WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

 

 

  На правах рукописи

Макарова Марина Витальевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ  МИКОБАКТЕРИЙ У ПАЦИЕНТОВ ФТИЗИАТРИЧЕСКИХ

УЧРЕЖДЕНИЙ

03.00. 07 Микробиология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович

Доктор медицинских наук, профессор Сельцовский Петр Петрович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Батуро Алла Петровна

Доктор медицинских наук, профессор Леви Диана Тимофеевна

Доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза Российской академии медицинских наук (ЦНИИТ РАМН), Москва. 

 

  Защита состоится  15 апреля  2010г. в 1200 часов на заседании  диссертационного совета Д 001.035.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).

Автореферат разослан «______» «_________________»  2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук  И.В.Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы

Нетуберкулезные микобактерии – это микроорганизмы, про которые в начале второй половины ХХ века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию  называют микобактериозами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобактериозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Katoch V., 2004; Khatter S., 2008].

В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, и их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2002; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены M. tuberculosis и M. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобактерий входят в так называемый M. tuberculosis complex: M. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель Л.М., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Оттен Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky E., 1979, 1992; Tells C., Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier K., 1998; Dawson D., 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Yong M., 2008].

Не входящие в M. tuberculosis complex микобактерии долгие годы называли микобактериями окружающей среды (enviromental mycobacteria), возбудителями микобактериозов, атипичными микобактериями. Однако, в последние десятилетия большинство микробиологов использует термин «нетуберкулезные микобактерии» (НТМ) [Wallace R. et al., 1990, 1997; Dawson D., 2000; Katoch V., Kumar М., 2001; Heifets L., 2004].

Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 50-70 годы XX века: Л.М. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б.Яблокова, Т.Б. Ильина, Р.О.Драбкина,  Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались в небольшом объеме лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005].

  За это время ситуация в мире резко изменилась, число больных микобактериозами во многих странах возросло в десятки раз. Это явилось следствием увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета  (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras T., Daley C.,2002; Cole T. et al.,2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная хроматография – ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Shin J. et al., 2009].

Заболевания, вызываемые разными видами НТМ, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Cole T.et al., 2005]. Перед микобактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо  для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.

В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению НТМ и микобактериозов прогрессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Katoch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Yong M., 2008]. 

К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактериоза и назначить своевременное лечение. 

Кроме того в России микобактериозы не считаются самостоятельными заболеваниями, несмотря на то, что они включены в Международную классификацию болезней. В связи с такой ситуацией, врачи не знают особенностей течения и лечения этой патологии, нет специальных курсов обучения, не используются современные методы диагностики микобактериозов. Сегодня даже не ясно, в каких учреждениях следует лечить таких больных. Часто пациенты, страдающие микобактериозами, находятся в одних палатах с больными туберкулезом и могут инфицироваться от них, а возможно и заражать их.

Все вышеизложенное определяет актуальность и необходимость разработки комплекса методов выделения и идентификации НТМ с применением всех имеющихся в настоящее время технических возможностей.

Цель исследования

Создание оптимального комплекса выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий (НТМ) с использованием разработанных и модифицированных методов и на этой основе изучение видового состава выделенных НТМ, включая оценку их чувствительности к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

  1. Изучить эффективность наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Йенсена,  плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC МGIT 960) для выделения НТМ.

  2. Провести сравнительный анализ использования для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.

3. Разработать для видовой идентификации НТМ новый молекулярно-генетический метод – биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с методами ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологическими методами.

4. На основании результатов сравнительных исследований  эффективности различных методов выделения и идентификации НТМ разработать оптимальный диагностический комплекс (алгоритм), с его применением охарактеризовать видовой спектр штаммов НТМ, циркулирующих в городе Москве.

5. Проанализировать частоту повторного обнаружения у больных одного и того же вида НТМ, как критерия (при наличии клинико-рентгенологических признаков заболевания) развития микобактериоза.

6. Выявить особенности чувствительности к противотуберкулезным и другим антибактериальным препаратам НТМ, выделенных из  диагностического материала, поступившего в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных учреждений города Москвы.

Научная новизна исследования

В результате сравнительного изучения эффективности выделения НТМ с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960), агаровой  Миддлбрука 7Н11 и яичной питательной среды Левенштейна-Йенсена установлено, что наибольшее число микобактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной  и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается получить до 10% изолятов, оптимальным для выделения НТМ  является комплексное применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.

Выявлено (при субкультивировании на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные на жидкой и плотной яичной питательных средах, могут содержать несколько видов микобактерий.

Впервые для идентификации видов НТМ разработан метод биологических микрочипов: поэтапно  испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов. В итоге полученный «БИОЧИП IMS» позволяет идентифицировать 9 видов НТМ: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae и дифференцировать их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).

В результате сравнительного изучения эффективности  видовой идентификации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов ПДРФ и ВЭЖХ на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований, не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий, но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале. 

Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации НТМ, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах – плотной и жидкой и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего – предпочтительнее).

Впервые с помощью  разработанного алгоритма охарактеризован видовой состав НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве. С наибольшей частотой среди медленнорастущих НТМ из клинического материала выделяются МАС,  M. xenopi и M. kansasii а быстрорастущих – M. fortuitum.  Большинство клинических изолятов НТМ отличается высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к  таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Впервые создана коллекция клинических изолятов (548 штаммов) нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику.

Предложено для эффективного выделения НТМ из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, выделенных на жидкой и плотной яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных средах культур, позволяет  обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культурально-морфологические свойства.

Высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий методом ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.

Результаты видовой идентификации культур нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-генетических методов – ПДРФ и биологических микрочипов аналогичным образом в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований при существенном сокращении времени получения результатов. В связи с этим, указанные методы могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения биочипов является простота метода, возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале и автоматизированный учет результатов.

При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ, при отсутствии M. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.

При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что НТМ в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Создана коллекция из 548 клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ, которая может быть использована в качестве контрольной при разработке или испытании новых диагностических тест-систем.

Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Москвы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиопульмонологии РМАПО.

На основании проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:

  • «Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 07.02.2007;
  • «Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009;
  • «Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для  выделения НТМ из клинического материала.

2. Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, иммобилизированных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae) и дифференциации их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).

3. Анализ сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью биочипов, метода ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологических методов, показал, что все эти методы дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические тесты  характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет  с помощью программного обеспечения и возможность идентификации непосредственно в клиническом материале.

4. Разработан алгоритм выделения и идентификации НТМ, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобактериозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и  плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой средой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и  проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.

5. При использовании предложенного алгоритма выделения и идентификации НТМ охарактеризован их видовой состав в городе Москве: с наибольшей частотой из медленнорастущих НТМ в клиническом материале обнаружены МАС,  M. kansasii и M. xenopi, а из быстрорастущих – M. fortuitum. Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ (при отсутствии M. tuberculosis) и наличие соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики дает основание  для рассмотрения в диагностическом ряду микобактериоза.

6. НТМ, выделенные от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве, отличаются высоким уровнем устойчивости как к основным, так и резервным противотуберкулезным препаратам, и в большинстве случаев чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на научных форумах всероссийского и международного уровней, включая научно-практические конференции и заседания  Ученого совета МНПЦБТ, 8-й Российский съезд фтизиатров (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 4-й конгресс Евро-Азиатского респираторного общества и 5-й Международный конгресс пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и 8-ю Московские Ассамблеи «Здоровье Столицы» в 2008 г. и 2009 г., Европейские респираторные конгрессы (Берлин 2008 г., Вена 2009 г.),  5-й конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий ссылки на 37 работ отечественных и 305 зарубежных авторов. Результаты исследования проиллюстрированы 20 рисунками, в виде графиков, схем, фотографий и 18 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клинические и лабораторные штаммы микобактерий

  Исследования проведены в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ и основаны на результатах изучения клинических образцов, поступивших из противотуберкулезных учреждений города Москвы за период с января 2006 г.  по ноябрь 2009 г. Всего за этот период исследовано 163766 образцов биологического материала, выделены 13283 культуры микобактерий, из которых к НТМ отнесено 764, что составило 5,8%. Из них 548 клинических изолятов НТМ относящихся к 14 видам, охарактеризованные не только микробиологическими, но и одним или двумя  молекулярно-генетическими методами и/или ВЭЖХ, находятся в коллекции МНПЦБТ.

