WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ДОНЧЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ

ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Новосибирск 2008

Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии

Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии (ИЭВСиДВ)

Научный консультант:  доктор ветеринарных наук, профессор

Смолянинов Юрий Иванович

Официальные оппоненты:  доктор ветеринарных наук, профессор

Ноздрин  Григорий Антонович, 

доктор ветеринарных наук, профессор

Колычев Николай Матвеевич,

доктор медицинских наук, профессор

Краснов Владимир Александрович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Казанская государственная академия

ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Защита состоится «___» ________ 2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» _________ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                         Г.М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наукой и практикой достигнуты определенные успехи в борьбе с туберкулезом сельскохозяйственных животных, однако, эта инфекция остается одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии.

Научно обоснованное планирование противоэпизоотических мероприятий  невозможно без их экономического анализа. В публикациях по экономическим аспектам туберкулеза животных в основном приведены данные, полученные в условиях ведения животноводства до 1990 г., и касаются они частных вопросов экономических потерь, затрат на оздоровительные мероприятия и их экономической эффективности. Комплексные исследования, раскрывающие экономическое значение туберкулеза в современных условиях сельскохозяйственного производства, отсутствуют. Между тем, во многих развитых странах в рамках  целевых программ искоренения туберкулеза животных давались комплексные экономические оценки, во многом способствующие эффективному проведению противоэпизоотических мероприятий. Так, например, экономическое обоснование ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота было дано в США (I. Steele, A. Ranney, 1958), Швейцарии (G. Fluckiger, 1965), Франции (M. Brochart, 1979), Венгрии (L. Denes, 1981), Италии (G. Ghilardi, 1982).

Основополагающими в системе противотуберкулезных мероприятий являются аллергическая диагностика с точным учетом показаний размера кожной складки, а также бактериологическая, включающая культивирование микобактерий на питательных средах. В связи с этим создание новых ветеринарных приборов для прижизненной диагностики туберкулеза, а также питательных сред, отличающихся высокими ростовыми свойствами, представляется весьма актуальным.

Современное направление диагностики туберкулеза – молекулярно-генетическое (ПЦР), бурно развивающееся как в медицине, так и ветеринарии. Актуальным при этом является разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных (А.Н. Шаров, В.А. Седов, 1998; А.Н. Шаров с соавт., 2000, 2003; М.С. Калмыкова и др., 2006; K. Moller et al., 1998; M. Hassan-King et al., 1999; T.-M. Zhang, G.-H. Mei, 1999; Zhao Jin-Rong et al., 1999).

В процессе разработки оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных был проведен ряд исследований по применению туберкулостатика изониазида как в чистом виде, так и в различных формах, однако, результаты их не нашли широкого применения ввиду низкой эффективности и нетехнологичности введения в организм, в связи с чем актуально конструирование новых препаратов, исключающих указанные недостатки (Н.Н. Зинина, 1989; Д.Д. Новак, Н.Н. Зинина, 1995; Д.Н. Мингалеев, М.А. Сафин, 2004, 2005).

Другим направлением специфической профилактики туберкулеза животных является иммунизация вакциной БЦЖ, но ее эффективность, как показала практика, невысока. Усиление иммуногенности вакцины БЦЖ связано с сочетанным использованием различных иммуномодулирующих препаратов (А.С. Донченко, 1989; Г.П. Протодьяконова, 1990; И.Д. Александров, 1995–2000; И.П. Хабузов, 1999). Изыскание новых иммуномодуляторов предопределяет актуальность продолжения исследований по повышению протективных свойств вакцины БЦЖ, а также использование ее для выявления анергичных к туберкулину животных.

Цель и задачи исследований. Цель исследований – усовершенствовать методы и средства диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

Задачи исследований:

  – дать ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации;

  – разработать плотную и жидкую питательные среды для культивирования микобактерий на основе минерального комплекса растительного происхождения;

– усовершенствовать методику постановки ПЦР для дифференциации микобактерий на основе геномного полиморфизма;

– разработать электронный кутиметр для оценки аллергических реакций на внутрикожное введение животным туберкулинов;

– изучить особенности фармакокинетики, свойства и эффективность  препарата ниазон для профилактики туберкулеза животных;

– изучить влияние иммуномодулирующих препаратов РНК ридостина и полирибоната на протективные свойства вакцины БЦЖ при сочетанном применении  для профилактики туберкулеза телят;

– дать экономическую оценку системы противотуберкулезных мероприятий.

Научная новизна и теоретическая значимость. Дан ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в РФ, масштабно показано экономическое значение туберкулеза в современных условиях ведения животноводства (экономический ущерб, затраты на оздоровительные мероприятия и их экономическая эффективность). Получены новые данные об эпизоотологическом значении телят, анергичных к туберкулину, – опасных источников распространения возбудителя туберкулеза. Предложены: метод выявления анергичных к туберкулину телят с использованием вакцины БЦЖ и система диагностических мероприятий, позволяющая снять ограничения по туберкулезу на фоне проявления неспецифических реакций на туберкулин.

Разработаны: автоматизированная система эпизоотологического мониторинга туберкулеза животных для оперативного контроля противотуберкулезных мероприятий и библиотека программ для автоматизации учета  пересеваемых культур микроорганизмов, их биологических характеристик и контроля сроков пересевов с использованием  «Электронного журнала учета культур».

Усовершенствована тест-система ПЦР для выявления возбудителя туберкулеза из биоматериала реагирующих на туберкулин животных. На основе анализа геномного полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ампликонов синтезированы генетические праймеры для дифференциации микобактерий туберкулезного комплекса от атипичных.

Разработаны новые плотная и жидкая питательные среды для культивирования микобактерий с использованием минерального комплекса растительного происхождения (вытяжка из золы древесины березы, оксидат торфа, криалл). Сконструирован обладающий неоспоримыми преимуществами перед имеющимися типами электронный кутиметр для оценки аллергических реакций на внутрикожное введение животным туберкулинов.

Испытан новый туберкулостатический пролонгированного действия препарат ниазон для профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в системе оздоровительных мероприятий. В эксперименте изучены его токсичность, пирогенность, бактериостатическая концентрация в крови, дозы и схема применения. В производственных условиях доказана противоэпизоотическая эффективность ниазона.

Теоретически обосновано и в серии экспериментальных  исследований  показано усиление иммунного ответа у телят, вакцинированных БЦЖ совместно с  иммуномодулирующими препаратами ридостин и полирибонат. Предложен способ профилактики туберкулеза у телят при сочетанном использовании вакцины БЦЖ и иммуномодуляторов.

  Научная новизна исследований защищена патентами на изобретения:

1. RU 2190417 C2 от 10.10.2002 г. «Средство снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных препаратов».

2. RU 2192472 С2 от 10.11.2002 г. «Среда для культивирования микобактерий туберкулеза».

3. RU 32984 U1 от 10.10.2003 г. на полезную модель «Кутиметр».

4. RU 2231972 С1 от 10.07.2004 г. «Кутиметр».

5. RU 2300559 С2 от 10.06.2007 г. «Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза».

Результаты исследований вносят существенный теоретический и практический вклад в решение проблемы туберкулеза животных и могут быть использованы при совершенствовании системы противотуберкулезных мероприятий, а также в учебном процессе вузов. 

Практическая значимость и внедрение результатов исследований.

В практику планирования и организации противотуберкулезных мероприятий внедрены автоматизированная система эпизоотологического мониторинга и экономического анализа эффективности профилактики и ликвидации туберкулеза. Внедрение разработанной схемы снятия ограничений по туберкулезу на фоне проявления неспецифических туберкулиновых реакций позволило оздоровить 72 неблагополучные по туберкулезу фермы.

Новые плотная и жидкая питательные среды на основе минерального комплекса растительного происхождения позволяют на 5–6 суток сократить срок бактериологической диагностики туберкулеза. Разработанный электронный кутиметр дает возможность качественно и технологично оценивать показания внутрикожной туберкулиновой пробы у животных.

Разработана схема оздоровления неблагополучных по туберкулезу хозяйств с использованием на взрослых животных химиопрофилактического препарата ниазон и специфической профилактики туберкулеза телят вакциной БЦЖ с иммуномодуляторами. Пролонгированный противотуберкулезный препарат ниазон с положительным эффектом апробирован в системе противотуберкулезных мероприятий на поголовье 7,9 тыс. гол. крупного рогатого скота 35 ферм региона Сибири.

Результаты исследований отражены в шести нормативно-технических документах федерального уровня, регламентирующих оздоровительные и профилактические мероприятия при туберкулезе животных, и в пяти региональных методических рекомендациях. Шесть завершенных научных разработок включены в каталоги информационных материалов по научному обеспечению реализации приоритетного национального проекта «Развитие АПК в Сибири» (Новосибирск, 2006, 2007).

  Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (1992–2007), международных, федеральных и региональных научно-практических конференциях: «Основные научные направления по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. животных» (Новосибирск, 1995), «Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики» (Махачкала, 1997), «Проблемы адаптации животных» (Новосибирск, 1997), «Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы» (Гродно, 1997), «Развитие агропромышленного комплекса в зонах рискованного земледелия» (Новокузнецк, 1998),  «Проблемы стабилизации и развития с.-х. производства Сибири, Монголии и Казахстана в ХХI веке (Новосибирск, 1999), «Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии» (Новосибирск, 2000), «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, 2000), «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии» (Краснодар, 2001), «АПК Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Улан-Батор, 2001), «Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана» (Абакан, 2002), «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей» (Покров, 2002), «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004), «Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики» (Алматы, 2005), на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных болезней» (Казань, 2005), на 1-ом Международном ветеринарном конгрессе (Алматы, 2002), на Сибирском международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005), на научной сессии ДО Россельхозакадемии (Благовещенск, 1995).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 54 научные работы, в том числе 1 монография и 11 статей в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук», «Биотехнология», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринарная патология»)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах, иллюстрирована 76 таблицами, 18 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (569 источников, в том числе 119 зарубежных) и приложений.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Усовершенствованные методы и средства диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и их эффективность.
  2. Методы профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием препарата ниазон и вакцины БЦЖ с РНК-имму-номодуляторами.
  3. Экономическая оценка системы противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.

