Данный способ открывает перспективы для более широкого применения ИФА молока для диагностики лейкоза. 

На основании полученных результатов разработан метод ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией ЦИК в пробах. Для определения диагностической ценности данного метода исследовали пробы молока из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств. Всего исследовано 295 проб молока отрицательно и положительно реагирующих в РИД коров. ИФА ставили: 1). согласно наставления по применению набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота НПО «НАРВАК»; 2). с предварительной диссоциацией ЦИК по предложенной методике.

50 проб молока, полученные из благополучных по лейкозу хозяйств, в иммуноферментном анализе во всех случаях показали отрицательные результаты. Результаты исследований проб полученных из неблагополучных хозяйств представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Сравнительная эффективность ИФА и РИД в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

РИД

Всего проб

ИФА без обработки проб

ИФА с обработкой проб

Полож.

%

Отр.

%

Полож.

%

Отр.

%

Положит.

177

136

77

41

23

165

93

12

7

Отрицат.

68

9

13

59

87

11

16

57

84

Из 177 проб молока от положительно реагирующих  в РИД коров без предварительной обработки 41  прореагировало отрицательно, что свидетельствуют о более низкой эффективности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота по сравнению с РИД.

ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в пробах гораздо чувствительнее и не уступает РИД исследованиям сывороток крови. Как видно из представленных данных, ИФА для выявления антител в молоке по предложенной методике дополнительно выявляет инфицированных животных из числа РИД отрицательных, что имеет важное значение в системе оздоровительных от лейкоза мероприятий.

3.6. Диагностическая ценность ПЦР для выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке

Исследовали 136 проб молока коров положительно реагирующих в РИД из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ. Пробы молока получены от коров инфицированного ВЛКРС стада со стабильной гематологической картиной на разных стадиях развития инфекционного процесса. Выделили 3 условные группы проб: 1) пробы молока коров реагировавших в РИД впервые; 2) через год после первой реакции; 3) в более поздних сроках развития инфекции.

В иммуноферментном анализе с предварительной диссоциацией ЦИК все пробы молока были положительными. ПЦР на обнаружение провируса в лейкоцитах содержащихся в молоке показала положительные результаты в 37 пробах (27%).  В дальнейшем из этих проб молока были выделены иммунные комплексы и проведен ПЦР анализ. Результаты исследований показали, что в 12 из них содержится провирусная ДНК и 9 из них относится к пробам третий, 3 – второй группы.

Роль провирус содержащих иммунных комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции не изучена. Возможно, они формируются в процессе гибели инфицированных В-лимфоцитов путем соединения не встроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными IgM, обладающими высокой аффинностью к ДНК.  Очевиден тот факт, что появляются они в более поздних стадиях болезни при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником заражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза может быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР, что исключит необходимость гематологических исследований и повысит эффективность противолейкозных мероприятий.

3.7. Динамика изменения титров антител против антигена gp51 у инфицированных ВЛКРС животных

Для выполнения поставленной задачи формировали опытную группу коров из 12 голов на базе ООО «Правда» Высокогорского района РТ.

Из них 2 головы гематологически больные, а остальные положительно реагирующие по РИД. Наблюдения велись в течение полугода. Титры связанных и свободных антител в исследуемых пробах определялись методом иммуноферментного анализа через каждые две недели.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что изменения титров противолейкозных антител, в сыворотке крови естественно инфицированных ВЛКРС коров, значительно отличаются от данных экспериментального заражения. По данным Ивановой Л. (2000),  при экспериментальном заражении коров вирусом лейкоза алгоритм изменения титров антител равен трем месяцам, а при естественном заражении он оказался разным.

За период исследования титры сывороточных антител в отдельных пробах оставались неизменными как в достаточно высоких, так и в относительно низких уровнях. Однако, в целом изменения титров антител в пробах происходили синусоидально.

Титры антител в молоке инфицированных коров не коррелируют с таковыми в сыворотке крови. При достаточно высоких титрах сывороточных антител, титры антител в молоке, у одних и тех же коров могут быть минимальными  и наоборот, при низких титрах сывороточных антител – высокие титры антител в молоке. Кроме того, несмотря на значительные изменения титров сывороточных антител по периодам исследования, титры противолейкозных антител в молоке могут не изменяться.  Это дает основания предполагать, что качественный спектр антител в сыворотке крови и молоке разный.

