WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи














ШЕВЧЕНКО ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА



СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКАИ ЛЕЧЕНИЕ

АССОЦИАТИВНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НУТРИЙ

16.00.03 –  ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Краснодар, 2008

Работа выполнена в Кубанском государственном аграрном

университете, на кафедрах микробиологии, эпизоотологии и вирусологии 

  факультета ветеринарной медицины

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, 

академик РАСХН,

заслуженный деятель науки РФ  Бакулов Игорь Алексеевич

 

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук,

профессор, академик РАЕН Тимченко Людмила Дмитриевна

доктор ветеринарных наук,

профессор  Болоцкий Иван Александрович

доктор ветеринарных наук,

профессор Малышева Людмила Александровна

 

 

Ведущая организация Ставропольский государственный аграрный университет, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12.

Защита диссертации состоится «  » 2008 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 220.038.07 при Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина 13, ауд. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан « »  2008г. 

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор  Родин И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

 

Актуальность проблемы. Россия по производству пушнины традиционно является одним из мировых лидеров. Значительную часть дохода этой отрасли приносят нутрии.

Нутриеводство – перспективная отрасль пушного звероводства. От нутрий получают вкусное диетическое мясо, ценные шкурки различных расцветок (В.П. Рютова, 1991; В.Г. Кузнецов, 1993; В.Ф. Кладовщиков, В.Н. Александров, 2002; Н.А. Балакирев, 2006).

Разведением нутрий в России занимаются в различных климатических зонах государственные, фермерские хозяйства и нутриеводы-любители, но преимущественно в южных регионах: в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской области (В.И. Вачугов, 1989; Н.А. Цепкова, В.А. Карпухин, 1991; Н.А. Балакирев, В.Ф. Кладовщиков, 2002; Г.А. Кузнецов, Е.Г. Сергеев, О.И. Федоров, 2003; И.А. Плотников, О.Ю Беспятых, 2003). 

Стабильному развитию нутриеводства препятствуют инфекционные болезни: колибактериоз, сальмонеллез, стрептококкоз, наносящие значительный экономический ущерб отрасли (Р.А. Кадымов с соавт., 1992; В.А. Есепенок с соавт, 1997; А.Н. Панин с соавт, 1997; Л.П. Миронова с соавт., 2000; В.Ф. Коссе, 2001). Заболевания имеют широкое распространение. Они регистрируются во всех развитых странах мира (K. Nordstoga, 1972; B. Kohler [et al.], 1988), в том числе России  (Е.А. Клепинина, 1987; А.А. Конопаткин, В.А. Есепенок,  1990; Л.П. Миронова, А.А. Миронова, 1998; П.А. Емельяненко, 2000; В.И. Терехов, Е.В. Малюхова, 2005). 

Следует отметить также, что колибактериоз, сальмонеллез, стрептококкоз имеют эпидемиологическое значение. Роль эшерихий, сальмонелл, стрептококков в инфекционной патологии животных, человека ежегодно возрастает (Н.И. Брико, 2000; Л.А. Бурова, 2000; Е.С. Вылегжанина, А.Н. Панин, 2001; Н.М. Колычев, М.И. Петрова, Л.И. Лазарева, 2006).

Как показывает мировой опыт, во многих случаях одним из основных средств специфической профилактики инфекционных болезней животных является вакцинация.

Выпускаемые в России поливалентная вакцина против сальмонеллеза и колибактериоза пушных зверей (С.Я. Любашенко, 1963), против пастереллеза и стрептококкоза нутрий (А.Н. Панин с соавт, 1997) содержат в своем составе штаммы возбудителей без учета их территориальной антигенной изменчивости. Антигенный состав биопрепаратов был предложен в 60- 90 гг. XX столетия и до сих пор не пересматривался. Проводимый мониторинг не учитывает серотиповую циркуляцию штаммов возбудителей инфекционных болезней. В силу этого выпускаемые биофабриками вакцины «отстают» от сложившегося антигенного фона эшерихий, сальмонелл, стрептококков и не обеспечивают надежной защиты нутрий от данных инфекционных болезней.

В последние годы в нутриеводческих хозяйствах широкое распространение получило ассоциативное течение колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза, а также пастереллеза, стафилококкоза в различных сочетаниях (В.А. Есепенок, 1990; Р.А. Кадымов, Э.М. Агаева, Г.Э. Дунямалиев, 1998; В.И. Терехов, С.Н. Тельнов, 1999; Л.П. Миронова, В.Ф. Коссе, А.А. Миронова, 1999, 2000, 2001; Н.В. Броварец, 2003; С.Н. Треглазов, Л.А. Малышева, 2003). В связи с этим большое значение придается применению ассоциированных вакцин, преимущество которых заключается в создании иммунитета сразу к нескольким болезням одновременно при отсутствии у животных иммунодепрессивных процессов, повышении производительности труда, экономии времени и меньшей трудоемкости процесса вакцинации (В.А. Есепенок с соавт., 2005; 2006). Кроме того, уменьшается процент травмирования и осложнений при отлове и фиксации животных (Р.А. Кадымов с соавт., 1990; И.А. Домский, 2002).

Для защиты нутрий от ассоциативных инфекций, включающих патогены колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза, ассоциированные вакцины в России не разработаны. Изучение возможности их применения с целью иммунизации пушных зверей представляет большой научный и практический интерес. Проведение таких исследований могло бы решить проблему надежной профилактики этих болезней у восприимчивых растительноядных.

На основании вышеизложенного, учитывая сложную эпизоотическую обстановку, обусловленную действием различных возбудителей, разработка новых ассоциированных вакцинных препаратов является одним из важнейших современных направлений в области инфекционной патологии животных (В.П. Урбан, 1985).

Серогрупповой состав стрептококков, эшерихий, сальмонелл многочисленен, склонен к быстрой смене по набору и количеству. В таких ситуациях методы специфической профилактики должны основываться на применении ассоциированных вакцин, содержащих сероварианты возбудителей, которые выделяются от больных и павших животных в эпизоотическом очаге. Биопрепараты из местных штаммов возбудителей болезней обладают более высокими антигенными и иммуногенными свойствами и способствуют созданию иммунитета достаточной напряженности (А.М. Ахмедов, 1983; В.И. Вачугов, 1989; Р.А. Кадымов с соавт.,1990; Р.Т. Маннапова, 1998; Н.Н. Шульга, Н.В. Яковлева, 2006).

Исследований по включению в состав ассоциированных вакцин антигенов колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза согласно выделенному серотиповому составу не проводилось. Разработка таких вакцинных ассоциаций и новых методов профилактики данных болезней целесообразна в теоретическом и практическом отношениях. Проведение этих работ будет способствовать решению актуальной проблемы надежной и эффективной профилактики, позволяющей в кратчайшие сроки с минимальными затратами создать иммунное в отношении возбудителей данных болезней поголовье зверей.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось разработка комплекса мероприятий для специфической профилактики ассоциативных инфекционных болезней нутрий – колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза и их лечения.

В связи с этим были поставлены задачи:

- изучение эпизоотологических особенностей инфекционных болезней нутрий, распространенных в Краснодарском крае;

- разработка технологии изготовления, нормативно-технической доку-

  ментации по изготовлению и контролю инактивированных моно- и ас-

  социированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стреп

  тококкоза нутрий;

- изучение иммунобиологических свойств новых моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях;

- изучение иммунобиологической реактивности организма нутрий до и после прививки ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий;

- изучение эффективности новых ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях;

- изучение лечебного действия антибактериальных препаратов при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий;

- разработка системы профилактических и лечебных мероприятий по колибактериозу, сальмонеллезу и стрептококкозу нутрий в Краснодарском крае.

Научная новизна работы. Впервые изучена эпизоотическая обстановка по инфекционным болезням нутрий в Краснодарском крае, определен серологический профиль возбудителей.

Впервые разработаны технологии изготовления новых инактивированных моновакцин против: колибактериоза; сальмонеллеза и ассоциированных вакцин против: сальмонеллеза и стрептококкоза; колибактериоза и стрептококкоза; сальмонеллеза и колибактериоза; колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

Отработана кинетика инактивации эшерихий, сальмонелл, стрептококков на основе совместного действия инактивантов разной физико-химической природы, которые позволяют в несколько раз уменьшить количество формалина, вводимого в бактериальную культуру, и сократить время инактивации микроорганизмов по сравнению с традиционными технологиями в 4 раза.

В ходе исследований определены оптимальные соотношения антигенов, адъюванта, входящих в состав новых инактивированных ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, дозы, схемы введения биопрепаратов. Доказана безвредность, слабая реактогенность и высокая иммуногенность новых инактивированных моно- и ассоциированных вакцин при их применении на нутриях.

Впервые изучена динамика морфобиохимического статуса и динамика формирования клеточного и гуморального  звеньев иммунитета у нутрий до и после иммунизации ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза.

Установлено, что применение инактивированных ассоциированных вакцин позволяет обеспечить не менее 80%-ную защиту нутрий от колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза, сократить количество прививок в 2-3 раза, создать иммунное поголовье в короткие сроки, увеличить производительность труда зооветспециалистов и обслуживающего персонала, уменьшить в два-три раза затраты на проведение противоэпизоотических мероприятий против колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза нутрий.

Разработали и внедрили в ветеринарную практику систему мероприятий по профилактике и ликвидации инфекционных заболеваний колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

Установили высокое лечебное действие отечественного антибактери-ального препарата «Абактан» при  ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

Научная новизна работы подтверждена и защищена 10 патентами РФ на изобретение.

Теоретическая и практическая значимость работы. Изучили эпизоотическую ситуацию по инфекционным болезням нутрий в Краснодарском крае. Теоретически обосновали и практически подтвердили необходимость защиты нутрий от инфекционных болезней моно- и ассоциированными вакцинами, изготовленными из местных штаммов возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

Разработали и предложили для внедрения в производство новые инактивированные моновакцины против: колибактериоза; сальмонеллеза и ассоциированные вакцины против: сальмонеллеза и стрептококкоза; сальмонеллеза и колибактериоза; колибактериоза и стрептококкоза; колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

Выявили характер изменений неспецифического и специфического звеньев иммунитета у нутрий, проявляющийся после иммунизации ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза.

Установили, что в формировании специфической защиты организма зверей ведущая роль принадлежит В-лимфоцитам, -глобулинам, Ig A, Ig M, Ig G и специфическим антителам.

Выявленные закономерности клеточной реакции фагоцитов полностью соответствуют активации уровня гуморального звена иммунитета у нутрий и существенно дополняют характеристику специфического иммунного ответа.

Разработали и утвердили в установленном порядке нормативно-технические документы (регламент по изготовлению и контролю, технические условия, временные наставления по применению моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий).

Производство разных вариантов новых инактивированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий освоено на ФГУ «Краснодарская биофабрика» и ФГУ «Армавирская биофабрика», изготовлено более 250 тысяч доз биопрепаратов, которые с положительными результатами были испытаны в производственных условиях.