2. СОБСТВЕННЫЕ  ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1992–2007 гг. в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН в соответствии с тематическими планами НИР: Д.01.02. «Разработать и внедрить способы повышения иммуногенности вакцины БЦЖ с применением стимуляторов иммунитета» (1991–1995), 02.05. «Разработать новые способы лабораторной диагностики туберкулеза на основе ДНК-зондов и твердых питательных сред» (1996–2000), 03.03. «Разработать и внедрить новую высокоэффективную комплексную систему контроля эпизоотического процесса туберкулеза в стадах крупного рогатого скота с использованием специфической - и химиопрофилактики» (1997–2000), 01.01. «Теоретически обосновать, разработать и предложить для реализации в ветеринарной практике систему эпизоотологического мониторинга по туберкулезу с целью совершенствования противоэпизоотических мероприятий» (2001–2005).

В опытах использовали крупный рогатый скот, кроликов, морских свинок, белых мышей и крыс. Группы опытных и контрольных лабораторных животных формировали по принципу аналогов, содержали с соблюдением правил, норм кормления, ухода (И.П. Западнюк и др., 1974) и гуманного обращения. Лабораторных животных декапитировали спирт-эфиром.

В опытах с заражением животных использовали музейные, официально зарегистрированные штаммы культур патогенных и атипичных микобактерий, хранящиеся и регулярно поддерживаемые (пересевы на питательные среды, пассажи на лабораторных животных): M.bovis (шт. 8, 14, BCG); M.tuberculosis (шт. H37Rv «Академия»); M.avium (шт. 780); M.kansasii, M. fortuitum, M.smegmatis. Кроме того, использовали штаммы микобактерий, изолированные нами в различные периоды от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств Сибири.

В процессе исследований из диагностических препаратов использовали различные серии ППД-туберкулинов для млекопитающих производства Курской биофабрики, тест-систему ПЦР для идентификации и дифференциации M.bovis и M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции производства «Нарвак» (М., 2004, 2005). 

Учитывая богатый минеральный состав и наличие большого количества биологически активных веществ, в качестве добавок при экспериментальном конструировании новых питательных сред использовали компоненты биологического и неорганического происхождения: суспензию из сухих пекарских дрожжей (ГОСТ 171–81), соевое молоко (ТУ 9222–002–10126 558–94), оксидат торфа (ТУ 88 БССР 135–88), криалл (производное торфогуминовых удобрений) и специально приготовленный минеральный комплекс – вытяжку из золы древесины березы, сыворотку крови лошади. За основу и в качестве контроля взяты технологии приготовления стандартных питательных сред Финн-2, Гельберга и Левенштейна-Йенсена, Сотона.

В опытах на лабораторных животных и в производственном испытании использовали вакцину БЦЖ различных серий производства НИИ вакцин и сывороток (г. Ставрополь), иммуномодуляторы полирибонат (поливедрин) – односпиральная РНК, ридостин (индуктор интерферона) – двухспиральная РНК. Иммуномодуляторы получены в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Бердск, Новосибирской обл.).

Экспериментально-производственные исследования проведены в 65 благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Сибири.

Выполнены следующие объемы диагностических исследований: аллергические (на крупном рогатом скоте и лабораторных животных) – 118 тыс.; патолого-анатомические – 3,7 тыс., бактериологические (включая биопробу на лабораторных животных) – 690.

В процессе исследований использовали следующие методы:

– монографический и аналитический – при анализе научной литературы отечественных и зарубежных исследователей по проблеме туберкулеза животных, включающей вопросы, освещаемые в диссертационной работе;

– эпизоотологический – при анализе эпизоотической ситуации и изучении особенностей эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота (А.А. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин, 1984; С.И. Джупина, А.А. Колосов, 1991);

– статистико-экономический – при анализе экономической эффективности противотуберкулезных мероприятий (по авторской методике);

– аллергический (согласно «Наставлению по применению ППД-туберкулинов для млекопитающих и птиц», 1999) – на крупном рогатом скоте хозяйств и лабораторных животных, инфицированных культурами микобактерий;

– патолого-анатомический (согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», 1986, 2002) – на крупном рогатом скоте для сканирования результатов аллергических исследований и отбора проб биоматериала; на лабораторных животных – в опытах с заражением культурами микобактерий. Экспертизе подвергали лимфатические узлы и паренхиматозные органы. Индекс пораженности туберкулезом органов определяли по методикам Ю.К. Вейсфеллера (1975), А.А. Триус (1976);

– бактериологический (согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», 1986, 2002 и «Методам лабораторной диагностики туберкулеза», ГОСТ 26072–89) (СТ СЭВ 3457–81). В культуральном методе использовали плотные (Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л, Петраньяни,  среда ИЭВСиДВ) и жидкие (Сотона, Школьниковой, Павловского) питательные среды. Культурально-биохимические свойства изолированных кислотоустойчивых микобактерий изучали во второй генерации роста после накопления бактериальной массы с предварительной проверкой на чистоту визуально и в мазках. Учет и оценку выросших колоний культур микобактерий проводили по схеме Г.Н. Першина (1971).

Методику постановки ПЦР, в том числе ПЦР-ПДФР, усовершенствовали с целью индикации патогенных микобактерий из биоматериала от животных и их дифференциации от атипичных.

Пролонгированную форму химиопрофилактического препарата ниазон готовили на основе производного гидразид изоникотиновой кислоты – изониазида производства фирмы AMSAL CHEM PVT LIMITED (Индия). Свойства противотуберкулезного препарата ниазон, полученного путем иммобилизации изониазида и гидрозон изониазида на водорастворимых полимерах, изучали по показателям острой и хронической токсичности, анафилактогенности, тератогенности, эмбриотоксичности, мутагенности. Фармакокинетику в сыворотке крови и бактериостатическую активность препарата определяли в опытах на кроликах и телятах. Кроме того, изучали влияние ниазона на проявление аллергических реакций у животных и его действие на ультраструктуру микобактерий. Для изучения возможности снижения токсичности ниазона использовали натриевую соль ДНК из молок лососевых рыб.

Протективные свойства вакцины БЦЖ при совместном использовании с иммуномодулирующими препаратами изучали по показателям динамики гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ), индекса и характера пораженности туберкулезом внутренних органов лабораторных животных, белкового спектра сыворотки крови, реакции специфического лизиса лейкоцитов крови, напряженности клеточного иммунитета в реакции бласттрансформации лимфоцитов (В.В. Хоробрых с соавт., 1983).

Цифровой  материал обрабатывали в программе Microsoft Excel по показателям средних значений (M±m), достоверности разницы опытных и контрольных данных (Р) и коэффициента корреляции (r).

Подробные схемы опытов, методов и методик исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.

Отдельные исследования выполнены совместно с А.С. Донченко,  Ю.И. Смоляниновым, В.Н. Донченко, Ю.С. Аликиным, Т.Н. Давыдовой, А.А. Колосовым, Г.П. Протодьяконовой, С.В. Иониной, М.Ш. Азаевым,  Е.В. Козеевым, В.И. Околеловым.

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

  Эпизоотическая ситуация в РФ

  Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота за последний период в РФ, несмотря на ухудшение эпидемиологической обстановки, неуклонно улучшается. Так, с 1990 по 2006 г. количество неблагополучных пунктов в стране сократилось с 1124 до 99, или в 11,4 раза (рис. 1), заболевших животных – с 116,2 до 5,3 тыс. гол., т. е. в 22 раза, очаговость – в 2 раза,  пораженность туберкулезом туш - в 17,3 раза. 

В 2006 г. туберкулез крупного рогатого скота регистрировался в 6 федеральных округах РФ из 7 (85,7%), в том числе в 22 субъектах (24,7%.).

Анализ показал, что наиболее неблагополучным является Южный федеральный округ, где туберкулез регистрируется в 9 (69,2%) субъектах РФ. В Сибирском федеральном округе туберкулез регистрируется в 3 субъектах РФ (21,4%), на долю которых приходится 29 % общего количества неблагополучных пунктов, зарегистрированных в Российской Федерации. Не регистрируется туберкулез в Северо-Западном федеральном округе, на грани оздоровления находится Дальневосточный регион страны.

В ряде субъектов РФ (Московская, Орловская, Ростовская, Курганская, Тюменская области, Республика Мордовия) выявлено несоответствие данных ветеринарно-санитарной экспертизы мясокомбинатов и рынков, уровня неблагополучия и заболеваемости туберкулезом, что требует уточнения эпизоотической обстановки по туберкулезу в хозяйствах, у животных которых при ветеринарно-санитарной экспертизе выявлены характерные для туберкулеза поражения.

Автоматизированная система

эпизоотологического мониторинга (АСЭМ)

Автоматизированная система эпизоотологического мониторинга разработана для оптимизации сбора, хранения, обработки и анализа эпизоотологической информации в масштабах субъектов РФ и входящих в них административных территорий с целью эффективного и оперативного контроля противоэпизоотических мероприятий.

Критерии оценки эпизоотической ситуации отобраны на основе многолетних традиционных методов эпизоотологического мониторинга и ранее разработанных критериев и рекомендаций по технологии противотуберкулезных мероприятий, а также нормативно-технической документации, регламентирующей мероприятия при туберкулезе животных.

По запросу пользователя в качестве вычисляемых характеристик АСЭМ  выдает за любой временной отрезок по любой административной территории в цифровом и графическом исполнении такие показатели, как распространенность, уровень неблагополучия, количество исследованных животных, инцидентность, заболеваемость, пораженность туш и др.

Совершенствование методов и средств диагностики туберкулеза

  Диагностика туберкулеза у ареактивного к туберкулину

  молодняка крупного рогатого скота

Одной из причин ареактивности молодняка крупного рогатого скота к туберкулину является врожденная толерантность в результате инфицирования  возбудителем туберкулеза в ранний постнатальный период жизни.

