WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

  На правах рукописи

Кальницкая Оксана Ивановна

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В СЫРЬЕ И ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

16.00.06 ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва 2008

       Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, академик РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор Б.В. Уша

(ГОУ ВПО МГУПБ)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

  В.А. Долгов (ГНУ ВНИИВСГЭ)

доктор ветеринарных наук, профессор

В.Е. Абрамов (ФГУ ВГНКИ)

доктор ветеринарных наук, профессор

В.И. Белоусов (ФГУ ЦНМВЛ)

Ведущая организация:  Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

       

Защита диссертации состоится ___________2008 г. в_____ часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.03. при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ

Автореферат разослан ________________ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, профессор И.Г. Серегин 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Государственная политика, направленная на создание основ биологической безопасности России, передовая концепция здорового питания населения страны предусматривают совершенствование нормативно-методической базы государственного надзора за качеством сырья и продуктов животного происхождения. Практические результаты в указанной области могут быть достигнуты при неукоснительном соблюдении и научно-обоснованной реализации ветеринарно-санитарных требований к животноводческой продукции, основанных на современных методах, обеспечивающих научное сопровождение получения высококачественного животноводческого сырья и биологически полноценных продуктов питания.

Обеспечение населения продовольствием и здоровое питание – важная и актуальная задача государственного значения. Без ее решения невозможна социальная стабильность общества и здоровье населения. За последние годы в стране в связи с изменением характера отечественного рынка приняты меры по интеграции российской экономики в мировую. При решении этой важной государственной задачи учитываются требования экологического и санитарного контроля, возложенного на  Россию  странами - участницами Всемирной торговой организации. Стремительный рост потребления продукции агропромышленного комплекса требует увеличения производительности и снижения себестоимости продукции, которые достигаются за счет рационального применения антибиотиков и стимуляторов роста (в животноводстве и птицеводстве), гербицидов, инсектицидов, фунгицидов (в растениеводстве). Отечественные производители сельскохозяйственной продукции, использующие в соответствии со своим технологическим регламентом антибиотики, обязаны гарантировать безопасность полученной продукции для здоровья населения. Остаточное содержание этих потенциально опасных химических соединений в готовой продукции не должно быть выше предельно допустимых уровней, определенных нормативной документацией.

Снизить риск загрязнения продовольственного сырья антибиотиками можно только при эффективной системе контроля на всех стадиях – от производства до реализации. Вследствие этого к методам массового контроля вредных соединений в сырье и продуктах животного происхождения предъявляются жесткие требования - они должны обеспечивать высокую чувствительность, селективность определения, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов (Романенко Г.А., 2004; Донченко Л.В., Надыкта В.Д., 1999; Elsheikh H.A., 2002; Heeschen W.,  Suhren G., 1993).

Проблема загрязнения животноводческой продукции антибиотиками является предметом обсуждения как в национальном, так и в международном масштабах. В Российской Федерации действуют санитарно-эпидемиологические правила и нормативы «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.1078-01), в которых регламентируется содержание ряда антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения. Однако, несмотря на высокую актуальность проблемы, комплексная оценка сложившейся ситуации носит фрагментарный характер, сведения о наличии токсикантов и контроль за ними недостаточен. Поэтому  настоятельно требуется высокоэффективный комплексный подход к решению проблемы получения высококачественного животноводческого сырья и биологически полноценных продуктов питания.

Исследования в данной области отражены в работах отечественных и зарубежных ученых (Дмитриева В.С., Семенов С.М., 1965; Дружинина Е.Н., Суворкина Д.В., 1968; Карташова В.М., 1980; Аксенов В.И., Ковалев В.Ф., Виолин Б.В., 1988; Демидова Л.Д., 1997; Даниленко В.Н., 2005; Пономарева Е.А., Комаров А.А., 2007; Hamann J., Tolle A., Heeschen W., 1975, 1979; Craven N., 1987; Elsheikh H.A., Taha A.A., Osman J., 2002), которые сходятся во мнении, что поступление в организм человека антибиотиков с пищевыми продуктами крайне нежелательно, поскольку они могут оказывать токсическое действие, приводить к возникновению аллергических реакций, дисбактериозов, циркуляции антибиотикоустойчивых штаммов и другим неблагоприятным явлениям.

На сегодняшний день  проблема безопасного питания в отношении содержания антибиотиков не решена. Различные взгляды на применение антибиотиков в животноводстве и ветеринарии, большое количество методических разработок, нормативных и подзаконных актов только усугубляют создавшуюся ситуацию. В связи с этим единый подход к применению лекарственных препаратов, а также  научно-обоснованная методология, позволяющая с высокой точностью,  чувствительностью и удовлетворительными метрологическими характеристиками обнаруживать остаточные количества антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, призваны гарантировать выпуск качественной и безопасной продукции в соответствии с требованиями действующих стандартов.

Цель работы – усовершенствовать ветеринарно-санитарный контроль за содержанием остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения и предложить пути их снижения.

Задачи исследования.

Провести мониторинг по определению степени загрязнения антибиотиками сырья и продуктов животного происхождения импортного и отечественного производства с применением действующих методов контроля и определить наиболее часто встречающиеся антибиотики.

Подобрать чувствительные тест-культуры микроорганизмов к наиболее широкому спектру антибиотиков, применяемых в ветеринарии и животноводстве.

Модифицировать метод микробиологического определения антибиотиков в субстрате с помощью чувствительных тест-культур микроорганизмов.

Усовершенствовать способ экстракции антибиотиков из мышечной ткани, молока, яиц.

Провести сравнительный анализ чувствительности лабораторных методов выявления антибиотиков в продуктах животноводства (ИФА, ВЭЖХ, микробиологический метод).

Предложить способы технологической обработки продуктов убоя животных и молока с целью уменьшения содержания в них наиболее часто встречающихся антибиотиков.

Теоретически обосновать и разработать концепцию ветеринарно-санитарной оценки продукции животноводства при обнаружении остаточных количеств антибиотиков, не нормируемых СанПиН 2.3.2.1078-01.

Разработать рекомендации по снижению остаточных количеств антибиотиков в продуктах убоя и молоке в условиях перерабатывающих предприятий.

Научная новизна работы состоит в том, что автором проведены мониторинговые исследования по изучению степени распространения сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков.

Определены и предложены чувствительные штаммы микроорганизмов в качестве тест-культур для определения в субстрате основных антибиотиков, применяемых в современной ветеринарии и животноводстве.

Разработан пластинчатый метод определения антибиотиков в биологических субстратах на основании двух отобранных штаммов Bac. subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341, чувствительных к широкому спектру современных антибиотиков. Модифицирована пробоподготовка продуктов животноводства для определения в них остаточных количеств антибиотиков.

В сравнительном аспекте изучена чувствительность методов иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологического метода, позволяющих определять наличие антибиотиков в биологических субстратах.

Установлена чувствительность микробиологической тест-системы Дельвотест-R (Нидерланды) к широкому спектру антибиотиков, встречающихся в молоке, и определена возможность ее использования при различных уровнях загрязнения молока антибиотиками.

Предложены технологические режимы обработки мяса и молока  для уменьшения в них остаточных количеств антибиотиков.

Дана научно обоснованная ветеринарно-санитарная оценка мяса и молока, содержащего остаточные количества антибиотиков.

Практическая ценность и реализация результатов работы. 

На основе проведенных мониторинговых исследований представлена степень распространения импортного и отечественного сырья и продуктов животного происхождения, в том числе не отвечающих требованиям качества и безопасности СанПиН 2.3.2.1078-01 по содержанию остаточных количеств антибиотиков. Материалы мониторинга использованы в плане мероприятий государственной ветеринарной службы г. Москвы по исключению из оборота на потребительском рынке столицы животноводческой продукции, содержащей антибиотики.

Разработана схема подбора штаммов микроорганизмов для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации «Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения» (2005 г.).

Разработан пластинчатый метод определения антибиотиков в биологических субстратах с использованием штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341, чувствительных к широкому спектру современных антибиотиков. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации «Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341» (2005г.).

Разработана и апробирована в условиях производственного предприятия ОАО «ТАМП» ускоренная пробоподготовка продуктов животноводства для определения в них остаточных количеств антибиотиков.

Проведен сравнительный анализ чувствительности иммуноферментного метода, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологического метода для определения антибиотиков в мясе, молоке, яйцах.

Определен нижний предел чувствительности микробиологической системы Дельвотест-R к широкому спектру антибиотиков, обнаруживаемых в молоке. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации «Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии» (2008 г.).

Дана ветеринарно-санитарная оценка продукции животноводства, содержащей антибиотики, и разработаны практические рекомендации по ее использованию. Предложены научно обоснованные технологические режимы обработки сырья, способствующие уменьшению остаточных количеств антибиотиков в мясе и молоке. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены «Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков» (2006 г.) и методические рекомендации «Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания» (2008 г.).

Подготовлены и утверждены УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения учебные пособия: «Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства» – М.: МГУПБ, 2006. – 93 с. и «Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики» – М.: МГУПБ, 2006. – 98 с.

Материалы диссертации используются в цикле лекций МГУПБ по курсу «Ветеринарно-санитарная экспертиза», «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии пищевых производств» для подготовки студентов по специальностям 11201 - «Ветеринария», 110501 - «Ветсанэкспертиза», 260302 – «Технология мяса и мясопродуктов», 240901 – «Биотехнология», 240902 – «Пищевая биотехнология», 200503 – «Стандартизация и сертификация в пищевой промышленности». 

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в в соответствии с планом НИР МГУПБ «Определение остаточных количеств антибактериальных веществ в продукции животноводства», регистрационный номер 7 – 3 – 06. Код темы по ГРНТИ 68.41.05, 62.01.37.

Апробация работы. Результаты научных и экспериментальных исследований доложены на:

- 2-ой Научно-практической конференции «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии» – Краснодар, 2001;

- 4-ой и 5-ой Международных научно-практических конференциях «Пища. Экология. Человек» – М., 2001, 2003;

- Международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» – Воронеж, 2002;

- 4-ой и 5-ой Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» – М., 2002, 2004;

- Международной научно-практической конференции «Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве» – Чебоксары, 2004;

- 12-ом Международном ветеринарном Конгрессе – М., 2004;

- 8-ом Всероссийском Конгрессе «Оптимальное питание – здоровье нации» – М., 2005;

- Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» – Саратов, 2005;

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» – Санкт-Петербург, 2005;

- Международной научно-практической конференции «Пищевые технологии –2005» – Одесса, 2005;

- Третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова – М., 2005;

- 4 Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» – М., 2005;

- Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» – Казань, 2005;

- Всероссийской конференции «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» – М., 2005;

- Симпозиуме «Научное обеспечение инновационных процессов в перерабатывающих отраслях АПК» – М., 2005;

- Второй Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» – Санкт-Петербург, 2006;

- Международной конференции «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» – М., 2006;

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии» – М., 2006;

- Х Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» – М., 2006;

- Международном симпозиуме «Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза» – Казань, 2006;

- Международной научно-практической конференции «Технология и продукты здорового питания» – М., 2006;

- 1-ом Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» – М., 2006;

- 2-ой Международной научно-практической конференции «Пищевые технологии - 2006» – Одесса, 2006;

- 6-ой Межународной научно-практической конференции «Качество, стандартизация, контроль: теория и практика» – Ялта, 2006;

- 8-ой Международной научно-практической конференции «Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемости» –  М., 2006;

- 6-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологичская безопасность населения» - М., 2007.

Публикации результатов исследований. По материалам собственных исследований опубликовано 46 печатных работы, в которых отражено основное содержание диссертации. Из них 2 учебных пособия для подготовки студентов утверждены УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения.