На основании теоретических, экспериментальных и производственных исследований предложена система мероприятий по специфической профилактике инфекционных болезней нутрий, включающая изучение эпизоотической обстановки хозяйства, выделение возбудителей, конструирование инактивированных вакцин, их контроль и применение. Разработали и предложили схему лечения ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, а также мероприятия по ликвидации указанных заболеваний.

Материалы исследований включены в утвержденные рекомендации по профилактике и ликвидации колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в Краснодарском крае.

Основные материалы оформлены, утверждены и вошли в монографию «Нутрии», учебное пособие с грифом МСХ РФ «Биологические особенности и болезни нутрий», патенты и используются на кафедре микробиологии Кубанского государственного аграрного университета при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по дисциплинам: «Болезни пушных зверей», «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных» на факультете ветеринарной медицины, дисциплине «Микробиология» на факультете перерабатывающих технологий, дисциплине «Микробиология и иммунология» на зооинженерном факультете, при лабораторной диагностике энтеробактерий в ГУ Краснодарского края «Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория», ФГУ «Краснодарская межобластная ветеринарная лаборатория», на кафедре микробиологии, вирусологии и патанатоми Донского государственного аграрного университета и Дагестанской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре эпизоотологии и микробиологии Ставропольского государственного аграрного университета, в Ставропольском НИИЖК РАСХН.

Практическое значение результатов работы и их внедрение подтверждено рядом актов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнялась в соответствии с тематическим планом НИР Кубанского государственного аграрного университета, государственный регистрационный №01200113464 «Разработка и совершенствование специфической профилактики инфекционных болезней животных»; по проекту № 03-04-96554 гранта совместных конкурсов РФФИ и администрации Краснодарского края «Теоретическое и экспериментальное моделирование профилактики инфекционных болезней у нутрий в Краснодарском крае»; по проекту № 06-04-96772 гранта совместных конкурсов РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ РОССИИ». «Теоретическое и экспериментальное моделирование эпизоотологической и экологической безопасности выращивания нутрий».

Апробация результатов исследований. Материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на 4-ой региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», 28-29 ноября 2002г., г. Краснодар; Международной научно-практической конференции «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с/х животных и людей», г. Покров, ВНИИВВиМ 16-18 апреля 2002г.; Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИИВВиМ «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» г. Покров, ВНИИВВиМ 24-26 сентября 2003г.; Региональных научно-практических конференциях Кубанского государственного аграрного университета, март 2004– 2008гг., г. Краснодар; научно-производственной конференции, посвященной 100-летию профессора Н.Г. Кондюрина «Актуальные вопросы микробиологии и инфекционной патологии животных». Омский ГАУ, институт ветеринарной медицины, г. Омск, 2004г.; Второй Всероссийской дистанционной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Донской ГАУ пос. Персиановский, 2004г.; Международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию Уральской государственной академии ветеринарной медицины 19-20 мая 2005г., г. Троицк; Всероссийской конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «р2003юг», г. Краснодар, 2003, 2004гг; Заключительной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «р2003юг», г. Краснодар, 2005г.; на конференции грантодержателей регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ РОССИИ», г. Краснодар, 2006, 2007гг.; на заседаниях ученого совета Кубанского государственного аграрного университета в 2001 – 2008 гг.

Публикация результатов исследований. Результаты исследований по теме диссертационной работы изложены в 61 научной работе, в том числе в монографии, учебном пособии с грифом МСХ РФ, пяти рекомендациях, 10 патентах, научных статьях и тезисах докладов центральных научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК, в материалах международных и всероссийских научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 листах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и предложения. Список литературы включает 485 источников, в том числе 107 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 46 таблицами и 35 рисунками. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения эпизоотической обстановки по инфекционным болезням нутрий в Краснодарском крае и серологического профиля возбудителей;

- результаты разработки технологии изготовления и методов контроля инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий;

- результаты изучения иммунобиологических свойств и эффективности новых инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях;

- результаты изучения иммунобиологической реактивности организма нутрий до и после прививки ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий;

- результаты изучения эффективности антибактериальных препаратов при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

- результаты разработки системы мероприятий по специфической профилактике и ликвидации инфекционных болезней нутрий.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы

Работа выполнена на кафедрах микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Федерального государственного образовательного учреждения (ФГУ) высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет», в государственном учреждении (ГУ) «Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория» Краснодарского края, в звероводческих хозяйствах Краснодарского края, в ФГУ «Краснодарская биофабрика», «Армавирская биофабрика» в период с 2000 по 2007 гг.

В работе использовали штаммы, выделенные от павших нутрий, возбудителей: стрептококкоза (Str. pneumoniae), сальмонеллеза (S. typhimurium), колибактериоза (Е. соli О1).

Животные. Опыты на лабораторных животных и нутриях проводили в виварии ГУ «Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория», на базе племзверосовхоза «Северинский», фермерских хозяйств п. Лорис, г. Усть-Лабинска, в ФГУ «Краснодарская биофабрика» и ФГУ «Армавирская биофабрика» Краснодарского края.

Для определения патогенности возбудителей, испытаний вакцин на безвредность, реактогенность, иммуногенность, пассажей и титрования возбудителей использовали белых беспородных мышей массой 16-18 г – 2500, нутрий (Miocastor coypus) различного возраста и окраса – 78500.

Зверей вакцинировали в возрасте от 40 до 60 дней, взрослых животных – за месяц до гона, беременных самок – во второй половине беременности.

Исследования проведены на клинически здоровых нутриях. Животные были подобраны по принципу параналогов (по породной принадлежности, возрасту, физиологическому состоянию, упитанности). Рационы животных соответствовали нормам, разработанным в НИИ пушного звероводства и кролиководства им. В. А. Афанасьева.

Производственные испытания вакцин проводили в племзверосовхозе «Северинский» Тбилисского района и фермерских хозяйствах Краснодарского края.

Биопрепараты. Для проведения научных исследований и производственных испытаний использовали опытные серии вакцин по разработанной нами технологии: вакцину против колибактериоза нутрий; вакцину против сальмонеллеза нутрий; вакцину против стрептококкоза нутрий; ассоциированную вакцину против сальмонеллеза и колибактериоза нутрий; ассоциированную вакцину против колибактериоза и стрептококкоза нутрий; ассоциированную вакцину против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; ассоциированную вакцину против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий; коммерческую вакцину против пастереллеза и стрептококкоза нутрий, ФГУ «Ставропольская биофабрика».

Диагностикумы, наборы, тест-системы:

- сыворотки «О»-коли агглютинирующие, поливалентные и моновалентные,  ФГУ «Армавирская биофабрика»;

- антиадгезивные коли-сыворотки, НПФ «ДИАВАК», п. Оболенск  Московской области;

- сыворотки сальмонеллезные О-комплексные агглютинирующие, ФГУ «Кур ская биофабрика»;

- сыворотки сальмонеллезные монорецепторные О и Н-агглютинирующие, ФГУ «Курская биофабрика»;

- эритроцитарный диагностический эшерихиозный набор для выявления антител в РНГА, ООО «Агровет» г. Москва;

- эритроцитарный диагностический сальмонеллезный набор для выявления антител в РНГА, ООО «Агровет» г. Москва;

- набор антистрептококковых группоспецифических сывороток и стандартных групповых антигенов для реакции преципитации, НПО «АКВАПАСТ», г. Санкт-Петербург.

2.2. Методы исследований

Клинические методы исследований. С целью изучения влияния вакцинных, вирулентных штаммов и биопрепаратов на организм лабораторных животных и опытных зверей проводили визуальное наблюдение за их состоянием после введения антигенов и возбудителей болезней. В необходимых случаях регистрировали физиологические параметры организма нутрий: температуру тела, пульс, частоту дыхания (В.А. Берестов, 2002).

Гематологические методы. Кровь у нутрий брали перед кормлением из боковой вены хвоста до начала опытов и через 7, 14, 21, 28 дней после иммунизации. Оценку гематологических показателей (количество эритроцитов, уровень гемоглобина, количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула) проводили по общепринятым методикам, описанным в соответствующих руководствах (В.А. Берестов, 1981).

Биохимические методы. Общий белок в сыворотке крови нутрий определяли рефрактометрически, содержание белковых фракций – нефелометрическим методом в соответствии с методическими указаниями по применению унифицированных биохимических методов исследования крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях (М., 1981).

Бактериологические методы. Применялись общепринятые в микробиологии приемы работы (Б.И. Антонов, 1986), а именно: посевы культур микроорганизмов на питательные среды для их выращивания, определение чистоты роста, идентификация штаммов; посевы на специальные среды для изучения биохимических свойств микроорганизмов, определение устойчивости их к антибиотикам; определение концентрации микробных клеток, проведение биопробы на лабораторных животных и нутриях.

Определение чувствительности выделенных бактериальных культур E. coli О1, S. typhimurium, Str. pneumoniae к антибактериальным препаратам: гентамицин, фурадонин, левомицетин, биовит-80, энрофлон, «Абактан» проводили методом диффузии в агар с применением дисков и лунок, методом серийных разведений в бульоне или агаре согласно методических указаний по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных (М., 1972), рекомендаций по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (А.В. Скориков, 2005).

Серологические методы. Для установления серогрупповой принадлежности возбудителя стрептококкоза нутрий использовали стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки в реакции преципитации (РП) в капиллярах по общепринятой методике (Д.И. Скородумов, 2005). Определение уровня антител в сыворотке крови нутрий проводили в РП согласно методических указаний по лабораторной диагностике стрептококкоза животных (М., 1990), утвержденных главным управлением ветеринарии (ГУВ).

Серологическую типизацию кишечной палочки и определение уровня антител в сыворотке крови нутрий проводили в реакции агглютинации (РА) согласно методических указаний по лабораторной диагностике колибактериоза  животных, утвержденных Департаментом ветеринарии РФ (М., 2000).

Серологическую типизацию выделенной культуры Salmonella и определение уровня антител в сыворотке крови нутрий проводили в РА согласно методических указаний по лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных (М., 1990).

Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных нутрий и защиту определяли через 7, 14, 21, 28 дней и выборочно у 5% животных через 60, 90, 180, 270 дней после прививки.

Иммунобиологические методы. Для определения факторов неспецифической резистентности использовали тест бактериального фагоцитоза нейтрофилов с учетом степени его завершенности по отношению к бактериям Staphylococcus aureus (№209 Р) по И.В. Нестеровой (1996).

Количество Т-, В-лимфоцитов, нулевых клеток крови нутрий определяли по методу Пирса (1962) в модификации Н.Н. Гугушвили (2000).

Содержание иммуноглобулинов основных классов (Ig А, Ig М, Ig G) в сыворотке крови нутрий определяли на биохимическом анализаторе HUMALYZER 2000.