  Для решения вопроса в научно-производственном опыте в шести хозяйствах Новосибирской области телят в возрасте до 12 дней иммунизировали вакциной БЦЖ и через 45 дней исследовали внутрикожно ППД-туберкулином для млекопитающих. При этом процент не реагирующих на туберкулин телят колебался в пределах 0,6–16,7 (в среднем 6,1). При повторной иммунизации через 45 дней количество не реагирующих телят снизилось до 3,9% (0,6–13,6%). Отсутствие реакций на туберкулин у части иммунизированных БЦЖ телят, а также зараженных патогенным возбудителем туберкулеза, свидетельствует об иммунологической толерантности.

Опыт продолжили в условиях экспериментальной  базы ИЭВСиДВ СО РАСХН, на которой разместили животных трех групп по 5 голов в каждой. Первую группу составили телята, дважды (после первой вакцинации и допрививки) не реагирующие на туберкулиновую пробу, вторую – вакцинированные БЦЖ за 3 мес. до постановки опыта, третью – не вакцинированные (контроль). Через 3 недели всех телят заразили вирулентной культурой M.bovis (шт. 14, ВНИИБТЖ) орально в дозе 0,1 мг/кг живой массы.

Установлено, что исследованные в различных диагностических тестах  (РСК, туберкулиновая проба) ареактивные животные реагировали на протяжении опыта (9 мес.) менее интенсивно и в меньшем количестве. При патолого-анатомических исследованиях наиболее обширные, вплоть до генерализации, туберкулезные поражения во внутренних органах и лимфатических узлах установлены у ареактивных к туберкулину телят.

Таким образом, часть инфицированных возбудителем туберкулеза телят в ранний постнатальный период не реагируют на внутрикожное введение туберкулина в возрасте 7–8 мес. У таких животных развиваются тяжелые формы поражений, они на протяжении длительного времени являются скрытыми источниками распространения возбудителя туберкулеза.

Указанная схема ранней диагностики туберкулеза с использованием вакцины БЦЖ апробирована в производственных условиях на 3112 телятах. При этом через 45 дней после вакцинации БЦЖ телят в возрасте до 14 дней не реагировало на туберкулин в среднем 7,1%, с колебаниями от 0,7 до 16,8% по отдельным фермам, причем это явление наблюдали на 10 из 13 экспериментальных фермах.

Через 45–60 дней после повторной вакцинации не реагировало на туберкулин  в среднем 21,7% телят на шести фермах, или 1,5% от числа первично вакцинированных в возрасте до 14 дней. Большинство этих телят отставали в росте, были ослаблены, а при убое у них обнаружены во внутренних органах и лимфатических узлах  туберкулезные поражения.

Таким образом, результаты производственного испытания подтвердили данные опытов по выявлению больных туберкулезом ареактивных к туберкулину телят при повторной вакцинации БЦЖ. Такие животные являются весьма опасными источниками распространения инфекции.

  Питательные среды на основе минерального комплекса

  растительного происхождения для культивирования микобактерий

Учитывая богатый минеральный состав и наличие большого количества биологически активных веществ, в качестве добавок при экспериментальном конструировании новых питательных сред использовали компоненты биологического и неорганического происхождения: суспензию из сухих пекарских дрожжей (ГОСТ 171–81), соевое молоко (ТУ 9222–002–10126 558–94), оксидат торфа (ТУ 88 БССР 135–88) и приготовленный нами минеральный комплекс – вытяжку из золы древесины березы.

За основу были взяты технологии приготовления оригинальных плотных питательных сред Финн–2, Гельберга и Левенштейна-Йенсена, наиболее часто применяемых в ветеринарной бактериологической практике для диагностики туберкулеза у разных видов животных.

В серии экспериментов были приготовлены и испытаны 52 варианта плотных питательных сред с использованием компонентов биологического и неорганического происхождения: суспензии из сухих пекарских дрожжей,  соевого молока, оксидата торфа и приготовленного минерального комплекса – вытяжки из золы древесины березы (в различных концентрациях, соотношениях компонентов, способах стерилизации и внесения, значениях рН). В результате испытаний отобрали оптимальный вариант, названный «Питательная среда ИЭВСиДВ».

Установлено, что питательная среда ИЭВСиДВ, содержащая в своем составе минеральный комплекс из вытяжки золы древесины березы и оксидат торфа в определенных концентрациях, при сравнительной дешевизне обладает лучшими ростовыми свойствами в сравнении с коммерческими средами (табл. 1).

При посеве культур M. bovis  на среду ИЭВСиДВ срок первичного роста составляет 6,2, M. tuberculosis – 5,3 суток, что вдвое меньше, чем на средах Финн-2 и Фаст-3Л. При посеве биоматериала от экспериментально зараженных M. bovis  лабораторных животных на среду ИЭВСиДВ  срок первичного роста сокращается на 4,1 – 6,7 (на 29 – 38%), от больного туберкулезом крупного рогатого скота – на 4,8 – 8,7 суток (на 23 – 29%). При культивировании M. avium и атипичных микобактерий (M. smegmatis) не выявлено преимуществ среды ИЭВСиДВ в сравнении с коммерческими средами

Т а б л и ц а  1 – Сравнительная характеристика показателей роста (сутки)

микобактерий на коммерческих питательных средах и среде ИЭВСиДВ

Культура,

биоматериал

Финн–2

ФАСТ–3Л

ИЭВСиДВ

первич-

ный

интен-

сивный

первич-

ный

интен-

сивный

первич-

ный

интен-

сивный

M. bovis (шт. 8, ВИЭВ)

10,1±0,2

16,3±0,6

11,5±0,2

18,3±0,2

6,2±0,1

11,4±0,6

M. tuberculosis (шт. Н37Rv)

9,1±0,4

15,1±0,6

11,4±0,3

17,3±0,3

5,3±0,2

8,1±0,2

M. avium (шт. 780, ВИЭВ)

9,3±0,5

13,1±0,8

7,1±0,3

11,3±0,6

10,4±1,6

13,5±2,4

M. smegmatis (ИЭВСиДВ)

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

Биоматериал от морских

  свинок (M. bovis)

14,6±0,3

23,7±0,5

17,2±1,1

24,4±1,6

10,5±0,3

13,2±0,5

Биоматериал от крупного

  рогатого скота (M. bovis)

21,4±0,9

25,3±0,9

23,1±1,0

26,7±1,0

16,6±0,6

19,5±0,9

  Сконструированная новая жидкая питательная среда, с включением в состав способствующих стимуляции роста микобактерий туберкулеза вытяжки из золы древесины березы, криалла и сыворотки крови лошадей, позволяет, в сравнении с оригинальной средой Сотона, получить первичный рост  M. bovis  раньше на 6 суток (на 43%), M. tuberculosis – на 8 (на 58%), а интенсивный рост обоих видов возбудителя – на 8 суток (на 37 – 40%).

Метод седиментации при обработке биоматериала от животных

для бактериологического исследования на туберкулез

Результативность бактериологического исследования на туберкулез во многом зависит от предварительной обработки биоматериала. В ветеринарной бактериологической практике чаще всего используются методы Гона (Гона-Левенштейна-Сумиоши), Аликаевой и флотации.

В исследованиях использовали такой физический прием, как седиментация, т.е. расслоение дисперсных систем под действием силы тяжести с отделением дисперсной фазы в виде осадка, необходимое для обогащения жидкодисперсной части гомогенизата микроорганизмами, высвобожденными из биологического материала от животных.

Процесс седиментации осуществляли в два этапа. Ткани биоматериала (пробы внутренних органов и лимфатических узлов) разрезали на кусочки размером 0,5 см3, помещали в ступку и заливали 6%-ным раствором щавелевой кислоты в соотношении 1:6. Через 20 – 30 мин. кислоту сливали, кусочки пробы промывали в течение 5 мин. дистиллированной водой, меняя ее  3 раза. Отмытые кусочки тканей растирали со  стерильным песком. Гомогенизат разбавляли физраствором (1:15) и проводили первичную седиментацию в течение 3, 4, 5 и 6 мин. Установлено, что полное оседание крупных частиц гомогенизата при первичной седиментации наступает через 5 мин.

Для освобождения жидкодисперсной части гомогенизата от примесей проводили вторичную седиментацию в течение 1, 2, 3, и 4 мин. При этом жидкодисперсную часть, полученную после первичной седиментации в ступке, переносили в бактериологические пробирки. Наибольшее количество высвобожденных микобактерий туберкулеза и меньшее – примесей при повторной седиментации наблюдается через 3 мин. Жидкодисперсную часть после вторичной седиментации центрифугировали при 3500 об/мин. в течение 20 мин., надосадочную жидкость сливали, а обогащенный возбудителем туберкулеза осадок использовали для бактериологического исследования.

Для сравнительного анализа эффективности предварительной обработки биоматериал от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств (пробы внутренних органов, лимфатические узлы) обрабатывали тремя методами: Гона, Аликаевой и предложенным нами методом двойной седиментации. Биоматериал высевали на питательную среду Левенштейна-Йенсена. 

Из биоматериала, обработанного методом двойной седиментации, культуры микобактерий выросли в 89 пробирках (49,4%), т.е. рост культур был на 36,6% больше, чем при обработке по методу Гона, и на 36,1% больше, чем при обработке по методу Аликаевой (табл. 2). При этом загрязненность посевов сопутствующей микрофлорой  в сравнении с методом Гона была ниже в 3,4 раза, Аликаевой – в 7,5 раза.

Т а б л и ц а  2 – Влияние способов предварительной обработки биоматериала

на высеваемость микобактерий туберкулеза и загрязненность посевов

Метод  обработки

биоматериала

Засеяно

пробирок

Рост культур

Загрязненность посевов

пробирок

%

пробирок

%

Гона

Аликаевой

Двойной седиментации

180

180

180

23

24

89

12,8

13,3

49,4

24

53

7

13,3

19,4

3,8

Таким образом, при использовании для посева на питательные среды жидкодисперсной суспензии биоматериала, полученной двойной седиментацией в течение 5 и 3 мин., значительно повышается высеваемость микобактерий и достигается высокая чистота роста возбудителя туберкулеза.

Усовершенствование методики постановки ПЦР

  в диагностике туберкулеза

Учитывая результаты достижений молекулярно-генетической диагностики инфекционных болезней, в том числе туберкулеза, методом ПЦР провели исследования по усовершенствованию методики постановки реакции, позволяющей выявить возбудителя туберкулеза непосредственно в биоматериале от больных туберкулезом животных. Основным требованием к праймерам являлись специфичность и способность выявлять комплекс патогенных микобактерий.