Объем работы. Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и практических предложений. Содержит 40 таблиц, 14 рисунков. Список литературы включает 286 источников, из них 138 отечественных и 148 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Результаты проведенного мониторинга по изучению степени распространения сырья и продуктов животного происхождения импортного и отечественного производства, содержащих остаточные количества антибиотиков.

• Результаты определения чувствительности четырнадцати бактериальных штаммов к девяти антибиотикам, применяемым в ветеринарии и животноводстве.

• Научно обоснованная схема подбора микробных тест-культур для определения антибиотиков в продуктах животного происхождения.

• Теоретическое обоснование и разработка методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341.

• Модификация пробоподготовки мяса, молока, яиц для определения содержания в них антибиотиков, применяемых в ветеринарии и животноводстве.

• Экспериментальные данные по сравнительной оценке чувствительности и специфичности методов ИФА, ВЭЖХ и микробиологического метода, используемых для определения остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения.

• Научно обоснованные пути снижения содержания остаточных количеств антибиотиков в мясе и молоке при их технологической обработке.

• Ветеринарно-санитарная оценка продукции животноводства, содержащей остаточные количества антибиотиков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работа проводилась в период с 2000 г. по 2008 г. на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

         Мониторинговые исследования  по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения проводили методом отбора образцов на предприятиях, в лабораториях, в торговой сети.        Пробы мышечной ткани и молока предоставлены ОАО «Таганский мясоперерабатывающий заводом», ООО «Герсан» (г. Солнечногорск), АО «Леггорн» (г. Тараклия), СХПК «ТОЙСИ» (Чувашская Республика), ООО «Продовольственная корпорация» (г. Казань), Пятигорским мясокомбинатом.

       Исследованию подвергали мышечную ткань и субпродукты птицы (РФ, Бразилия, Китай, Дания, Канада), крупного рогатого скота (Бразилия, Польша) и свиней (Германия), фарш куриный (Германия, Франция), яйца куриные (РФ), молоко и молочные продукты (РФ, Литва, Болгария), рыбу морскую (РФ) - всего 2075 образцов.

       Для объективности, полноты картины были проанализированы данные по обнаружению остатков антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, предоставленные лабораторией санитарии молока и профилактики мастита ГНУ ВНИИВСГЭ,  Московской городской ветеринарной лабораторией, ФГУ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», ЗАО «РОСТЕСТ».

       Содержание остаточных количеств антибиотиков определяли микробиологическим методом диффузии в агар (МУ 3049-84),  экспресс-методом (МУК 4.2.026-95), методом иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04).

       Штаммы микроорганизмов Bac. subtilis штамм L2, штамм ATCC 6633, штамм 720, Bac. pumilus штамм NCTC 8241, Bac. cereus ATCC 11778, Bac. mycoides 537, St. aureus штамм ATCC 6538, штамм 209P, Micrococcus luteus штамм ATCC 9341, штамм 8340, Micrococcus flavus ATCC 10240,  Str.thermophilus, Str.faecium, E.coli ATCC 9637 были получены во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ»).

Определяли чувствительность четырнадцати тест-культур к бензилпенициллину, тетрациклину, стрептомицину, неомицину, гентамицину, спектиномицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину. Их содержание в животноводческой продукции регламентируется СанПиН 2.3.2.1078 – 01 и ФАО – ВОЗ.

В опытах использовали бумажные диски, содержащие антибиотики, изготовленные самостоятельно из ватмана № 2 на 0,01 н растворе соляной кислоты из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл (Егоров Н.С., 1964).

При приготовлении питательных сред использовали пептон, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, 40 %-ный коммерческий раствор глюкозы («Реахим», Россия).

Питательные среды  считали пригодными, если при культивировании получали четкие зоны ингибиции. Всего было испытано 15 вариантов питательных сред.

       Экстракцию антибиотиков из субстрата проводили с помощью химических веществ и воздействия температуры. Использовали пепсин, панкреатин, серную кислоту, реактив Карреза, ацетон, этилацетат и метанол.

Замораживали образцы мышечной ткани  при температуре -18С,  размораживали при комнатной температуре.

Сравнивали предложенный нами способ пробоподготовки образцов со способами, изложенными в «Методических указаниях по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» (МУ 3049-84), в «Экспресс-методе определения антибиотиков в пищевых продуктах» (МУК 4.2.026-95), в методических указаниях «Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа» (МУК 41.1912-04).

Апробация методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 проведена комиссионно на производственном предприятии АО «ТАМП». 

       Для количественного определения левомицетина и тетрациклина в продуктах питания использовали метод твердофазного конкурентного ИФА на поли­стироловых планшетах. Исследования проводили в условиях Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории МСХ РФ. Измерения проводили на планшетном фотометре «Униплан» с использованием фильтра, соответствующего длине волны 450 нм. Расчеты осуществляли в полуавтоматическом режиме по программе «Photo Check».

Использовали тест-системы RIDASCREEN Левомицетин и RIDASCREEN Тетрациклин (ООО «Стайлаб» R-Biopharm). Образцами для определения левомицетина служили говядина жилованная 1 сорта, свинина жилованная 1 сорта, фарш для докторской колбасы высшего сорта, яйцо столовое 1 категории, полученные в СХПК «Тойси» Батыревского района Чувашской Республики. Образцами для определения тетрациклина служили пробы молока, отобранные в Тукаевском филиале ООО «Продовольственная корпорация» Республики Татарстан и пробы молока и говядины, в которые искуственно вносили раствор тетрациклина, содержащий 50 мкг/л активного антибиотика.

Содержание остаточных количеств левомицетина и тетрациклина  в продуктах животного происхождения определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04) с последующим количественным определением на жидкостном хроматографе с УФ-детектором, обеспечивающим измерение при длине волны 278 нм для левомицетина и 355 нм для тетрациклина. Исследования проводили в Московской городской ветеринарной лаборатории. Обработку цифровых данных проводили методом корреляционного анализа (Чарыков А.К., 1984).

Пробы мяса отбирали по ГОСТ 7269-79 «Мясо. Методы отбора проб для органолептического исследования».  Всего в экспериментах по определению левомицетина и тетрациклина использовано более 500 образцов животноводческой продукции.

Для определения влияния температурной обработки на разрушение антибиотиков в мышечной ткани всего исследовано 140 образцов мышечной ткани крупного рогатого скота, свиней и птицы, полученных в АО «Леггорн» г. Тараклия.

Убой опытных животных и птицы проводили в различные сроки после введения левомицетина, тетрациклина, гризина, бацитрацина. Отбор образцов тканей проводили по ГОСТ 26668-85. Содержание антибиотиков определяли по МУ 3049-84. 

Для термической обработки применяли режимы и параметры, утвержденные «Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983). Мясо убойных животных проваривали кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч. при достижении температуры внутри куска не менее 80С. Тушки птицы разрубали вдоль позвоночного столба на две половины и проваривали при 100С в течение 1 ч.

После проварки образцы повторно исследовали на содержание остаточных количеств антибиотиков. Исследованию также подвергали бульон, полученный после варки.

Для изучения влияния режимов варки колбасных изделий на снижение концентрации антибиотиков в готовой продукции в условиях АО «ТАМП» был изготовлен опытный образец колбасы «Закусочной» согласно ГОСТ Р 52196-2003. Говядину для фарша получили от животного, которому при жизни был введен препарат «Тиакат-и». Препарат разработан ВИЭВ и изготовлен на основе окситетрациклина. Препарат вводили животному внутримышечно из расчета 0,5 мл на 10 кг живого веса.

Для изготовления образцов колбасной продукции использовали также говядину жилованную, которую предварительно инъецировали растворами  левомицетина, бензилпенициллина, стрептомицина, тетрациклина.

С целью изучения влияния промывания и замораживания мяса на снижение в нем остаточных количеств антибиотиков, куски говядины промывали под проточной водой и замораживали в морозильной камере в течение 48 часов при температуре -12С. Говядину обрабатывали по методу Mc Namara P. (2002) введением растворов антибиотиков в лимфатические узлы и орошением поверхности. Использовали растворы хлортетрациклина в концентрации 10 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л, а также раствор, содержащий 100 мг/л хлортетрациклина и 200 мг/л нистатина (Стекольников Л.И., 1984). Остаточные количества антибиотиков определяли на поверхности куска, на глубине 1 см и 3 см.

Для выявления антибиотиков в молоке использовали микробиологическую тест-систему Дельвотест-R (Нидерланды).

Пробы молока были подвергнуты длительной (63 - 65С в течение 30 мин), кратковременной (75 - 80С в течение 15 – 20 с) и мгновенной (80 - 90С без выдержки)  пастеризации каждая в объеме 50 мл, а также кипячению и стерилизации. Кипячение проводили при общепринятых параметрах, используя стерильную посуду. Стерилизацию образцов проводили в условиях Юрьев-Польского молочного завода (Владимирская обл.). Молоко сначала нагревали паром до 75С, потом в инжекторе за несколько секунд до 140С и в течение последующих 4 с выдерживали под высоким давлением.

Для изучения влияния сквашивания на уменьшение содержания остаточных количеств антибиотиков образцы молока сквашивали ацидофильной закваской, а после появления сгустка и охлаждения подвергали исследованию.

Количественные показатели результатов исследований подвергали вариационно-статистическому анализу с помощью пакета программ Microsoft Excel (2003), Statgraf, Statgraf Plus. Достоверность различий устанавливали по методу Стьюдента-Фишера (Плохинский Ш.А., 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение степени загрязнения остаточными количествами антибиотиков животноводческой продукции отечественного и импортного происхождения

Большинство специалистов связывают попадание антибиотиков в пищевые продукты с широким применением лечебных, лечебно-профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы, а также с несанкционированным использованием антибиотиков для удлинения сроков хранения продуктов питания. В настоящее время большую актуальность приобретает вопрос о безопасности  животноводческой продукции. Исследования показывают, что пищевые продукты в зависимости от качества сырья и технологии его переработки могут содержать различные ксенобиотики, в том числе антибиотики.

       Во исполнение п. 17 постановления Правительства города Москвы № 59-ПП «Об основных направлениях укрепления продовольственной безопасности города Москвы на дальнейшую перспективу» с 2002 по 2005 год нами проводились мониторинговые исследования  по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения отечественного и импортного производства (табл. 1, рис. 1).

Из 2075 исследуемых проб в 391 случае (18,8 %) были обнаружены антибиотики, из них тетрациклин - в 344 случаях, левомицетин – в 21 случае, стрептомицин – в 17 случаях, пенициллин – в 7 случаях, гризин – в 2 случаях.

       Таким образом, в 88 % случаев выявления антибиотиков в сырье и продуктах животноводства был обнаружен тетрациклин, что составило 16,6 % всех исследуемых образцов. В 5,4 % случаев был обнаружен левомицетин, что составило 1,0 % всех исследуемых образцов. В 4,3 % случаев был обнаружен стрептомицин, что составило 0,8 % всех исследуемых образцов. В  1,8 % случаев был обнаружен пенициллин, что составило 0,3 % всех исследуемых образцов. В 0,5 % случаев был обнаружен гризин, что составило 0,01 % всех исследуемых образцов (рис. 1).