Безвредность моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий оценивали на белых беспородных мышах массой 18-20 г , нутриях в возрасте 40-60 дней путем подкожного и внутримышечного соответственно введения им вакцины в 3-5-кратной иммунизирующей дозе. Вакцина считается безвредной, если она не вызывает нарушения физиологического состояния нутрий (повышение температуры тела, воспаление в месте введения препарата, хромота и др.) в течение 10 дней.

Иммуногенность вакцинных препаратов оценивали по проценту выживаемости (защиты) привитых нутрий (белых мышей) после заражения вирулентными возбудителями колибактериоза (E. сoli О1), сальмонеллёза (S. typhimurium) и стрептококкоза (Str. pneumoniae) в летальных дозах, определяемых предварительным титрованием на нутриях и белых мышах.

Статистические методы. Статистическая обработка массовых цифровых материалов проводилась на персональном компьютере IBM с использованием пакета статистических программ «Microsoft», «Microsoft Word» и «Microsoft Excel». Полученные результаты были подвергнуты биометрической обработке по И.А. Ойвину (1960), степень достоверности установлена по распределению Стьюдента.

Научные исследования по теме диссертации проводили по схеме (рисунок 1).

       

Рисунок 1– Схема проведения исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Эпизоотологические особенности распространения

  инфекционных болезней нутрий в Краснодарском крае

Нами был проведен ретроспективный анализ уровня заболеваемости нутрий инфекционными болезнями в Краснодарском крае в сравнительном аспекте и динамике. За основу были взяты ветеринарная отчетность по инфекционной патологии животных в Краснодарском крае за 1992–2006 гг. и результаты собственных исследований. Регистрировали также количество и видовой состав выделенных культур возбудителей. 

Установлено, что в течение 11 лет (1996-2006гг.) в нозологическом профиле инфекционной патологии нутрий доминировали (рисунок 2) стрептококкоз (60%), колибактериоз (33%), сальмонеллез (4%), инфекционная энтеротоксемия, псевдомоноз, стафилококкоз (1%). Возбудители первых трех инфекций вызывали массовую заболеваемость и гибель животных.

Стрептококкоз – инфекционная болезнь всех возрастных групп многих видов сельскохозяйственных и лабораторных животных, пушных зверей и птиц. Характеризуется  развитием гнойно–воспалительных процессов в разных органах и тканях. Широкому распространению его способствует постоянное обитание стрептококков в верхних дыхательных путях и кишечнике здоровых животных, выделение их бактерионосителями во внешнюю среду.

У нутрий болезнь регистрировали в течение всего года, заболеваемость составляла 30–60%, летальность–70–90%. До 80% самок абортировали во второй половине беременности.

  Рисунок 2 – Нозологический профиль инфекционной патологии нутрий

  в Краснодарском крае (1996-2006 гг.)

Выявили, что при естественном заражении к стрептококкозу восприимчивы все возрастные группы нутрий. Однако чаще всего поражались звери 2-3 месячного возраста.  Болезнь регистрировали в периоды массового щенения (февраль-март), отсадки потомства от самок (май-июнь), а также при формировании групп зверей для косячной случки (сентябрь-ноябрь). После всех технологических перемещений отход нутрий начинался на 12-45 день.

При изучении территориальной распространенности стрептококкоза нутрий в Краснодарском крае установили, что чаще всего его регистрировали (рисунок 3) в Кавказском (29%), Динском (16%), Белоглинском (15%), Тбилисском (11%) районах и г. Краснодаре (9%).

От больных и павших нутрий при лабораторных исследованиях выделяли различные стрептококки: Str. рneumoniae (55,73%), Str. zooepidemicus (20,36%), относящиеся к группе С, а также Str. faecalis (23,91%) группы D.

Колибактериоз – широко распространенная, остро протекающая инфекционная болезнь молодняка всех видов животных, в том числе пушных зверей, проявляющаяся септицемией, токсинемией и энтеритами – летальность до 100%, а у взрослых самок – абортами или рождением мертвых щенков. 

  Колибактериоз нутрий чаще регистрировали (рисунок 4) в Кавказском (26%), Каневском (16%), Ленинградском и Динском (по 8%), Тбилисском (7%) районах и в г. Краснодаре (19%) При этом из патологического материала павших и заболевших животных выделяли сероварианты E. coli, доля которых составляла (%): О1 (20,77), О2 (5,93), О4 (4,15), О8 (6,53), О15 (11,28), О20 (8,61), О26 (2,67), О33 (2,97), О41 (3,56), О55 (8,31), О78 (2,97), О103 (4,75), О111 (2,97), О115 (3,26), О127 (0,30), О139 (2,37), О141 (1,78), 987Р (5,04) К88 (1,78).  Доминирующим среди них был серотип E. coli О1 (20,77%). 

       

Рисунок 3 – Динамика регистрации стрептококкоза нутрий в

Краснодарском крае (1996-2006 гг.)

       

Рисунок 4 – Динамика регистрации колибактериоза нутрий в

Краснодарском крае (1996-2006 гг.)

Сальмонеллез – инфекционная болезнь преимущественно молодняка сельскохозяйственных животных, диких и пушных зверей,  характеризующаяся лихорадкой, септицемией, токсинемией и энтеритами. Нутрии чаще болеют сальмонеллезом в возрасте 1,5–5 мес и во время беременности. Болезнь носит сезонный характер (февраль, сентябрь–ноябрь). Заболеваемость и смертность зверей составляют 33–55 и 17–31% соответственно.

Сальмонеллез нутрий чаще всего регистрировали (рисунок 5) в Белоглинском (33%), Динском (19%), Каневском (16%), Выселковском и Крымском (по 7%), Северском (5%), Славянском и Кавказском районах (по 2%), а также в г. Краснодаре (9%).

При лабораторных исследованиях от больных и павших нутрий выделяли сероварианты, доля которых составляла (%): S. typhimurium (71,71), S. dublin (13,73), S. enteritidis (5,04), S. choleraesuis (3,92), S. gallinarum (1,68), S. раratyphi (3,92). Доминировал среди них серовариант S. typhimurium (71,71%).

Ассоциативное течение инфекционных болезней нутрий в Краснодарском крае установлено в 89,2% случаев, в том числе: стрептококкоза и колибактериоза; колибактериоза и сальмонеллеза; стрептококкоза и сальмонеллеза; колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза.

Рисунок 5 – Динамика регистрации сальмонеллеза нутрий в районах

Краснодарского края (1996-2006 гг.)

3.2 Разработка технологии изготовления инактивированных моно- и

  ассоциированных вакцин против колибактериоза,

  сальмонеллеза  и  стрептококкоза нутрий

Изучили биологические свойства 185 различных бактериальных культур, наиболее часто выделяемых сероваров и на основании проведенных исследований по антигенности, иммуногенности, стабильности подобрали штаммы Е. coli О1, S. typhimurium, Str. рneumoniae для изготовления биопрепаратов. Накопление микробных клеток (м.к./см3) изучали на обогащенных питательных средах: селенитовая, желчный бульон, мясо-пептонный бульон, Эндо, Левина, глюкозо-сывороточный бульон. Оно составляло от 10 до 20 млрд м.к./см3. Для получения бактериального сырья для производства вакцин нами был взят мясо-пептонный бульон, обогащенный глюкозой, позволяющий получать необходимую концентрацию микробных клеток и как наиболее доступный и дешевый. На основе штаммов Е. coli О1, S. typhimurium, Str. рneumoniae нарабатывали бактериальное сырье для изготовления инактивированных моно- и ассоциированных вакцин согласно разработанной нами технологической схемы (рисунок 6).

  Разработали эффективные режимы инактивации возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза нутрий на основе совместного действия формалина и температуры. Формалин в 0,4%-ной концентрации при температуре 37±2°С в течение 2–3 суток полностью подавлял инфекционную активность Е. coli О1, Str. рneumoniae нутрий, а в 0,5% концентрации при температуре 37±2°С в течение 3-4 суток – инфекционную активность S. typhimurium нутрий, сохраняя при этом иммуногенные свойства антигенов. Данные режимы  позволили сократить время инактивации микроорганизмов по сравнению с традиционной технологией в 4 раза (рисунок 6).

Инактивированную бактериальную массу подвергали стандартизации путем разбавления ее физиологическим раствором до концентрации не менее 4 млрд. микробных клеток в 1 см3 по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича. Депонирование биомассы проводили путем внесения адъюванта – 3 - 6%-ного гидрата окиси алюминия до 20-30% к объему и выдерживания с ним в течение 12-24 ч при температуре 20-25°С (рисунок 6).

3.3 Изучение иммунобиологических свойств моно-и

ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза

и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и

производственных условиях

3.3.1 Изучение иммунобиологических свойств моновакцин против

колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий

По разработанной нами технологии были изготовлены опытные образцы инактивированных моновакцин против: колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий на основе штаммов E. coli О1, S. typhimurium, Str. рneumoniae соответственно: формолвакцины, адсорбированные на гидрате окиси алюминия; формолвакцины с масляным адъювантом; формолвакцины без адъюванта.

  При изучении иммуногенности  и безвредности серий вакцин на нутриях в возрасте 40-50 дней установили, что после однократной внутримышечной прививки зверей одной из гидроокисьалюминиевых формолвакцин в дозе 0,5 см у животных через 14 суток формируется напряженный иммунитет против соответствующей инфекции, обеспечивающий 80% защиту нутрий. В дозах 0,1-0,4 см данные биопрепараты создавали 50-60% защиту животных, что не отвечает предъявляемым требованиям к инактивированным вакцинам. У нутрий, иммунизированных формолвакцинами без адъюванта и формолвакцинами с масляным адъювантом, наблюдали хромоту в течение 2-3 дней, защита зверей составляла 60-80 %.

При определении иммунобиологических свойств гидроокисьалюминиевых формолвакцин против: колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий после двукратной  внутримышечной прививки (первая доза – 0,5 см, вторая  – 1,0 см с интервалом 10 суток) у животных не наблюдали поствакцинальных осложнений, через 14 суток после ревакцинации у привитых зверей формировался напряжённый иммунитет против соответствующей инфекции, обеспечивая 100% защиту.