В качестве контролей использовали лабораторные штаммы микобактерий, находящиеся в музее Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis Ravenel, M. bovis BCG, M. avium, M. intracellularae, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. marinum,  M. fortuitum, M. chelonae, M. gordonae, M. smegmatis, M.terrae, M. xenopi, M. malmoense, M. gastri, M. simiae, M. phlei, M.vacca, M.flavescense. Штаммы получены из ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва), НИИ фтизиопульмонологии (Санкт-Петербург) от профессора Т.Ф. Оттен и из НИИ лепры (Астрахань). Эталонные штаммы M. avium ATCC 35712, M. intracellularae ATCC 35761, M. kansasii ATCC 25101,  M. marinum ATCC 11565, M. fortuitum ATCC 14467, M. gordonae 14470 получены из микобактериологической лаборатории Еврейского медицинского исследовательского центра (Денвер, Колорадо, США) от профессора Л. Хейфеца.

2. Выделение и идентификация НТМ

Выделение микобактерий проводили микробиологическими методами на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й), на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, разделенных на 2 сектора: с антибиотиками/без антибиотиков (с антибиотиками – 7Н11 селективный агар – для подавления роста посторонней микрофлоры и получения чистой культуры микобактерий, без антибиотиков – для выделения штаммов микобактерий, рост которых могут ингибировать антибиотики), а также в модифицированной жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson).

Биологический материал, полученный от обследуемых лиц: мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, материал биопсии, и т.д., перед посевом на питательные среды для уничтожения неспецифической микрофлоры и разжижения подвергали щадящей обработке с помощью Myco-Prep-реагента  (BBL), содержащего N-аcetyl-L-cysteine (NALC) и 3% NaOH. Все образцы микроскопировали на наличие кислотоустойчивых микроорганизмов после окраски флюорохромами.

Идентификацию выделенных культур микробиологическими методами проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Вначале культуры кислотоустойчивых микроорганизмов по морфологии колоний и способности к пигментообразованию на плотных и «косообразованию» (результаты микроскопии)  в жидкой питательных средах предварительно делили на две группы: M. tuberculosis complex и НТМ. Затем проводили их дальнейшую идентификацию, основанную на оценке скорости роста, способности роста при различных температурах, в присутствии салицилового натрия, 5% NaCl и изучении их биохимических свойств: способности к восстановлению нитратов, теллурита калия; гидролизу Твина-80; никотинамидазной, арилсульфатазной, каталазной активности и др. С целью  сокращения времени получения результатов идентификации биохимическими методами для постановки нитратредуктазного и ниацинового тестов использовали первичные культуры микобактерий, выделенные в жидких питательных средах.

Для хроматографического и молекулярно-генетических анализов использовали культуры микобактерий, выделенные в  жидкой и на плотных питательных средах, в которых наличие кислотоустойчивых микроорганизмов и отсутствие контаминации подтверждали микроскопией мазков, окрашенных по Циль-Нильсену. Для подтверждения наличия в культуре одного вида микобактерий и их идентификации  микробиологическими методами, проводили субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11.

3. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Идентификацию микобактерий методом ВЭЖХ выполняли по методике, основанной на анализе различий в составе миколовых кислот клеточной стенки, разработанной центром по контролю и предотвращению заболеваний (CDC, USA, 1996) и предложенной для использования,  как стандартного метода определения видов, входящих в род Mycobacterium, в микобактериологических референс-лабораториях. Разделение миколовых кислот осуществляли методом обращенно-фазовой хроматографии с помощью хроматографической системы Breeze Waters, состоящей из бинарного градиентного насоса, модуля для автоматического ввода проб, модуля для подогрева колонки, многоволнового флюоресцентного детектора, колонки Symmetry C18 5мМ  3,950 мм с предколонкой.

4. Идентификация микобактерий молекулярно-генетическими методами

В сотрудничестве с институтом молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН последовательно разработаны экспериментальные версии биологических микрочипов «IMS», предназначенные для идентификации M. tuberculosis и ряда видов НТМ.

Метод включает в себя двухстадийную ПЦР. На первой стадии проводили амплификацию исследуемых фрагментов gyrB гена. На второй стадии использовали ДНК из амплифицированных образцов и дезоксинуклеотид, меченый флуоресцентной меткой CY-5.  Полученные ПЦР продукты  гибридизовали на чипе, содержащем набор олигонуклеотидов, специфичных для gyrB регионов разных видов микобактерий. Процедуру гибридизации проводили в камере в течение 16-18 часов при 37о.





Интерпретацию результатов гибридизации осуществляли при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих видоспецифические олигонуклеотиды, с помощью специального программного обеспечения «Imageware» (ИМБ РАН, Россия). Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствовал о наличии совершенного гибридизационного дуплекса.

Идентификация НТМ с помощью ПДРФ  также включала  два последовательных этапа. На первом этапе проводили ПЦР фрагмента гена hsp65, на втором – осущуствляли  рестрикционный анализ ампликонов, полученных после проведения ПЦР. Детекцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов проводили с помощью электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии этидиума бромида при напряжении тока 10B/см  в течение 10 минут, в однократном TВE буфере (0,089мМ трис-бората; 0,089М борной кислоты; 2мМ EDTA, рН 8,0). По окончании электрофореза гель просматривали в трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете. После обработки рестриктазой Hin6I на электрофорезе были видны четкие отличия разных видов микобактерий, в зависимости от числа пар нуклеотидов.

5. Определение лекарственной чувствительности культур нетуберкулезных микобактерий

Лекарственную чувствительность культур, выделенных на плотных и в жидкой питательных средах, из клинических образцов больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез, изучали методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03г.).

6. Статистическая обработка результатов

Для обработки информации была сформирована база данных (формат Excel), включавшая паспортную информацию о пациентах, сведения о цели исследования, характере диагностического материала, диагнозе и проведенном лечении, результатах микробиологического и молекулярно-генетических исследований. Оценку достоверности различия качественных признаков и долей в группах проводили с использованием критерия Фишера (для двух параметров) и 2-критерий (для трех и более параметров). В качестве критического уровня достоверности различий принят р = 0,05. [Наглядная статистика в медицине/А. Петри, К. Сэбин//Пер. с англ. В.П. Леонова.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.- 144С.].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящая работа посвящена проблемам разработки и внедрения оптимального комплекса методов выделения и идентификации НТМ.  Следует подчеркнуть, что данные о том, каким должен быть оптимальный комплекс (даже только микробиологических методов), который можно рекомендовать для этих целей, в отечественной литературе отсутствуют, а разные зарубежные авторы имеют неодинаковые мнения по этой проблеме. Что касается ВЭЖХ и молекулярно-генетических методов, то в абсолютном большинстве исследований были охарактеризованы возможности применения только одного из них, без определения его места в системе (алгоритме) выделения и идентификации НТМ.

1. Выделение и микробиологическая идентификация видов НТМ

1.2. Сравнительное изучение эффективности выделения НТМ на разных средах

Настоящее исследование  проведено для сравнения эффективности выделения микобактерий на разных питательных средах: плотной яичной – Левенштейна-Йенсена (Л-Й), модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (7Н9) в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 и чашках с плотной агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (7Н11).

Произведено 2029 посевов, выделено 227 культур микобактерий, из них как M. tuberculosis complex идентифицировано 186 культур (81,9%) и 41 (18,1%) – как НТМ (MAC – 17, M. kansasii – 8, M. xenopi – 6, M. fortuitum – 10).

Таблица 1.

Эффективность выделения микобактерий на разных питательных средах

Вид

микобактерий

Число (%) изолятов микобактерий, выделенных на среде:

Достоверность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена (1)

Миддлбрука 7Н11 (2)

Миддлбрука 7Н9 (BACTEC MGIT 960) (3)

M. tuberculosis (186)

139 (74,7)

150 (80,6)

169 (90,9)

p1-2 > 0,1

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,01

МАС (17)

10

11

14

M. kansasii (8)

5

6

7

M. xenopi (6)

5

5

5

M. fortuitum (10)

7

7

9

Всего НТМ (41)

27 (65,9)

30 (73,2)

35 (85,4)

p1-2 > 0,1

p1-3 < 0,05

p2-3 > 0,1

ИТОГО (227)

166 (73,1)

180 (79,3)

204 (89,9)

p1-2 > 0,1

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,01

Установлено (табл. 1), что жидкая питательная среда (7Н9) более  эффективна в выделении микобактерий, чем плотные. Из 227 культур микобактерий, выделенных на трех средах, 204 (89,9%) получены в жидкой питательной среде (как только в ней одной, так и в комбинациях с другими средами). На среде 7Н11 выделены 180 (79,3%), а на Л-Й – 166 (73,1%) культур. Что касается НТМ, то больше всего культур также удалось выделить в жидкой питательной среде 7Н9 – 35 (85,4%),  меньше на плотной агаровой 7Н11 – 30 (73,2%), и ещё меньше на среде Л-Й – 27 (65,9%) культур.