Рис. 1. Частота обнаружения антибиотиков в количествах, превышающих МДУ, в продуктах животного происхожения

Таблица 1

Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства

Объект исследования

Антибиотик

Количество исследованных проб

Из них положительных

кол-во

%

Грудки куриные

Тетрациклин

76

14

18,5

Печень куриная

Тетрациклин

76

20

26,3

Желудки куриные

Тетрациклин

Гризин

76

46

2

60,5

2,6

Фарш куриный

Тетрациклин

Левомицетин

12

4

1

33,3

8,3

Мышечн. ткань индейки

Тетрациклин

11

8

72,7

Яйца куриные

Тетрациклин

Стрептомицин

Левомицетин

60

17

2

1

28,3

3,3

1,6

Мышечная ткань крс

Тетрациклин

400

32

8,0

Печень крс

Тетрациклин

Левомицетин

400

42

3

10,5

0,08

Почки крс

Тетрациклин

Левомицетин

400

51

7

12,6

1,8

Мышечная ткань свиней

Тетрациклин

160

27

16,9

Печень свиней

Тетрациклин

160

27

16,9

Почки свиней

Тетрациклин

Левомицетин

160

31

6

19,4

3,8

Молоко

Тетрациклин

Стрептомицин

Пенициллин

34

6

12

5

17,6

35,3

14,7

Сметана

Тетрациклин

Стрептомицин

Пенициллин

17

4

2

2

23,5

11,8

11,8

Десерт творожный

Тетрациклин

8

8

100,0

Сыр твердый

Тетрациклин

Левомицетин

Стрептомицин

12

2

3

1

16,6

25,0

8,3

Рыба морская

Тетрациклин

13

5

38,8

Всего

2075

391

18,8

В продуктах убоя птицы (Бразилия, Китай, Дания, Канада, Германия, Франция, РФ) чаще всего обнаруживали тетрациклин – в 18,5 % случаев в куриных грудках, в 26,3 %  - в печени, в 63,1 % - в желудках, в 33,3 % - в фарше. Более высокая частота встречаемости тетрациклина в мускульных желудках по сравнению с мышечной тканью связана с тем, что мышечная ткань хуже накапливает антибиотики.

Чаще всего тетрациклин выделяли из мышечной ткани индейки – в 72,7 % случаев. Возможно, это связано со сложностями при выращивании молодняка индейки и дополнительным введением тетрациклина. Наши данные согласуются с данными Аксенова В.И. и Ковалева В.Ф. (1977). 

В 8,3 % случаев из фарша куриного был выделен левомицетин и в 2,6 % из желудков куриных - гризин.

Всего в 251 пробе продуктов убоя птицы выявлено 95 случаев превышения допустимого содержания антибиотиков, что составляет 37,9 %.

       При исследовании 60 шт. яиц куриных (РФ) тетрациклин обнаружили в 17 яйцах (28,3 %), стрептомицин – в 2 яйцах (3,3 %), левомицетин – в 1 яйце (1,6 %). Итого, в 33,2 % случаев яйца куриные содержали антибиотики, несмотря на то, что куры-несушки не должны получать антибиотики.        

Наибольший удельный вес тетрациклина, возможно, обусловлен тем, что его продолжают давать птице для стимуляции роста, не взирая на запрещающую инструкцию.

Мышечная ткань крупного рогатого скота (Бразилия, РФ) содержала тетрациклин в 8 % случаев, печень (Польша ) – в 10,5 % случаев, почки (Польша) – в 12,6 % случаев.  В печени и почках крупного рогатого скота также был обнаружен левомицетин в 0,08 % и 1,8 % случаев соответственно.

Мышечная ткань свиней (Германия, РФ) содержала тетрациклин в 16,9 % случаев, печень (Германия) – в 16,9 % случаев, почки (Германия) – в 19,4 % случаев. Кроме того, в почках свиней был обнаружен левомицетин в 3,8 % случаев.

Всего на содержание антибиотиков нами было исследовано 1200 образцов продуктов убоя крупного рогатого скота, из них в 135 случаях были обнаружены тетрациклин и левомицетин, то есть в 11,2 % образцов остаточные количества антибиотиков превышали МДУ.

Для исследования продуктов убоя свиней было отобрано 480 проб, в 91 пробе были обнаружены антибиотики в превышающих количествах, что составило 19,0 %.

Молоко (РФ) содержало наиболее широкий спектр выделенных антибиотиков. В 14,7 % случаев МДУ превышало содержание пенициллина, в 17,6 % случаев - тетрациклина, в 35,5 % случаев – стрептомицина. Из 34 образцов в 23 были обнаружены антибиотики, что составило 67,6 %.

В сметане (РФ) из 17 исследованных образцов в 8 случаях (47,6 %) были выявлены антибиотики, в 23,5 % случаев - тетрациклин, в 11,8 % - стрептомицин и в 11,8 % - пенициллин.

Десерт творожный (Литва) содержал тетрациклин во всех исследованных пробах – в 100 % случаев.

Сыр твердый (Болгария, РФ) содержал в 25,0 % случаев левомицетин, в 16,6 % - тетрациклин, в 8,3 % - стрептомицин. Всего в 50 % отобранных образцов отмечено содержание остаточных количеств антибиотиков.

В рыбе морской (РФ) был обнаружен тетрациклин в 38,8 % отобранных образцов. Мы связываем загрязнение рыбы с ее поверхностной обработкой тетрациклином.

На рис. 2 отражена степень загрязнения различных продуктов животноводства антибиотиками, наиболее часто применяемыми в ветеринарии и животноводстве.

Рис. 2. Степень загрязнения сырья и продуктов животного происхождения остаточными количествами антибиотиков

Таким образом, отечественные и импортные сырье и продукты животного происхождения  характеризуются различным содержанием остаточных количеств антибиотиков - от невыявления до 100 % положительных проб. Кроме того, в продуктах присутствует весь спектр антибиотиков, остаточные количества которых нормируются СанПиН 2.3.2.1078-01.

В таблице 2 представлено распределение содержания антибиотиков в исследованных импортных и отечественных образцах животноводческой продукции.

Таблица 2

Загрязненность антибиотиками животноводческой продукции отечественного и импортного происхождения

Вид продукции

Отечественная продукция

Импортная продукция

Всего исследовано,

шт

Загряз-ненных, шт

%

Всего

исследовано, шт

Загряз-ненных,шт

%

Мышечная ткань птицы

16

2

12,5

60

12

20

Субпродукты птицы

40

17

42,5

112

51

45,5

Мышечная ткань крупного рогатого скота

100

4

4

300

28

9,3

Мышечная ткань свиней

40

6

15

120

21

17,5

Сыр твердый

8

2

25

4

4

100

Как видно из таблицы 2 и рисунка 3, антибиотики обнаруживаются и в отечественной, и в импортной продукции. Частота загрязнения импортных и отечественных образцов мяса птицы, субпродуктов птицы и мяса свиней сопоставима. Отечественная говядина содержит антибиотики в 4 % случаев, а импортная в 9,3 %, что вдвое выше. Отечественный сыр твердый содержит антибиотики в 25 % случаев, тогда как импортный - в 100 %, что выше в 4 раза.

       Рис. 3. Степень загрязненности антибиотиками животноводческой продукции отечественного и импортного происхождения

Установлено, что во всех пробах остаточные количества антибиотиков в десятки раз превышали МДУ, который определен СанПиН 2.3.2.1078-01, тогда как, согласно инструкций по применению антибиотиков, не разрешается добавлять антибиотики в корм коровам, племенному скоту, курам-несушкам. Кроме того, инструкциями установлены сроки прекращения введения или дачи  с кормами антибиотиков за 3 – 7 суток перед убоем животных. Молоко от коров, которых лечили антибиотиками, не должно поступать в пищу.

Тот факт, что остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в сырье и продуктах животного происхождения, может свидетельствовать о нарушении существующих инструкций по их применению. Проследить причины попадания антибиотиков в импортную продукцию не представляется возможным.

        При анализе данных городских лабораторий выявлено 114 случаев превышения содержания антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения. Из них в мышечной ткани и субпродуктах птицы – 48 случаев. В 14 случаях печень куриная отечественного производства содержала тетрациклин, в 33 случаях грудки куриные (Китай) содержали тетрациклин, в одном образце грудки куриные (Канада) содержали стрептомицин.

       При исследовании фарша куриного в трех случаях обнаружен тетрациклин (Германия), в одном случае стрептомицин (Франция).

       Яйца куриные отечественного производства содержали тетрациклин в двух случаях и стрептомицин в двух случаях. Эти же антибиотики обнаружены в яичном порошке (Бразилия).

В говядине и печени говяжьей (Бразилия) обнаруживали тетрациклин (10 образцов) и левомицетин (5 образцов). В говядине безкостной замороженной (Польша) – гризин (5 образцов), бацитрацин (1 образец). В свинине (Германия) выявлено 16 случаев содержания тетрациклина в количествах, превышающих МДУ.

Молоко отечественного производства содержало пенициллин, стрептомицин, тетрациклин. В брынзе (Болгария) были обнаружены остаточные количества пенициллина, стрептомицина, тетрациклина и левомицетина (табл. 3).

       

Таблица 3        

Антибиотики, обнаруживаемые в продуктах животного происхождения в количествах, превышающих требования СанПиН 2.3.2.1078-01

Объект исследования

Страна происхождения

Антибиотик

Количество положитель-ных проб

Место проведения исследований

Грудки куриные

Китай

Канада

Тетрациклин

Стрептомицин

33

1

Горветлаборатория

Печень куриная

РФ

Тетрациклин

14

Горветлаборатория

Фарш куриный

Германия

Франция

Тетрациклин

Стрептомицин

3

1

Горветлаборатория

ЦГСЭН

Яйца куриные

РФ

Тетрациклин

Стрептомицин

2

2

Горветлаборатория

Яичный порошок

Бразилия

Тетрациклин

Стрептомицин

3

3

РОСТЕСТ

Говядина

Бразилия

Тетрациклин

10

ЦГСЭН

Печень крупного рогатого скота

Бразилия

Левомицетин

5

ЦГСЭН

Горветлаборатория

Свинина

Германия

Тетрациклин

16

Горветлаборатория

Говядина б/к замороженная

Польша

Гризин

Бацитрацин

5

1

ЦГСЭН

Молоко

РФ

Пенициллин

Стрептомицин

Тетрациклин

3

3

1

РОСТЕСТ

Брынза

Болгария

Пенициллин

Стрептомицин

Тетрациклин

Левомицетин

2

2

2

2

РОСТЕСТ

Всего  114 случаев

       

Анализ представленных лабораториями данных показывает, что чаще всего остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в продуктах убоя птицы импортного и отечественного производства, в говядине и свинине импортного производства, а также в молоке отечественного производства. Преобладающее большинство исследуемых проб продукции животноводства содержало тетрациклин. Реже в образцах продукции обнаруживали остаточные количества левомицетина, стрептомицина, пенициллина, гризина, бацитрацина.

Результаты проведенного мониторинга по выявлению животноводческой продукции, содержащей антибиотики, показали необходимость совершенствования методологии обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, расширения круга выявляемых антибиотиков и ветеринарно-санитарной оценки сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков.

Подбор унифицированных культур микроорганизмов для определения антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения

       Большинство современных микробиологических методов ориентировано на определение антибиотиков, МДУ которых нормируется СанПиН – пенициллин, тетрациклин, левомицетин, стрептомицин, гризин, бацитрацин, в то время как в современном животноводстве и ветеринарии используется около 50 антибиотиков и их миксов.

       Мы изучили чувствительность микроорганизмов к основным антибиотикам, используемым в ветеринарии и животноводстве, с целью подобрать унифицированные тест-культуры к наиболее широкому спектру антибиотиков. Показателем чувствительности микроорганизма к антибиотику служил диаметр зоны задержки микробного роста вокруг бумажного диска.

Тестирование чувствительности четырнадцати микроорганизмов по отношению к антибиотикам (содержание активного вещества 0,1 мкг/мл) дало возможность обозначить наиболее чувствительные виды и штаммы.