Исходя из результатов исследований с патогенными (M. bovis, M. tuberculosis, M. avium) и атипичными (M. smegmatis, M. flavium, M. triviale, M. flaviscens) микобактериями, наиболее информативным следует считать метод выделения ДНК микобактерий, включающий предварительную обработку биоматериала от животных двойной седиментацией тканей с последующим жестким режимом обработки образцов хлороформом и фенолом. Предложенная реакционная смесь (100 мкл смеси состоит из 10 мкл 10-кратного буфера, 4 мкл 5 мМ dNTP, 8 мкл праймера, 66 мкл Н2О и 2 мкл Таg-полимеразы) для проведения амплификации по качественным показателям не уступает классической прописи, но более доступна и проста. Для постановки ПЦР с ДНК микобактерий, выделенных из биоматериала от животных, необходимо 40 циклов амплификации. При такой кратности циклов продукт ПЦР синтезируется в достаточном количестве для качественного проведения и контроля электрофореза. Предложенный метод позволяет выделить ДНК микобактерий из биоматериала уже через 7 дней после инфицирования морских свинок патогенными и атипичными микобактериями. При анализе образцов биоматериала от больного туберкулезом крупного рогатого скота методом ПЦР с использованием ДНК микобактерий отмечены высокая чувствительность и специфичность, превосходящие аналогичные показатели при культуральном методе исследования. При температуре отжига праймеров 68°С неспецифические реакции ПЦР на ДНК непатогенных микобактерий исчезают.

Одним из вариантов ПЦР-генетического типирования микроорганизмов является анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ампликонов, получаемых с помощью специфических праймеров. Методы, выявляющие геномный полиморфизм, обладают рядом преимуществ перед традиционными подходами при идентификации возбудителя болезней.  С учетом этого провели исследования по выяснению возможности выявления специфических праймеров для дифференциации патогенных культур микобактерий. В работе использовали данные EMBL/Gen FGH Bank/DDB c проведением предварительного анализа нуклеотидных последовательностей разных видов патогенных микобактерий. Для анализа в программах OLIGI и DIROM был осуществлен подбор и синтез специфических праймеров для референтных штаммов культур патогенных видов микобактерий (M.bovis, шт. BCG; M.bovis, шт. 8; M.tuberculosis, шт. Н37Rv; M.avium, шт. 19).

Проанализировав вставки нуклеотидных последовательностей M.bovis, M.bovis BCG и M.tuberculosis, выделили ДНК микобактерий из референтных штаммов и эпизоотических культур. Установлено, что предельный срок хранения ДНК микобактерий составляет 6 мес. при t –18°С. Выбраны и синтезированы два специфических праймера для предварительной дифференциации микобактерий туберкулезного комплекса от атипичных видов,  а также два специфических праймера для постановки ПЦР-ПДРФ, фланкирующих фрагмент вставки  IS 6110 в 1289 нуклеотидных пар (н.п.).

Анализ полученных в ПЦР-ПДРФ генетических профилей с помощью праймеров рестриктазы Alu1 выявил характерный для M.tuberculosis фрагмент в 504 н. п., отсутствующий у M.bovis и M.bovis BCG, а в генетическом профиле M.bovis – фрагмент в 307 н. п., отсутствующий у M.tuberculosis и M.bovis BCG.

Электронный кутиметр для оценки внутрикожной аллергической

реакции на введение туберкулиновых препаратов

При аллергической диагностике туберкулеза у разных видов животных обязательным является измерение толщины кожной складки после введения туберкулинов. С этой целью отечественное приборостроение выпускает несколько видов линейных и циферблатных кутиметров, однако они не дают четких показаний, и их невозможно использовать без дополнительной подсветки в темное время суток и в помещениях с недостаточным освещением.

Нами разработано новое техническое решение электронного кутиметра (рис. 2) для аллергической диагностики туберкулеза животных, производственное испытание которого показало его технологичность и надежность в использовании, точность и стабильность результатов промеров кожной складки как в условиях животноводческих помещений при любом световом режиме и освещении, так и на открытом воздухе.



Рисунок 2 – Цифровой ветеринарный кутиметр

  Снятие ограничений по туберкулезу на фоне проявления

неспецифических реакций на туберкулин

К настоящему времени система профилактики и ликвидации туберкулеза сформировалась и в целом оказывает положительное влияние на эпизоотическую обстановку. Однако, возникают нестандартные ситуации,  требующие корректировки и дополнений ряда положений, регламентирующих противотуберкулезные мероприятия. Так, часто проявление неспецифических туберкулиновых реакций наблюдается на фоне неблагополучия стад по туберкулезу, когда эти реакции, ввиду сложной дифференциации, учитываются как специфические. Оздоровление таких ферм по общепринятым критериям, предусмотренным санитарными и ветеринарными правилами, недостижимо.

Основанием для проведения комплекса дополнительных исследований с целью снятия ограничений должно явиться отсутствие туберкулезных поражений во внутренних органах и лимфатических узлах при убое реагирующих на туберкулин животных в течение последнего года.

Согласно разработанной схеме, критерием благополучия фермы по туберкулезу является получение 4-кратных отрицательных результатов патолого-анатомических и бактериологических исследований биоматериала от реагирующих на туберкулин животных. Схема предусматривает ежеквартальные, в течение года, аллергические исследования поголовья на туберкулез, убой всех реагирующих на туберкулин животных с ветеринарно-санитарной экспертизой внутренних органов и лимфатических узлов и бактериологическое исследование биоматериала.

Если на любом этапе исследований туберкулез при убое реагирующих на туберкулин животных подтвержден или выделен возбудитель из биоматериала, применение схемы прекращают и продолжают проводить оздоровительные мероприятии. При получении 4-кратных отрицательных результатов патолого-анатомических и бактериологических исследований ферму признают благополучной по туберкулезу, и после проведения заключительных мероприятий снимают ограничения.

Разработанная схема диагностических исследований апробирована в 48 неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Сибири, с которых в течение года сняты ограничения. Рецидивов инфекции не отмечено.

Совершенствование методов и средств профилактики туберкулеза

Эффективность профилактического туберкулостатического

препарата ниазон при туберкулезе крупного рогатого скота

Общая характеристика

Ниазон представляет собой прозрачный вязкий водный раствор светло-желтого цвета, в состав которого входят изониазид, гидразон изониазида, полимер-пролонгатор метилцеллюлоза, стабилизатор трилон Б, антимикробные вещества – производные параоксибензойной кислоты и вода для инъекций в определенном соотношении. Препарат получают путем иммобилизации изониазида и гидразона изониазида на водорастворимом полимере.

Ниазон после длительного (в течение 1 года) хранения при комнатной температуре в защищенном от света месте не изменил цвет и не расслоился, а изменение основных параметров (рН, суммарное содержание активно действующего вещества – изониазида, массовое соотношение глюкозил-изониазида и изониазида) находилось в пределах нормативных требований.

Токсикологическая характеристика

Опыт по определению острой токсичности ниазона на 48 самцах белых мышей показал, что тяжесть клинических симптомов и время гибели животных находятся в прямой зависимости от дозы препарата, а ЛД50 препарата составляет 796,0±124,8 мг/кг живой массы. Признаки интоксикации у мышей наступали через 30–40 мин. после введения ниазона в летальных дозах. На основании результатов опыта, согласно ГОСТ 12.1.007–76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности», ниазон относится к препаратам 3-го класса опасности – вещества умеренно опасные.

Важным показателем безопасного применения бактериостатических препаратов является также индекс широты терапевтического действия, определяемый делением максимально переносимой дозы (ЛД0) на величину ориентировочно-профилактической дозы. Исходя из этого, максимально переносимая доза ниазона составляет 300 мг/кг, а ориентировочно- профилактическая – 20 мг/кг. При соотношении этих показателей терапевтический индекс для ниазона составляет 15, что указывает на широкий предел безопасного применения препарата для химиопрофилактики туберкулеза животных.

В длительном токсикологическом эксперименте (9 мес.) на самцах крыс линии «Вистар» изучили хроническую токсичность ниазона при подкожном введении в дозе 20 мг/кг живой массы по схеме: 4 раза через 10 дней, далее - ежемесячно. Установлено, что ниазон не вызывает существенных изменений гематологических показателей (Р>0,05), в том числе содержания гемоглобина, количества эритроцитов и лейкоцитов в сравнении с контрольными животными и не вызывает нарушений антитоксической функции печени. Средняя продолжительность «гексеналового сна» крыс опытной (3378±40 сек.) и контрольной (3328±56,3 сек.) групп достоверно не отличалась. 

Показатели эмбрионального материала (количество желтых тел беременности, живых и мертвых плодов, пол, масса,  длина эмбрионов) опытных и контрольных крыс достоверно не отличались (Р>0,05), т. е. ниазон не обладает тератогенным и эмбриотоксическим действием на организм самок. Продолжительность эстрального цикла, общая эмбриональная, доимплантационная и постимплантационная смертность эмбрионов опытных крыс не превышали показатели контрольных, что свидетельствует об отсутствии гонадотоксических свойств и повышении доминантных летальных мутаций.

Фармакокинетика ниазона в сыворотке крови

Фармакокинетику активной фракции ниазона – изониазида определяли на 10 кроликах и 10 телятах 5–6-месячного возраста по методу О. Волленберга в модификации Р.И. Шендеровой (1975). Ниазон вводили подкожно, однократно, в дозе 20 мг/кг живой массы.

Установлено, что максимальное содержание изониазида в сыворотке крови содержится на 5-е сутки после введения препарата – 5,8 мкг/мл у кроликов и 8,6 мкг/мл у телят. Бактериостатический уровень (0,8–1,0 мкг/мл) изониазида у кроликов сохранялся до 8, у телят – до 10 дней, что учтено нами в дальнейшем при разработке схемы применения ниазона.