Чаще НТМ выделяли на трех средах –18 (43,9%), что достоверно выше, чем при других сочетаниях сред ( p < 0,05), и лишь в единичных случаях только на одной среде: Л-Й – 1 (2,4%); 7Н11 – 2 (4,9%) и 7Н9 – 5 (12,2%), соответственно (табл. 2).

Таблица 2.

Частота выделения микобактерий на разных питательных средах

и их комбинациях (абс., %)

Среда

Число выделенных изолятов микобактерий

МАС

M. kansasii

M. xenopi

M. fortuitum

Всего НТМ

Только Л-Й

1

-

-

-

1 (2,4)

Только Миддлбрук 7Н11

1

1

-

-

2 (4,9)

Только Миддлбрук 7Н9

3

1

-

1

5 (12,2)

Л-Й + 7Н11

2

-

-

1

3 (7,3)

Л-Й + 7Н9

2

-

1

2

5 (12,2)

7Н9 + 7Н11

3

2

2

-

7 (17,1)

На всех средах

5

4

3

6

18 (43,9)

ИТОГО

17

8

6

10

41

Таблица 3.

Эффективность выделения НТМ  на средах Левенштейна-Йенсена 

и Миддлбрука 7Н9

Вид

микобактерий

Число НТМ выделенных на среде:

Достоверность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена

Миддлбрука 7Н9 (BACTEC MGIT 960)

абс.

%

абс.

%

МАС (106)

64

60,4

83

78,3

< 0,02

M. kansasii (51)

31

60,8

43

84,3

< 0,01

M. xenopi (42)

35

83,3

39

92,9

< 0,05

M. gordonae (16)

10

62,5

13

81,3

< 0,02

M. marinum (6)

4

66,7

5

83,3

> 0,05

Всего медлен-норастущие (221)

144

65,2

183

82,8

< 0,05

M. fortuitum (71)

48

67,6

51

71,8

> 0,05

M. chelonae (11)

7

63,6

8

72,7

> 0,05

M. flavescens (8)

6

75,0

7

87,5

> 0,05

Всего быстро-растущие (90)

61

67,8

66

73,3

> 0,05

ВСЕГО НТМ (311)

205

65,9

249

80,1

< 0,05

Дополнительно на значительно большем количестве материала было проведено сравнение эффективности использования двух сред – Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9, которые постоянно применяют в  микробиологической лаборатории МНПЦБТ (табл. 3). Частота выделения всех видов НТМ оказалась также в 1,2 раза выше в жидкой питательной среде, в наибольшей степени это относилось к  МАС, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae.

Таблица 4.

Сроки выделения культур НТМ на разных питательных средах

Вид

микобактерий

Длительность культивирования (дни)

на среде:

Различия в длительности культивиро-вания (коэф-фициент)

Досто-верность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена (1)

Миддлбру-ка 7Н11 (2)

Миддлбру-ка 7Н9 (3)

МАС (17)

38,6 ± 3,2

30,1 ± 2,7

22,3 ± 3,4

(1)-(2) – 1,3

(1)-(3) – 1,7

(2)-(3) – 1,4

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,05

M. kansasii (8)

30,2 ± 8,6

26,5 ± 4,6

16,1 ± 4,9

(1)-(2) – 1,1

(1)-(3) – 1,9

(2)-(3) – 1,7

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,01

M. xenopi (6)

40,4 ± 6,9

30,6 ± 5,1

22,8 ± 5,1

(1)-(2) – 1,3

(1)-(3) – 1,8

(2)-(3) – 1,3

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 > 0,05

M. fortuitum (10)

38,4 ± 2,1

34,5 ± 4,6

16,8 ± 8,6

(1)-(2) – 1,1

(1)-(3) – 2,3

(2)-(3) – 2,1

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,01

ВСЕГО (41)

37,2±4,5

30,5±3,9

19,8±5,2

(1)-(2) 1,2

(1)-(3) 1,9

(2)-(3) 1,5

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,05

Следует отметить, что обнаружение роста  микобактерий в системе BACTEC MGIT 960 (в модифицированной жидкой среде Миддлбрука 7Н9) происходило на 10-20 дней раньше (табл. 4), чем на плотных средах. Среднее время детекции роста на этой среде составило 19,8±5,2  дней, по сравнению с 30,5±3,9  днями на среде 7Н11 и 37,2±4,5  днями на среде Левенштейна-Йенсена (т.е. в 1,5 и 1,9 раз быстрее, соответственно).

Эти данные подтверждены и при расширенном исследовании с использованием только сред Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9 (табл. 5).

Таблица 5.

Длительность культивирования НТМ на средах Левенштейна-Йенсена 

и Миддлбрука 7Н9

Вид

микобактерий

Длительность культивирования (дни) на среде:

Различия в длительности культивирования (коэф-фициент)

Достоверность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена

Миддлбрука 7Н9

МАС (106)

35,9 ± 2,7

18,4 ± 3,0

2,0

< 0,01

M. kansasii (51)

28,4 ± 4,2

15,3 ± 3,6

1,9

< 0,01

M. xenopi (42)

36,2 ± 3,9

20,8 ± 3,5

1,7

< 0,01

M. gordonae (16)

40,1 ± 4,1

20,3 ± 2,2

2,0

< 0,01

M. marinum (6)

33,3 ± 2,6

20,2 ± 4,9

1,6

< 0,01

M. fortuitum (71)

37,8 ± 1,7

16,2 ± 5,1

2,3

< 0,01

M. chelonae (11)

22,2 ± 3,9

13,2 ± 0,9

1,7

< 0,01

M. flavescens (8)

23,4 ± 3,2

14,1 ± 0,3

1,7

< 0,01

ВСЕГО (311)

34,5±3,0

17,6±3,5

2,0

< 0,01

Самый высокий процент контаминации посевов наблюдался на среде Л-Й (11,2%), а самый низкий на среде 7Н11 (5,3%), 7,2% образцов было контаминировано в среде 7Н9.

В ходе проведенных исследований выявлено, что недостатком метода выделения микобактерий в жидких питательных средах является невозможность наблюдения за морфологией и хромогенностью колоний.

Преимуществом яичных сред (в частности, Л-Й), является устойчивость к высыханию, а следовательно пригодность для инкубации в течение длительного периода. Однако при росте контаминатов происходит разжижение среды, что приводит к прерыванию инкубации и потере клинически значимых штаммов микобактерий.

Следует также отметить, что агаровая среда Миддлбрука 7Н11, благодаря простому химическому составу менее подвергалась контаминации, а наличие в ее составе гидролизата казеина способствовало росту штаммов, наиболее требовательных к условиям культивирования.

Дополнительное (к среде 7Н9) культивирование на среде 7Н11 и/или Л-Й обеспечивало более полное выделение микобактерий (по данным L.Heifets,1997 до 10% НТМ вырастает только на плотных средах), а использование чашек с агаровой средой 7Н11 позволяет провести первичную идентификацию вида микобактерий по морфологии колоний и выбрать наиболее информативные биохимические тесты для окончательной идентификации, получить чистую культуру в случаях обильного роста контаминантов и обнаружить смешанные культуры микобактерий.

Вместе с тем, следует иметь в виду, что недостатком применения чашек с агаровой средой 7Н11 в условиях централизованных микробиологических лабораторий с большим потоком исследований являются неудобства, связанные с серьезными трудозатратами по инкубированию и просмотру большого количества чашек, однако в пробирочном варианте эта среда может успешно применяться в комплексе выделения микобактерий. Исходя из  вышеизложенного, целесообразнее агаровые чашки использовать для субкультивирования изолятов, полученных на плотной яичной или в жидкой питательных средах.

Необходимо подчеркнуть, что ни на одной из изученных питательных сред не удалось выделить из клинических образцов культуры микобактерий в 100% случаев,что является важным доводом для применения их комбинаций.

В итоге проведенных исследований разработан оптимальный микробиологический комплекс методов выделения НТМ: культивирование диагностического материала на модифицированной жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) в сочетании с одной из плотных сред.

1.2. Частота обнаружения и видовой состав НТМ, выделенных в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ

Анализ частоты обнаружения НТМ в клиническом материале свидетельствует о существенном увеличении их количества в последние 2 года.  Если в 2006 г. выделено 102 (3,0%), в 2007 г. – 111 (3,4%), то в 2008 г. – 253 (6,9%) и за 10 месяцев 2009 года – 268 (8,7%) изолятов НТМ (от общего числа микобактерий) (рис.1).