Производственные штаммы

  E. coli О1, S. typhimurium, Str. рneumoniae

       Приготовление питательной среды для культивирования

П производственных штаммов

Освежение культур E. coli О1,

S. typhimurium, Str. рneumoniae

в МПБ с добавлением 40%-ного р-ра глюкозы до 0,2% - 1%-ной концентрации, рН 7,2 – 7,4, инкубирование при температуре 37±2° С в течение 12 – 24 ч

Контроль на чистоту роста (посев на МПА, МПБ, среды Эндо и Плоскирева, окраска по методу Грама)

Получение матровой расплодки культур E. coli О1, S. typhimurium, Str. рneumoniae в МПБ с добавлением 40%-ного р-ра глюкозы до 0,2% - 1%-ной концентрации, рН 7,2 – 7,4, инкубирование при температуре 37±2° С в течение 12 – 24 ч

Контроль на чистоту роста (посев на МПА, МПБ, среды Эндо и Плоскирева, окраска по методу Грама)

 

Получение бактериальной массы культур E. coli О1, S. typhimurium, Str. рneumoniae в 3 – 5 литровых бутылях с МПБ и добавлением 40%-ного р-ра глюкозы до 0,2% - 1%-ной концентрации, рН 7,2 – 7,4, инкубирование при температуре 37±2° С в течение 12 – 24 ч

Инактивирование биомассы путем внесения формалина в 0,4 - 0,5%-ной концентрации при температуре 37±2° С в течение  48 - 96 ч

Контроль полноты инактивации высевом на МПА, МПБ, среды Эндо, Плоскирева и биопроба на белых мышах

  Стандартизация

(разбавление до необходимой концентрации)

Смешивание антигенов в определенном соотношении и адсорбирование их (внесение 3 - 6%-ного раствора гидрата окиси алюминия до 20% к объему) в течение 12-24 ч при температуре 20-25°С

Контроль на бактериальную стерильность (посев на МПА, МПБ,  агар и бульон Сабуро, Китта-Тароцци)

  Фасовка и этикетировка

Контроль на бактериальную стерильность (посев на МПА, МПБ, агар и бульон Сабуро, Китта-Тароцци), безвредность, иммуногенность

  Рисунок 6 – Принципиальная технологическая схема изготовления

инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против

колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий

Таким образом, нами были разработаны и испытаны в лабораторных условиях безвредные и высокоиммуногенные гидроокисьалюминиевые формолвакцины против колибактериоза, против сальмонеллеза и против стрептококкоза нутрий (далее вакцины против: колибактериоза, сальмонеллеза и стрептоккоза нутрий), обеспечивающие после одно- и двукратной иммунизации 80 и 100% соответственно защиту животных.

Учитывая ассоциативное течение инфекционных болезней нутрий в зверохозяйствах России, Краснодарского края, а также отсутствие эффективных  ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, дальнейшие наши исследования были направлены на разработку технологии изготовления ассоциированных вакцин против данных инфекций нутрий в разных сочетаниях и изучение их основных свойств.


3.3.2 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной

  вакцины против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в

экспериментальных и производственных условиях

На основе эпизоотических штаммов S. typhimurium и St. рneumoniae нутрий нарабатывали бактериальное сырье и инактивировали его формалином и температурой раздельно согласно разработанной нами технологической схемы (рисунок 6). После проверки на полноту инактивации антигены смешивали в соотношении 1:1,1:2,1:3, добавляли 10-30% гидрата окиси алюминия, перемешивали, выдерживали в течение 12-24 ч при температуре 20-25С, контролировали на бактериальную стерильность и фасовали во флаконы с последующей укупоркой. По разработанной нами технологии были изготовлены опытные серии ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий и изучены ее основные свойства.

Иммуногенность вакцины оценивали на белых мышах массой 18-20 г, предварительно определив для них иммунизирующую дозу антигенами сальмонеллеза и стрептококкоза, а также соответствующие дозы для заражения данными вирулентными возбудителями. Результаты исследований  показали, что после однократной подкожной прививки белых мышей ассоциированной вакциной в дозе 2 млн./0,5 см у них через 14 суток формируется напряжённый иммунитет, обеспечивающий защиту 80-90% привитых против стрептококкоза и сальмонеллеза соответственно, поствакцинальных осложнений не отмечали.

При изучении влияния соотношения антигенов и компонентов в ассоциированной вакцине на ее иммуногенную активность установили, что биопрепарат в соотношении антигенов сальмонеллеза и стрептококкоза 1:2 и 20 % гидрата окиси алюминия после двукратной иммунизации белых мышей подкожно с интервалом 10 суток в дозе по 0,5 см не вызывает у животных поствакцинальных осложнений и через 14 суток после ревакцинации обеспечивает 80-100 %-ную защиту против стрептококкоза и сальмонеллеза соответственно.

При определении оптимальной иммунизирующей дозы ассоциированной вакцины против сальмонеллёза и стрептококкоза для нутрий в возрасте 40-50 дней (однократно внутримышечно в область бедра) установили, что 1,0 млрд. микробных клеток по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича позволяет защитить 100% вакцинированных нутрий от вирулентных возбудителей сальмонеллёза и стрептококкоза при 100% заболевании и 100% гибели невакцинированных животных (контроль).

С целью изучения безвредности и иммуногенности ассоциированной вакцины на каждую серию препарата брали по 5 нутрий в возрасте 40 – 50 дней, вакцинировали однократно в дозе 1,0 см и двукратно (первая доза – 1,0 см, вторая – 1,5 см с интервалом 10 суток), внутримышечно с последующим заражением привитых и не привитых животных вирулентными возбудителями S. typhimurium (50 млрд м.к.) и St. рneumoniae ( 2 млрд м.к.).

Выявили, что у животных через 14 суток после вакцинации и ревакцинации формируется напряжённый иммунитет, обеспечивающий защиту 80­ 100%  привитых против стрептококкоза и сальмонеллеза, поствакцинальных осложнений не отмечали. 

Производственные испытания 2-х опытных серий вакцины проводили в племзверосовхозе «Северинский» Тбилисского района Краснодарского края. В хозяйстве иммунизировали 3000 нутрий 40-60 дневного возраста внутримышечно в область бедра двукратно: первая доза – 1,0 см, вторая – 1,5 см с интервалом 10 суток.  За привитыми животными вели наблюдение в течение 9 месяцев. Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных нутрий определяли выборочно (у 5% животных) к S. typhimurium  в РА и к Str. рneumoniae в РП по общепринятым методикам.

В результате исследований установлено, что у нутрий, привитых ассоциированной вакциной против сальмонеллёза и стрептококкоза двукратно, отклонений от физиологической нормы не было, через 14 суток после ревакцинции формировался напряжённый иммунитет, обеспечивая защиту всех привитых зверей против сальмонеллёза и стрептококкоза. Через 9 месяцев после повторной прививки уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных нутрий к S. typhimurium  составил 1:80-1:320, а к Str. рneumoniae – 1:8-1:32.

 

3.3.3 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной

  вакцины против сальмонеллеза и колибактериоза нутрий в

экспериментальных и производственных условиях

По разработанной нами технологии (рисунок 6) на основе выделенных штаммов S. typhimurium и Е. coli О1 были изготовлены 2 опытные серии ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и колибактериоза нутрий. Установили, что биопрепарат при соотношении антигенов сальмонеллеза и колибактериоза 1:1 и 10 и 20 % гидрата окиси алюминия после двукратной подкожной иммунизации белых мышей в дозе 0,5 см с интервалом 10 суток  не вызывает у животных поствакцинальных осложнений и через 14 суток после ревакцинации обеспечивает 100%-ную защиту против сальмонеллеза и колибактериоза.

При изучении безвредности и иммуногенной активности вакцины на нутриях в возрасте 40–50 дней выявили, что у животных через 14 суток после однократной внутримышечной прививки биопрепаратом в дозе 1,0 см3, а также двукратной: первая доза 1,0 см3, вторая – 1,5 см3 с интервалом 10 суток формируется напряженный иммунитет, обеспечивающий 80% защиту после однократной иммунизации и 100% после двукратной прививки против сальмонеллеза и колибактериоза, поствакцинальных осложнений не отмечали.

В результате производственных испытаний вакцины (две серии) в племзверосовхозе «Северинский» на 2000 нутрий 40-60 дневного возраста установили, что у животных после двукратной внутримышечной прививки в область бедра (первая доза – 1,0 см, через 10 дней вторая – 1,5 см) через 14 дней после ревакцинации формируется напряженный иммунитет, обеспечивающий защиту всех привитых зверей  против сальмонеллеза и колибактериоза. Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизированных нутрий через 9 месяцев после вакцинации, выявляемых в РА к S. typhimurium и Е. coli О1, колебался от 1:80 до 1:320.

3.3.4 Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной

  вакцины против колибактериоза и стрептококкоза нутрий в

  экспериментальных и производственных условиях

При изучении влияния соотношения компонентов в ассоциированной вакцине  на иммуногенную активность установили, что биопрепарат в соотношении антигенов колибактериоза и стрептококкоза 1:2 и 20% гидрата окиси алюминия после двукратной иммунизации белых мышей подкожно с интервалом 10 суток в дозе 0,5 см3  не вызывает у животных поствакцинальных осложнений и через 14 суток после  ревакцинации обеспечивает 80 и 100%-ную защиту против стрептококкоза и колибактериоза соответственно.

При изучении безвредности и иммуногенности биопрепарата выявили, что после однократной внутримышечной прививки нутрий ассоциированной вакциной против колибактериоза и стрептококкоза в дозе 1,0 см, а также двукратной ( первая доза 1,0 см, вторая - 1,5 см с интервалом 10 суток после первой) у животных через 14 суток после вакцинации и ревакцинации формируется напряжённый иммунитет, обеспечивающий 80% защиту против колибактериоза и стрептококкоза после однократной иммунизации и 100% после двукратной прививки, поствакцинальные осложнения не отмечали.

В результате производственных испытаний вакцины в племзверосовхозе «Северинский» на 1000 нутрий 40-60 дневного возраста установили, что у животных после двукратной внутримышечной прививки в область бедра (первая доза – 1,0 см, через 10 дней вторая – 1,5 см) формируется напряженный иммунитет, обеспечивающий защиту всех привитых  против колибактериоза и стрептококкоза через 14 дней после ревакцинации. Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных нутрий в РА против колибактериоза составил 1:80-1:160, в РП против стрептококкоза – 1:8- 1:16.

3.3.5 Изучение иммунобиологических свойств  ассоциированной

вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза 

  нутрий в экспериментальных  и производственных условиях

По разработанной нами технологии на основе  штаммов E. coli О1, S. typhimurium, St. рneumoniae  изготовили три опытные серии ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

При изучении влияния соотношения компонентов в биопрепарате на  иммуногенную активность выявили, что ассоциированная вакцина  в соотношении антигенов колибактериоза, сальмонеллёза, стрептококкоза 1:1:2 и 20% гидрата окиси алюминия после однократной иммунизации белых мышей подкожно в дозе 0,5 см не вызывает у них поствакцинальных осложнений и через 14 суток после  вакцинации обеспечивает 80%-ную защиту против трех инфекций, что отвечает предъявляемым требованиям (таблица 1).