Бактериостатическая активность

В опыт отобрали 24 морские свинки  и сформировали 3 группы по 8 голов в каждой. Морским свинкам 1-й опытной группы  инъецировали ниазон в дозе 20 мг/кг живой массы и через 5 дней заразили их культурой M.bovis (шт. 14, ВНИИБТЖ) в оттитрованной дозе – 0,00001 г. Животным 2-й опытной группы ниазон ввели одновременно с заражением. Морских свинок 3-й группы заразили без применения препарата ниазон (контроль). Ниазон вводили лабораторным животным каждые 10 дней 4 раза, в дальнейшем – 1 раз в месяц, в течение 5 месяцев.

В ходе опыта все контрольные морские свинки пали в течение 2 мес. с генерализованными формами поражений туберкулезом внутренних органов. Животных 1–2-й опытных групп декапитировали через 6 мес. после заражения на фоне применения ниазона. При патолого-анатомическом исследовании характерных для туберкулеза изменений во внутренних органах опытных животных не установлено. Посев биоматериала на среду Финн–2 также не дал положительного результата.

В опыте на крупном рогатом скоте 5 телятам перед заражением ввели подкожно в область нижней трети шеи ниазон в дозе 20 мг/кг живой массы, 5 телят были контрольными (без применения ниазона). Всех телят заразили per os оттитрованной культурой M.bovis (шт. 14, ВНИИБТЖ) в дозе 0,15 мг/кг живой массы. Телятам опытной группы ниазон вводили 4 раза через 10 дней, в дальнейшем – 1 раз в месяц. Ежемесячно опытных и контрольных животных аллергически исследовали на туберкулез.

Согласно результатам аллергических исследований, животные контрольной группы (без применения ниазона) начали реагировать на внутрикожное введение туберкулина через 1 мес. после заражения утолщением кожной складки на 8,8±2,1 мм. У телят опытной группы этот показатель был достоверно ниже – 2,7±0,6 мм (Р<0,05) , т.е. не в диагностическом параметре. При последующих исследованиях у животных контрольной группы величина среднего утолщения кожной складки несколько уменьшилась через 6 мес. после заражения, однако оставалась высокой для диагностического титра – 6,2±1,2 мм.

Через 6 мес. после заражения всех телят опытной и контрольной групп подвергли убою. При ветеринарно-санитарной экспертизе у телят, которым вводили ниазон, характерных для туберкулеза поражений внутренних органов и лимфатических узлов не обнаружено, а при бактериологическом исследовании биоматериала исходная культура заражающего штамма возбудителя туберкулеза не выделена. При этом у всех контрольных телят, зараженных M.bovis и не подвергавшихся химиопрофилактике ниазоном, на вскрытии обнаружены туберкулезные поражения в различных лимфатических узлах, а при бактериологическом исследовании изолирована культура заражающего агента.

Таким образом, введение ниазона в соответствии с разработанными дозой и схемой обеспечивает 100%-ю профилактическую защиту морских свинок и молодняка крупного рогатого скота при заражении вирулентной культурой M. bovis.

Аллергизирующие свойства ниазона и влияние его на ультраструктуру

  микобактерий

В опытах на морских свинках установлено, что ниазон не обладает аллергизирующим действием и не оказывает отрицательного влияния на капиллярную проницаемость кожи, а также не угнетает аллергическую реактивность организма к туберкулину при заражении культурой M. bovis.

Изучение субмикроскопической организации микобактерий при электронной микроскопии показало, что в зависимости от дозы ниазона происходят глубокие изменения морфологической структуры возбудителя, приводящие к его гибели. Так значительные изменения субмикроскопической организации М.bovis отмечены при концентрации ниазона 0,9 мкг/мл. Форма клеток микобактерий варьирует от округлой до звездчатой, клеточная стенка теряет трехслойное строение и выявляется как одноконтурная структура, цитоплазматическая мембрана фрагментирована и не имеет четких очертаний, цитоплазматическая мембрана и клеточная стенка разделены обширным периплазматическим пространством, цитоплазма клеток неравномерной плотности, разрежена, плотный гранулярный компонент скапливается в разных участках клетки, нуклеотид четко не определяется.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности беспрепятственного длительного применения ниазона для профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

  Средство снижения токсичности ниазона

Учитывая высокую иммуномодулирующую активность препаратов ДНК, способствующих индукции интерферона в организме и являющихся сильными адаптогенами, повышающими сопротивляемость организма, в качестве средства снижения токсичности ниазона испытали натриевую соль ДНК из молок лососевых рыб (дешевое и доступное сырье).

Исследования на 80 белых мышах показали, что острая токсичность ниазона при совместном применении с натриевой солью ДНК из молок рыб снижается при всех параметрах ЛД с увеличением дозы препарата по действующему веществу (изониазиду) в среднем на 12,4%.

Техника введения ниазона в организм

Ниазон крупному рогатому скоту вводят шприцем Жанэ подкожно в область нижней трети шеи животного в карман, образующийся при оттягивании кожи, через кровобрательную иглу № 2652 или № 2651 с переходным резиновым шлангом, из расчета 0,2 мл/кг живой массы, молодняку – в кожный карман переднего края лопатки.

Испытание ниазона в системе оздоровительных мероприятий

Ниазон в системе противотуберкулезных мероприятий испытан в 35 неблагополучных по туберкулезу фермах на 7,9 тыс. гол. крупного рогатого скота. Препарат вводили не реагирующим на ППД-туберкулин для млекопитающих животным подкожно в дозе 20 мг/кг живой массы каждые 10 дней, затем ежемесячно в течение 4 – 7 месяцев.

С учетом эпизоотической ситуации по туберкулезу на отдельных фермах, кратность введения ниазона составила 8–11 раз, или 8,6 раза в среднем на одну ферму. Все фермы после прекращения выявления реагирующих на туберкулин животных и при отрицательных результатах патолого-анатоми-ческих и бактериологических исследований, предусмотренных санитарными и ветеринарными правилами, а также после проведения заключительных мероприятий были оздоровлены и с них сняты ограничения по туберкулезу. Срок оздоровления ферм составил 12–16 мес. (13,7 мес. в среднем). Повторных вспышек туберкулеза в оздоровленных фермах не регистрировали.

  Повышение протективных свойств вакцины БЦЖ

с помощью иммуномодуляторов

В качестве иммуномодуляторов повышения протективных свойств вакцины БЦЖ испытывали препараты рибонуклеиновой кислоты (РНК): полирибонат (поливедрим) – односпиральная РНК; ридостин (индуктор интерферона) – двухспиральная РНК. Иммуномодуляторы получены в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор».

Физико-химические, пирогенные, токсические, анафилактогенные и другие свойства полирибоната и ридостина изучены ранее Ю.С. Аликиным (1992–1995), в связи с чем подробно изложим результаты собственных экспериментов, проведенных совместно с Протодьяконовой Г.П., по изучению влияния этих препаратов на повышение иммуногенных свойств вакцины БЦЖ при туберкулезе животных.

  Полирибонат

Влияние полирибоната на иммуногенные свойства вакцины БЦЖ изучали в опыте на 180 морских свинках, разделенных на 18 групп. Всех животных иммунизировали вакциной БЦЖ и заразили оттитрованной дозой M.bovis (шт. 14, ВНИИБТЖ). Морским свинкам 3–17-й групп одновременно с вакцинацией внутримышечно вводили полирибонат в различных дозах (30, 50 и 65 мг на голову). Повторно полирибонат вводили в указанных дозах в сроки от 12 до 16 сут.

Результаты исследований показали, что все животные, зараженные без предварительной иммунизации вакциной БЦЖ (1-я группа), пали в среднем в течение 78 сут. с характерными для туберкулеза поражениями внутренних органов. Средняя продолжительность жизни морских свинок, иммунизированных вакциной БЦЖ без полирибоната, составила 96 сут.

Наибольшая продолжительность жизни после заражения (убиты через 145 сут.) отмечена в группах животных (3–17), привитых БЦЖ в сочетании с дробным введением полирибоната. Наименьшую пораженность внутренних органов опытных животных наблюдали в 9–11 группах.

Увеличение дозы полирибоната до 100 мг на голову при однократном введении существенно не повлияло на защитные свойства вакцины БЦЖ.

Таким образом, наибольшая степень иммунной защиты морских свинок от заражения возбудителем туберкулеза бычьего вида достигается при иммунизации их вакциной БЦЖ в сочетании с дробным введением иммуномодулятора полирибоната в дозе 30 мг на голову через 14 дней.

Влияние полирибоната на протективные свойства вакцины БЦЖ изучали  на 15 бычках 10–12-дневного возраста, сформированных в 4 группы. Животных 1-й группы (3 гол.) не вакцинировали (контроль), 2-й (4 гол.) – иммунизировали БЦЖ в дозе 1 мг на голову, внутрикожно. Бычков 3-й группы вакцинировали БЦЖ в сочетании с однократным внутримышечным введением полирибоната в дозе 1 мг/кг живой массы, 4-й – в сочетании с дробным введением полирибоната по схеме: первый раз одновременно с вакциной в дозе 0,5 мг /кг, второй – через 14 дней в той же дозе.

Через 2,5 мес. после вакцинации всех бычков заразили вирулентной культурой возбудителя туберкулеза – M.bovis (шт. 14, ВНИИБТЖ) в дозе 0,15 мг/кг живой массы. Через 5 мес. после заражения все животные были убиты, проведены ветеринарно-санитарная экспертиза внутренних органов, лимфатических узлов и бактериологическое исследование биоматериала.

Результаты опыта показали, что лучший протективный эффект от заражения возбудителем туберкулеза отмечен в группе животных, иммунизированных вакциной БЦЖ с дробным введением полирибоната с интервалом 14 дней. Результаты патолого-анатомических и бактериологических исследований свидетельствовали, что эти телята не заразились туберкулезом. При иммунизации БЦЖ в сочетании с однократным введением полирибоната в дозе  1 мг/кг живой массы характерные для туберкулеза поражения при убое были найдены у одного животного (25%).

Среди телят, вакцинированных БЦЖ без иммуномодулятора, туберкулез при убое установлен у двух (50%) и у одного теленка – по результатам бактериологического исследования биоматериала. У всех контрольных животных (только заражение) при убое зарегистрирован туберкулез, причем у двух отмечена генерализация туберкулезного процесса.