Грамотрицательный штамм E.coli ATCC 9637 малочувствителен к таким антибиотикам, как бензилпенициллин (диаметр зоны 9 мм), линкомицин (9 мм), бацитрацин (9 мм). Штамм B.subtilis L2 оказался высокочувствительным ко всем изученным антибиотикам (диаметр зоны 17 мм и более), за исключением левомицетина (14 мм) и бацитрацина (13 мм), к которым он оказался умеренно чувствительным. Штамм B.subtilis ATCC 6633 проявил высокую чувствительность к тетрациклину, неомицину, гризину, бацитрацину (диаметр более 19 мм) и умеренную чувствительность к бензилпенициллину, гентамицину, линкомицину, левомицетину (13 - 14 мм). Аналогична чувствительность к антибиотикам и у штамма B.subtilis 720. Штамм B.cereus ATCC 11778 высокочувствителен к тетрациклину, левомицетину, гризину (диаметр зоны 22 мм), но к остальным изученным антибиотикам  штамм умеренно чувствительный. Штамм B.mycoides 537 оказался умеренно чувствительным ко всем используемым антибиотикам. B.calidolactis чувствителен к бензилпенициллину и левомицетину (соответственно 21 и 17 мм), к остальным антибиотикам умеренно чувствителен (12 - 15 мм). Штамм B.pumilus NCTC 8241 ко всем изучаемым антибиотикам оказался чувствительным (диаметр зоны 17 - 20 мм). Оба штамма S.aureus 209-P и ATCC 6538 одинаково высокочувствительны к концентрации изучаемых антибиотиков, содержащейся в бумажных дисках (16 - 20 мм). Три изученных штамма M.luteus – ATCC 9341, ATCC 10240, 8340 незначительно различаются по своей чувствительности к антибиотикам, но самым высокочувствительным является M.luteus ATCC 9341 (19 - 24 мм). Зоны задержки роста вокруг дисков, пропитанных антибиотиками, у штаммов стрептококков Str.thermophilus и S.faecium относительно одинаковы (14 - 20 мм).

Исходя из полученных результатов, для дальнейших исследований должны были использованы штаммы со стабильной высокой чувствительностью к антибиотическим препаратам.

Штамм B.subtilis L2 является одновременно чувствительным к наличию в среде тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, бензилпенициллина и гризина, охватывая, таким образом, достаточно широкий спектр антибиотиков.

Для определения наличия в субстрате левомицетина и бацитрацина может быть использован штамм M.luteus ATCC 9341, как наиболее чувствительный. У остальных изученных микроорганизмов интервал антибиотикочувствительности и степень чувствительности ниже требуемой.

В результате исследований микробиологическим методом были установлены пределы чувствительности восьми штаммов микроорганизмов к девяти антибиотикам, наиболее часто применяемым в ветеринарии и животноводстве. Пределы чувствительности изученных микробных культур представлены в таблице 4.

Таблица 4

Нижний предел чувствительности микробных культур к антибиотикам

Антибиотик

Концентрация антибиотика в питательной среде, ед/мл, мкг/мл

B.subtilis L2

B.micoides

537

B.pumilus

NCTC 8241

S.aureus

209-P

S.aureus

ATCC 6538

M.luteus

ATCC 9341

Str.termo-

philus

Str.faecium

Пенициллин

(не допускается)*

0,01

1

0,5

0,1

0,1

100

0,1

1

Тетрациклин

(не допускается)

0,01

5

0,1

0,1

0,5

0,1

5

100

Неомицин

(0,5 мг/кг)

0,1

0,1

0,5

0,5

1

1

100

5

Гентамицин

(0,1мг/кг)

0,01

1

0,01

5

5

0,5

1

100

Стрептомицин

(не допускается)

0,1

1

0,1

0,1

0,5

1

5

10

Левомицетин

(не допускается)

0,1

0,1

0,1

10

10

0,01

0,01

0,1

Линкомицин

(0,1мг/кг)

0,1

5

100

10

100

1

100

100

Гризин

(не допускается)

0,1

1

0,5

10

10

100

10

100

Бацитрацин

(не допускается)

0,5

1

0,5

5

10

0,01

100

100

* В скобках указаны максимальные уровни остатков антибиотиков, допускаемые в продуктах убоя согласно СанПиН 2.3.2.1078 – 01 и рекомендаций ФАО – ВОЗ.

       

Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения микробиологическим методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341

На основании данных, полученных при изучении чувствительности различных штаммов микроорганизмов к нарастающим концентрациям изучаемых антибиотиков, разработана методика, позволяющая определять антибиотики в продуктах животного происхождения.

Сущность метода заключается в том, что адсорбирующие бумажные диски, смоченные изучаемым субстратом и растворами антибиотика различной концентрации, размещаются на поверхности агаризированной питательной среды, содержащей тест-культуру к изучаемому антибиотику. Рост тест-культуры при термостатировании  приводит к помутнению агара. Отсутствие помутнения вокруг диска с изучаемым образцом (зона отсутствия роста, зона задержки роста) свидетельствует о наличии в изучаемом субстрате антибиотического вещества. Размер зоны отсутствия роста сравнивается с размером зоны отсутствия роста вокруг дисков, содержащих различные концентрации антибиотика.

Для обнаружения в субстрате тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, гризина, бензилпенициллина был использован штамм B.subtilis L2. Штамм M.luteus ATCC 9341 был использован для обнаружения левомицетина и бацитрацина.

Для построения стандартных кривых и расчета концентрации антибиотиков была составлена таблица роста штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 вокруг бумажных дисков, содержащих различные концентрации антибиотиков (табл. 5).

Таблица 5

Рост штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 вокруг бумажных дисков, пропитанных различными концентрациями антибиотиков

Антибиотик

Диаметр зоны задержки роста штаммов, мм

0,001мкг/мл

0,01мкг/мл

0,1мкг/мл

1,0мкг/мл

B.subtilis L2

Бензилпенициллин

9,2 ± 1,0

10,3 ± 0,8 

17,5 ± 0,6

24,3 ± 0,7

Тетрациклин

9,3 ± 1,0

17,2 ± 0,5

23,5 ± 0,4

23,5 ± 0,4

Неомицин

9,5 ± 0,5

18,3 ± 1,0

20,0 ± 0,6

22,2 ± 0,9

Гентамицин

9,3 ± 0,5

14,3 ± 0,3

18,5 ± 0,9

21,4 ± 0,3

Гризин

10,2 ± 0,5

14,3 ± 0,6

20,3 ± 0,2

22,5 ± 0,6

M.luteus ATCC 9341

Левомицетин

10,5 ± 0,6

18,6 ± 0,5

21,1 ± 0,2

26,2 ± 0,2

Бацитрацин

10,1 ± 0,3

17,5 ± 0,2

21,3 ± 0,5

27,2 ± 0,5

На основании результатов исследований диаметра зоны задержки роста построены стандартные кривые для определения концентраций бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, левомицетина, гризина, бацитрацина с помощью наиболее чувствительных штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 (рис. 4, 5).

Рис. 4. Стандартные калибровочные кривые роста штамма B.subtilis L2 в присутствии различных концентраций антибиотиков

Рис. 5. Стандартные калибровочные кривые роста штамма M.luteus АТСС 9341 в присутствии различных концентраций антибиотиков

Стандартные кривые роста штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 используются для определения концентрации антибиотиков в изучаемом субстрате.

Результаты исследований по определению концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 апробированы в условиях производственной лаборатории Таганского мясокомбината (акт исследований от 27.03.05).

Сравнительный анализ и совершенствование способов пробоподготовки образцов мышечной ткани

Для выбора оптимального, наименее трудоемкого и наиболее быстрого способа извлечения антибиотиков было изучено влияние различных химических веществ на мышечную ткань. Для этого один и тот же образец мышечной ткани, полученный от опытных животных, которым вводили известный антибиотик, подвергали воздействию различных химических веществ и температуры и проводили сравнение их действия. Степень извлечения антибиотиков определяли по диаметру зоны задержки роста тест-культур вокруг бумажных дисков, пропитанных элюатами. С целью исключения влияния самих химических веществ на рост тест-культур ставили контрольные опыты, в которых воздействию химических веществ подвергалась мышечная ткань, свободная от антибиотиков.

Сначала сравнивали действие буферного раствора и дистиллированной воды, а также выдержки проб в термостате при 37С и интенсивного встряхивания в шуттель-аппарате.

Установлено, что степень диффузии антибиотика в агар не изменялась при добавлении дистиллированной воды, которой заменили буферный раствор. Также не установлено значительной разницы в  степени извлечения антибиотиков из проб мышечной ткани, если заменить термостатирование образцов в течение 90 мин. при температуре 37С на интенсивное встряхивание в течение 10 мин. в шуттель-аппарате.

С целью депротеинизации к мышечной ткани добавляли пепсин, для разрушения мышечных волокон пробы подвергали заморозке и оттаиванию. На извлечение антибиотиков большее влияние оказывает добавление 2%-ного раствора пепсина. Возможно после оттаивания замороженных до -8С проб какая-то часть антибиотиков удаляется с мышечным соком.

С целью увеличения экстракции антибиотиков к образцам мышечной ткани добавляли серную кислоту, реактив Карреза, ацетон и метанол.

Установлено, что добавление 1%-ного раствора серной кислоты привело к уменьшению степени диффузии всех антибиотиков в агар. По сравнению с образцами, которые не подвергались воздействию кислоты, диаметр зоны задержки роста тест-культур уменьшился для тетрациклина приблизительно на 5%, для левомицетина – на 6%, неомицина – на 6%. По-видимому, экстракция антибиотиков из мышечной ткани протекает лучше в щелочной и нейтральной среде, чем в кислой.

Добавление к образцам реактива Карреза привело к незначительному увеличению диффузии антибиотика в агар и увеличению диаметра зоны задержки роста тест-культур. Диаметр увеличился при добавлении реактива Карреза в целом на 5%.

Добавление к гомогенизату ацетона в соотношении 1:1 привело к увеличению диаметра зоны задержки роста тест-культур для тетрациклина с 23,5 ± 0,5 мм до 27,5±0,2 мм (≈17%), для левомицетина - с 23,5 ± 0,3 мм до 26,9±0,5 мм (≈15%), для неомицина - с 20,0 ± 0,0 мм до 22,3±0,0 мм (11,5%).

Добавление метанола в соотношении 1:1 практически не изменило степень диффузии антибиотиков в агар. В контрольных образцах задержки роста тест-культур не наблюдалось.

Таким образом, опытами установлено, что характер предварительной обработки образцов мышечной ткани оказывает влияние на степень извлечения антибиотиков. Наибольшее влияние наблюдается при добавлении к образцам ацетона в соотношении 1:1, наименьшее – при добавлении 1%-ного раствора серной кислоты и при заморозке образцов в течение 12 ч. при температуре -8С.

Термостатирование образцов при 37С в течение 90 мин., добавление 2%-ного раствора пепсина, реактива Карреза и метанола практически не влияло на степень извлечения антибиотиков из мышечной ткани и диаметр зоны задержки роста тест-культур.

Влияние предварительной обработки образцов на степень извлечения тетрациклина, левомицетина, неомицина показано на рис. 6.

Рис. 6. Влияние добавляемых реактивов на степень извлечения антибиотиков из образцов мышечной ткани

Исходя из полученных результатов, нами предложен метод пробоподготовки образцов мышечной ткани, который заключается в следующем: пробу без предварительного нагревания необходимо гомогенизировать в ступке и добавить дистиллированной воды в соотношении 1:2. Перемешать в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Для более полного экстрагирования добавить к пробе ацетон в соотношении 1:1 и подвергнуть повторному встряхиванию в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Затем пробу необходимо подвергнуть центрифугированию при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Полученная проба (водная фаза) готова к исследованию.