Таблица 1

  Влияние соотношения компонентов в ассоциированной вакцине против

колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий на ее иммуногенность

Вакцина

Соотно

шение антигенов колибактериоза,

сальмо

неллёза и стрептококкоза

Адъювант, %

Безвредность

Результаты заражения возбудителями сальмонеллёза, стрептококкоза и колибактериоза через 14 суток

S. typhimurium

Str. pneumoniae

E. coli О1

Кол-во

жив-х

Пало

жив-х

Вы-

жи-

ло

жив-х

Кол-во

жив-х

Па-ло жив-х

Вы-

жи-

ло

жив-х

Кол-во

жив-х

Пало

жив-х

Вы

жи

ло

жив-х

Ассоциированная  против

колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза

нутрий

1:1:1

10

10

  2

8

10

4

6

10

  0 

10

  1:1:2

20

10

 

  0

10

10

2

8

10 

 

  0

10

  1:1:3

 

30

10

 

  3

 

  7

10

1

9

10

  3

7

Контроль,

непривитые

  –

 

  –

 

  3

  3

 

  0

3

3

0

3

  3

0

  Определили, что иммунизирующей дозой для ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий является 1,5 млрд. микробных клеток  по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича, которая обеспечивает 100% защиту привитых зверей от вирулентных возбудителей колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза при 100% заболевании и гибели невакцинированных животных (таблица 2).

  Таблица 2

Определение иммунизирующей дозы ассоциированной вакцины против

колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий

Вакцина

Имму

низи

рую

щая

доза,

109 м.к.

Кол-во

нут

рий

Вирулентный

возбудитель,

доза, млрд. м.к./1 см

Результаты заражения возбудителями сальмонеллёза, стрептококкоза и колибактериоза через 14 суток

S. typhimurium

Str. pneumoniae

E. coli О1

Забо

лело

жив-х

Пало

жив-х

Вы

жи

ло

жив-х

Забо

лело

жив-х

Па

ло

жив-х

Вы

жи

ло

жив-х

Заболело

жив-х

Па

ло

жив-х

Вы

жи

ло

жив-х

Ассоциированная против

колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза

нутрий

2,0

1,5

 

1,0

0,5

0,25

  4

 

  4

 

  4

  4

  4

S. typhimurium, 50 млрд.

м.к.

Str. pneumoniae, E.coli О1 - 2 млрд.

м.к.

0

 

0

0

1

 

2

0

 

0

0

 

0

 

1

  4

  4

 

  4

  4

 

  3

  0

 

  0

 

  1

  2

 

  3

0

0

1

1

 

2

  4

 

  4

  3

 

  3

 

  2

0

0

0

1

2

0

0

0

1

1

4

4

4

3

3

Контроль,

непривитые

-

 

4

50 млрд.

м.к.

 

  4

  4

 

  0

 

Контроль,

непривитые

 

-

4

2 млрд.

м.к.

 

  4

4

 

  0

4

4

0

При определении иммуногенности трехвалентной вакцины выявили, что после однократной внутримышечной прививки нутрий в возрасте 40-50-дней данным препаратом в дозе 1,0 см у животных через 14 суток формируется напряжённый иммунитет против трёх инфекций, обеспечивая 80%-ную защиту  против сальмонеллёза и колибактериоза, а 60%-ную против стрептококкоза.

  Установили, что ассоциированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий при оптимальном соотношении компонентов с адъювантом после двукратной иммунизации зверей (первая доза 1,0 см, вторая - 1,5 см через 10 суток после первой) формирует напряжённый иммунитет через 14 суток после ревакцинации, обеспечивая 100%-ную защиту против колибактериоза, сальмонеллёза и 80% защиту против стрептококкоза, поствакцинальных осложнений не отмечали.

Учитывая, что одним из основных показателей вакцин является их безвредность, произвели оценку биопрепарата по данному показателю на белых мышах и нутриях при внутримышечном и подкожном методах введения соответственно в дозах, превышающих иммунизирующие в 5-10 раз. Установили, что ассоциированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий является безвредной как для взрослых белых мышей, так и для молодняка нутрий с 30-дневного возраста. Все испытанные дозы ассоциированной вакцины не вызывали у подопытных животных в месте введения биопрепарата поствакцинальных осложнений (воспаление, припухлости, абсцессы, хромота).

Таким образом, в экспериментальных условиях ассоциированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий после одно- и двукратной прививки зверей не вызывает поствакцинальных осложнений, обеспечивает формирование напряженного иммунитета и защиту.

После получения положительных результатов по иммунизации белых мышей, нутрий в лабораторных условиях ассоциированной трехвалетной вакциной, были проведены опыты по сравнительной эффективности данного биопрепарата с коммерческой вакциной против пастереллеза и стрептококкоза нутрий Ставропольской биофабрики в эпизоотическом очаге при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза нутрий в племзверосовхозе «Северинский»  Тбилисского района Краснодарского края. 

С этой целью молодняк нутрий в возрасте 40–60 дней иммунизировали  ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий двукратно: первая доза – 1,0 см, вторая – 1,5 см с интервалом 10 суток. Коммерческим биопрепаратом животных прививали  в соответствии с  «Временным  наставлением по применению вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий» (таблица 3). 

Из данных таблицы 3 видно, что при иммунизации нутрят в неблагополучном по колибактериозу, сальмонеллезу, стрептококкозу нутрий хозяйстве высокий процент эффективности во всех трех опытах получен при применении ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий. Сохранность поголовья составляла 99,19 - 99,71%.

В тех же условиях вакцина против пастереллеза и стрептококкоза нутрий обеспечивала сохранность нутрят в 19,52±2,95%, что достоверно ниже (Р>0,001) аналогичного показателя при использовании ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в 5,0 раз.

Таблица 3 

Профилактическая эффективность вакцин при ассоциативной инфекции

  нутрий

Контроль

(неиммунизированные)

Вакцина против пастереллеза и стрептококкоза  нутрий

Ассоциированная

вакцина против

колибактериоза,

сальмонеллеза и

стрептококкоза

нутрий

Опыт,

Кол-во животных

Сохранность,

%

Опыт,

Кол-во  животных

Сохранность,

  %

Опыт,

Кол-во  животных

Сохранность,

  %

в нача

ле опыта

в кон

це опы

та

в нача

ле опы

та

в кон

це

опы

та

в нача

ле опы

та

в кон

це

опы

та

  1

50

5

10,00

  1

365

  66

18,08

  1

365

363

99,45

  2

50

7

14,00

  2

373

  57

15,28

  2

373

370

99,19

  3

50

4

  8,00

  3

357

  90

25,21

  3

357

356

99,71

М±m

 

50,00±

0,00

5,33±

0,88

10,67±

1,76

М±m

 

365,00±

4,62

71,00±

9,85

19,52±

2,95

М±m

 

365,00±

4,62

363,00±

4,04

99,45±

0,15

3.3.5.1 Изучение иммунобиологической реактивности организма 

нутрий до и после вакцинации

При вакцинации иммунологическая перестройка организма затрагивает многие органы и системы и сопровождается соответствующими изменениями клинических, морфологических и биохимических показателей. Учитывая данное обстоятельство, а также тот факт, что в литературе отсутствуют сведения о прививочных реакциях нутрий на ассоциированные вакцины, нами у нутрий до иммунизации в 2-х месячном возрасте и на 7-14-21-28 сутки после прививки их ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий были изучены динамика морфобиохимического статуса, факторы неспецифической и специфической резистентности. Вакцинацию животных проводили внутримышечно двукратно: первая прививка в возрасте 60 дней 1,0 см3, через 7 суток вторая – 1,5 см3.

В результате анализа общеклинического исследования крови выявили, что количество гемоглобина и эритроцитов в опытной группе на протяжении всего периода было выше, чем у контрольных животных аналогичного возраста на 1- 3%, но выявленные увеличения данных показателей не являются достоверными по отношению к контрольным зверям. Число лейкоцитов у иммунизированных нутрий на 7, 14 сутки после прививки было достоверно выше в 1,5 раза (Р>0,001) относительно контрольных животных аналогичного возраста. В более поздние сроки опыта эти показатели выравнивались с контрольными и соответствовали физиологическим нормам. При определении клеточного состава крови у вакцинированных зверей отмечен нейтрофильный лимфоцитоз.

Оценка показателей белкового обмена у нутрий опытной группы позволила установить нам повышенное количество общего белка и относительного содержания -глобулинов по сравнению с контрольными животными аналогичного возраста на 4,21 – 21,11% (Р>0,001) и 8,70 – 22,71% (Р>0,001) соответственно (таблица 4).

Таблица 4

Содержание общего белка и белковых фракций у нутрий до и после вакцинации 

(М±m; n=10)

Группа животных

Общий белок, г%

Альбу-

мины, %

Глобулины, %

- глобу лины

- глобу лины

γ- глобу лины

до вакцинации

Контрольная

4,96±0,05

60,94±0,25

13,05±0,17

12,61±0,22

13,40±0,12

Опытная

5,13±0,05

62,83±0,26

12,36±0,13

11,47±0,28

13,34±0,13

на 7-е сутки после вакцинации

Контрольная

5,22±0,02

61,07±0,41

13,95±0,10

10,33±0,45

14,65±0,21

Опытная

5,44±0,03 ***

59,01±0,26

14,23±0,12

10,82±0,24 ***

15,94±0,15 ***

на 14-е сутки после вакцинации

Контрольная

5,50±0,04

61,39±0,40

13,82±0,20

9,95±0,22

14,84±0,12

Опытная

6,05±0,05

***

58,26±0,23

13,30±0,27

10,23±0,20 ***

18,21±0,10 ***

на 21-е сутки после вакцинации

Контрольная

5,76±0,04

61,78±0,45

13,96±0,20

9,33±0,16

14,93±0,22

Опытная

6,70±0,14

***

58,40±0,28

12,51 ±0,20 ***

11,35±0,11

***

17,74±0,18 ***

на 28-е сутки после вакцинации

Контрольная

5,92±0,06

62,12±0,32

13,25±0,24

9,46±0,20

15,17±0,25

Опытная

7,17±0,09

***

59,55±0,36

12,40±0,17 **

11,56±0,17

16,49±0,13 ***

*P<0,05; ** P>0,01; ***P>0,001

 

Фагоцитарная активность стимулированных иммунным процессом нейтрофилов по сравнению с контролем была достоверно выше (Р>0,001)  во все сроки исследования. Максимальные значения данных показателей зарегистрированы на 14-е сутки после первой вакцинации. В отдаленные сроки после иммунизации фагоцитарная реакция нейтрофилов проявлялась на достоверно высоком уровне относительно контрольных животных (рисунок 7).

 

Рисунок 7 – Изменение показателей фагоцитарной активности

нейтрофилов у нутрий после вакцинации (в % от контроля –

до вакцинации)

       

При изучении клеточного звена иммунитета у нутрий выявили, что вакцинация нутрий ассоциированной вакциной стимулировала интенсивный синтез В-лимфоцитов. Относительное содержание их у иммунизированных зверей было достоверно выше (Р<0,05 – Р>0,001) с 7 по 28 сутки опыта на 5-24% в сравнении с контрольными животными аналогичного возраста. Максимальный уровень В-лимфоцитов отмечен на 14 сутки после первой иммунизации – 32,50±0,50 % (таблица 5).  Данное обстоятельство вполне объяснимо, так как В-лимфоциты являются продуцентами иммуноглобулинов, отвечающих за специфическое звено иммунитета.