Иммунизация телят БЦЖ вызывала повышение интенсивности фагоцитарной активности нейтрофилов, выявленное в опсонофагоцитарной реакции, наиболее высокий показатель наблюдали у иммунизированных телят в сочетании с дробным введением полирибоната, что свидетельствует о повышении неспецифической резистентности организма.

Полученные данные послужили основанием для проведения производственного испытания вакцины БЦЖ с полирибонатом в одном из неблагополучных по туберкулезу районов Новосибирской области. Результаты производственного испытания показали, что до применения вакцины БЦЖ с иммуномодулятором полирибонат при проверке уровня напряженности иммунитета через 45–60 дней не реагировало на туберкулин в целом 15,2% телят (табл. 3). Сочетанное применение вакцины БЦЖ и полирибоната позволило снизить этот показатель до 0,3%. Результаты производственного испытания подтвердили полученные нами экспериментальные данные о повышении протективных свойств вакцины БЦЖ при сочетанном использовании с полирибонатом.

Т а б л и ц а  3 – Сравнительная оценка напряженности иммунитета у телят,

  вакцинированных БЦЖ и БЦЖ с полирибонатом

Год

Вакцинировано БЦЖ, гол.

Исследовано

туберкулином через 45 дней

Не реагировало на туберкулин

гол.

%

Вакцинация БЦЖ без полирибоната

1992

1993

11325

10021

10215

9311

1854

1381

15,5

14,8

Всего

21346

19526

2965

15,2

Вакцинация БЦЖ с полирибонатом

1994

1995

10254

10876

9587

10025

35

22

0,4

0,2

Ридостин

В опыте на 175 морских свинках установлено, что сочетанное применение вакцины БЦЖ и ридостина значительно снижает степень поражения внутренних органов при заражении вирулентной культурой M.bovis. При этом все животные остались живы (срок наблюдения 140 дн.)

В опыте на кроликах (25 гол.) индекс пораженности органов и показатели специфического лизиса лейкоцитов в крови были также ниже у зараженных животных на фоне предварительного применения БЦЖ и ридостина, а протеинограмма (общий белок, альбумины, 1 и 2- глобулины, - глобулины и иммуноглобулины класса G1 и G2) существенно не отличалась от показателей контрольных животных, что свидетельствовало о сбалансированности анаболических и катаболических процессов.

Таким образом, совместное применение вакцины БЦЖ и иммуномодуляторов РНК полирибоната и ридостина повышает клеточный и гуморальный иммунитет, что приводит к увеличению иммуногенности вакцины и препятствует заражению возбудителем туберкулеза.

Экономическая оценка системы противотуберкулезных мероприятий

В методологическом отношении экономические исследования при различных болезнях животных предусматривают изучение следующих основных показателей: причиняемого экономического ущерба, затрат на оздоровительные мероприятия и их экономической эффективности. Разноречивость данных и различные методические подходы предопределили необходимость исследований в новых экономических условиях ведения животноводства и изменившейся структуры экономических потерь при туберкулезе.

Экономический ущерб

Исходя из клинического проявления туберкулеза и специфики оздоровительных мероприятий, обоснованы и разработаны формулы расчета отдельных видов потерь в их структуре. Расчеты по разработанной методике показали, что экономический ущерб, причиняемый туберкулезом крупного рогатого скота, составляет в среднем 14361,3 руб. на одно заболевшее животное (табл. 4).

Т а б л и ц а  4 – Структура и коэффициенты  экономического ущерба

при туберкулезе крупного рогатого скота

Вид экономического ущерба

На одно заболевшее животное

руб.

доля

ущерба, %

потери

продукции, кг

Сокращение срока эксплуатации коров

Убой некондиционного молодняка

Утилизация туш

Снижение качества мяса

Потери приплода

Снижение качества молока

Потери молока при пастеризации

Потери молока при туберкулинизации

1571,5

779,0

378,4

319,2

794,0

9220,7

1024,6

273,9

10,9

5,4

2,7

2,2

5,6

64,2

7,1

1,9

3,42 (молоко)

0,31 (жив. масса)

0,15 (жив. масса)

0,13 (жив. масса)

0,55 (голов)

20,00

2,23

0,60

ВСЕГО:

14361,3

100,0

Наибольшие потери (64,2%) обусловлены снижением качества молока при дополнительной вынужденной пастеризации в неблагополучных хозяйствах и сокращением срока продуктивного использования коров (10,9%). При этом от одного больного туберкулезом животного теряется в среднем 26,3 ц молока, 59 кг мяса в живой массе и 0,55 головы приплода. В племенных хозяйствах экономический ущерб повышается в среднем на 57%.

Используя показатели динамики эпизоотической ситуации (заболеваемость, движение неблагополучных пунктов, пораженность туш и др.), с учетом разработанных коэффициентов рассчитали объемы экономического ущерба, причиняемого туберкулезом крупного рогатого скота, в Российской Федерации за 1961–2003 гг., т.е. за 43 года. Для сопоставимости данных расчеты представлены в ценах на сельскохозяйственную продукцию 2005 г.

За указанный период в России выявлено и убито на мясоперерабатывающих предприятиях 5 млн 876,2 тыс. голов больного туберкулезом крупного рогатого скота. Наибольший экономический ущерб от туберкулеза в стране отмечен в 1963–1989 гг. с колебаниями от 1,5 до 3,5 млрд руб. в отдельные годы. С 1990 г. прослеживается устойчивое равномерное снижение объемов экономического ущерба, который достиг минимального значения в 2002 г. (99,2 млн руб.). Суммарный экономический ущерб, причиненный туберкулезом крупного рогатого скота экономике животноводства России за период анализа, превысил 84,9 млрд руб. При этом потеряно более 15,3 млн т молока, 1,6 млн т мяса и 3,5 млн голов приплода.

Затраты на оздоровительные мероприятия

Специфика оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота предусматривает следующие основные виды затрат: диагностические исследования, пастеризация молока, дезинфекция объектов животноводства, санитарный ремонт помещений, прочие мероприятия.

Установлено, что затраты в расчете на одно заболевшее туберкулезом животное за период неблагополучия составляли 4725,8 руб., на одно животное неблагополучного стада – 1241 руб. (табл. 5). Наибольшие затраты приходятся на санитарный ремонт – 38% и пастеризацию молока – 31%. С учетом динамики эпизоотической ситуации и разработанных коэффициентов общие затраты на противоэпизоотические мероприятия при туберкулезе крупного рогатого скота в РФ за 1961–2003 гг. составили не менее 27,4 млрд руб. (в ценах 2005 г.).

Т а б л и ц а  5 – Структура и коэффициенты затрат на оздоровительные

мероприятия при туберкулезе крупного рогатого скота

Вид затрат

На одно животное, руб.

Структура,

%

заболевшее

неблагополучного стада

Диагностические исследования

Пастеризация молока

Дезинфекция помещений

Санитарный ремонт помещений

Прочие мероприятия

118,6±7,6

1460,1±35,4

285,3±11,3

1785,9±126,1

1056,7±49,7

31,3±3,8

385,9±19,6

75,4±9,1

472,0±36,4

279,2±25,7

2,5

31,0

6,1

38,0

22,4

ВСЕГО:

4725,8±46,0

1241,0±18,9

100,0

Экономическая эффективность оздоровительных мероприятий

Расчеты проводили по разработанной методике с учетом коэффициентов ущерба  и затрат на противоэпизоотические мероприятия в динамике эпизоотической ситуации по туберкулезу с 1961 г.

За анализируемый период в результате оздоровительных мероприятий в РФ предотвращено заболевание туберкулезом 1 млн 490,7 тыс. голов крупного рогатого скота. Однако, экономическая эффективность оздоровительных мероприятий в масштабе страны проявлялась не во все периоды анализа. Так, исходя из эпизоотической ситуации, экономический эффект не установлен в 1963–1965 и в 1967–1989 гг. В эти периоды не удалось добиться снижения заболеваемости туберкулезом, что и предопределило экономическую неэффективность мероприятий.

Стабильно и равномерно эффективность оздоровительных мероприятий в связи с улучшением эпизоотической обстановки стала повышаться с 1990 г. и достигла в расчете на 1 руб. затрат к 1999–2003 гг.  17–69 руб.  В целом с 1961 г. в результате проведения плановых противотуберкулезных мероприятий в РФ  суммарный предотвращенный экономический ущерб составил 21,5 млрд руб., экономическая эффективность – 17,7 млрд руб. Экономический эффект оздоровительных мероприятий на 1 руб. затрат за весь период в среднем был невысоким – 1,31 руб., что объясняется отсутствием его в период до 1991 г. За период анализа предотвращены потери 3 млн 752 тыс. т молока стоимостью свыше 23,3 млрд руб., 43,2 тыс. т мяса (2,9 млрд руб.) и 1,4 млн голов приплода (1,4 млрд руб.).

3. ВЫВОДЫ

1. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в РФ  стабильно улучшается. С 1990 по 2006 г. количество неблагополучных пунктов сократилось в 11,4, заболеваемость – в 22, пораженность туш – в 17,3 раза. К 2007 г. неблагополучными по туберкулезу были 22 (25%) субъекта РФ, с наибольшим распространением инфекции в Поволжье, Северном Кавказе и Западной Сибири. Наиболее неблагополучным остается Южный федеральный округ (неблагополучны 9, или 70%, субъектов). На долю  Сибирского федерального округа приходится 29 % общего количества неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота пунктов, зарегистрированных в Российской Федерации.

2. Автоматизированная система эпизоотологического мониторинга, разработанная на основе информационно-аналитической поддержки, позволяет оперативно получать эпизоотологическую информацию по туберкулезу животных за любой временной отрезок, на любой административной территории субъекта РФ в цифровом и графическом исполнении, прогнозировать эпизоотическую ситуацию и планировать оздоровительные мероприятия. Разработанный «Электронный журнал учета культур» дает возможность создания итоговых отчетов, автоматизации учета и контроля пересеваемых культур микроорганизмов.