При сравнении пробоподготовок мяса, яиц, молока, предложенных в «Методических указаниях по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» (№ 3049-84), в «Экспресс-методе определения антибиотиков в пищевых продуктах» (МУК 4.2.026-95), в «Определении остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа» (МУК 41.1912-04) и пробоподготовки, разработанной нами, установлено, что предложенный нами способ несколько увеличивает степень извлечения антибиотиков, а также позволяет экономить реактивы и время за счет исключения термостатирования (90 мин.) и заморозки (1 сут.).

Определение остаточных количеств антибиотиков методом иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологическим методом в сравнительном аспекте

Разработка новых и модификация существующих методов определения количества антибиотиков, пригодных для массовых исследований, позволит более полно изучить содержание антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, сопоставить данные, полученные в разных лабораториях, должным образом оценить проблему и принять необходимые меры, обеспечивающие сохранность здоровья населения.

       Эффективность метода определения остаточных количств антибиотиков в значительной мере зависит от эффективности пробоподготовки. Подготовка проб мяса, яиц проводилась нами двумя способами: по методике МУК 4.1.1912-04 «Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа» и по методике, разработанной нами. Пробоподготовка согласно методике МУК 4.1.1912-04 длилась около двух часов и требовала большего количества реактивов, чем пробоподготовка, разработанная нами. Кроме того, самостоятельно разработанная пробоподготовка не уступала по эффективности пробоподготовке по МУК 4.1.1912-04.

               Результаты, полученные с помощью метода иммуноферментного анализа с использованием обоих способов обработки образцов, практически не различались, что позволило предположить, что для постановки ИФА возможно применение пробоподготовки, разработанной нами. Концентрация левомицетина в образцах, подготовленных по методике, разработанной самостоятельно, составляла в говядине 0,063 мг/кг, в свинине - 0,065 мг/кг, фарше – 0,062 мг/кг, яйцах – 0,051 мг/кг. Концентрация левомицетина в образцах, обработанных по МУК 4.1.1912-04 соответственно: 0,064; 0,068; 0,062; 0,05 мг/кг.

       Аналогичные результаты были получены при исследовании методом ИФА проб молока и говядины, искусственно загрязненных 50 мкг/л тетрациклина. Концентрация тетрациклина в образцах, подготовленных по МУК 4.1.1912-04, составила в говядине 0,044 мг/кг, в молоке – 0,043 мг/кг, а при пробоподготовке, разработанной нами соответственно: 0,041 мг/кг и 0,046 мг/кг.

Более высокое содержание тетрациклина в молоке, полученное при использовании пробоподготовки, разработанной самостоятельно, объясняется применением в процессе обработки образца ацетона, который разрушает белковую оболочку жировых шариков молока.

В мясе более высокий результат получен при пробоподготовке, описанной в МУК 4.1.1912-04. Однако следует учитывать, что эта пробоподготовка более трудоемкая, дорогостоящая и длительная, тогда как разница в полученных результатах незначительная.

В образцах молока и мяса, искусственно загрязненных 50 мкг/л тетрациклина, степень извлечения была очень высокая и составила соответственно для молока 91 ± 1 %, для мяса – 85 ± 3 % при использовании обеих пробоподготовок.

       С целью сравнения эффективности и достоверности методов с помощью ВЭЖХ определяли антибиотики в тех же образцах  животноводческой продукции, в которых определяли остаточные количества левомицетина и тетрациклина методом ИФА. 

       При пробоподготовке образцов по методике, предложенной в МУК 4.1.1912-04, были получены более высокие результаты по определению содержания левомицетина и тетрациклина в сравнении с методикой пробоподготовки, разработанной нами. Это позволяет сделать вывод о том, что методика пробоподготовки, разработанная нами, менее эффективна при определении антибиотиков методом ВЭЖХ. По-видимому, исключение из пробоподготовки некоторых этапов экстрагирования и обезжиривания привело к тому, что содержание антибиотиков в образцах, которые готовились к исследованию по методике пробоподготовки, разработаннойнами, оказалось ниже в среднем на 25 – 30 %, чем в идентичных образцах, подготовленных согласно МУК 4.1.1912-04.        

       Определение остаточных количеств левомицетина и тетрациклина микробиологическим методом в тех же образцах животноводческой продукции позволило получить сходные результаты, которые практически не отличались от значений, полученных методом ИФА и ВЭЖХ. Подготовка проб для микробиологического исследования длилась приблизительно 2 ч. Результаты исследования были получены через 12 ч.

       Значения, полученные при использовании пробоподготовки, разработанной нами, практически не отличались от значений, полученных при обработке образцов с применением пробоподготовки по МУК 3049-84.

       Результаты сравнительного тестирования чувствительности методов ИФА, ВЭЖХ (МУК 4.1.1912-04)  и микробиологического метода (МУК 3049-84) по определению левомицетина и тетрациклина в одних и тех же образцах  мяса, фарша, яиц и молока представлены в таблице 6.

Таблица 6

Содержание левомицетина и тетрациклина в образцах продукции

Образец

АБ

Концентрация антибиотиков, мг/кг (М±m)

ИФА

ВЭЖХ

Микробиологический метод

1

2

1

2

1

2

Говядина

Л

0,064±0,002

0,063±0,002

0,071±0,001

0,051±0,004

0,070±0,003

0,08±0,003

Свинина

Л

0,068±0,002

0,065±0,002

0,065±0,001

0,050±0,002

0,060±0,003

0,050±0,006

Фарш

Л

0,062±0,001

0,062±0,003

0,067±0,003

0,052±0,001

0,050±0,004

0,050±0,006

Яйцо

Л

0,050±0,003

0,051±0,004

0,055±0,001

0,045±0,003

0,050±0,006

0,040±0,008

Молоко № 1

Т

0,150±0,001

0,170±0,002

0,255±0,002

0,150±0,005

0,220±0,007

0,200±0,003

Молоко № 2

Т

0,043±0,002

0,046±0,002

0,047±0,002

0,040±0,002

0,040±0,002

0,040±0,004

Говядина искусственно

загрязненная

Т

0,044±0,001

0,041±0,002

0,045±0,003

0,041±0,003

0,040±0,003

0,050±0,002

1 – подготовка образцов к исследованию по МУК 4.1.1912-04  и 3049-84

2 - подготовка образцов к исследованию по методике, разработанной нами

Л – левомицетин, Т – тетрациклин

Результаты, полученные параллельно с использованием одних и тех же образцов, вполне сопоставимы и различаются незначительно, что свидетельствует о сходной эффективности методов.

       Статистическая обработка данных позволила определить, что отличия в концентрации антибиотиков, полученные с помощью различных методов, не превышают 10%-ный уровень. То есть, совпадение результатов при использовании разных методов очень высокое.

       Пробоподготовка, разработанной нами, эффективна для определения концентрации антибиотиков методом ИФА и микробиологическим методом. При этом полученные данные не ниже, а в некоторых случаях выше, чем данные, полученные при использовании пробоподготовки, рекомендуемой МУК 4.1.1912-04 и 3049-84. Например, при определении содержания остаточных количеств тетрациклина в образцах молока № 1 и № 2, тетрациклина и левомицетина в говядине.

       Данные, полученные с помощью метода ВЭЖХ при использовании пробоподготовки, разработанной нами, оказались во всех случаях ниже, чем данные, полученные с использованием пробоподготовки, рекомендованной МУК 4.1.1912-04. Сказалось отсутствие обезжиривания и экстракции.

       Следует отметить, что на сегодняшний момент методом ИФА и ВЭЖХ возможно определять только остаточные количества левомицетина и тетрациклина, тогда как на практике применяется около 50 антибиотиков и их миксов.

       Преодолеть эти недостатки позволяет микробиологический метод, для которого нами усовершенствована схема пробоподготовки, занимающая 1,5 – 2 часа, и с помощью которого можно определять остаточные количества любых антибиотиков, в том числе современных, методом подбора тест-культур.        

Для сравнения чувствительности методов ИФА, ВЭЖХ и микробиологического метода изучению на содержание остаточных количеств антибиотиков подвергались образцы молока, искусственно загрязненные различным количеством левомицетина и тетрациклина (от 0,00001 мг/кг до 1,0 мг/кг) (табл. 7).

Таблица 7

Частота обнаружения остаточных количеств левомицетина и тетрациклина различными методами в искусственно загрязненных образцах молока

Пробы молока

Количество положительных проб

Количество внесенного антибиотика, мг/л

Количество исследуемых образцов

ВЭЖХ

ИФА

Микробиологический метод

Л

Т

Л

Т

Л

Т

0,000001

10

-

-

-

-

-

-

0,00001

10

-

-

10

10

-

-

0,0001

10

-

-

10

10

-

-

0,001

10

4

5

10

10

1

3

0,01

10

10

10

10

10

10

10

0,1

10

10

10

10

10

10

10

1,0

10

10

10

10

10

10

10

Л – левомицетин, Т - Тетрациклин

       Как видно из таблицы 7, предел чувствительности для метода ВЭЖХ и микробиологического метода составляет 0,01 мг/кг, а для метода ИФА – 0,00001 мг/кг антибиотика, что совпадает с данными большинства литературных источников.

       С помощью метода ВЭЖХ только в 4-х образцах из 10-ти (40 %) был обнаружен левомицетин и в 5-ти образцах из 10-ти (50 %) тетрациклин в концентрации 0,001 мг/кг. С помощью микробиологического метода левомицетин в концентрации 0,001 мг/кг был обнаружен в 1-ом образце из 10-ти (10 %), а тетрациклин в 3-х образцах из 10-ти (30 %). Более низкие концентрации левомицетина и тетрациклина с помощью этих методов не обнаруживались.

Следовательно, ВЭЖХ и микробиологический метод определения остаточных количеств антибиотиков могут быть использованы для определения левомицетина и тетрациклина в концентрации, обусловленной требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01. Пограничное содержание левомицетина и тетрациклина в концентрации ниже 0,01 мг/кг может  быть определено с помощью метода ИФА во избежание получения ложно отрицательных результатов.

Микробиологический метод определения антибиотиков, как наиболее доступный, может использоваться для скрининговых целей, а положительные результаты, полученные с его помощью, должны служить основанием для дальнейших исследований продуктов животноводства методом ИФА или ВЭЖХ.

       

Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя, содержащих антибиотики

«Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983 г.) не  содержат рекомендаций по ветсанэкспертизе продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков. Даны лишь следующие указания: «В случае вынужденного убоя животных, подвергшихся отравлению ядовитыми веществами химического происхождения, решение о возможности использования в пищу мяса от таких животных принимается в каждом отдельном случае, с учетом степени и клинических признаков отравления животных, токсичности и остаточного количества яда, вызвавшего отравление» (п. 9.1.).

В таких случаях бактериологические и физико-химические исследования не способны решить вопрос о дальнейшей реализации продуктов убоя. Необходимо определять остаточные количества  антибиотиков (их МДУ нормируются СанПиН 2.3.2.1078-01), а также принимать решение об использовании продуктов убоя, полученных от таких животных.

Нами исследованы 140 образцов мышечной ткани крупного рогатого скота, свиней и птицы по следующей схеме: введение антибиотиков опытным животным, птице согласно наставлениям по применению препаратов → убой опытных животных, птицы в различные сроки после введения препарата, отбор образцов по ГОСТ 26668-85 → исследование образцов на содержание антибиотиков по МУ 3049-84 → термическая обработка образцов → повторное исследование образцов и бульона, полученного после варки, на содержание антибиотиков.

Результаты исследований представлены в таблице 8.