Титры антител, как в молоке, так и в сыворотке крови у гематологически больных животных достоверно снижаются по мере развития болезни.

Сравнивая титры свободных и «связанных» антител в сыворотке крови можно сказать, что они с развитием болезни меняются, и прослеживается взаимосвязь между ними. При уменьшении титров свободных антител наблюдается, в большинстве случаев, увеличение титров «связанных» антител, т.е. повышается степень образования циркулирующих иммунных комплексов.

  Полученные данные свидетельствуют о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота могут быть не достаточно эффективными. Изучение динамики образования иммунных комплексов раскрывают перспективы совершенствования ранней диагностики лейкоза животных.

3.8. Динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза

Для изучения изменения спектра антител с развитием болезни, проводили перекрестные исследования сывороток крови методом ИФА и иммуноблотанализа с антигенами вируса иммунодефицита человека.

В этих целях отобрали 25 проб сыворотки крови из числа положительно реагирующих в ИФА на лейкоз и исследовали «Тест-системой иммуноферментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест».

В результате 16 проб сывороток крови крупного рогатого скота показали положительную реакцию, с титрами антител к антигенам ВИЧ до 1:256. Титры специфических антител на gp51 ВЛКРС  этих же проб составляли до 1:729.

С использованием «Набора для выявления антител к ВЛКРС» были исследованы сыворотки крови от ВИЧ-инфецированных людей. Из 20 исследованных проб только 3 показали отрицательные результаты.

Полученные данные свидетельствуют о том, что gp51 ВЛКРС обладает достаточно высокой гомологичностью белкам ВИЧ.

Однако между титрами антител против gр51 ВЛКРС и титрами антител реагирующих с белками ВИЧ, в сыворотках крови коров, больных лейкозом, закономерной взаимосвязи не просматривается.  Более того, некоторые пробы с низкими титрами противолейкозных антител обнаруживают более высокие титры антител в ИФА на ВИЧ антигены. Полученные данные еще раз подтверждают то, что  развитие лейкоза крупного рогатого скота сопровождается как количественным, так и качественным изменением спектра специфических антител.

Изучение спектра антител в пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблоттинга на все структурные белки ВИЧ. На рисунке 1 представлены денситограммы иммунноблотграмм сероактивных поли­пептидов ВИЧ с положительными к gp51 ВЛКРС сыворотками на разной стадии развития инфекции.

 

А  Б

В Г

Рис.1. Денситограммы иммуноблотограмм сероактивных поли­пептидов ВИЧ с положительными к gp51 ВЛКРС сыворотками на разной стадии развития инфекции

Обозначения: А – сыворотка крови коровы в начальной стадии инфекции, впервые реагировавшей на РИД положительно; Б, В – сыворотка крови коров в более поздних стадиях болезни;  Г – сыворотка крови гематологически больной коровы;

В начальных стадиях развития болезни в сыворотки крови животных появляются антитела перекрестно реагирующие с антигенами ВИЧ р40, р25. В более поздних сроках – с р55, р97, gp120.  GP120 ВИЧ –  гликопротеин оболочки и соответствует gp51 ВЛКРС.

Таким образом, приведенные данные доказывают, что на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр сывороточных антител меняется.

Данный факт свидетельствует о недостаточной эффективности серологических методов, основанных на выявление антител только против одного антигена.

В заключении следует отметить, что наиболее перспективным, в исключении недостатков существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, может являться применение методов иммуноблот анализа.

Иммуноблотинг позволит изучать титры и спектр антител против всех антигенов ВЛКРС, а также продуктов их расщепления. Изучение спектра и динамики образования антител, ЦИК в крови и молоке животных по стадиям развития инфекции, определение взаимосвязи между антительным спектром и появлением в ЦИК провирусной ДНК позволили бы стандартизировать параметров и разработать тест-систему для диагностики лейкоза методом иммуноблотинга. Такая тест-система способна при массовых исследованиях  заменить серологические и гематологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота. 