Рис. 1. Частота обнаружения НТМ за период 2006-2009 гг.

Низкий показатель выделения НТМ в 2006-2007 годы  связан с отсутствием оптимальных методических возможностей, поскольку организация данного вида исследований только начиналась. В связи с этим, не все выделенные в лаборатории  культуры НТМ идентифицировали до вида, часть из них (полученные в жидкой питательной среде) только дифференцировали от микобактерий туберкулезного комплекса, поэтому при подсчете не учитывали. Начиная с 2008 года, выделение и идентификацию НТМ проводили с использованием разработанного алгоритма, с применением вышеописанного набора питательных сред, молекулярно-генетических методов (ПДРФ, биочипы) и ВЭЖХ, что позволило ускорить процесс идентификации микобактерий и повысить его специфичность. Благодаря этому,  за последние годы ряду больных был установлен диагноз микобактериоза (некоторым – вместо туберкулеза) и назначена соответствующая терапия; положительная динамика процесса в большинстве случаев подтвердила  правильность диагноза.

При изучении видового спектра выделенных в Центре НТМ было установлено (табл. 6), что две трети из них относились к медленнорастущим (по классификации Runyon) и одна треть к быстрорастущим.

Таблица 6.

Частота обнаружения микобактерий при использовании

микробиологических методов

Группа микобактерий

Виды

микобактерий

Количество

%

всего

в т.ч.

в ассоциации

M. tuberculosis complex

M. tuberculosis

230

20*

27,3

M. bovis

2

0,2

ВСЕГО

232

20

27,6

Нетуберкулезные микобактерии

Медленнорастущие

MAC

203

16**

24,1

M. kansassii

78

9,3

M. xenopi

83

9,9

M. gordonae

25

3,0

M. marinum

6

0,7

M. scrofulaceum

5

0,6

Прочие****

6

0,7

Всего

406

16

48,3

Быстрорастущие

M. fortuitum

169

8***

20,1

M. chelonae

18

2,1

M. flavescens

15

1,8

Прочие****

1

0,1

Всего

203

8

24,1

ВСЕГО НТМ

609

24

72,4

ИТОГО

841

44

100,0

* В 14 пробах – с MAC  и в 6 – с M. fortuitum

** В 14 пробах –  с M. tuberculosis и в 2 – с M. fortuitum

*** В 2 пробах – с MAC и в 6 – с M. tuberculosis

**** Прочие (M. gastri, M. simiae – 2, M. szulgai, M. terrae, M. malmoensae, M. smegmatis)

Самым распространенным видом оказались  M. avium complex, что согласуется с известным (по данным зарубежных авторов) значением МАС в патологии человека. Вторыми по частоте выделения были M. fortuitum (однако, как одно-, так и неоднократное выделение быстрорастущих микобактерий,  требует тщательного изучения наличия и особенностей симптомов заболевания для оценки их этиологической значимости). Затем следовали M. kansasii и  M. xenopi. У двоих больных M. xenopi были обнаружены в операционном материале (содержимое туберкулемы, каверны), что даже при однократном обнаружении может служить подтверждением диагноза микобактериоза.

232 культуры микобактерий в результате комплексного микробиологического исследования были отнесены к M. tuberculosis. В данном разделе работы речь идет о тех культурах, которые первоначально вызвали трудности при дифференциации от НТМ. В первую очередь, это культуры, с не типичной для M. tuberculosis морфологией колоний, выделенные на среде Л-Й от больных, длительно получавших противотуберкулезную терапию. В жидкой питательной среде – контаминированые посторонней микрофлорой или смешанные культуры микобактерий (M. tuberculosis + M. fortuitum, M. tuberculosis + МАС). При микроскопии мазков из таких культур не наблюдалось характерного расположения  клеток в виде «кос» – проявление корд-фактора при росте на жидких питательных средах и морфология клеток M. tuberculosis  была измененной.

При анализе частоты и видового состава НТМ в зависимости от вида исследуемого материала, установлено, что большая часть НТМ была выделена из мокроты (что вполне понятно, поскольку этот источник является наиболее доступным),  как «спонтанной» (без каких либо «местных» воздействий), так и после ингаляции. Реже НТМ обнаруживали в материале бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальных смывов, а также в других образцах (плевральный экссудат, материал биопсии и др.). При этом не было существенных (статистически достоверных) различий в соотношении частоты выявления разных видов НТМ в зависимости от источника исследуемого клинического материала.

Проанализирована также частота выделения НТМ в зависимости от диагноза, с которым материал поступил на исследование из противотуберкулезных диспансеров. Выявлены некоторые особенности в распределении видов НТМ по группам с диагнозом: туберкулез, нетуберкулезные заболевания легких, «диагностический поиск». Так, M. kansasii несколько чаще обнаруживали в «диагностическом» материале, чем у больных с диагнозом «туберкулез», а МАС и  M. xenopi у больных с клиническим диагнозом «туберкулез».

Изучена частота неоднократного выделения от больных одного и того же вида НТМ (рис. 2). Эти результаты важны, так как неоднократное обнаружение НТМ с большой вероятностью указывает на его этиологическую роль в развитии микобактериоза у данного больного.

Всего НТМ повторно обнаружены у 114 больных; в 47 случаях (41,2%, что достоверно больше, чем другие виды микобактерий, р < 0,05) это были МАС, в 24 (21,1%) –  M. kansasii, в 25 (21,9%) – M. fortuitum, в 12 (10,5) – M. xenopi, в 4 (3,5%) – M. flavescens и по 1 случаю (0,9%) – M. gordonae и M. smegmatis.

Двукратно выделяли один и тот же вид НТМ от 73 больных (64,0%), трехкратно – от 29 (25,4%) и более четырех  раз – от 12 (10,5%) больных.

Рис. 2. Частота повторного выделения нетуберкулезных микобактерий

Здесь имеет смысл особо обратить внимание на случаи трехкратного и более обнаружения НТМ у одного и того же больного. По критериям Американского торакального общества (Wallace R.et al., 1997) это является (при наличии клинико-рентгенологической симптоматики) важным диагностическим критерием микобактериоза. Всего трехкратно и более НТМ были выделены от 41 больного – 36,0% всех случаев их неоднократного обнаружения (в т.ч. MAC – от 20, M. kansasii – от 8, M. fortuitum – от 8, M. xenopi – от 4, M. flavescens –  от одного больного).

2. Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения вида НТМ

В этом разделе работы сопоставлены результаты определения вида микобактерий  микробиологическими методами и ВЭЖХ. Содержание миколовых кислот, анализируемых методом ВЭЖХ, и их соотношение в бактериальной клетке является устойчивым фенотипическим признаком, характерным для каждого вида микобактерий, что позволяет получать достоверные, воспроизводимые результаты.  Высокая чувствительность метода за счет применения флуоресцентного детектора дает возможность анализировать культуры, выделенные в жидких питательных средах, даже с небольшим содержанием бактериальных клеток, что значительно сокращает сроки идентификации.

На рисунке 3 в качестве примера представлены хроматограммы, полученные при анализе миколовых кислот музейного штамма M. avium ATCC35712 и штамма, выделенного от больного.

Совпадение результатов, полученных с помощью ВЭЖХ и бактериологических методов, имело место в 94,4% случаев; в том числе для медленнорастущих НТМ – в 93,4%, быстрорастущих – в 87,5% (в целом для НТМ – в 92,4%), а M. tuberculosis complex – в 99,0% (табл.8.). При этом следует подчеркнуть, что идентификация вида НТМ культуральными  и биохимическими методами занимает до трех недель, тогда как применение ВЭЖХ сокращает это время до 24 часов (статистически достоверные различия результатов идентификации микобактерий микробиологическими методами и ВЭЖХ отсутствуют).

 

а

б

Рис. 3. Анализ миколовых кислот M. avium с помощью метода ВЭЖХ: а M. avium АТСС 35712 (из музея МНПЦБТ);  б культура № 4-M. avium, выделенная от больного

Таблица 8.