       Таблица 8

Содержание антибиотиков в мышечной ткани животных и птицы до и после проварки

Вид животно-

го

Антибиотик

Содержание в сырой мышечной ткани (100%) (М±m)

Содержание в мышечной ткани после варки

(М±m)

Содержание в бульоне (М±m)

Разруше-но (М±m)

мг/кг

мг/кг

%

мг/кг

%

%

Крупный рогатый скот

Тетрациклин n=8

0,4±0,12

0,04±0,01

9,2±3,1

0,28±0,05

70,0±2,9

20,8±4,0

Левомицетин, n=6

0,3±0,05

0,03±0,01

11,3±2,9

0,21±0,03

67,5±3,0

21,2±3,9

Свиньи

Тетрациклин

n=10

0,98±0,05

0,01±0,001

8,9±2,6

0,72±0,07

71,3±4,0

19,8±3,3

Левомицетин, n=6

0,65±0,04

0,08±0,005

12,0±3,0

0,45±0,04

70,0±1,1

18,0±5,8

Птица

Тетрациклин, n=30

0,5±0,01

0,045±0,008

9,0±2,6

0,36±0,04

71,2±2,9

19,8±4,1

Левомицетин, n=30

0,5±0,02

0,055±0,01

11,7±1,9

0,34±0,03

69,0±1,5

19,3±2,0

Гризин,

n=30

0,25±0,05

0,01±0,0

5,9±1,6

0,17±0,03

76,0±3,4

18,1±2,8

Бацитрацин,

n=20

0,2±0,04

0,015±0,0

7,3±3,0

0,15±0,03

78,2±2,2

14,5±2,1

В результате термической обработки в мышечной ткани животных и птицы значительно снижается содержание антибиотиков. В основном из мышечных волокон лекарственный препарат вместе с мышечным соком переходит в бульон, часть препарата разрушается под действием высоких температур.

По сравнению с исходным количеством после варки остается от 5,9 % (гризин в мясе птицы) до 11,7 % (левомицетин в мясе птицы) антибиотиков в мышечной ткани. В бульон переходит около 70 % первоначального содержания антибиотиков. Приблизительно 20 % от исходного количества антибиотиков разрушается в результате проварки, либо переходит в метаболиты, которые микробиологическим методом не определяются.

Бульон после варки должен быть уничтожен, так как содержит около 70 % первоначального содержание антибиотика.

       Для изучения уменьшения содержания окситетрациклина в процесе варки колбасы в условиях АО «ТАМП» согласно ГОСТ Р 52196-2003 был изготовлен опытный образец колбасы «Закусочной» из говядины, в 1 г которой содержалось 1,0±0,006 мкг окситетрациклина, что в 100 раз превышало требования СанПиН 2.3.2.1078-01. В сыром фарше содержание окситетрациклина составило 0,73±0,01 мкг/г. Уменьшение количества антибиотика в фарше по сравнению с говядиной объясняется разбавлением мышечной ткани шпиком, крахмалом и другими ингредиентами, добавляемыми по рецептуре.

В готовой колбасе «Закусочной» содержание окситетрациклина после варки равнялось 0,65±0,009 мкг/г, что составило 89 % от исходного содержания в фарше. Таким образом, снижение концентрации антибиотика в готовом изделии оказалось незначительным.

Для изготовления образцов колбасной продукции использовали также говядину жилованную, которую предварительно инъецировали растворами  следующих антибиотиков: левомицетина, бензилпенициллина, стрептомицина, тетрациклина.

Образцы продуктов были подвержены всем технологическим операциям, которые используются для изготовления колбас вареных. В таблице 9 отражено содержание антибиотиков в фарше и опытных образцах, изготовленных из него.

Таблица 9

Влияние технологических параметров (варки) на содержание антибиотиков в готовом изделии (n=6)

Объект исследования

Содержание антибиотиков, мкг/г, (М±m)

Левомицетин

Бензил-пенициллин

Стрептомицин

Тетрациклин

В сыром фарше

1,00±0,02

0,65±0,01

0,70±0,05

1,50±0,01

В готовом изделии

0,92±0,07

0,58±0,02

0,64±0,08

1,32±0,04

В % к начальному содержанию

93 %

89 %

90 %

89 %

Полученные данные позволяют предположить, что варка колбасных изделий с использованием горячего пара в термических камерах не приводит к значительному разрушению антибиотиков и не может быть рекомендована для использования мышечного сырья с содержанием антибиотиков в концентрациях, превышающих предельно допустимые.

Во всех образцах колбасных изделий содержание антибиотиков не опускалось ниже 89 % от исходного содержания в фарше.

В отличие от проварки мышечного сырья кусками в ваннах или автоклавах, при изготовлении вареных колбас  не образуется бульон, в который могла бы уходить большая часть антибиотиков. Следовательно, изготовление колбасных изделий не может быть рекомендовано для использования мясного сырья, содержащего остаточные количества антибиотиков.

Использование антибиотиков для продления сроков хранения пищевых продуктов

За последние десятилетия во многих странах мира внимание привлечено к антибиотикам как  к веществам, задерживающим в процессе хранения порчу многих пищевых продуктов: мяса, рыбы, птицы, овощей и др. Применяемые в небольших концентрациях, они способны предохранить продукты от порчи в течение определенного времени.        

В литературе встречается несколько способов применения растворов антибиотиков для консервирования сырья. Для воспроизведения методики (Mc Namara P., 2002) мы вводили в лимфатические узлы говядины сразу после убоя растворы хлортетрациклина и нистатина различной концентрации. Этими же растворами орошали говядину.

       Наибольшее снижение количества микроорганизмов наблюдалось при введении в лимфоузлы раствора, содержащего 100 мг/л хлортетрациклина и 200 мг/л нистатина - до 340 ± 19 микроорганизмов в грамме мяса, при этом в контрольной пробе содержание микроорганизмов составляло 5050 ± 24 микробных клеток в грамм мяса. При орошении говядины этим раствором количество микроорганизмов снизилось до 1190 ± 16. Применение растворов хлортетрациклина с концентрацией активного вещества 10 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л привело к аналогичным результатам.        

При использовании растворов нистатина заметного снижения количества микрофлоры не наблюдалось. Эффект был ниже, чем при использовании растворов хлортетрациклина. По-видимому, это связано с тем, что нистатин эффективен в основном против дрожжей и плесеней.

       Нами подтверждена эффективность применения растворов хлортетрациклина с концентрацией активного антибиотика 10, 50, 100 мг/л и смеси растворов хлортетрациклина 100 мг/л и нистатина 200 мг/л в соотношении 1:1 для предохранения охлажденной говядины от порчи. Однако вопрос о безопасности применения антибиотиков остается открытым. Поэтому в каждом куске обработанной говядины определяли содержание остаточных количеств антибиотиков (табл. 10).

При обработке говядины орошением остаточное количество антибиотика ниже, чем при введении в лимфатические узлы. Возможно, это связано с тем, что при орошении обрабатывается только поверхность куска, и за 24 часа антибиотик не успевает проникнуть в глубокие слои мышечной ткани. Однако, независимо от способа введения растворов, остаточные количества хлортетрациклина и нистатина значительно превышают требования СанПиН 2.3.2.1078-01. Таким образом, охлажденная говядина, подвергшаяся обработке растворами антибиотиков с целью продления сроков хранения, не может быть реализована потребителю без ограничений.

Таблица 10

Остаточные количества антибиотиков в говядине охлажденной

Концентрация раствора вводимого антибиотика

Остаточные количества антибиотиков, мг/кг, (М±m)

Введение в лимфоузлы

Орошение куска

Хлортетрациклин, 10 мг/л

0,76 ± 0,003

0,58 ± 0,01

Хлортетрациклин, 50 мг/л

4,45 ± 0,05

4,21 ± 0,02

Хлортетрациклин, 100 мг/л

8,94 ± 0,01

7,62 ± 0,09

Нистатин, 10 мг/л

0,64 ± 0,017

0,57 ± 0,024

Нистатин, 50 мг/л

4,12 ± 0,06

4,00 ± 0,003

Нистатин, 100 мг/л

6,90 ± 0,03

5,77 ± 0,015

Х + Н, 100 мг/л + 200 мг/л

24,03 ± 0,21

20,12 ± 0,05

        При применении растворов с концентрацией активного антибиотика 10 мг/л в охлажденной говядине обнаруживается 0,76 ± 0,003 мг/кг (при введении в лимфоузлы) и 0,58 ± 0,01 мг/кг (при орошении) хлортетрациклина, что недопустимо для мяса, поступающего в реализацию.

       При применении более высоких концентраций растворов антибиотиков (50, 100, 200 мг/л), рекомендуемых в литературе, остаточные количества превышают допустимые показатели в сотни и тысячи раз.        

Для снижения количества хлортетрациклина обработанные раствором  куски говядины промывали под проточной водой и замораживали в морозильной камере в течение 48 часов. Остаточные количества антибиотиков определяли на поверхности куска, на глубине 1 см и на глубине 3 см.

После промывания проточной водой в кусках говядины, которые обрабатывались введением раствора хлортетрациклина (концентрация 10 мг/л)  в лимфатические узлы, содержание антибиотика было выше, чем в кусках, которые орошались раствором. К аналогичным результатам привело замораживание кусков (рис.7).

При отборе проб после промывания говядины, обработанной введением раствора антибиотика в лимфатические узлы, содержание хлортетрациклина составило 0,57 ± 0,06 мг/кг (снизилось на 25 %). В говядине, которую орошали раствором антибиотика, содержание хлортетрациклина составило 0,51 ± 0,07 мг/кг (снизилось на 12 %).

После замораживания содержание антибиотиков снизилось еще на 23 % в говядине, обработанной введением раствора антибиотика в лимфатические узлы, и составило 0,44 ± 0,003 мг/кг хлортетрациклина, и на  21 % в говядине, которую орошали раствором антибиотика, и составило 0,40 ± 0,040 мг/кг хлортетрациклина.

Таким образом, использование для обработки говядины  раствора хлортетрациклина с концентрацией активного антибиотика 10 мг/кг позволяет достичь бактериостатического эффекта, однако после промывания водопроводной водой и замораживания остаточные количества антибиотика в мышечной ткани превышают требования СанПиН 2.3.2.1078-01. Мясо, обработанное орошением раствором хлортетрациклина, не может быть реализовано в охлажденном виде.

Рис. 7. Динамика разрушения хлортетрациклина в говядине после промывания и замораживания

Ветеринарно-санитарная оценка молока, содержащего антибиотики

При анализе молока и молочных продуктов наиболее широкое распространение за рубежом получил тест-микроб Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953, который чувствителен не только к пенициллину, но и к ряду других антибиотиков, а также отличается быстротой роста при повышенных температурах. Эта тест-система под названием Дельвотест-R в последние годы является самой распространенной при проведении анализа молока на содержание антибиотиков. Однако в наставлении по применению указана чувствительность тест-системы только к пенициллину, в то время как на практике применяется около 20 антибиотиков.

Для расширения возможностей использования тест-системы Дельвотест-R мы определяли чувствительность культуры Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953 к различным антибиотикам. Результаты определения нижнего уровня чувствительности Дельвотест-R к антибиотикам отражены в таблице 11.

Как видно из таблицы 11, тест-микроб Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953 высокочувствителен к наличию в молоке пенициллина, неомицина, гентамицина, тетрациклина, эритромицина. 

К остальным антибиотикам Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953 проявляет среднюю чувствительность или малочувствителен (олеандомицин, полимиксин, левомицетин). В их присутствии тест-система Дельвотест-R изменяет цвет при концентрациях антибиотиков, в несколько раз превышающих максимально допустимые уровни. Чтобы учесть следовые количества таких антибиотиков в молоке, результаты, полученные с помощью тест-системы Дельвотест-R, должны подтверждаться дополнительными методами.