Оценка гуморального звена иммунитета у нутрий позволила установить нам достоверное повышенное содержание (P>0,001) в сыворотке крови привитых зверей в сравнении с животными до вакцинации уровня  Ig А в 1,2–1,3 раза (максимум 28 сутки), Ig М и Ig G  в 1,4 – 1,6 раза и в 1,2 – 1,7 раза соответственно (максимум 14 сутки), что свидетельствовало  о специфической иммунологической перестройке организма зверей после  прививки их ассоциированной вакциной (таблица 6).

  Таблица 5

  Показатели клеточного иммунитета у нутрий до и после вакцинации

(М±m; n=10)

Группа

животных

Т-лимфоциты, %

В-лимфоциты, %

Нулевые клетки

крови, %

до вакцинации

Контрольная

57,90±0,50

24,80±0,65

17,30±0,72

Опытная

59,50±0,48*

23,60±0,45

16,90±0,69

на 7-е сутки после вакцинации

Контрольная

59,00±0,58

25,40±0,40

15,60±0,65

Опытная

52,20±0,47***

29,30±0,37***

18,50±0,73**

на 14-е сутки после вакцинации

Контрольная

58,80±0,51

26,30±0,56

14,90±0,71

Опытная

54,10±0,50***

32,50±0,50***

13,40±0,73

на 21-е сутки после вакцинации

Контрольная

59,20±0,47

27,00±0,47

13,80±0,53

Опытная

56,70±0,42***

31,10±0,35***

12,20±0,57*

на 28-е сутки после вакцинации

Контрольная

58,30±0,56

27,60±0,48

14,10±0,48

Опытная

59,40±0,54

28,90±0,43*

11,70±0,83*

  *P<0,05; **P>0,001; ***P>0,001

Таблица  6

Показатели гуморального иммунитета нутрий до и после  вакцинации

  (М±m; n=10)

Группа животных

IgA (г/л)

IgM (г/л)

IgG (г/л)

до вакцинации

Контрольная

0,290±0,02

1,12±0,01

2,40±0,02

О Опытная

0,310±0,02

1,13±0,05

2,37±0,03

на 7-е сутки после вакцинации

Контрольная

0,320±0,02

1,38±0,01

2,50±0,02

  Опытная

0,365±0,01 *

1,69±0,03 ***

2,92±0,02 ***

на 14-е сутки после вакцинации

Контрольная

0,340±0,02

1,47±0,02

2,53±0,02

  Опытная

0,386±0,01 **

1,80±0,03 ***

3,96±0,03 ***

на 21-е сутки после вакцинации

Контрольная

0,355±0,02

1,57±0,02

2,58±0,02

  Опытная

0,392±0,01

1,70±0,03 ***

3,69±0,03 ***

на 28-е сутки после вакцинации

Контрольная

0,380±0,02

1,58±0,01

2,63±0,02

  Опытная

0,413±0,01

1,62±0,02 ***

3,44±0,03 ***

*P<0,05; **P>0,01; ***P>0,001 . 

Динамика гуморального иммунного ответа у вакцинированных нутрий свидетельствует о росте титра специфических антител в сыворотке крови привитых зверей к Str. рneumoniae, E. сoli О1, S. typhimurium  уже на 7 сутки после иммунизации. Рост показателей продолжается до 14–21 дня, когда отмечены максимальные значения, далее следует постепенное их снижение (рисунок 8).

  Рисунок 8 – Динамика титров антител у нутрий, иммунизированных 

двукратно против колибактериоза, сальмонеллёза и 

стрептококкоза

.

Таким образом установили, что ассоциированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий безвредна для зверей, не вызывает у них поствакцинальных осложнений и обладает одновременно антигенностью и иммуногенностью. Выявленные у привитых зверей закономерности изменений клеточного звена иммунитета полностью соответствуют активации уровня гуморальных показателей и существенно дополняют характеристику иммунного ответа.

3.3.5.2 Производственные испытания ассоциированной вакцины 

против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий

Производственные испытания 3-х опытных серий ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий проводили в племзверосовхозе «Северинский» Тбилисского района, в фермерском хозяйстве п. Лорис Динского района Краснодарского края.

В племзверосовхозе «Северинский» вакцинировали 5000 нутрий, в фермерском хозяйстве п. Лорис – 3000 нутрий 40-60-дневного возраста внутримышечно в дозе 1,0 см в область бедра. Повторную иммунизацию проводили через 10 дней в дозе 1,5 см. За привитыми животными вели наблюдение в течение 12 месяцев. У вакцинированных нутрий отклонений от физиологической нормы не было. Заболевания и гибели нутрий от колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза в течение 12 месяцев (срок наблюдения) не отмечали.

Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных нутрий определяли выборочно у 5% животных в течение 12 месяцев после повторной прививки к E. coli O1, S. typhimurium  в РА и к Str. рneumoniae в РП по общепринятым методикам.

В результате исследований установили, что у нутрий, иммунизированных ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза двукратно, формируется напряжённый иммунитет через 14 суток после ревакцинации, обеспечивая защиту всех привитых животных против трех инфекций. Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных нутрий в РА против колибактериоза, сальмонеллеза колебался от 1:80 до 1:1280, а в РП против стрептококкоза – от 1:4 до 1:64.

  В период эпизоотии ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в племзверосовхозе «Северинский» вакцинировали 5000 животных. Иммунизацию проводили с 40-дневного возраста не разделяя традиционно поголовье на явно больных, подозрительных по заболеванию и условно здоровых. Вакцину вводили нутриям двукратно внутримышечно в область бедра: первая доза 1,0 см, вторая – 1,5 см с интервалом 10 дней. За привитыми животными вели наблюдение в течение 12 месяцев. Падеж нутрий после вакцинации в течение месяца резко сократился, составил 8,57% в месяц против 47,25% перед иммунизацией и в дальнейшем прекратился.

  Таким образом, ассоциированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в производственных условиях подтвердила безвредность и высокую иммуногенность. В эпизоотическом очаге в период массовой гибели нутрий при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза оказывает высокий профилактический эффект, позволяет остановить эпизоотию и сохранить 93,75 % зверей.

Разработанные нами методы контроля вакцины на безвредность и иммуногенную активность (белые мыши и нутрии), реактогенность (нутрии), стерильность позволяют выпускать безопасную, стерильную и высокоиммуногенную вакцину против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий. Эффективность предложенного контроля подтверждена при производстве 15 серий (более 250 тыс. доз) биопрепарата.

При изучении стабильности ассоциированной вакцины установили, что она не теряет свои иммунобиологические свойства в течение 12 месяцев при обычных условиях хранения биопрепаратов (сухое темное место и температура 2-8°С), обеспечивая после двукратной иммунизации не менее 80%-ную защиту против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

В период 2001-2007 гг. в хозяйствах Краснодарского края ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллёза и стрептококкоза нутрий было иммунизировано 78500 нутрий. Осложнений, угнетения, отказа от корма, заболевания и падежа животных не отмечено. При подведении итогов щенения иммунизированных самок зарегистрировано физиологически нормальное течение беременности и щенения, увеличение выхода нутрят  на самку. При выращивании зверьков повысилась их сохранность, молодняк хорошо рос и развивался.

Важнейшим практическим аспектом при применении ассоциированной вакцины явилось реальное сокращение сроков создания иммунного поголовья и 2-3 кратное снижение трудовых затрат для ветеринарных специалистов и звероводов.

Производство инактивированной ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий освоено на ФГУ «Армавирская биофабрика» Краснодарского края. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативно-техническая документация на опытно-промышленное производство (регламент по изготовлению и контролю, ТУ, наставление по применению).

  3.4 Изучение эффективности антибактериальных  препаратов при

лечении ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза 

и стрептококкоза  нутрий

С этой целью провели определение чувствительности выделенных штаммов S. typhimurium (n=23), E. coli О1(n=35), Str. pneumoniae (n=52) к препаратам: гентамицину, фурадонину, левомицетину, биовит-80, энрофлону, «Абактану» методом диффузии в агар с применением дисков, лунок и методом серийных разведений в МПБ. Установили, что они обладали наибольшей чувствительностью к «Абактану», энрофлону.

Терапевтическую эффективность «Абактана», энрофлона и биовит-80 определяли на нутриях в возрасте 40-50 дней в племзверосовхозе «Северинский» при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза нутрий. 

Установили, что наиболее эффективным в производственных условиях  был «Абактан» в дозе 5мг/кг массы тела при внутримышечной инъекции в течение 3 дней. По этой схеме лечили 120 животных, из них выздоровело 119 (99,16%). При применении энрофлона с кормом в дозе 0,25г/кг массы тела животного в течение 7 дней (согласно наставлению по применению) выздоровело 110 (91,66%), а биовит-80 0,5г/нутрию в течение 12 дней– 55 (45,83 %) соответственно.

Таким образом, в производственных условиях при ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза нутрий высокую терапевтическую эффективность показали «Абактан» (99,16%) и энрофлон (91,66%). 

3.5 Разработка  мероприятий по профилактике и  ликвидации

  колибактериоза,  сальмонеллеза и  стрептококкоза нутрий

В России мероприятия по профилактике и ликвидации колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий отсутствуют, поэтому нами на основании теоретических и практических результатов исследований они были разработаны по каждой указанной инфекции.

Для профилактики и оздоровления хозяйств от инфекционных заболеваний молодняка и взрослых нутрий, в частности, от колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза, необходимо выполнять общие и специфические мероприятия.

Общая профилактика колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза  нутрий основывается на проведении комплекса технологических, зоогигиенических, ветеринарно-санитарных и специфических мероприятий, направленных  на повышение резистентности организма матери и новорожденного молодняка, снижение уровня контаминации помещений репродукторного отделения фермы возбудителями болезни и предотвращения заражения животных в период их рождения и  выращивания патогенными микроорганизмами через корма, объекты  внешней среды. При этом исходят из особенностей содержания и выращивания молодняка нутрий (рисунок 9).

Специфическая профилактика колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий у новорожденных животных основана на проведении вакцинации маточного поголовья и молодняка соответствующими вакцинами в сроки  и дозах, указанных в наставлениях по их применению. Наряду с вакцинами применяют следующие препараты:

а) иммуномодуляторы (поливедрин, вестин, левамизол, полиоксидонин, Т- и В-активин и др. ),  которые вводят  одновременно с вакциной одно- или двукратно согласно  наставлению по их применению;

б) поливалентные гипериммунные сыворотки: сальмонеллезную, коли-, стрептококкоза, а также бактериофаги в соответствии с действующими наставлениями по их применению;

в) нормальные глобулины сывороток крови животных вводят внутримышечно или подкожно по 0,7 мл на 1 кг массы тела один раз в сутки в течение 2-3 дней;

г) пробиотики (ветом–1.1, споробактерин, субалин, ромакол, бифидумбактерин, бифацидобактерин, лактицин и др.) применяют в профилактической дозе по схеме, указанной в наставлении.