3. В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах часть телят раннего постнатального периода (3,9%) инфицированы возбудителем туберкулеза, они анергичны к туберкулину и являются опасными в эпизоотическом отношении. Качество диагностики туберкулеза у таких телят в системе изолированного выращивания повышается стимуляцией иммунного ответа на введение вакцины БЦЖ.

4. Плотная питательная среда ИЭВСиДВ для культивирования микобактерий, содержащая в своем составе минеральный комплекс из вытяжки золы древесины березы и оксидат торфа, обладает лучшими ростовыми свойствами в сравнении с коммерческими средами. При посеве культур M.bovis на среду ИЭВСиДВ срок первичного роста составляет 6,2 сут., M. tuberculosis – 5,3 сут., что вдвое меньше, чем на средах Финн-2, Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л. При посеве биоматериала от зараженных M.bovis  лабораторных животных и больного туберкулезом крупного рогатого скота срок первичного роста сокращается на 4,1 – 8,7 сут. (на 23 – 38%).

Жидкая питательная среда на основе вытяжки из золы древесины березы, криалла и сыворотки крови лошади, в сравнении со средой Сотона, сокращает срок первичного роста M. bovis и M.tuberculosis на 6–8 сут. (на 43–58%).

  5. Посев на питательные среды биоматериала от животных в виде жидкодисперсной фракции, полученной путем двойной седиментации, повышает высеваемость M.bovis, в сравнении с методами предварительной обработки по Гону и Аликаевой, на 36% и снижает загрязненность посевов сопутствующей микрофлорой в 3,4–7,5 раза.

6. Для постановки ПЦР с ДНК микобактерий, выделенной из биоматериала от животных, необходимо 40 циклов амплификации. При этом продукт ПЦР синтезируется в достаточном количестве для качественного проведения и контроля электрофореза. При температуре отжига праймеров 68°С исчезают неспецифические реакции ПЦР на ДНК непатогенных микобактерий. Предложенный метод позволяет выделить ДНК микобактерий из биоматериала уже через 7 дней после инфицирования морских свинок патогенными и атипичными микобактериями.

7. В варианте ПЦР - генетического типирования микроорганизмов – анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ампликонов – получены  генетические профили с помощью выбранных и синтезированных  праймеров рестриктазы Alul, фланкирующие фрагмент вставки IS 6110 в 1289 нуклеотидных пар (н. п.), что позволило выявить характерный для M.tuberculоsis фрагмент в 504 н.п., отсутствующий у M.bovis и M.bovis BCG, а в генетическом профиле M.bovis – фрагмент в  307 н.п., отсутствующий  у M.tuberculosis и M.bovis BCG, на основании чего возможна дифференциация этих видов микобактерий.

8. Сконструированный цифровой электронный кутиметр нового поколения позволяет технологично, качественно и, независимо от освещенности помещений, оценивать реакции на внутрикожное введение туберкулинов разным видам животных.

9. Эпизоотический процесс туберкулеза в отдельных хозяйствах протекает на фоне неспецифической реактивности крупного рогатого скота к туберкулину, что не дает возможности, согласно требованиям санитарных и ветеринарных правил, снять ограничения с хозяйства. Основанием для этого являются отрицательные результаты 4-кратных в течение последнего года патолого-анатомических и бактериологических исследований, что подтверждается результатами оздоровления 48 ферм региона Сибири.

10. Химиопрофилактический туберкулостатический препарат пролонгированного действия ниазон не обладает эмбриотоксическим, тератогенным, мутагенным, гонадотоксическим и аллергизирующим действием, не угнетает аллергическую реактивность к туберкулину, стабилен при хранении в течение 1 года, токсичность его на 12,4% снижается при совместном использовании натриевой соли ДНК из молок лосося.

11. Бактериостатическая концентрация изониазида (0,8–1,0 мкг/мл) в сыворотке крови кроликов сохраняется до 8 сут., а у телят - до 10 сут.

12. Применение ниазона в системе оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота по схеме: 20 мл/кг живой массы подкожно, 4 раза каждые 10 дней и затем ежемесячно до прекращения выявления реагирующих на туберкулин животных, позволяет оздоровить стадо в течение 12–16 мес

13. Совместное применение вакцины БЦЖ и иммуномодуляторов РНК (полирибоната и ридостина) с интервалом 14 дней повышает у животных клеточный и гуморальный иммунитет, способствует увеличению иммуногенности вакцины и препятствует заражению возбудителем туберкулеза.

14. Коэффициент экономического ущерба на одно заболевшее животное в сопоставимых ценах (2005 г.) на продукцию животноводства составляет  14,5 тыс. руб. Затраты на противотуберкулезные мероприятия составляют 4725 руб. на одно заболевшее или 1241 руб. на одно животное неблагополучного стада. Оздоровительные мероприятия  в РФ до 1991 г. были экономически малоэффективны (1,3 руб. на 1 руб. затрат). В дальнейшем, в связи с внедрением научно разработанной системы, их экономическая эффективность повысилась до 17–69 руб. В результате внедрения комплекса противотуберкулезных мероприятий предотвращенный экономический ущерб составил 21,5 млрд руб., экономический эффект – 17,7 млрд руб.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований использованы при разработке следующих нормативно-технических документов при туберкулезе животных:

1. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сб. сан. и вет. правил. 10. Туберкулез (утв. ДВ МСХиП РФ 18.06.1996 г. и Госэпиднадзором РФ 31.05.1996).

2. Наставление по применению полирибоната в ветеринарии в качестве иммуномодулятора (одобрено ветфармбиосоветом, протокол № 3 от 18.06.1998 г., и утв. ДВ МСХ РФ 26.04.2001 г., № 13–4–03/0060).

3. Наставление по диагностике туберкулеза животных (утв. ДВ МСХ РФ 18.11.2002).

4. Автоматизированная система эпизоотологического мониторинга (зарегистр. в национальном информационном центре ФГУП «Всероссийский научно-технический центр», № 1017/01-15 от 1.11.2004).

5. Автоматизированная система эпизоотологического мониторинга при туберкулезе животных (утв. Управлением ветеринарии федерального агентства по сельскому хозяйству МСХ РФ, № 5-1-14/970 от 03.10.2005).

6. Электронный журнал учета культур (зарегистр. в национальном информационном центре ФГУП «Всероссийский научно-технический центр», № 609/01-15 от 12.02.2006).

7. Стратегия и тактика оптимизации контроля эпизоотического процесса туберкулеза. Метод. рекомендации (утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол № 4 от 23.06.2000).

8. Снятие ограничений при регулярном выявлении реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота. Метод. рекомендации (утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол № 5 от 10.01.2003).

9. Анализ экономической эффективности оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота. Метод. рекомендации (утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 9 от 5.03.2004).

10. Контроль благополучия животноводческих хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота. Метод. рекомендации (утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 2 от 5.03.2004.

11. Цифровой ветеринарный кутиметр для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Метод. рекомендации (утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 4 от 09.11.2007г.

В каталоги информационных материалов по научному обеспечению реализации приоритетного национального проекта «Развитие АПК в Сибири» (Новосибирск, 2006, 2007) включены следующие разработки автора:

– комплексная система дифференциальной диагностики неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота;

– система мероприятий по профилактике и ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота  хозяйств всех форм собственности;

– химиопрофилактический противотуберкулезный препарат ниазон;

– электронный кутиметр для учета аллергических исследований животных на туберкулез;

– автоматизированная система эпизоотологического мониторинга туберкулеза крупного рогатого скота;

– контроль благополучия животноводческих хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.

  1. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих научных журналах,  рекомендованных

ВАК Минобразования РФ и науки

1. Научные и практические основы профилактики и ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота / Соавт.:  А.С. Донченко //Сиб. вестник с.-х. науки. – 1997. – № 3–4. – С. 62–68.

2. Основы профилактики и ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота/ Соавт.: А.С. Донченко //Вестник Российской академии с.-х. наук. – М., 1999. – С. 30–33.

3. Профилактика и ликвидация туберкулеза крупного рогатого скота в регионе Сибири и Дальнего Востока / Соавт.: А.С. Донченко, Ю.И. Смолянинов //Вестник Российской академии с.-х. наук. – 2000. – № 4. – С. 29–47.

4. Основные принципы эпизоотологического мониторинга при туберкулезе, бруцеллезе и лейкозе крупного рогатого скота / Соавт.: А.С. Донченко, С.К. Димов, В.В. Табакаев и др. //Сиб. вестник с.-х. науки. – 2003. – № 3. –  С. 27–31.

5. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств / Соавт.: М.Ш. Азаев, Л.Р. Лебедев, Ю.В. Туманов и др. //Биотехнология. – 2004. – № 4. – С. 33–40.

6. Эффективность противотуберкулезных химиопрепаратов при туберкулезе крупного рогатого скота / Соавт.: А.С. Донченко, А.А. Колосов, А.А. Шварц //Сиб. вестник с.-х. науки. – 2004. – № 4. – С. 142–146.

7. Научное обеспечение ветеринарных проблем туберкулеза крупного рогатого скота сибирского животноводства / Соавт.: А.С. Донченко //Ветеринарная патология. – 2004. – № 1–2. – С. 32–34.

8. Генетическое типирование микобактерий туберкулезного комплекса с помощью анализа ПДРФ амплификонов /Соавт.: А.С. Донченко, В.И. Семенихин // Ветеринарная патология. – 2004. – № 1–2. – С. 71–73.

9. Научно-практические основы профилактики туберкулеза крупного рогатого скота/Соавт.: А.С. Донченко//Сиб. вестник с.-х. науки.– 2004.– №3.– С. 81–88.

10. Сравнительная оценка питательных сред для индикации микобактерий туберкулеза /Соавт.: А.С. Донченко, С.В. Ионина, В.Н. Донченко // Сиб. вестник с.-х. науки.– 2004. – № 3. – С. 88–89. 

11. Совершенствование методических подходов и методик расчета экономического ущерба при туберкулезе крупного рогатого скота / Соавт.: Буяндалай Цацралт, А.Н.Шевьев // Сиб. вестник с.-х. науки.– 2007. – № 12. – С. 83–89. 