Таблица 11

Нижний предел чувствительности Дельвотест- R к антибиотикам

Антибиотик

Нижний уровень чувствительности, мг/л

Левомицетин

0,5

Пенициллин

0,002

Тетрациклин

0,01

Линкомицин

0,04

Эритромицин

0,01

Олеандомицин

0,6

Полимиксин

0,1

Рифамицин

0,08

Неомицин

0,007

Гентамицин

0,005

Стрептомицин

0,04

Для изучения влияния температурных режимов на уменьшение содержания антибиотиков в молоке использовали образцы с естественным фоном загрязнения антибиотиками и с искусственным внесением пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина.

Пробы молока были подвергнуты всем способам пастеризации - длительной, кратковременной и мгновенной. После охлаждения в каждой пробе определяли остаточное количество антибиотика и сравнивали с первоначальным содержимым в сыром молоке. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 12.

Таблица 12

Влияние режимов пастеризации на разрушение антибиотиков в молоке

Пробы молока

Исходное содержание антибиоти-

ков,мг/л

Остаточное содержание антибиотиков в молоке

Длительная пастеризация

Кратковременная пастеризация

Мгновенная пастеризация

мг/л

(М±m)

%

мг/л

(М±m)

мг/л

(М±m)

%

Естественный фон, n=15

0,009±0,0002

0,007±0,001

77,7

0,009±0,01

100

0,009±0,001

100

Пенициллин, n=10

0,1±0,003

0,08±0,005

80

0,08±0,002

80

0,09±0,003

90

Тетрациклин, n=10

0,5±0,002

0,37±0,01

74

0,42±0,02

84

0,40±0,01

80

Стрептомицин, n=10

0,05±0,002

0,039±0,00

78

0,041±0,005

82

0,040±0,01

80

Левомицетин, n=10

1,0±0,005

0,86±0,005

86

0,90±0,01

90

0,90±0,002

90

Как видно из таблицы 12, пастеризация оказывает незначительное разрушительное действие на содержание антибиотиков в молоке. После пастеризации в молоке содержание антибиотиков составляло 74 - 100 % от исходного показателя. Максимально был подвержен разрушению тетрациклин при использовании режима длительной пастеризации. 

Из-за частичного свертывания белков и образования солей на поверхности чанов образуется осадок – молочный камень (пригар). Возможно, его образование и способствует уменьшению остаточных количеств антибиотиков в молоке, которые частично денатурируют и образуют белково-солевые комплексы, оседающие на стенках.

Результаты статистической обработки данных по содержанию остаточных количеств антибиотиков в образцах молока, подвергнутых кипячению и стерилизации, представлены в таблице 13.

Таблица 13

Влияние кипячения и стерилизации молока на разрушение антибиотиков

Образец молока

Исходное содержание антибиотика, мг/л (М±m)

Содержание антибиотиков после обработки

Кипячение

Стерилизация

мг/л (М±m)

%

мг/л (М±m)

%

Естественный фон, n = 15

0,009 ± 0,0002

0,0086±0,01

95

0,0085±0,004

95

Пенициллин,

n = 10

0,1 ± 0,003

0,090±0,001

90

0,100 ±0,05

100

Тетрациклин,

n = 10

0,5 ± 0,002

0,465±0,02

93

0,500 ±0,002

100

Стрептомицин,

n = 10

0,05 ± 0,002

0,045±0,003

90

0,046±0,005

92

Левомицетин,

n = 10

1,0 ± 0,005

0,910±0,04

90

0,945±0,03

95

Кипячение и стерилизация практически не влияют на содержание антибиотиков в молоке. После кипячения в молоке остается от 90 до 95 % исходного количества антибиотиков, то есть разрушается от 5 до 10 % их количества. После стерилизации в молоке остается от 92 до 100 % исходного количества антибиотиков. Такие данные позволяют сделать выводы о непригодности параметров кипячения и стерилизации для разрушения антибиотиков в молоке.

При сквашивании молока в конечном продукте незначительно уменьшается количество изучаемых антибиотиков. В готовом продукте остается в среднем 90,4 % от их исходного количества.

На рис. 8 диаграммами отмечено влияние различных параметров технологической обработки образцов молока на разрушение в них антибиотиков. 

Рис. 8. Влияние различной технологической обработки молока на содержание в нем остаточных количеств антибиотиков

Наибольшее снижение количества антибиотиков в образцах происходит при длительной пастеризации. Возможно это связано с наиболее длительным влиянием на антибиотики высокой температуры, которая приводит к коагуляции белков и оседанию их вместе с антибиотиком на стенках емкостей.

В наименьшей степени антибиотики разрушаются под действием стерилизации. В молоке остается от 92 до 100 % антибиотиков от исходного количества.

Кратковременная и мгновенная пастеризация приводят к разрушению приблизительно 12 % количества антибиотиков, что эффективнее, чем кипячение и сквашивание, после которых в образцах молока остается от 90 до 100 % от исходного количества антибиотиков.

       

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована методология ветеринарно-санитарного контроля сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков, и предложены пути их технологической обработки, позволяющие снизить количество антибиотиков до безопасного уровня.

2. Установлено, что сырье и продукты животного происхождения импортного и отечественного производства, отобранные на предприятиях, в лабораториях и на рынках г. Москвы, могут содержать остаточные количества антибиотиков.

Антибиотики в количествах, превышающих МДУ, встречаются в мышечной ткани индейки в 72,7 % исследованных проб, в грудках куриных – в 18,5 % проб, в печени куриной – в 26,6 % проб, в желудках куриных – в 63,1 % проб, в фарше курином – в 41,6 % проб, в яйцах куриных – в 33,2 % проб, в мышечной ткани крупного рогатого скота и свиней соответственно в 8 % и 16,9% исследованных проб, в печени крупного рогатого скота и свиней соответственно в 10,6 % и 16,9 % проб, в почках крупного рогатого скота и свиней соответственно в 14,4 % и 23,2 % проб, в молоке и молочных продуктах – от 47,6 % до 100 % проб, в рыбе морской – в 38,8 % проб.

Частота загрязнения отечественных образцов мяса птицы составила 12,5%, импортных - 20 %, субпродуктов птицы отечественного производства - 42,5 %, импортного - 45,5 %, мяса свиней соответственно – 15 и 17,5 %. Отечественная говядина содержала антибиотики в 4 % случаев, импортная - в 9,3 %. Отечественный сыр твердый содержал антибиотики в 25 % случаев, импортный - в 100 % случаев.

3. Из 2075 исследованных проб сырья и животноводческой продукции в 391 (18,8 %) были обнаружены антибиотики, из них тетрациклин - в 344 пробах (16,6 % всех исследованных образцов), левомицетин – в 21 пробе (1,0 %), стрептомицин – в 17 пробах (0,8 %), пенициллин – в 7 пробах (0,3 %), гризин – в 2 пробах (0,01 %).

В 88 % случаев выявления антибиотиков был обнаружен тетрациклин, в 5,4 % - левомицетин, в 4,3 % - стрептомицин, в 1,8 % - пенициллин, в 0,5 % - гризин.

4. Определена чувствительность бактериальных штаммов B.subtilis L2, B.mycoides 537, B.pumilus NCTC8241, S.aureus 209-P, S.aureus ATCC 6538, M.luteus ATCC 9341, Str.thermophilus, Str.faecium к следующим антибиотикам: бензилпенициллину, тетрациклину, неомицину, гентамицину, спектиномицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину. Установлено, что штаммы B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 являются чувствительными к наибольшему количеству исследованных антибиотиков.

5. Модифицирована микробиологическая методика с использованием бактериальных штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341. С помощью штамма B.subtilis L2 по диаметру зоны задержки роста вокруг бумажного диска, пропитанного экстрактом мышечной ткани или молока, возможно определить в субстрате наличие тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, гризина, бензилпенициллина. С помощью штамма M.luteus ATCC 9341 – наличие левомицетина и бацитрацина.

Установлено, что оптимальной средой для культивирования штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 является перевар Хоттингера с содержанием 120 –140 мг% аминного азота с добавлением 1% глюкозы, рН среды 7,2 – 7,4. Плотность инокулюма для получения сплошного газона должна составлять 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл культуральной жидкости. Величина инокулюма – 1 мл на одну чашку Петри. Температура культивирования – 35 – 37С.

6. Усовершенствована пробоподготовка мышечной ткани и молока при определении в них антибиотиков, которая заключается в гомогенизации пробы, экстрагировании антибиотика ацетоном в соотношении 1:1 с дальнейшим центрифугированием экстракта при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Она обеспечивает максимальное извлечение антибиотиков, сопоставимое с существующим (МУК 4.1.1912-04 и МУ 3049-84), снижает затраты времени и средств.

       

7. Показано, что модифицированный нами микробиологический метод и метод ВЭЖХ позволяют определять антибиотик в диапазоне 0,01 - 100 мг/кг. Коэффициент корреляции результатов определения концентрации левомицетина и тетрациклина в мышечной ткани и молоке модифицированным микробиологическим методом и методом ВЭЖХ составил 0,80. Иммунохимический метод твердофазного ИФА позволяет определять антибиотик в диапазоне 0,0001 - 100 мг/кг. Коэффициент корреляции результатов определения концентрации левомицетина и тетрациклина в мышечной ткани и молоке модифицированным микробиологическим методом и методом ИФА составил 0,92. Более чувствительный метод ИФА может использоваться для выявления проб с низким содержанием антибиотиков.

8. Установлено, что микробиологическая тест-система Дельвотест-R чувствительна к присутствию в молоке пенициллина, неомицина, гентамицина, тетрациклина, эритромицина в количествах, регламентированных СанПиН 2.3.2.1078-01.  В присутствии линкомицина, рифамицина, стрептомицина олеандомицина, полимиксина, левомицетина цвет тест-системы изменяется при концентрации активного антибиотика выше МДУ. Чтобы учесть следовые количества таких антибиотиков в молоке, результаты, полученные с помощью тест-системы Дельвотест-R, должны подтверждаться дополнительными методами.

9. Проварка говядины и свинины кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч в открытых котлах при достижении температуры внутри куска не менее 80С, а тушек птицы - 1 ч позволяет снизить исходное количество антибиотиков на 85 – 90 %. 15 – 20 % исходного количества антибиотиков разрушается в процесе варки, около 70 % переходит в бульон.

При изготовлении вареных колбас из сырья, содержащего антибиотики в количествах, превышающих предельно допустимые, в готовом изделии остается от 89 до 93 % исходного количества антибиотика. Термохимический способ изготовления колбас не приводит к заметному снижению количества антибиотиков.

Промывание мяса приводит к снижению содержания антибиотика на 12 – 25 % в зависимости от способа его введения. После замораживания количество антибиотика снижается на 21 – 23 %.

10. На основании проведенных исследований мы предлагаем следующую ветеринарно-санитарную оценку мяса: при обнаружении остаточных количеств антибиотиков, превышающих максимально допустимый уровнь в 1,5 – 2 раза, мясо можно обработать промыванием с последующей замораживанием. При более высоком содержаниии антибиотиков  рекомендутся проварка мяса при общепринятых технологических режимах с последующим изготовлением низкосортных вареных колбас.

11. При использовании режимов  длительной пастеризации молока (63 - 65С в течение 30 мин) количество антибиотиков снижается на 14 – 26 % в зависимости от вида антибиотика, при использовании режимов кратковременной (75 - 80С в течение 15 – 20 с) и мгновенной (80 - 90С без выдержки) пастеризации молока количество антибиотиков снижается на 0 – 20 %. При кипячении происходит снижение количества антибиотиков на 5 – 10 %, при стерилизации – на 0 – 8 %, при сквашивании в среднем на 10 %. На основании проведенных исследований мы предлагаем следующую ветеринарно-санитарную оценку молока: при обнаружении остаточных количеств антибиотиков молоко должно подвергаться разбавлению с последующей пастеризацией или может использоваться в качестве дополнительного кормового средства.