Мероприятия по ликвидации заболевания По установлению диагноза на колибактериоз, сальмонеллез, стрептококкоз администрация района (города) в порядке, предусмотренном законом «О Ветеринарии», по представлению главного ветеринарного врача района (города) выносит решение об объявлении хозяйства (фермы), населенного пункта (его отдельной самостоятельной части в зависимости от эпизоотической обстановки) неблагополучными по сальмонеллезу, стрептококкозу и установлении карантина, а в случае обнаружения колибактериоза вводят ограничения. В решении указывают точные границы эпизоотического очага болезни, неблагополучного пункта, угрожаемой зоны, а также определяют основные мероприятия по ликвидации болезни в неблагополучном пункте и ее профилактике в угрожаемой зоне. Проводят все необходимые мероприятия, направленные на недопущение выноса возбудителя за пределы эпизоотического очага и его локализацию. В угрожаемой зоне проводят общие и специфические профилактические мероприятия. 

Рисунок 9 - Схема лечебно-профилактических мероприятий при колибактериозе, сальмонеллезе и стрептококкозе

  нутрий

ВЫВОДЫ

  1. Эпизоотическая ситуация по стрептококкозу, колибактериозу и сальмонеллезу нутрий в Краснодарском крае остается напряженной. За 1996-2006 гг. неблагополучными по данным инфекционным болезням зверей  являются 15 из 38 районов края, а также г. Краснодар. В последние годы в нутриеводческих хозяйствах широкое распространение получило ассоциативное течение стрептококкоза, колибактериоза и сальмонеллеза в различных сочетаниях.

  2. В нозологическом профиле инфекционной патологии нутрий в Краснодарском крае доминируют стрептококкоз (60%), колибактериоз (33%), сальмонеллез (4,0%) и пастереллез (2%). Территориально стрептококкоз чаще всего регистрировали в Кавказском (29%), Динском (16%), Белоглинском (15%), Тбилисском (11%) районах и г. Краснодаре (9%); колибактериоз – в Кавказском (26%), Каневском (16%) районах и г. Краснодаре (19%); сальмонеллез – в Белоглинском (33%), Динском (19%), Каневском (16%) районах и г. Краснодаре (9%).

  3. Среди нутрий циркулируют различные сероварианты возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза. Подавляющее большинство энтеробактерий, выделенных от нутрий в Краснодарском крае, приходится на  S. typhimurium  (71,71%),  Str. рneumoniae (55,73%), E. coli О1 (20,77%).

  4. Разработаны технологии и способы изготовления новых инактивированных моновакцин против: колибактериоза; сальмонеллеза и ассоциированных вакцин против: сальмонеллеза и стрептококкоза; колибактериоза и стрептококкоза; сальмонеллеза и колибактериоза; колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий. Отработаны параметры оценки качества по стерильности, безвредности, иммуногенности новых инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

  5. Разработаны эффективные режимы инактивации возбудителей колибактериоза (E. coli О1), сальмонеллеза (S. typhimurium), стрептококкоза (Str. рneumoniae) нутрий в течение 2-4 суток на основе совместного действия формалина в 0,4-0,5%-ной концентрации и температуры 37±2°С. Они позволили сократить время инактивации микроорганизмов по сравнению с традиционной технологией в 4 раза при сохранении у них иммуногенной активности. 

  6. Подобраны оптимальные иммунологически сбалансированные соотношения инактивированных антигенов S. typhimurium, E. coli О1, Str. рneumoniae 1:1:2 соответственно и адъюванта гидрата окиси алюминия до 20%, входящих в состав разработанных нами ассоциированных вакцин.

  7. Новые моно- и ассоциированные вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий в экспериментальных и производственных условиях являются безвредными и высокоиммуногенными. Через 14 суток после однократной прививки и двукратной с интервалом 10 суток у нутрий формируется напряжённый иммунитет, обеспечивающий не менее 80% защиту от вирулентных возбудителей. Свои иммунобиологические свойства вакцины сохраняют в течение года при обычных условиях хранения биопрепаратов (сухое темное  место и температура 2-8°С) 

  8. Иммунизация нутрий ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий не вызывает у них поствакцинальных осложнений,о чем свидетельствуют гематологические и биохимические показатели. Фагоцитарная активность стимулированных иммунным процессом нейтрофилов была достоверно выше по сравнению с контролем с 7 по 28 сутки опыта в 1,1 –1,5 раза.

  9. После двукратной прививки ассоциированной трехвалентной вакциной у нутрий происходит специфическая иммунологическая перестройка организма, о чем свидетельствует достоверное увеличение уровня В-лимфоцитов на 22-38%, -глобулинов и основных иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови привитых зверей в 1,1-1,6 раза в сравнении с животными до иммунизации.

10. Выявленные закономерности клеточной реакции фагоцитов полностью соответствуют активации уровня гуморальных антител к колибактериозу и сальмонеллезу (от 1:80 – 1:1280), к стрептококкозу (от 1:4 до 1:64) у иммунизированных ассоциированной трехвалентной вакциной нутрий, обеспечивая невосприимчивость животных к вирулентным возбудителям в течение года. Экономическая эффективность применения вакцины составила 26,69 руб на 1 рубль затрат.

  11. В производственных условиях установлена высокая терапевтическая эффективность (99,16%) отечественного антибактериального препарата «Абактан» при лечении больных нутрий ассоциативной инфекцией колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза. Экономическая эффективность применения «Абактана» составила12,02 рубля на 1 рубль затрат.

12. Разработаны рекомендации по профилактике и ликвидации колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий, позволяющие регламентировать профилактические мероприятия, а в случае возникновения заболеваний проводить их ликвидацию. Утверждена в установленном порядке нормативно-техническая документация на ассоциированную вакцину против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены способы технологии изготовления и новые инактивированные моновакцины против: колибактериоза; сальмонеллеза; стрептококкоза; ассоциированные вакцины против: сальмонеллеза и стрептококкоза; колибактериоза и стрептококкоза; сальмонеллеза и колибактериоза; колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий.

2. Предложена схема лечения ассоциативной инфекции колибактериоза, сальмонеллеза и  стрептококкоза нутрий отечественным препаратом «Абактан».

3. Для проведения профилактики и ликвидации сальмонеллеза, стрептококкоза и колибактериоза нутрий предложены: «Рекомендации по профилактике и ликвидации колибактериоза нутрий в Краснодарском крае», «Рекомендации по профилактике и ликвидации сальмонеллеза нутрий в Краснодарском крае»,  «Рекомендации по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий в Краснодарском крае».

  4. Полученные результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе на биологических и ветеринарных факультетах и при повышении квалификации ветеринарных специалистов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Монографии

1. Шевченко, А. А. Нутрии: Биологические особенности. Содержание. Разведение. Болезни и лечение / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко. – М.: Аквариум Бук, 2004.  – 160 с.

2. Шевченко, Л. В. Болезни и биологические особенности нутрий: учеб. пособие / Л. В. Шевченко, В. В. Стрельников, А. А. Шевченко; М-во сел. хоз-ва РФ, Куб ГАУ. Краснодар: Краснодарбланкиздат, 2006. 272с.

Статьи в изданиях, в которых рекомендуется публикация основных

результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук

3. Шевченко, Л. В. Эпизоотологические особенности распространения инфекционных болезней нутрий в Краснодарском крае / Л. В. Шевченко // Тр./ КубГАУ. – 2006. –  №4. – С. 154-159.

4. Шевченко, Л. В. Иммунобиологические свойства ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий  / Л. В. Шевченко // Тр. / КубГАУ. – 2007. –  №1(5). – С. 144 – 146.

5. Шевченко, Л. В. Технология изготовления ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий  / Л. В. Шевченко // Тр. / КубГАУ. –  2007. –  №2(6). – С. 149–152.

6. Шевченко, Л. В. Формирование иммунитета у нутрий, привитых ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза / Л.В. Шевченко //  Тр. / КубГАУ. – 2007. –  №3(7). – С. 123-126.

7. Шевченко, Л. В. Новая вакцина против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий  / Л. В. Шевченко // Ветеринария. – 2007. – №4. – С.24-26.

8. Шевченко, Л. В. Лечение ассоциативных инфекционных болезней нутрий / Л. В. Шевченко //  Тр. / КубГАУ. – 2007. –  №4(8). – С. 73-74

9. Шевченко, Л. В. Инфекционные болезни нутрий  в Краснодарском крае / Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, О. Ю. Черных // Ветеринария. – 2007. – №11. – С. 24-25.

10. Шевченко, Л. В. Иммунобиологическая реактивность нутрий, привитых ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза  / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко // Изв. вузов. Сев.-Кавказ. регион. – 2008. – №1. – С.91-93.

11. Шевченко, Л. В. Динамика морфобиохимического статуса нутрий, привитых ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза  / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко // Вестн. Саратов. госагроун-та им. Н. И. Вавилова. – 2008. – №2. – С.32-35.

Статьи в журналах, аналитических сборниках и материалах

  конференций

12. Шевченко, А. А. Идентификация возбудителей кокковых инфекций нутрий / А. А Шевченко, Л. В. Шевченко // Биол.-экол. проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. – Покров, 2002. – С. 252-254.

13. Шевченко, Л. В. Идентификация энтеробактерий нутрий /Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко // Биол.-экол. проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. – Покров, 2002. – С. 254-255.

14. Шевченко, Л. В. Лабораторная диагностика энтеробактерий нутрий / Л. В. Шевченко // Сб. науч. тр. / КубГАУ. –  2004. – №406 (434). –  С. 15-20.

15. Шевченко, Л. В. Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий / Л. В. Шевченко, В. В. Стрельников, А. А. Шевченко // Сб. науч. тр. / КубГАУ. - 2004. – №406 (434). –  С. 25-29.

16. Шевченко, Л. В. Лечение энтеробактериальных инфекций нутрий / Л. В. Шевченко, Э. А. Горностаев, А. А. Крыцула // Сб. науч. тр. / КубГАУ. –  2004. – №406 (434). –  С. 29-32.

17. Шевченко, Л. В. Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий / Л. В. Шевченко // Сб. науч. тр. / КубГАУ. –  2004. – №406 (434). –  С. 32-37.

18. Шевченко, Л. В. Изучение коккобактерий нутрий, совершенствование профилактики / Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко // Актуал. вопр. микробиологии и инфекц. патологии животных: Материалы науч.-произв. конф. / Ом. ГАУ; ин-т ветеринар. медицины. – Омск,  2004. – С. 164-173.

