WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Диссертационная работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова, Россия; в отделе биофизической органической химии Лейденского Института Химии, в отделе биофизики Лейденского Института Физики Лейденского Университета и в отделе биохимии Центра молекулярых наук

о жизни при Радбауд Наймегенском Университетском Медицинском Центрe, Наймеген, Нидерланды

Научный консультант:

Академик РАМН, доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

Академик РАН, доктор химических наук, профессор Мясоедов Николай Фёдорович Доктор химических наук, профессор Польшаков Владимир Иванович Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация: Институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится 14 марта 2011 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.

В. Ломоносова (МИТХТ) по адресу 119571, Москва, проспект Вернадского, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан ___ ____________ 2011 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Д 212.120.кандидат химических наук cтарший научный сотрудник Лютик Алла Игоревна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. В настоящее время возрастает необходимость ускорения и повышения эффективности процесса разработки новых лекарственных препаратов для борьбы с существующими, вновь рецедивирующими и возникающими заболеваниями. Наряду с этим растёт потребность в разработке новых профилактических фармакологических и диетических подходов и связанных с ними чувствительных тестов для ранней диагностики в целях предотвращения заболеваний. Для осуществления выпуска новых препаратов фармацевтические фирмы стремятся использовать более быстрые и эффективные методы их разработки и для обеспечения 4-8% годового роста продаж увеличить разработку лекарств, в среднем, от 1-1.5 до 3-5 в год. В связи с этим расширяются программы по разработке новых лекарств, которые включают высокоэффективный скрининг сотен тысяч потенциальных соединений в качестве их кандидатов, и важную роль приобретают подходы, основанные на знании структуры мишени, на которую направлены действия лекарств. Детальное определение трёхмерной структуры мишени, как полагают, сможет служить основой для моделирования in silico докинга, виртуального скрининга и дальнейшего конструирования фармакологически подходящих соединений с определённой заданной или даже новой физиологической активностью.

Имеющиеся на сегодняшний день на рынке лекарства действуют на 500 мишеней из которых более, чем 90% составляют белки-мишени. Причём более половины имеющихся на рынке лекарств действуют на мишени, представляющие собой мембранные белки класса G- белок сопряженных рецепторов (GPCR1). В то время когда на сегодняшний день согласно базе белковых структур PDB, трёхмерное строение более, чем 10,000 водорастворимых белков известно и определено такими классическими методами как кристаллография и ЯМР с разрешением выше чем 3 , пространственное строение установлено лишь для четырёх мембранных белков класса GPCR: родопсина в 2000 г., 2 и 1 адренергического рецептора человека в 2007 и 2008 г и аденозинового рецептора А2А человека в 2008 г.

В случае белков, кристаллы которых получить сложно, Ядерный Магнитный Резонанс (ЯМР) твёрдого тела является практически единственным возможным способом исследования.

Преимуществом ЯМР является также возможность изучения белков в физиологическом окружении. Структурно-функциональный анализ с помощью ЯМР позволяет получить детальную информацию о трёхмерной структуре связанного с рецептором лиганда, о его участке связывания, о взаимодействии рецептор-лиганд, в том числе, H-связывании, взаимодействии, электростатических эффектах и перераспределении зарядов. Для этих Список сокращений приведён на стр. исследований требуются миллиграммовые количества высокоочищенных белков, меченных стабильными изотопами, такими как 13C15N или их комбинации. Белки могут быть получены экспрессией соответствующей копийной ДНК в выбранной клетке-хозяине.

В настоящей работе разрабатывались методологические подходы связанные с созданием эффективных методов тотального мечения биомолекул стабильными изотопами, [USIL], а также структурно-функциональными исследований мембранных белков методами ЯМР и Фурье-ИК. Особое внимание уделено методам [U-SIL], позволяющим получить структурную информацию с помощью лишь одного образца.