ВЫВОДЫ

        1. Комплекс диагностических мероприятий при туберкулезе и лейкозе крупного рогатого скота должен включать иммунохимические и молекулярно-генетические методы исследований.
        2. Антигены от живых и инактивированных микобактерий имеют разный электрофоретический профиль белковых фракций. Большинство сероактивных фракций ДМСО-антигенов микобактериальных культур располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Серопозитивная фракция с Мм 60кД отмечается только в антигенных препаратах M.bovis и M.tuberculosis, что позволяет дифференцировать их от других микобактериальных культур.
        3. Антисыворотки, полученные против  микобактериальных антигенов и истощенные с использованием белково-глутаральдегидных иммуносорбентов, обладают высокой специфичностью. Использование антисывороток в ИФА позволяет дифференцировать микобактериальные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5.
        4. Иммуноферментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям, повышается эффективность диагностических мероприятий. Если наряду с аллергическим методом диагностики туберкулеза применять и иммуноферментный метод анализа сывороток крови, то степень достоверно выявленных больных туберкулезом животных составляет 92%.
        5. Микобактериальные антигены (ДМСОм-антиген), полученные по предложенному способу, позволяют дифференцировать в ИФА неспецифические реакции на туберкулин, вызванные атипичными микобактериями со специфичностью более 90%.
        6. ИФА и ПЦР являются высокоточными методами исследований туберкулеза. ИФА, как более массовый метод, перспективен в определении статуса стада коров по туберкулезу, позволяет исключить туберкулез у части реагирующих на ППД, а также выявить больных туберкулезом из числа не реагирующих на ППД коров в неблагополучных хозяйствах.
        7. Значительная часть антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота находится в циркулирующих иммунных комплексах. Титры свободных и «связанных» в ЦИК антител в сыворотке крови с развитием болезни меняются. Изучение динамики образования иммунных комплексов свидетельствует о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота не достаточно эффективны. В оздоравливаемых от лейкоза хозяйствах необходимо проводить двукратные (с интервалом в 2-3 месяца) исследования сывороток крови методом ИФА с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в пробах.
        8. Разработанный способ диссоциации иммунных комплексов в пробах сыворотки крови и молока позволяет повысить чувствительность методов ИФА до 20%.  Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом ИФА для выявления специфических антител в молоке, с предварительной диссоциацией ЦИК, не уступает по чувствительности и специфичности современным узаконенным методам диагностики этой инфекции. Данный метод, как экономически более выгодный, может применяться для мониторинга эпизоотической ситуации в хозяйствах.
        9. В сыворотке крови и молоке инфицированных ВЛКРС коров выявляются иммунные комплексы, содержащие провирусные ДНК. Провирус содержащие иммунные комплексы появляются в основном, в более поздних стадиях болезни, когда животное становится потенциально опасным источником перезаражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза должна быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР.
        10. Антитела против антигенов ВЛКРС обладают гомологичностью белкам гена gag ВИЧ в иммунохимической реакции. Степень гомологии анти-ВЛКРС антител к полипептидам ВИЧ резко меняется с развитием инфекционного процесса. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител меняется, что свидетельствует о недостаточной эффективности серологических методов, основанных на выявление антител только против одного антигена.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для более полного выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу в хозяйствах наряду с аллергической пробой использовать иммуноферментный метод анализа сывороток крови крупного рогатого скота. Метод позволяет исключить туберкулез у реагирующих, а также выявить больных туберкулезом животных из числа не реагирующих на ППД коров в неблагополучных хозяйствах.

2. В благополучных хозяйствах для дифференциации туберкулиновых реакций рекомендуется использовать ИФА для выявления микобактериальных антител в сыворотоке крови с применением ДМСОм – антигенов микобактерий.

3. Перспективным для постановки диагноза на туберкулез является ИФА для обнаружения микобактериальных антигенов в патматериале с применением антисывороток полученных и истощенных по предложенному способу.

4. Для повышения эффективности серологических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота рекомендуется предварительно диссоциировать иммунные комплексы в исследуемых пробах сывороток крови и молока. С учетом особенностей  динамики образования свободных антител и ЦИК в сыворотке крови серологические исследования на лейкоз проводить дважды с интервалом 2-3 месяца.

5. Для мониторинга эпизоотической ситуации по лейкозу в хозяйствах использовать ИФА молока с предварительной диссоциацией иммунных комплексов.

СПИСОК  РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Якупов Т.Р. Выявление специфических антител против микобактерий в сыворотке крови крупного рогатого скота методом ИФА/ Т.Р.Якупов// Материалы республиканской научно-производственной конференции «Достижения ветеринарных и зоотехнических наук в животноводство», Казань, 1989, С.38.