Сравнительные данные идентификации микобактерий

микробиологическими методами и ВЭЖХ *

Группа

микобактерий

Вид

Методы

%

совпадений

микробиологические

высокоэффективная

жидкостная

хроматография

M. tuberculosis complex

M. tuberculosis

98

97

99,0

M. bovis

2

-

M. bovis BCG

-

2

Медленнорастущие нетуберкулезные микобактерии

МАС

94

89

94,7

M. kansasii

30

28

93,3

M. xenopi

37

35

94,6

M. gordonae

15

13

86,7

M. scrofulaceum

3

2

66,7

M. szulgai

1

1

M. marinum

1

1

M. gastri

1

1

M. terrae complex

1

1

Всего

183

171

93,4

Быстрорастущие

нетуберкулезные микобактерии

M. fortuitum

30

28

93,3

M. chelonae

5

5

100,0

M. flavescens

4

1

25,0

M. smegmatis

1

1

Всего

40

35

87,5

Всего НТМ

223

206

92,4

ИТОГО

323

305

94,4

* В таблице за 100% взяты результаты микробиологического исследования, с которыми сопоставлены данные ВЭЖХ (в таблице не учитывали, что в ряде случаев окончательная идентификация была основана на результатах использования комплекса методов, включая ВЭЖХ и молекулярно-генетические исследования)

Проведено также сопоставление результатов идентификации методом ВЭЖХ культур микобактерий, выделенных в жидкой и на плотных питательных средах. Всего были проанализированы 243 культуры (сопоставляли данные идентификации только наиболее часто выделяемых культур). Установлено, что в целом совпадение результатов, полученных двумя методами при идентификации культур, выделенных в жидкой питательной среде, имело место в 93,4%, а на плотных – в 93,0% случаев (табл.9), в одном случае M. fortuitum, выделенные на среде Л-Й, методом ВЭЖХ идентифицировать не удалось.

Таблица 9.

Результаты идентификации микобактерий, выделенных на плотной (Л-Й) и в жидкой (7Н9) питательных средах, с помощью ВЭЖХ

Результаты микробиологических исследований

(число выделенных культур)

Высокоэффективная жидкостная

хроматография, культуры со среды:

Левенштейна-Йенсена

Миддлбрука 7Н9

абс.

% совпадений

абс.

% совпадений

MAC (78)

74

94,9

74

94,9

M. fortuitum (65)

60

92,3

61

93,8

M. xenopi (38)

35

92,1

35

92,1

M. kansassii (32)

30

93,8

30

93,8

M. chelonae (12)

11

91,7

11

91,7

M. gordonae (11)

10

90,9

10

90,9

M. flavescens (7)

6

85,7

6

85,7

ВСЕГО (243)

226

93,0

227

93,4

Таким образом, независимо от того проводили анализ с помощью ВЭЖХ  изолятов, выделенных в жидкой или на плотной питательных средах, получены практически идентичные данные, однако, использование культур с жидкой среды предпочтительнее из-за сокращения сроков получения результатов.

3. Молекулярно-генетические исследования для идентификации НТМ

Молекулярно-генетические методы в настоящее время широко используются для видовой идентификации микроорганизмов. После того, как был полностью расшифрован геном ряда микобактерий, произошел существенный прогресс в разработке методов их идентификации и соответствующих диагностических тестов. Достаточно сложной задачей является поиск геномной мишени, при молекулярно-генетическом анализе которой будет возможна идентификация вида НТМ (выбор мишени осложняется большим сродством геномов различных представителей рода Mycobacterium). В настоящее время, для этой цели используют инсерционные последовательности (IS900, IS901, IS1245, IS1561, IS2404), структурные гены (rpoB, gyrB, hsp65, secA1, recA, sodA, ген 16S rRNA, область ITS гена 16S rRNA) микобактериальной ДНК.

На основе изучения микобактериального генома и исследований возможных генетических мишеней, приемлемых для видовой идентификации микобактерий, разработаны различные методы молекулярно-генетического определения вида микобактерий: полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в сочетании с гибридизационным анализом, гибридизация in situ, ПЦР в сочетании с рестрикционным анализом (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), секвенирование. Чаще всего с этой целью используют ПЦР в сочетании с гибридизационным или рестрикционным анализом.

В настоящем исследовании для определения вида НТМ были использованы два молекулярно-генетических метода – биологические микрочипы, разработанные совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и вариант определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена hsp65.

3.1. Разработка и испытание биологического микрочипа (биочипа) для идентификации НТМ

Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время является использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе методов на небольшой по размеру поверхности стекла или другого твердого носителя иммобилизуют в виде правильно расположенных микропятен небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов, которые далее используют для гибридизации с анализируемыми образцами нуклеиновых кислот. При совпадении первичной структуры ДНК микропятна и анализируемого образца  на поверхности стекла образуются правильные ДНК-ДНК гибриды, которые обнаруживают по появлению сигналов в данных участках микроматрицы, например, в виде микроскопической флуоресцирующей точки. Твердые носители с нанесенными на них микроматрицами ДНК получили название микрочипов ДНК.

В настоящее время в Российской Федерации лицензированы две тест-системы с использованием биологических микрочипов, которые применяются во фтизиатрической практике. Это тест-система «ТБ-БИОЧИП», позволяющая одновременно выявлять M. tuberculosis в клиническом материале и определять их устойчивость к рифампицину и изониазиду, и тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» – для определения лекарственной устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам (обе тест-системы разработаны в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, совместно с МНПЦБТ).

Идея создания биологических микрочипов для определения видов НТМ возникла в связи с нарастающей актуальностью проблемы их идентификации и ускоренной лабораторной диагностики микобактериозов.

Данный метод основан на анализе видоспецифического участка гена gyrB, размером 371 п.н. и сегодня позволяет идентифицировать девять видов НТМ (M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae) и дифференцировать их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG). Разработку метода проводили поэтапно, с последовательным увеличением количества иммобилизированных в заполненных гелем лунках биочипа специфических для разных видов микобактерий олигонуклеотидов. ДНК-ДНК гибридизация происходит в трехмерном измерении, что является отличительной особенностью данного вида биочипов от используемых за рубежом.

Ген gyrB ответственен за синтез -субъединицы фермента ДНК-гиразы (топоизомеразы II типа), которая индуцирует образование отрицательных сверхвитков в релаксированной кольцевой молекуле ДНК микобактерий в процессе ее репликации. По данным H. Kasai и соавт. (2000), ген gyrB является отличной мишенью для молекулярного определения вида микобактерий. В отличие от таких генов как 16S-23S rRNA, 16S-23S rRNA ITS, регион gyrB обладает большей вариабельностью нуклеотидной последовательности и вследствие этого более высокой видоспецифичностью. Анализ гена gyrB позволяет, помимо идентификации тех видов, которые можно определить и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей вышеуказанных генов, дифференцировать M. kansasii от M. gastri, M. malmoense от M. szulgai, M. marinum от M. ulcerans, а также виды, входящие в M. tuberculosis complex, за исключением M. bovis BCG.

На сайте GenBank были взяты нуклеотидные последовательности гена gyrB из генома разных видов микобактерий. С помощью программы Vector NTI 10, AlignX (Invitrogen, США) проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей ДНК разных видов микобактерий относительно друг друга.

Выявлено, что ген gyrB представлен как консервативными областями, так и вариабельными видоспецифичными участками. Консервативные участки наиболее подходили для дизайна праймеров, а полиморфные вариабельные участки – это регион подбора видоспецифичных олигонуклеотидных зондов. В работе M. Fukushima и соавт. (2003) с целью видовой идентификации микобактерий предложено анализировать участок гена gyrB размером около 184 п.н. В свою очередь по результатам проведенного выравнивания нуклеотидных последовательностей этого гена стала очевидной целесообразность расширения данной  области, которая в итоге составила около 400 п.н., тем самым, была повышена специфичность метода. Построение дендрограммы производили с помощью программы Vector NTI 10 (Invitrogen, США) и алгоритма Clustal W (рис.4).

При анализе дендрограммы, построенной для 20 видов микобактерий, установлено, что, выбранная область гена gyrB, подходит для создания тест-системы для видовой идентификации микобактерий, а именно «БИОЧИП IMS».

Микрочип «IMS» содержит 49 видоспецифичных дискриминирующих иммобилизованных олигонуклеотидов, 3 маркерные ячейки для позиционирования изображения  и 20 резервных ячеек. Гелевые ячейки, содержащие видоспецифичные дискриминирующие олигонуклеотиды, объединены в 4 группы.

Рис. 4. Дендрограмма последовательности гена gyrB для некоторых видов

микобактерий, построенная на основании программы Vector NTI 10

(Invitrogen, США) и алгоритма Clustal W

       

На рисунке 5 представлена картина гибридизации видоспецифических олигонуклеотидных зондов, иммобилизированных на биологическом микрочипе «IMS», с меченными флуоресцентной меткой комплементарными последовательностями ДНК ампликонов, полученных после проведения двухстадийной ПЦР, где в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из исследуемых культур микобактерий. Оценку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения.

При использовании предпоследнего варианта экспериментальной версии биочипов «IMS» изучено 187 культур микобактерий, выделенных из клинических образцов в жидкой и на плотной питательных средах. Получен высокий процент совпадений полученных результатов (92,6%) с данными микробиологических исследований (табл. 10.).