Цель и задачи исследования заключалась в разработке мультидисциплинарного подхода и развитии ряда технологий для структурно-функциональных исследований мембранных белковых комплексов методами [U-SIL] и последующего вклада в рациональное конструирование лекарственных препаратов. Особое внимание уделялось доступности [U-SIL] лигандов и [U-SIL] мембранных комплексов при эффективном использовании метаболических 13 15 предшественников, полученных на базе меченных стабильными изотопами C, N H различных природных источников (бактерии, дрожжи грибы водоросли растения клеточные линии насекомых и млекопитающих). В ходе исследования были поставлены задачи:

1. Разработать методы эффективного введения стабильной изотопной метки в различные прокариотические и эукариотические источники для последующего выделения целевых2 продуктов. При этом исследовать влияние комбинации выбора природного источника, методов и условий культивирования на выход целевого продукта.

2. Разработать ряд аналитических методов для контроля воспроизводимости получения биомасс, определения их химического состава и степени включения изотопной метки.

3. Решить проблему доступности меченых соединений при их получении в клеточных линиях эукариотов. В связи с этим разработать питательные среды для эффективного [U-SIL] клеточных линий наcекомых и млекопитающих. Исследовать биотехнологический потенциал дрожжевых экстрактов как компонентов питательных сред.

4. Выбрать фармацевтически важный белок-мишень, получить его в [U-SIL] виде c использованием специально разработанных питательных сред, тем самым продемонстрировать возможность получения [U-SIL] сложных белков-мишеней для получения структурной информации.

5. Исследовать возможности стратегии [U-SIL] и показать её преимущества для дальнейшего применения в метаболомике, протеомике и структурной биологии с помощью Целевым продуктом являются низкомолекулярные и высокомолекулярные соединения, такие как пигменты, липиды жирные кислоты, стерины, углеводы, аминокислоты, пептиды, мембранные белки, а также различные экстракты полученные из клеточных биомасс и приготовленые согласно разработанным протоколам с учётом условий их дальнейшего применения.

методов MAS ЯМР, ИК и МС. Для этого выбрать объекты и изучить как [U-SIL] лиганд в мембранно-белковом комплексе, так и [U-SIL] белковый комплекс в целом.

Научная новизна заключается в разработке на основе [U-SIL] и биофизических методов исследования ряда методологий для рациональной разработки лекарственных препаратов и для ранней диагностики. В европейском патенте 2003 г, заявленном в Европе, Российской Федерации, Японии, Канаде, США, Австралии отражены композиции и методы мечения молекул стабильными изотопами. Разработаны приёмы эффективного [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых.

Замена в синтетических питательных средах для клеточных линий насекомых и млекопитающих дорогостоящих меченных стабильными изотопами индивидуальных аминокислот, органических кислот и других компонентов экстрактами биомасс из различных источников позволяет уменьшить стоимость питательных сред, по крайней мере, в пять раз с учётом лишь стоимости аминокислот. Впервые было продемонстрировано рекомбинантное получение [U-SIL] фармакологически важного рецептора класса GPCR - гистаминового рецептора человека Н1R в клеточной линии насекомых sf9 на основе разработанных питательных сред. Таким образом, открыты новые возможности для получения фармацевтически важных белков-мишеней с сохранённой биологической активностью в количествах, достаточных для структурных исследований с помощью ЯМР и получения информации для дальнейшего моделирования in silico при разработке лекарств, связанных с действием рецептора.

Эффективное биосинтетическое мечение стабильными изотопами позволяет снизить стоимость целевого продукта по сравнению со стандартными методами, тем самым обеспечивает доступность [U-SIL] биомолекул для широкого спектра исследований.

Разработанные подходы включают рациональную конверсию метаболического предшественника в целевой продукт, многократное использование культуральной жидкости создание установок по типу закрытых циркуляционных систем, контроль качества биомасс и степени обогащения. Доступность биомасс с высокой степенью обогащения позволила выделить различные меченные стабильными изотопами соединения, такие как аминокислоты пептиды липиды мембранные белки, а также получить различные экстракты биомасс.