2. Якупов Т.Р. Возможности использования метода ИФА для выявления возбудителя туберкулеза в патологическом материале и определение его чувствительности/ Т.Р.Якупов// Материалы республиканской научно-производственной конференции «Животноводству – комплексную программу развития», Казань, 1990, С.66.

3. Хафизов Ш.Х. Динамика титра антител в сыворотке крови коров экспериментально зараженных туберкулезом после иммунизации вакциной БЦЖ// Ш.Х.Хафизов, М.Ш.Зайдуллин, Т.Р.Якупов// Материалы республиканской научно-производственной конференции «Животноводству – комплексную программу развития», Казань, 1990, С.61.

4. Якупов Т.Р. Выявление и типизация возбудителя туберкулеза иммуноферментным методом / Т.Р.Якупов // Материалы Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине», Н.Новгород, 1990, С.142-143.

5. Якупов Т.Р. Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M/bovis/ Т.Р.Якупов, Р.П.Тюрикова // Удостоверение на рац. Предложение №314, Казань, 1991.

6.  Якупов Т.Р. ИФА – в прижизненной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, В.И. Шилова // Материалы межвузовской научно-практической конференции молодых ученых «Вклад  молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства», Ставрополь, 1991, С.133-134.

7. Хазипов Н.З. Иммуноферментный анализ сыворотки крови крупного рогатого скота в диагностике туберкулеза / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р. Якупов, А.А. Нуруллин // Межвузовский сборник научных трудов КВИ «Эффективные меры борьбы с туберкулезом с/х животных» Казань, 1991, С.3-9.

8. Якупов Т.Р. Получение высокоспецифических иммунных сывороток против антигенов М.bovis, M.avium, M.phlei и др. / Т.Р. Якупов, Р.П. Тюрикова  // Материалы научно-практической конференции  «Достижения Казанской ветеринарной школы в практику животноводства» Казань, 1991, С.10.

9. Якупов Т.Р. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота: Дис. … канд. вет. наук / Т.Р. Якупов; КГВИ. – К., 1991, С.127.

10. Якупов Т.Р. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. … канд. вет. наук / Т.Р. Якупов; КГВИ. – К., 1991, С.17.

11. Якупов Т.Р. Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, М.А. Сафин // Материалы научно-практической конференции, Казань, 1993, С.32-33.

12. Хазипов Н.З. Антигенная структура микобактерий М.bovis / Н.З.Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р. Якупов, Т.М. Ахметов // Тезисы стендовых сообщений II съезда биохимического общества РАН. Пущино, 1997. С.542-543.- Шифр 97-14028-2.

13. Якупов Т.Р. Метод иммуноферментного анализа в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р.Якупов, Р.П.Тюрикова, К.В.Усольцев // Материалы международной научной конференции, посвященной 125–летию КГАВМ, Казань, 1998, С.127-128.

14. Якупов Т.Р. Сравнительная характеристика современных методов диагностики туберкулеза / Т.Р.Якупов, Т.М.Ахметов // Материалы республиканской научно-производственной конференции «Молодые ученые - агропромышленному комплексу»  Казань, 1998, С.68-69.

15. Якупов Т.Р. Роль специфических антител в диагностике туберкулеза / Т.Р.Якупов, Р.А.Хамзин, К.В.Усольцев // Проблемы инфек. и инваз. болезней в животноводстве на современном этапе, МВА им. Скрябина, 1999, С.146-148.

16. Якупов Т.Р. Диагностическое значение определения противотуберкулезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа /Т.Р.Якупов, Р.А.Хамзин, К.В.Усольцев, А.А.Перлова // Материалы международной научно-производственной конф., посвященной 100-летию члена-корр. ВАСХНИЛ В,Т,Котова Воронеж, 1999, С.132-134.

17. Якупов Т.Р. Сравнительная оценка эффективности ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза / Т.Р.Якупов, К.В.Усольцев// Материалы республиканской научно-производственной конференции, Казань, 1999, С.51.

18. Усольцев К.В. Изучение антигенной структуры микобактерий / К.В.Усольцев, Т.Р.Якупов // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых. АН РТ, Казань, 2000, С.42-43.

19. Якупов Т.Р. Эффективность ИФА сывороток крови в системе диагностических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота / Т.Р.Якупов, К.В.Усольцев // Материалы международной научной конференции, посвященной 70-летию зооинженерного факультета Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, Казань, 2000, С.140-144.