Рис. 5. Анализ гибридизационной картины биочипа «IMS» с помощью программного

обеспечения (гибридизационная картина, характерная для M. intracellulare)

Таблица 10.

Видовая идентификация микобактерий с помощью

экспериментальной версии биологических микрочипов «IMS»

и микробиологическими методами

п/п

Вид микобактерий

Микробиологическая идентификация

Биочип

Число совпадений результатов (%)

1.

M. tuberculosis

M. tuberculosis

24

23

96,0

M. bovis

1

1

2.

MAC

М. avium

64

58

95,3

M. intracellulare

3

3.

M. kansasii

20

18

90,0

4.

M. fortuitum

18

16

88,9

6.

M. gordonae

16

14

87,5

7.

M. scrofulaceum

3

2

66,7

8.

M. chelonae

1

1

100,0

9.

M. marinum

1

1

100,0

ИТОГО

148

137

92,6

В таблице не представлены результаты идентификации 39 культур НТМ, принадлежащих к видам и подвидам для определения которых данная версия  биочипов «IMS» не предназначена. Отрицательный результат их идентификации подтвердил специфичность методики (статистически достоверные различия результатов, полученных при использовании двух методов, отсутствовали). Но это было существенным недостатком данной версии биологических микрочипов, так как одним из видов, который невозможно было идентифицировать, оказались часто выделяемые из биологического материала больных с подозрением на микобактериальную инфекцию M. xenopi. В связи с этим на гелевую микроматрицу биочипа внесли олигонуклеотидные зонды, специфичные в отношении данного вида микобактерий.  Для проверки их специфичности для детекции M. xenopi, из собранной коллекции были выбраны ДНК культур, идентифицированных микробиологическими методами и ВЭЖХ как M. xenopi, а методом ПДРФ гена hsp65 как M. xenopi/M. gordonae и показавшие отрицательный результат гибридизации на этой версии биочипов. После проведения идентификации 32 культур на новой версии биочипов, специфичных в отношении M. xenopi, было получено совпадение результатов в 100% случаев (в сравнительных исследованиях – их данные приведены в разделе 3.3.  представлены результаты использования последней версии биочипа с помощью которого возможно идентифицировать и  M. xenopi).

3.2. Видовая идентификация микобактерий с помощью ПДРФ

Изучена также эффективность использования для идентификации НТМ метода оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в модификации, ранее разработанной в МНПЦБТ (Краснова М.А., Макарова М.В. и др., 2006). Это необходимо для последующего сравнения результатов, полученных с помощью биологических микрочипов и ПДРФ (исследование проведено на значительно большем материале, чем это было сделано ранее). 

Данная тест-система основана на ПДРФ гена hsp65 и предназначена для идентификации следующих видов микобактерий: M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. fortuitum/M. chelonae, M. xenopi/M. gordonae, M. marinum, и их дифференциации от M. tuberculosis complex.

С использованием метода оценки ПДРФ исследованы 342 культуры микобактерий, выделенных на плотной (Л-Й) и в модифицированной жидкой (7H9) питательных средах.

Таблица 11.

Видовая идентификация микобактерий с помощью

определения ПДРФ в сравнении с микробиологическими методами

Вид микобактерий

Микробиологическая

идентификация

ПДРФ гена hsp65

Число совпадений результатов (%)

1.

M. tuberculosis

41

39

95,1

2.

МАС

M. avium

106

91

97,2

M. intracellulare

12

3.

M. kansasii

57

57

100,0

4.

M. xenopi/  M. gordonae

M. xenopi

42

48

92,3

M. gordonae

10

5.

M. marinum

5

3

60,0

6.

M. scrofulaceum

2

2

100,0

7.

M. fortuitum/ M. chelonae

M. fortuitum

69

74

93,7

M. chelonae

10

ВСЕГО

342

326

95,3

Полученные данные свидетельствовали о том, что распределение по частоте выявления видов НТМ при использовании микробиологических методов и ПДРФ, в основном совпадало (в 95,3% случаев в целом) (табл. 11.), статистически достоверные различия результатов, полученных при использовании двух методов, отсутствовали.

3.3. Сравнение результатов использования биочипов и других методов идентификации НТМ

Представляло интерес оценить эффективность разработанного последнего варианта биологических микрочипов (возможность идентификации M. xenopi) для идентификации микобактерий в сравнении с данными, полученными с помощью ПДРФ и ВЭЖХ. Количество положительных результатов оценивали по отношению к данным идентификации НТМ микробиологическими методами (табл. 12).

Таблица 12.

Сопоставление результатов идентификации НТМ, полученных с помощью биологических микрочипов, ПДРФ и ВЭЖХ, с данными

микробиологических исследований (%)

Группа

НТМ

Вид

Методы и процент совпадений

Биочип

ПДРФ

ВЭЖХ

абс.

%

абс.

%

абс.

%

Медленнорастущие

МАС (56)

53

94,6

52

92,9

52

92,9

M. kansasii (34)

31

91,2

33

97,1

32

94,1

M. xenopi (22)

21

95,5

31

93,9

21

95,5

M. gordonae (11)

10

90,9

10

90,9

M. marinum (3)

3

2

3

M. scrofulaceum (3)

2

3

3

Всего (129)

120

93,0

121

94,0

121

94,0

Быстрорастущие

M. fortuitum (42)

40

95,2

45

93,8

39

92,8

M. chelonae (6)

5

5

Всего (48)

45

93,8

45

93,8

44

91,7

Всего НТМ (177)

165

93,2

166

93,8

165

93,2

Полученные тремя вышеуказанными методами данные при идентификации как медленнорастущих (биочип – 93,0% совпадений с результатами микрокробиологических исследований, ПДРФ – 94,0%, ВЭЖХ – 94,0%), так и быстрорастущих (93,8%, 93,8%, 91,7% – соответственно) НТМ вполне сопоставимы (статистически достоверные различия отсутствовали).

Основными причинами частичного несовпадения результатов идентификации НТМ методом ВЭЖХ, молекулярно-генетическими и микробиологическим методами, являлись с одной стороны – вариабельность бактериологических и биохимических свойств разных штаммов внутри одного вида микобактерий, а с другой – схожесть этих свойств у некоторых представителей разных видов, большое сродство геномов разных видов микобактерий, а также «относительный» субъективизмом  в интерпретации результатов проводимых микробиологических тестов и полученных хроматографических профилей.

Таким образом, молекулярно-генетические методы (биочип «IMS»,  ПДРФ) и ВЭЖХ показали высокую информативность при идентификации нетуберкулезных микобактерий – имел место высокий процент совпадения их результатов с данными микробиологических методов. При этом необходимо подчеркнуть, что наиболее перспективным для идентификации НТМ в практических микробиологических лабораториях может быть использование биологических микрочипов, поскольку этот метод прост в исполнении, стандартизирован и автоматизирован. Перспективным, на наш взгляд, является продолжение исследований с целью увеличения спектра видов НТМ, идентифицируемых этим методом.

4. Виды НТМ в городе Москве и характеристика их лекарственной чувствительности

Данные литературы свидетельствуют о том, что в разных регионах земного шара имеются различия как в частоте обнаружения разных видов НТМ, так и в их чувствительности к противотуберкулезным (ПТП) и другим антибактериальным препаратам [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Литвинов В.И. и др.,2008;  Adle-Biassette H., et al, 2003; Heifets L., 2004; Kathoch V., 2004] .

В связи с вышеизложенным проанализирована частота обнаружения  НТМ в городе Москве с помощью разработанного оптимизированного комплекса исследований и определен спектр их чувствительности к антибактериальным препаратам.

Учитывая, что материал для исследования поступал из большинства противотуберкулезных диспансеров города Москвы, под наблюдением которых состоят больные туберкулезом и лица из групп риска заболевания туберкулезом из двух третей населения города, можно считать, что полученные результаты дают достоверное представление о видовом составе НТМ в городе Москве.

4.1. Характеристика видов НТМ в городе Москве

Установлено (рис. 6), что чаще всего среди НТМ обнаружены MAC (203 культуры – 33,3%), M. fortuitum (169 культур – 27,8 %),  M. xenopi (83 культуры – 13,6%), M. kansasii (78 культур – 12,8%), реже М. gordonaе (25 культур – 4,1%), M. chelonae (18 культур – 3,0%),  M. flavescens (15 культур  – 2,5%), ещё реже  M. marinum (6 культур – 1,0%), M. scrofulaceum (5 культур – 0,8%), M. simiae (2 культуры – 0,3%) и по одной культуре M. gastri, M. szulgai, M. terrae, M. malmoense, M. smegmatis.