12. Усовершенствованный ветеринарно-санитарный контроль за содержанием остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения призван способствовать получению потребителем животноводческой продукции, отвечающей требованиям стандартов качества и безопасности по содержанию антибиотических препаратов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы по обоснованию путей снижения содержания антибиотиков в животноводческом сырье включены в рекомендации по совершенствованию ветеринарно-санитарного контроля сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков, и представлены в Департамент ветеринарии для рассмотрения.

Материалы мониторинга по изучению распространения сырья и продуктов животного происхождения, загрязненных остаточными количествами антибиотиков, использованы в плане мероприятий государственной ветеринарной службы г. Москвы по исключению из оборота на потребительском рынке столицы животноводческой продукции, содержащей антибиотики (письмо Комитета ветеринарии г. Москвы от 19.02.2008).

Результаты работы могут быть использованы  в практической деятельности научно-исследовательских учреждений и производственных лабораторий при определении качественных и количественных показателей содержания антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения и при решении вопросов о дальнейшей их реализации.

Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации для специалистов научно-исследовательских учреждений и лабораторий, занимающихся вопросами ветеринарно-санитарного контроля мяса и мясопродуктов:

- «Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения» (2005г.);

- «Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341» (2005г.);

- «Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков» (2006 г.);

-«Методические рекомендации по определению антибиотиков в продуктах животноводства методом высоковольтного электрофореза» (2006 г.).

- «Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии» (2008 г.).

- «Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания» (2008 г.).

Изданы учебные пособия для студентов ветеринарных и технологических факультетов высших учебных заведений, курсов повышения квалификации и практических специалистов по ветсанэкспертизе:

- «Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики» - М.: МГУПБ, 2005. – 98 с.;

- «Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства» - М.: МГУПБ, 2005. – 93 с.

Материалы экспериментальных исследований используются в учебном процессе при подготовке ветеринарных и ветеринарно-санитарных врачей, технологов, специалистов пищевой биотехнологии, слушателей курсов повышения квалификации по курсам ветсанэкспертизы, производственного ветеринарного контроля, ветсанэкспертизы с основами технологии производства продуктов животного происхождения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Кальницкая О.И. Оптимальные среды и режимы культивирования микроорганизмов // Научный вестник ЛГАВМ. – Львов. – 2000. - С. 112-114.
  2. Кальницкая О.И. О качестве и безопасности пищевых продуктов // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 4-ой международной научно-практической конференции. – М., 2002. – С. 54-55.
  3. Кальницкая О.И. Ветеринарно-санитарные требования к качеству продуктов убоя животных // Практик. – 2003. - № 6.
  4. Кальницкая О.И. Определение потенциально опасных химических соединений в продуктах убоя животных и птицы // Пища. Экология. Человек: Материалы 5-ой международной научно-технической конференции. – М. - 2003. – С. 244-245.
  5. Кальницкая О.И. Проблемные аспекты использования антибиотиков в ветеринарии и животноводстве // Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции. – Чебоксары. - 2004. – С. 4-8.
  6. Кальницкая О.И. Экспериментальное определение чувствительности споровых тест-культур к наиболее распространенным антибиотикам // Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции. – Чебоксары. - 2004. – С. 8-11.
  7. Кальницкая О.И. Антибактериальные препараты и их определение в животноводческой продукции // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 5-ой международной научно-практической конференции. – М. - 2004. – С. 163-165.
  8. Кальницкая О.И. Нитрофураны как ксенобиотики лекарственного происхождения // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 5-ой международной научно-практической конференции. – М. - 2004. – С. 165-166.
  9. Кальницкая О.И. Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения: методические рекомендации (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.05). – М.: МГУПБ, 2005. – 18 с.
  10. Кальницкая О.И. Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341: методические рекомендации (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.05). – М.: МГУПБ, 2005. – 6 с.
  11. Кальницкая О.И. Влияние остаточных количеств антибиотиков на результаты ветсанэкспертизы продуктов животноводства // Оптимальное питание – здоровье нации: 8 Всероссийский Конгресс. - М., ГУ НИИ питания РАМН. - 2005. - С. 110.
  12. Кальницкая О.И. Использование антибиотиков в ветеринарии и животноводстве // Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы: Материалы международной конференции. - М., ФГУ ВГНКИ, 2005. – С. 51 – 53.
  13. Кальницкая О.И. Новые направления использования антибиотиков в пищевой промышленности // Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы: Материалы международной конференции. - М., ФГУ ВГНКИ, 2005. – С. 53 – 54.
  14. Кальницкая О.И. Определение остаточных количеств антибиотиков в мышечной ткани птицы // Мясная индустрия. – 2005. - № 12. - С. 35-37.
  15. Кальницкая О.И. Проблема применения антибиотиков // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Материалы международной конференции. – Саратов, ИБФРМ РАН. -  2005. - С. 132-133.
  16. Кальницкая О.И. О необходимости ветеринарного контроля за остаточными количествами антибиотиков в продукции животноводства / Кальницкая О.И., Кунаков А.А., Серегин И.Г. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Материалы научно-практической конференции. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 89-90.
  17. Кальницкая О.И. Антибиотики в мясных продуктах питания / Кальницкая О.И., Мулюкова А.П. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Материалы научно-практической конференции. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 88-89.
  18. Кальницкая О.И. Экологические аспекты производства пищевых продуктов // Пищевые технологии-2005: Материалы международной научно-практической конференции. – Одесса, ОНАПТ. – 2005. - С. 130-131.
  19. Кальницкая О.И. К вопросу о безопасности питания // Материалы 3 съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. -  М. – 2005. - С. 151.
  20. Кальницкая О.И. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, применяемым в ветеринарии и животноводстве // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии: сборник научных трудов. - М. – 2006. – Т. 118. – С. 149-155.
  21. Кальницкая О.И. Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства: учебное пособие. – М.: МГУПБ, 2006. – 93 с.
  22. Кальницкая О.И. Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики: Учебное пособие. – М.: МГУПБ, 2006. – 99 с.
  23. Кальницкая О.И. Нормативные акты в области обеспечения безопасности сырья / Кальницкая О.И., Баранов М.А. // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 4 международной научной конференции. М., МГУПБ. – 2005. - С. 199-201.
  24. Кальницкая О.И. Лекарственные средства как возможные контаминанты продукции животноводства // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Материалы международного симпозиума. - Казань, ФГУ ФЦТРБ-ВНИВИ. – 2005. - С. 165-169.
  25. Кальницкая О.И. Методы определения антибиотиков в продуктах животноводства // Научное обеспечение инновационных процессов в перерабатывающей отрасли: сборник трудов, посвященный 75-летию ВНИИМП им. В.М. Горбатова. - М. – 2005. - С. 19-21.
  26. Кальницкая О.И. Современные методы определения антибиотиков // Ветеринария. – 2006. - №6. -  С. 54-56.
  27. Кальницкая О.И. Гигиенические аспекты проблемы использования лекарственных препаратов в животноводстве // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии: Материалы международной научно-практической конференции. - М., ВИЭВ. – 2006. - С. 608-609.
  28. Кальницкая О.И. Нормативная база по организации питания детей // Актуальные проблемы педиатрии:  Х Конгресс педиатров России. – М. -  2006. - С. 239.
  29. Кальницкая О.И. Влияние канцерогенных веществ на качество сельскохозяйственной продукции и здоровье человека / Кальницкая О.И., Ильина А.Г. // Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза: Материалы международного симпозиума. – Казань -  2006.- С. 41-47.
  30. Кальницкая О.И. Ветеринарный контроль за остаточными количествами антибиотиков в животноводческой продукции / Кальницкая О.И., Мулюкова А.Н. // Эффективное животноводство. Изд-во «ЭФПИТ».
  31. Кальницкая О.И. Контроль безопасности пищевых продуктов с помощью современных методов исследования / Кальницкая О.И., Иванова Г.В. // Технология и продукты здорового питания: Материалы международной научно-практической конференции. - М., МГУПП. – 2006. -С. 28-31.
  32. Кальницкая О.И. Уровень обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, полученных из отечественного и импортного сырья / Туник А.Н., Уша Б.В., Кальницкая О.И. // Ветеринария. – 2007. - № 4. – С. 48-53.
  33. Кальницкая О.И. Особенности регионального мониторинга продуктов питания, содержащих антибиотики / Кальницкая О.И., Розанова И.И., Кипин Е.Н. // Диетология: проблемы и горизонты: 1-й Всероссийский съезд диетологов и нутрициологов. - М. – 2006. - С. 44-45.
  34. Кальницкая О.И. Законодательное обеспечение работ в РФ по недопущению в пищу продовольственного сырья, содержащего ксенобиотики / Кальницкая О.И., Петрова Е.И. // Качество, стандартизация, контроль: теория и практика: Материалы  6-ой международной научно-практической конференции. – Ялта. -  2006. -  С. 57-60.
  35. Кальницкая О.И. Влияние антибиотиков, обнаруженных в продуктах животноводства, на здоровье человека / Кальницкая О.И., Петрова Е.И. // Качество, стандартизация, контроль: теория и практика: Материалы  6-ой международной научно-практической конференции. – Ялта. -  2006. – С. 60-63.
  36. Кальницкая О.И. Оценка степени риска при применении антибиотиков в пищевой промышленности / Кальницкая О.И., Кунаков А.А., Серегин И.Г. // Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемости: Материалы  8-ой международной научно-практической конференции. - М., ВНИИМП. – 2006. - С. 67-68.
  37. Кальницкая О.И. Влияние остаточных количеств антибиотиков на безопасность продуктов животноводства / Чубарова Е.А., Кальницкая О.И. // Материалы 6-ой международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М., МГУПБ. – 2007. - С. 233-234.
  38. Кальницкая О.И. Влияние способов пробоподготовки на степень извлечения антибиотиков из биологических субстратов // Ветеринария, № 1, 2008, с. 58-60.
  39. Кальницкая О.И. Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10.06) / Кальницкая О.И., Уша Б.В. // Ветеринарный консультант. – 2007. - № 3 (142). - С. 11-14.
  40. Кальницкая О.И. Методические рекомендации по определению антибиотиков в продуктах животноводства методом высоковольтного электрофореза (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10.06)  / Кальницкая О.И., Петрова Е.И. // Ветеринарный консультант. – 2007. - № 6 (145). - С. 7-10.
  41. Кальницкая О.И. Методические рекомендации «Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии» (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 06.02.08) / Кальницкая О.И. // Ветеринарный консультант. – 2008. - № 6 (169). - С. 8 - 9. 
  42. Кальницкая О.И. Методические рекомендации «Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания» (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 06.02.08) Кальницкая О.И. // Ветеринарный консультант. – 2008. - № 6 (169). - С. 9 - 11. 
  43. Кальницкая О.И. Влияние параметров термической обработки мяса на уменьшение в нем остатков антибиотиков // Ветеринарная патология. – М., № 2 (24), 2008, с. 120 –125.
  44. Кальницкая О.И. Характеристика антибиотиков, попадающих в молоко и молочные продукты // Молочная промышленность. – М., № 6, 2008, с. 82 – 83.
  45. Кальницкая О.И. Подбор микробных тест-культур к антибиотикам // Ветеринарная патология. М., № 2 (24), 2008, с. 125 –129.
  46. Кальницкая О.И. Ветеринарно-санитарная оценка мяса животных и птицы, содержащего антибиотики // Аграрный вестник Урала (в печати).





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.