20. Якупов Т.Р. Иммунофермент ысулын кулланып эре мгезле терлеклрд туберкулезга диагноз кую турында / Т.Р.Якупов // Наука и язык, 2000.- № 2, С.51-52.

21. Якупов Т.Р. Совершенствование способа получения микобактериальных антигенов/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов, К.С.Хаертдинов // Современные вопросы медицины и биологии. Сборник научных трудов БГАУ Уфа, 2000, С.318-319.

22. Якупов Т.Р. ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р.Якупов, К.В.Усольцев, А.Н.Аскарова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, т.172. Казань, 2002, С.37-43.

23. Якупов Т.Р. Гель-хроматография ППД-туберкулина / Т.Р.Якупов // Материалы Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса. Казань, 2004, С.67-69.

24. Якупов Т.Р. Электрофоретические профили микобактериальных антигенов / Т.Р. Якупов, К.С. Хаертдинов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Казань, 2006, С.66-68.

25. Волков А.Х. ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / А.Х. Волков, Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Казань, 2006, С.23-26.

26. Якупов Т.Р. Диагностическое значение иммунных комплексов при лейкозе крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев, А.Х. Волков // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, т.128. Казань, 2007, С.215-219.

27. Якупов Т.Р. Метод ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев, Ф.Ф. Зиннатов, А.Х.Волков // Материалы международной научной конференции “Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки”, Троицк, 2007, С.255-258.

28. Кокорев В.А. Показатели химического состава молока инфицированных ВЛКРС коров / В.А. Кокорев, А.Х. Волков, Т.Р. Якупов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Казань, 2007, С.112-113.

29. Якупов Т.Р. Обнаружение антител, общих к антигенам микобактерий и ВЛКРС / Т.Р. Якупов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Казань, 2007, С.121-123.

30. Якупов Т.Р. Изучение активности антител против ВЛКРС в иммунохимической реакции с антигенами ВИЧ / Т.Р. Якупов, Н.З. Хазипов, В.П. Коксин // Вятский медицинский вестник, 2007, спецвыпуск, № 4, С.79-80.

31. Якупов Т.Р. Антигенное родство ВЛКРС с вирусами иммунодефицита человека / Т.Р. Якупов // Ветеринарный врач, 2008, № 2, С.13-15.

32. Кокорев В.А. Изменение титров антител против антигена gp51 инфицированных ВЛКРС животных / В.А. Кокорев, Т.Р. Якупов, А.Х.Волков // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, т.192. Казань, 2008, С.83-84.

33. Хазипов Н.З. Внеклеточная провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота в патогенезе инфекции / Н.З. Хазипов, Т.Р. Якупов, Ф.Ф. Зиннатов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, т.192. Казань, 2008, С.161-164.

34. Хазипов Н.З. Провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота и ее роль в патогенезе инфекции / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р. Якупов,  // Материалы 1У съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, С.505.

35. Хазипов Н.З. Внеклеточный провирус ВЛКРС в патогенезе лейкоза / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р. Якупов, Б.В. Камалов // Международная научно-практическая конференция «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» Москва, 2008, С.158.

36. Якупов Т.Р. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа / Т.Р. Якупов, К.С. Хаертдинов, Р.А. Хамзин, И.К. Фахртдинов//Ветеринарный врач, 2010, № 6, С.24-26.

37. Якупов Т.Р. Динамика изменений титров «свободных» и «связанных» антител у инфицированных ВЛКРС коров/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов// Ученые записки КГАВМ, 2009, т.197, С.150-154.

38. Якупов Т.Р. Возможности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов, А.М.Алимов, Б.В.Камалов// Ученые записки КГАВМ, 2010, т.201, С. 133-136.

39. Якупов Т.Р. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа молока/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов, А.С.Козлов// «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», 2009, №4, С.99-100.

40. Якупов Т.Р. Иммуноблот анализ в диагностике туберкулеза/ Т.Р.Якупов К.С.Хаертдинов// Ветеринарный врач, №1, 2011.

  41. Зиннатов Ф.Ф. Диагностическая ценность выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке/ Ф.Ф.Зиннатов, Т.Р.Якупов//  «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», 2010. №4, С.21-22.

42. Якупов Т.Р. Новые подходы в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Т.Р.Якупов// Ученые записки КГАВМ, 2010, т.204, с.342-347. 







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.