Рис. 6. Виды нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез

Полученные данные отличаются от таковых, в других регионах мира, в частности, из медленнорастущих НТМ M. xenopi в ряде стран находятся на втором месте по частоте обнаружения (после МАС). В Москве  M. kansasii и M. xenopi  встречаются практически с одинаковой частотой; среди быстрорастущих НТМ в некоторых регионах мира наиболее часто обнаруживаются  M. chelonae, в Москве – M. fortuitum [Katoch V., Kumar M., 2001; Murras T., Daley C., 2002].

4.2. Чувствительность НТМ к антибактериальным препаратам

Проведено изучение чувствительности выделенных в городе Москве нетуберкулезных микобактерий к противотуберкулезным и ряду других антибактериальных препаратов: стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу, канамицину, этионамиду, циклосерину, ПАСК, капреомицину, офлоксацину, левофлоксацину, ципрофлоксацину, моксифлоксацину. При ее оценке учитывали также частоту множественной лекарственной устойчивости (по критериям ВОЗ – к изониазиду и рифампицину), устойчивости ко всем препаратам основного ряда, XDR (по критериям ВОЗ – к рифампицину + изониазиду + к одному из фторхинолонов + капреомицину/канамицину), устойчивости к одному фторхинолону или любому химиопрепарату. 

Рис. 7. Частота устойчивости нетуберкулезных микобактерий к антибактериальным препаратам

Установлено (рис. 7), что выделенные культуры MAC в большинстве случаев устойчивы к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу, этионамиду, ПАСК, капреомицину, офлоксацину, левофлоксацину, в половине случаев – к  канамицину, циклосерину и, как правило, чувствительны к ципрофлоксацину, моксифлоксацину. Устойчивость МАС ко всем противотуберкулезным препаратам основного ряда выявили в 66,7% случаев,  к одному фторхинолону– в 54,3% случаев, а хотя бы к одному антибактериальному препарату – в 86,4% случаев. Множественной лекарственной устойчивостью обладали 79,2% выделенных изолятов МАС, XDR среди них обнаружено не было.

M. kansasii в большинстве случаев проявляли резистентность к изониазиду и ПАСК, а в половине случаев оказались чувствительны к основным и резервным противотуберкулезным препаратам. Устойчивость M. kansasii ко всем препаратам основного ряда определили в 21,6% случаев, МЛУ – в 32,4%, XDR – не было, устойчивость к одному фторхинолону выявлена в 16,2% случаев, а к одному антибактериальному препарату – в 73, 0% случаев.

У M. xenopi в 2/3 случаев обнаружена устойчивость к рифампицину, этамбутолу и ПАСК, в половине – к изониазиду, офлоксацину, этамбутолу, в 1/3 случаев – к стрептомицину, этионамиду. К остальным антибактериальным препаратам этот вид НТМ был чаще чувствителен. МЛУ  у M. xenopi  выявили в  33,3 % случаев,  устойчивость  ко всем противотуберкулезным  препаратам основного ряда в 27,8% случаев, XDR у М. xenopi  не  обнаружена.  К одному фторхинолону этот  вид  НТМ  был устойчив  в 29,4% случаев, а к одному антибактериальному препарату – в 52,9% случаев.

M. fortuitum в 100% случаев проявляли устойчивость к стрептомицину и изониазду, почти в 100% – к  рифампицину, этамбутолу, этионамиду, канамицину, циклосерину, ПАСК и капреомицину, в половине случаев – к офлоксацину, левофлоксацину, и в 1/3 случаев к  ципрофлоксацину и моксифлоксацину. МЛУ определяли в 94,6% случаев, устойчивость ко всем  противотуберкулезным препаратам основного ряда –  в 92,7%, XDR –  в 3,8% случаев, устойчивость  к одному фторхинолону обнаружена в 37,8% и к одному антибактериальному препарату –  в 96,4% случаев.

О чувствительности к антибактериальным препаратам других выделенных видов НТМ, делать выводы пока сложно из-за малого числа наблюдений.

Всего к стрептомицину оказались резистентными 63,9% медленнорастущих и 94,1% быстрорастущих НТМ, что в целом составило 73,1%,  изониазиду 82,7%, 98,5% и 87,5%, соответственно; рифампицину – 59,6%, 88,2% и 68,3%, соответственно;  этамбутолу – 62,2%, 86,8% и 69,6%, соответственно;  канамицину – 39,5%, 81,8% и 53,6%, соответственно;  этионамиду – 61,0%, 97,7% и 73,5%, соответственно;  циклосерину – 33,3%, 87,7% и 57,7%, соответственно;  ПАСК – 88,6%, 92,5% и 89,9, соответственно;  капреомицину – 31,0%, 83,3% и 46,3%, соответственно.

Что касается фторхинолонов, то к офлоксацину были устойчивы 51,7% медленнорастущих и 53,4% быстрорастущих НТМ (в целом 52,3%), к лево-флоксацину –  40,3 %, 48,8% и 43,2%, соответственно; к ципрофлоксацину –  16,7%, 25,0% и 18,8%, соответственно; к моксифлоксацину – 8,5%, 26,1% и 13,4%, соответственно.

Множественная лекарственная устойчивость обнаружена в 52,6% случаев у медленнорастущих НТМ и в 86,8% случаев у быстрорастущих (62,9% в целом), устойчивость ко всем ПТП первого ряда в 42,9%, 83,6% и 55,4% соответственно. XDR у медленнорастущих НТМ отсутствовала, а у быстрорастущих выявлена в 3,1% случаев. Устойчивость к одному фторхинолону имела место в 36,0%  38,6% и 36,9% соответственно, а к одному антибактериальному препарату –  в 75,0%, 96,7% и 82,4%, соответственно.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в городе Москве имеются определенные особенности чувствительности НТМ к основным и резервным ПТП и другим антибактериальным препаратам. При этом можно выделить два «положительных» момента – преимущественное сохранение чувствительности к таким фторхинолонам как ципрофлоксацин и моксифлоксацин у ряда НТМ и трем резервным ПТП (канамицину,капреомицину и циклосерину).

Суммируя результаты проведенных исследований, следует обратить внимание на то, что впервые  было проведено сравнительное изучение наиболее эффективных современных методов выделения и идентификации НТМ (микро-биологических, молекулярно-генетических, ВЭЖХ), в результате чего предложен их оптимальный комплекс. Также охарактеризованы особенности распространения разных видов НТМ в городе Москве (включая данные об их лекарственной чувствительности), что чрезвычайно важно для практического здравоохранения.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что нетуберкулезные микобактерии в последние годы с возрастающей частотой обнаруживают в клиническом материале, полученном от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез. В результате культурального исследования 163766 образцов такого материала, поступившего из противотуберкулезных диспансеров города Москвы за период с января 2006 по ноябрь 2009гг., было получено 13283  изолятов микобактерий, из них к  НТМ отнесены – 764 (5,8 %) культуры. При этом если в 2006 г. выделено 102 (3,0%), в 2007 г. – 111 (3,4%), то в 2008 г. – 253 (6,9%) и за 10 месяцев 2009 года – 268 (8,7%) изолятов НТМ (от общего числа выделенных микобактерий).

2. Наибольшее число НТМ из клинического материала удается выделить при использовании модифицированной жидкой среды Миддлбрука 7Н9 в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 (85,4%), в сравнении с агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (73,2%) и яичной средой Левенштейна-Йенсена (65,9%). При этом срок детекции роста микобактерий при использовании жидкой питательной среды – 19,8±5,2 дней, что в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной  (37,2±4,5 дней) и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде (30,5±3,9 дней).

3. Для видовой идентификации НТМ разработан метод биологических микрочипов (БИОЧИП IMS), на основе поэтапного испытания различных вариантов биочипов с увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов (увеличение числа идентифицируемых НТМ). БИОЧИП «IMS» позволяет идентифицировать  9 видов НТМ: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae и дифференцировать их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).

4. Использованные для видовой идентификации микобактерий методы –  микробиологические, биочипы, ПДРФ, ВЭЖХ дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические методы  характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения.

5. Разработан оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации НТМ, который включает выделение микобактерий с помощью  культивирования биологического материала на двух питательных средах (жидкой и  плотной) и применение ВЭЖХ и/или одного из молекулярно-генетических методов (ПДРФ, биочип – последний предпочтительнее) для определения вида выделенной культуры.