19. Шевченко, Л. В. Изучение иммунобиологических свойств вакцины против

сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий / Л. В. Шевченко // Соврем. проблемы устойчивого развития агропром. комплекса России: Материалы Второй Всерос. дистанц. науч.-практ. конф. / Дон ГАУ. –  пос. Персиановский, 2004.  –  С. 90-92.

20. Шевченко, Л. В. Основные свойства вакцины против сальмонеллеза нутрий / Л. В. Шевченко, В. В. Стрельников // Соврем. проблемы устойчивого развития агропром. комплекса России: Материалы Второй Всерос. дистанц. науч.-практ. конф. / Дон ГАУ. –  пос. Персиановский, 2004.  –  С. 92-93.

21. Шевченко, Л. В. Эффективность вакцины против колибактериоза нутрий / Л. В. Шевченко, В. В. Стрельников // Соврем. проблемы устойчивого развития агропром. комплекса России: Материалы Второй Всерос. дистанц. науч.-практ. конф. / Дон ГАУ. –  пос. Персиановский, 2004.  –  С. 94-95.

22. Шевченко, А. А. Изучение энтеробактерий нутрий и совершенствование лечения и профилактики / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, К. А. Лино, Э.А. Горностаев, П. В. Фендриков // Фундам. исслед. – 2004. – №1. – С. 93.

23. Шевченко, Л. В. Иммунобиологические свойства вакцины против колибактериоза нутрий / Л. В. Шевченко // Актуал. проблемы биологии и ветеринар. медицины мелких домашних животных: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. / УГАВМ. – Троицк, 2005. – С. 204-207.

24. Шевченко, Л. В. Лечение и специфическая профилактика сальмонеллеза нутрий / Л. В. Шевченко // Актуал. проблемы биологии и ветеринар. медицины мелких домашних животных: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. / УГАВМ. – Троицк, 2005. – С. 201-204.

25. Шевченко, А. А. Теоретическое и экспериментальное моделирование профилактики инфекционных болезней нутрий в Краснодарском крае  / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко // Заключ. конф. грантодержателей регион. конкурса РФФИ и администрации Краснод. края «р2003юг»: тез. докл. -  Краснодар, 2005. –  С. 70-72. 

26. Шевченко, Л. В. Энтерококковая инфекция нутрий / Л. В. Шевченко, В. В. Стрельников, А. А. Шевченко // Ветеринария с.-х. животных. – 2006. – №2.  –  С. 29-31.

27. Шевченко, Л. В. Ассоциированная вакцина против сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий / Л. В. Шевченко, Э. А. Горностаев, А. А. Крыцула  // Ветеринария с.-х. животных. – 2006. – №3.  –  С. 25-26.

28. Шевченко, Л. В. Теоретическое и экспериментальное моделирование эпизоотологической и экологической безопасности выращивания нутрий / Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, О. Ю. Черных // Тез. конф. грантодержателей регион. конкурса Рос. фонда фундам. исслед. и администрации Краснод. края «ЮГ РОССИИ». -  Краснодар, 2006. – С. 174-175.

29. Шевченко, Л. В. Иммунобиологические свойства вакцины против колибактериоза нутрий / Л. В. Шевченко // Сб. науч. тр. / КубГАУ. – 2007. – №426(454). –  С. 99-101. 

30. Шевченко, Л. В. Диагностика и лечение стрептококкоза нутрий / Л. В. Шевченко // Сб. науч. тр. / КубГАУ. – 2007. – №426(454). –  С. 105-108. 

31. Шевченко, Л. В. Эффективность вакцины против сальмонеллеза нутрий / Л. В. Шевченко // Сб. науч. тр. / КубГАУ. – 2007. – №426(454). –  С. 89-91. 

32. Шевченко, Л. В. Вакцина против колибактериоза и стрептококкоза нутрий / Л.В. Шевченко  // Фундам. исслед.  – 2007. – №1.  –  С. 91.

33. Шевченко, Л. В. Динамика распространения инфекционных болезней нутрий в Краснодарском крае / Л. В. Шевченко  // Наука Кубани. – 2007. – №1. – С. 31-34.

34. Шевченко, Л. В. Вакцина против колибактериоза и стрептококкоза нутрий / Л.В. Шевченко // Соврем. наукоемкие технологии. – 2007. – №4. – С. 96-97.

35. Шевченко, А. А. Специфическая профилактика инфекционных болезней пушных зверей / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, Д. Ю. Зеркалев // Вестн. ветеринарии. –  2007. –  №40-41(1-2). –  С. 144-148.

36. Шевченко, Л. В. Терапия ассоциативных инфекций нутрий / Л.В. Шевченко // Соврем. наукоемкие технологии. –  2007. –  №4. –  С. 99-100.

37. Шевченко, Л. В. Иммунологическая  реактивность нутрий, привитых ассоциированной вакциной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко // Успехи соврем. естествознания. –  2007. –  №8. –  С. 72-74.

38. Шевченко, Л. В. Технология изготовления ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко // Успехи соврем. естествознания. –  2007. –  №8. –  С. 74-75. 

39. Шевченко, Л. В. Иммунобиологические свойства ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко // Новые технологии в эксперим. биологии и медицине: материалы Междунар. науч.-практ. конф.

/ НИИ БИОЛОГИИ ЮФУ. –  Ростов-н/Д., 2007. – С. 73.

40. Шевченко, Л. В. Технология изготовления ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко // Новые технологии в эксперим. биологии и медицине: Материалы Междунар. науч.-практ. конф. / НИИ БИОЛОГИИ ЮФУ. –  Ростов-н/Д., 2007. – С. 74.

41. Шевченко, Л. В. Теоретическое и экспериментальное моделирование эпизоотологической и экологической безопасности выращивания нутрий / Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, О. Ю. Черных // Вклад фундам. исслед. в развитие соврем. инновац. экономики Краснод. края: сб. тез. конф. грантодержателей регион. конкурса РФФИ и администрации Краснод. края «ЮГ РОССИИ».- Краснодар, 2007. – С. 188-189.

  Патенты на изобретения

42. Патент 2279291 РФ, МПК А61К 39/112. Вакцина против сальмонеллеза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, Н. Е. Пак, В. И. Койков; заявл. 08.02.05; опубл. 10.07.06, Бюл. №19. – 6 с.

43. Патент 2279891 РФ, МПК А61К 39/112. Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, А. Ю. Шантыз, Н. Е. Пак; заявл. 08.02.05; опубл. 20.07.06, Бюл. №20. – 5 с.

44. Патент 2288004 РФ, МПК А61К 39/108, А61Р 31/04. Вакцина против колибактериоза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, В. В. Зайдель; заявитель и патентообладатель КубГАУ. – №2005118190/13; заявл. 14.06.05; опубл. 27.11.06, Бюл. №33(ч). – 6 с.

45. Патент 2288005 РФ, МПК А61К 39/108. Способ изготовления вакцины против колибактериоза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко; заявл. 14.06.05; опубл. 27.11.06, Бюл. №33(ч). – 5 с.

46. Патент 2292915  РФ, МПК А61К 39/116, А61К 39/112, А61К 39/108. Способ изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза и колибактериоза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, Е. А. Шиканова; заявл. 02.08.05; опубл. 10.02.07, Бюл. №4(ч). – 6 с.

47.  Патент 2292912 РФ, МПК А61К 39/116, А61К 39/112, А61К 39/09, А61Р 31/04. Вакцина ассоциированная против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, Е. А. Шиканова,  А. А. Шевченко; заявл. 02.08.05; опубл. 10.02.07, Бюл. №4(ч). – 7 с.

48. Патент 2292911 РФ, МПК А61К 39/116, А61К 39/112, А61К 39/09. Способ изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, Е. А. Шиканова; заявл. 02.08.05; опубл. 10.02.07, Бюл. №4(ч). – 6 с.

49. Патент 2292913 РФ, МПК А61К 39/116, А61К 39/112, А61К 39/108, А61Р 31/04. Вакцина ассоциированная против сальмонеллеза и колибактериоза нутрий / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко,  Е. А. Шиканова; заявл. 02.08.05; опубл. 10.02.07, Бюл. №4(ч). – 6 с.

50. Патент 2301077 РФ, МПК А61К 39/116, А61К 39/112, А61К 39/108, А61К 39/09. «Способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий» / Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, А. А. Шевченко, Е. А. Шевченко; заявл. 31.01.06; опубл. 20.06.07, Бюл. №17(ч). –  7 с.

51. Патент 2301681 РФ, МПК А61К 39/116, А61К 39/112, А61К 39/108, А61К 39/09, А61Р 1/00. «Вакцина ассоциированная против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий» / Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко, А. А. Шевченко, О. Ю. Черных; заявл. 31.01.06; опубл. 27.06.07, Бюл. №18(ч). – 8 с.

  Учебно-методические материалы и рекомендации

52. Шевченко, А. А. Ветеринарная микробиология и иммунология: метод. указания по изучению дисциплины и задания для контрольных работ студентам заоч. обучения фак. ветеринар. медицины / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2003. – 63с.

53. Шевченко, А. А. Учебно-методический комплекс для дисциплины «Болезни пушных зверей»  по специальности  111210 - «Ветеринария» фак. ветеринар. медицины  / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2005. –  16с.

54. Шевченко, А. А. Микробиология по специальности  311200 – «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции» / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2005. – 21с.

55. Шевченко, А. А. Учебно-методический комплекс для дисциплины «Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных»  по специальности  111210 - «Ветеринария» фак. ветеринар. медицины / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2005. – 35с.

56. Шевченко, А. А. Пищевые токсикоинфекции и токсикозы: учеб. пособие с грифом МСХ РФ / А. А. Шевченко, В. В. Стрельников, Л. В. Шевченко. Краснодар: КубГАУ, 2006. – 173с.

57. Шевченко, А. А. Рекомендации по профилактике и ликвидации сальмонеллеза нутрий в Краснодарском крае / А. А. Шевченко, Л. В. Шевченко,  О. Ю. Черных, Н. Е. Пак. – Краснодар: КубГАУ, 2005. – 38с.

58. Шевченко, Л. В. Рекомендации по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий в Краснодарском крае / Л. В. Шевченко, О. Ю. Черных, А. А. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2005. – 29с.

59. Черных, О. Ю. Рекомендации по профилактике и ликвидации колибактериоза нутрий в Краснодарском крае / О. Ю. Черных, Л. В. Шевченко, А. А. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2006. – 31с.

60. Шевченко, А. А.  Рекомендации по лабораторной диагностике стафилококкозов и стрептококкозов животных / А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, В.Н. Шевкопляс, Л. В. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2008. – 31с.

61. Шевченко, А. А.  Рекомендации по лабораторной диагностике энтеробактериальных инфекций животных / А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, В.Н. Шевкопляс, Л. В. Шевченко. – Краснодар: КубГАУ, 2008. – 131с.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.