Патенты

12. Патент № 2190417 C2 от 10 октября 2002 г. Средство снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных препаратов/ Соавт.: М.Ш. Азаев, С.И. Татьков// Заявитель и патентообладатель ГНЦ ВБ «Вектор» по заявке № 2000131552 от 18.12.2000. –Бюлл. № 10.

13. Патент № 2192472 С2 от 10 ноября 2002 г. Среда для культивирования микобактерий туберкулеза /Соавт.: А.С. Донченко, В.Н. Донченко, С.В. Ионина// Заявитель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН по заявке № 2000126439 от 20.10.2000. –Бюлл. № 31

14. Патент на полезную модель № 32984 U1 от 10 октября 2003 г. Кутиметр / Соавт.: Е.В. Козеев, А.С. Донченко, Я.В. Плотников// Заявитель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН по заявке № 2003112381 от 30.04.2003. –Бюлл. № 28.

15. Патент № 2231972 С1 от 10 июля 2004 г. Кутиметр / Соавт.: Е.В. Козеев, А.С. Донченко, Я.В. Плотников, А.В. Козеев // Заявитель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН по заявке № 2002135801 от 30.12.2002. –Бюлл. № 19.

16. Патент № 2300559 С2 от 10 июня 2007 г. Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулезаа /Соавт.: А.С. Донченко, В.Н. Донченко, С.В. Ионина// Заявитель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии по заявке № 2005120834 от 04.07.2005. – Бюлл. № 16.

Монография

17. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / Соавт.: А.С. Донченко, Н.П. Овдиенко. – Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС», 2004. – 309 с.

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах

конференций и других изданиях

18. Профилактическая эффективность туберкулостатических препаратов при туберкулезе животных /Соавт.: А.С. Донченко, В.Н. Донченко //Сб. науч. тр./ Новосибирский НИИ туберкулеза МЗ РФ. – Новосибирск, 1995. – С. 310–311.

19. Использование индуктора интерферона вестина (ридостина) для повышения резистентности организма животных и иммуногенности вакцины БЦЖ / Соавт.: А.С. Донченко, Ю.С. Аликин //Сб. науч. тр./ НИИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор». – Бердск, 1996. – С. 173–181.

20. Факторы, влияющие на распространение и стационарное течение туберкулеза животных / Соавт.: А.С. Донченко //Проблемы адаптации с.-х. животных. – Новосибирск, 1997. – С. 54–57.

21. Влияние иммуномодуляторов на активность вакцины БЦЖ / Соавт.:  А.С. Донченко //Зооантропонозные болезни. – Гродно, 1997. – С. 124–127.

22. Использование индуктора интерферона ридостина для повышения резистентности организма животных и иммуногенности вакцины БЦЖ /Соавт.: А.С. Донченко //Эпизоотология, диагностика и меры борьбы с болезнями животных: cб. науч. тр./ ИЭВСиДВ СО РАСХН. – Новосибирск, 1997. – С. 87– 92.

23. Применение пролонгированного туберкулостатического препарата ниазон для профилактики туберкулеза крупного рогатого скота / Соавт.: И.С. Тюнин // Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных: сб. науч. тр./ ИЭВСиДВ СО РАСХН. – Новосибирск, 1997. – С. 93–95.

24. Влияние различных иммуномодуляторов на развитие туберкулезного процесса у морских свинок /Соавт.: В.Н. Донченко, А.С. Донченко // Там же. – С. 124–127.

25. Ареактивные к туберкулезу телята и их значение в эпизоотологии туберкулеза/Соавт.:А.С.Донченко //Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики в условиях реформирования с.-х. производства Прикаспийского региона. – Махачкала, 1997. – С. 109 –111.

26. Научное обеспечение профилактики и оздоровления от туберкулеза стад крупного рогатого скота / Соавт.: А.С. Донченко, В.Г. Мерман // Проблемы адаптации с.-х. животных: Матер. науч.-практ. конф. – Иркутск, 1997. – С. 54–57.

27. Научные и практические основы ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота / Соавт.: А.С. Донченко //Сб. науч. тр./ ИЭВСиДВ СО РАСХН. – Новосибирск, 1998. – С. 83–84.

28. Ниазон – новый туберкулостатический препарат, характеристика, применение / Соавт.: А.С. Донченко // Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве. – Минск, 1998. – С. 164–167.

29. ПЦР с ДНК микобактерий, выделенных из патматериала реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота /Соавт.: А.С. Донченко // Развитие АПК в зонах рискованного земледелия. – Новокузнецк, 1999. – С. 41–42.

30. Стратегия и тактика оптимизации контроля эпизоотического процесса туберкулеза /Соавт.: А.С. Донченко, Е.А. Удальцов, С.К. Димов, М.В. Качкин //Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных: Сб. науч. тр./ ВНИИБТЖ СО РАСХН. – Омск, 2000. – С. 15–28.

31. Токсикологические свойства нового композиционного противотуберкулезного препарата ниазона при комбинированном применении с ДНК из молок лососевых рыб в ветеринарной медицине/Соавт.: М.Ш Азаев., С.И. Татьков // Проблемы биологической и экологической безопасности: Матер. науч.-практ. конф. – Оболенск, 2000. – С.129-131.

32. Профилактика туберкулеза  химиотерапевтическим препаратом ниазон / Соавт.: А.С. Донченко, А.А. Колосов // Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии. – Новосибирск, 2000. – С. 167–168.

33. Повышение протективных свойств вакцины БЦЖ с помощью иммуномодуляторов / Соавт.: А.С. Донченко, В.Н. Донченко //Там же. – С. 168–170.

34. Разработка и внедрение научно обоснованных мер борьбы с туберкулезом животных / Соавт.: А.С. Донченко // Ветеринария Сибири. – 2000. – № 4.– С. 17–21.

35. Применение туберкулостатика ниазон при оздоровлении хозяйств от туберкулеза / Соавт.: А.А. Колосов, А.С. Донченко //Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии. – Краснодар, 2001. – С. 183–184.

36. Профилактическая эффективность туберкулостатического препарата ниазон / Соавт.: А.А. Колосов, А.С. Донченко, В.В. Филонов //АПК Сибири, Монголии и Казахстана в ХХI веке. – Новосибирск, 2001. – С. 212–215.

37. Изолированное выращивание здорового молодняка в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах / Соавт.: А.А. Колосов //Там же. – Новосибирск, 2001. – С. 215–218.

38. Туберкулостатический препарат ниазон в системе противотуберкулезных мероприятий, обеспечивающих управление эпизоотическим процессом / Соавт.: А.С. Донченко, А.А. Колосов // Ветеринария Сибири. – 2002. – № 7. – С. 8–13.

39. Туберкулостатический препарат ниазон в системе противотуберкулезных мероприятий /Соавт.: А.С. Донченко, А.А. Колосов //Сб. науч. тр./ Тувинский НИИСХ. – Кызыл, 2002. – С. 406–411.

40. Эффективность туберкулостатического препарата ниазон в системе противотуберкулезных мероприятий /Соавт.: А.С. Донченко //Сельские новости. – 2002. – № 11. – С. 21–24.

41. Действие ниазона на ультраструктуру микобактерий туберкулеза /Соавт.: В.И. Околелов, А.С. Донченко //Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных: Сб. науч. тр. /ВНИИБТЖ СО РАСХН. – Омск, 2003. – С. 10–17.

42. Разработка электронных устройств для диагностики и лечения заболеваний животных / Соавт.: А.С. Донченко, Е.В. Козеев, Я.В. Плотников //Информационные технологии, измерительные системы и приборы в исследовании с.-х. процессов.  – Новосибирск, 2003. – Ч. 2. – С. 334–337.

43. Создание автоматизированной системы информационно - аналитической поддержки эпизоотологического мониторинга по туберкулезу / Соавт.: С.К. Димов, А.А. Колосов, А.Л. Дудкин // Там же. – С. 337–340.

44. Туберкулостатический препарат ниазон в системе противотуберкулезных мероприятий / Соавт.: А.С. Донченко // Состояние и перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири. – Петропавловск, 2003. – Т. 2.– С. 110–115.

45. Роль туберкулостатических препаратов в системе противотуберкулезных мероприятий / Соавт.: А.С. Донченко //Роль с.-х. науки в развитии АПК Крайнего Севера: Матер. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2003. – С. 217–219.

46. Электронные приборы для ветеринарной науки и практики / Соавт.: А.С. Донченко, Е.В. Козеев, Я.В. Плотников //Современные проблемы эпизоотологии: Матер. междунар. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2004. – С. 73–77.

47. Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза / Соавт.: А.С. Донченко, С.В. Ионина, В.Н. Донченко //Современные проблемы эпизоотологии: Матер. междунар. науч. конф. – Новосибирск, 2004. – С. 80–85.

48. Плотные питательные среды для культивирования микобактерий туберкулеза / Соавт.: В.Н. Донченко, С.В. Ионина //Актуальные проблемы ветеринарной науки и практики. – Алматы, 2005. – Т. 1. – С. 140–144.

49. Роль туберкулостатических препаратов в системе противотуберкулезных мероприятий/ Соавт.: А.С. Донченко, А.А. Колосов// Там же – С.144-145.

50. Туберкулостатические препараты в комплексе противотуберкулезных мероприятий // Сб. науч. тр./ ДальЗНИВИ.– Благовещенск, 2005. – С. 50–53.

51. Экономическое значение туберкулеза крупного рогатого скота в Российской Федерации / Соавт.: Ю.И. Смолянинов, А.С. Донченко, В.Ф. Бордюг и др. // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний. – Казань, 2005. – Ч. 2. – С. 320–325.

52. Влияние возрастной структуры стада на сроки оздоровления от туберкулеза /Соавт.: А.А. Колосов, Д.И. Пашкевич, А.И. Важов, В.И. Кашеваров // Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири: Сб. науч. работ / ИЭВСиДВ СО РАСХН. – Новосибирск, 2006. – С. 118–121.

53. Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных / Соавт.: М.Ш. Азаев, Л.Р. Лебедев, Г.А.Кузьмичева, и др.// Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2007. – №2. – С.38–42.

54. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза / Соавт.: Першикова Н.Л. // Вестник КрасГАУ. – 2007. – №5. – С.129–131.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.