6. Охарактеризован видовой состав НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез за период с января 2006 по ноябрь 2009 в городе Москве. Установлено, что с наибольшей частотой среди медленнорастущих НТМ из клинического материала выделяются МАС (33,6%),  M. xenopi (13,2%) и M. kansasii (12,7%), а быстрорастущих – M. fortuitum (28,5%).  Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ, при отсутствии M. tuberculosis и наличии соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики, дает основание  для рассмотрения лечащим врачом в диагностическом ряду микобактериоза.

7. Установлено, что большинство клинических изолятов НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез  в городе Москве отличается высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к  таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

8. Поскольку материал для исследования поступал в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных диспансеров, в которых состоят на учете больные туберкулезом и лица из групп риска развития туберкулеза из двух третей населения города, данные видовой идентификации НТМ и определения их чувствительности к антибактериальным препаратам отражают ситуацию в целом в городе Москве.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для эффективного выделения НТМ из биологического материала рекомендуется его посев на две питательные среды: жидкую (Миддбрука 7Н9 в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную).

2. Для обнаружения смешанных культур микобактерий, получения чистой культуры и изучения культурально-морфологических свойств рекомендуется культуры НТМ, выделенные в жидкой и/или на плотной питательных средах, субкультивировать на чашках с агаровой средой 7Н11.

3. Культурально-морфологические и биохимические свойства разных штаммов одного и того же вида микобактерий вариабельны, что может приводить к неправильной их идентификации. При наличии в лаборатории более точных методов идентификации (например,  молекулярно-генетических и ВЭЖХ), использование  микробиологических тестов целесообразно лишь в отдельных (спорных) случаях.

4. Поскольку при использовании ВЭЖХ имеет место высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий с данными микробиологических исследований, этот метод может быть рекомендован для их определения в бактериологических референс-лабораториях, тем более что идентификация вида микобактерий микробиологическими методами занимает до 3-4 недель, тогда как применение ВЭЖХ сокращает ее время до 24 часов.

5. Результаты видовой идентификации культур нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-генетических методов – ПДРФ и биологических микрочипов, также как и ВЭЖХ, в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований, в связи с этим и быстрым получением результатов, данные методы также могут быть рекомендованы для использования в практике. При этом преимуществом применения биочипов является простота метода и автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения.

6. При неоднократном  обнаружении у больного одного и того же вида НТМ (в сочетании с клинико-рентгенологическими проявлениями заболевания) в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.

7. При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать то, что НТМ, как правило, устойчивы к основным и  большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительны к фторхинолонам (ципрофлоксацину и моксифлоксацину).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Краснова М.А. Идентификация микобактерий комплекса «MAIS» и M. tuberculosis методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена hsp65 / Макарова М.В., Скотникова О.И., Мороз А.М. // БЭБиМ. – 2006. - №8.- с. 188-191.
  2. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии: классификация, эпидемиология, патология у людей и животных, лабораторная диагностика // Пробл. туб. и болезней легких.- М. - 2007. - №10. - с.7-17.
  3. Краснова М.А. Применение молекулярно-генетических методов для определения вида микобактерий «MAIS»  и M. tuberculosis complex / Макарова М.В., Дорожкова И.Р., Скотникова О.И., Мороз А.М. // Пробл. туб. и болезней легких.  – М. – 2007. – №11. – с.29-33.
  4. Макарова М.В. Изучение чувствительности нетуберкулезных микобактерий к химиопрепаратам / Фрейман Г.Е. // Туберкулез и болезни легких. – М. – 2009. – №7. – с.55-58.
  5. Макарова М.В. Изучение чувствительности нетуберкулезных микобактерий, выделенных на плотных и жидких питательных средах, к противотуберкулезным препаратам / Фрейман Г.Е. // Туберкулез и болезни легких. – М. – 2009. – №8. – с.49-51.
  6. Макарова М.В. Частота обнаружения  разных видов нетуберкулезных микобактерий в Москве / Краснова М.А., Фрейман Г.Е., Литвинов В.И. // Туберкулез и болезни легких. – М. – 2009. – №9. – с.29-32.
  7. Макарова М.В. Выделение  микобактерий на разных питательных средах и их идентификация / Левченко Т.Н., Фрейман Г.Е. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.  – М. – 2009. – №3. – с.7-10.
  8. Макарова М.В. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Краснова М.А., Мороз А.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.  – М. – 2009. – №3. – с.64-66.
  9. Макарова М.В. Идентификация нетуберкулезных микобактерий / Краснова М.А. // Российский медицинский журнал.- М. – 2009. - №1. – с.27-29.
  10. Литвинов В.И.. Нетуберкулезные микобактерии / Макарова М.В., Краснова М.А.// Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». – 2008, 254 С.
  11. Краснова М.А. Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа / Макарова М.В., Скотникова О.И. //Методические рекомендации №3. – М. – 2007. – 17С.
  12. Макарова М.В. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Краснова М.А. // Методические рекомендации №18. – М. – 2009. – 18 С.
  13. Макарова М.В. Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами / Краснова М.А., Фрейман Г.Е. // Методические рекомендации №19. – М. – 2009. – 22 С.
  14. Краснова М.А. Определение вида микобактерий комплекса MAIS и M. tuberculosis complex молекулярно-генетическими методами / Макарова М.В., Дорожкова И.Р., Скотникова О.И., Мороз А.М. // Научные труды (к 80-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г.Москвы) Под редакцией академика РАМН В.И.Литвинова. М.: МНПЦБТ. – 2007. – с.200-204
  15. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии (обзор литературы) // Научные труды (к 80-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы) Под редакцией академика РАМН В.И.Литвинова. М.: МНПЦБТ. – 2007. – с.233-246
  16. Скотникова О.И. Применение современных технологий для определения вида микобактерий и чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам / Носова Е.Ю., Галкина К.Ю., Краснова М.А., Макарова М.В., Мороз А.М. // Туберкулез в России. Материалы VIII Российского съезда фтизиатров. – М.- 2007. – с.127-128.
  17. Krasnova M.A. Species identification of mycobacteria in Moscow state / Makarova M.V. // В сб. тезисов «ERS». – Берлин. – 2008. – с.86
  18. Литвинов В.И. Молекулярно-генетические технологии при туберкулезе / Носова Е.Ю., Макарова М.В., Краснова М.А., Мороз А.М. // Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций: Материалы Всерос. Научн.-практ. конф. Под ред. Ю.Н. Левашева – С-Пб. – 2008. – с. 252-254
  19. Макарова М.В. Выявление и идентификация нетуберкулезных микобактерий / Краснова М.А. // Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций: Материалы Всерос. Научн.-практ. конф./ Под ред. Ю.Н. Левашева – С-Пб. – 2008. – с. 254-256
  20. Краснова М.А. Видовая идентификация микобактерий / Макарова М.В.// Научные труды 4-го конгресса Евро-Азиатского респираторного общества и 5-го международного конгресса пульмонологов Центральной Азии. – Ташкент. – 2008. – с.92
  21. Литвинов В.И. Нетуберкулезные микобактерии (Библиографический указатель) / Макарова М.В., Краснова М.А.// Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». – 2008. – 96 С.
  22. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии (выделение, идентификация) / Краснова М.А. // Тезисы докладов. VII Московская ассамблея «Здоровье столицы» 18-19 декабря 2008 г. – М.: ГЕОС, 2008. – с.149.
  23. Makarova M. Isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria (NTM) / Krasnova M. // European respiratory society, Austria, September 12-16,  2009. –  р.2465.
  24. Krasnova M.A. Mycobacteria identification using the experimental version of biological microchips / Makarova M.V. // 5th  Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Abstract Book, 27-30 May 2009, Dubrovnik, Croatia. – р.109
  25. Макарова М.В. Видовая идентификация нетуберкулезных микобактерий / Краснова М.А. // Тезисы докладов. VIII Московская Ассамблея «Здоровье столицы» 17-18 декабря 2009 г. – М.: ГЕОС, 2009. – с. 218.
  26. Адамбеков Д.А. Туберкулез и микобактериозы /Литвинов В.И., Макарова М.В., Гергерт В.Я., Сабодаха М.А. // В кн. «Микробиология и иммунология зооантропонозных инфекций» под ред.Д.А.Адамбекова, В.И.Покровского, В.И.Литвинова. – Бишкек, 2009. – с.293-371.
  27. Краснова М.А. Идентификация микобактерий молекулярно-генетическими методами /Макарова М.В. //Сб.тр. к 85-летию со дня рождения М.М.Авербаха. Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». - М. – 2010. –  с.36-39.
  28. Макарова М.В. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Краснова М.А. // Сб.тр. к 85-летию со дня рождения М.М.Авербаха. Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». - М. – 2010. – с.43-48.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.