Разработанные с помощью ИК и МС аналитические методы мониторинга роста, химического состава, оценки воспроизводимости партий биомасс, степени их изотопного обогащения позволяют изучать их химический состав, получать характеристики различных штаммов, проводить метаболическое профилирование. Это представляет собой отдельный интерес для протеомики и метаболомики в плане разработки продуктов для ранней диагностики в целях создания индивидуальных диетических программ и изучения их влияния на здоровье человека.

Практическая значимость. Показано, что специализированные [U-SIL] образцы способствуют развитию методов ЯМР, позволяют проводить эксперименты на одном образце и сократить расходы, связанные с получением целого ряда специфически меченых образцов, с использованием оборудования и с затратой времени для исследований. Возможности стратегии [U-SIL] и ЯМР твёрдого тела продемонстрированы на примере фотосинтетических объектов.

При этом была охарактеризована на атомном уровне роль кофакторов фотосинтетических белков в рамках изучения первичного процесса фотосинтеза. В ходе работы выполнены задачи разработки методологии для получения информации с помощью [U-SIL] и ЯМР твёрдого тела.

Доставка [U-SIL] образцов в различные научные и коммерческие организации послужила дальнейшему развитию ЯМР технологий (новые импульсные последовательности подходы для расшифровки сложных спектров тестирования чувствительности и разрешающей способности высоких магнитных полей), ИК, МС, а также применению стратегий [U-SIL] для биофизических и метаболических исследований. Фотосинтетические белки РЦ, CК2, СК1-РЦ использовали в Лейденском Университете и Университете Бохума для исследований методами ЯМР, Фурье–ИК и атомно-силовой спектроскопии.

Специализированные образцы были поставлены в Швейцарский федеральный институт технологии, Цюрих; Университет г. Бохум, Германия; Университет г. Ахус, Дания;

Университет в Нотингаме, Великобритания; Вайцмановский институт науки, Израиль; Макс Планк Институт, Франкфурт, Германия; Университет г. Страсбург, Франция, Университет г.

Лиеж, Бельгия, Лейденский Институт Химии Наймегенский центр молекулярных наук о жизни Университет Вагенинга и Лейден-Амстердам центр по исследованию лекарств, Нидерланды, Институт органической химии РАН им. Н.Д. Зелинского, Россия. Таким образом, новые методологии нашли применение для биомедицинских метаболических, экологических, бионанотехнологических и фундаментальных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка метода получения меченных стабильными изотопами аминокислот из гидролизатов биомасс различных источников; получение меченных стабильными изотопами фармацевтически важных пептидов на примере зервамицинов, изучение влияние условий культивирования на биосинтез пептаиболов, их исследование методом масс спектрометрии.

2. Методология [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых и получение белка-мишени на примере гистаминового рецептора H1R человека.

3. Получение и биофизическое изучение с помощью методов ЯМР в растворе и в твёрдом теле [U-13C,15N] пигментов, таких как: хлорофилл (Chl) a, феофитин (Pheo) a;

бактериохлорофилл (BChl) a, бактериофеофитин (BPheo) a.

4. Разработка рациональной и эффективной методологии получения структурной информации о лиганде в мембранно-белковом комплексе, о лиганд-белковом и лигандлигандном взаимодействии путём изучения электронной структуры, поляризации, протонирования. На примере бактериальных фотосинтетических мембранных комплексов, таких, как реакционные центры (РЦ) и светособирающий комплекс 2 (СК2) исследованы возможности: A) Методов [U-SIL] и двумерной (2D) корреляционной ЯМР для характеристики атомной структуры лиганда в мембранном белковом комплексе; Б) Фурье-ИК для изучения [USIL] лиганда в мембранном белковом комплексе, определения степени замещения лиганда в белковом комплексе и его взаимодействия с белковым окружением. Для этого разработаны условия фотонакопления HA- в РЦ; В) Изучения кофактор-кофакторного взаимодействия в СК2.

5. Разработка эффективной методологии получения информации о структуре целого мембранно-белкового комплекса c помощью [U-SIL] и 2D корреляционной ЯМР.

Личный вклад автора в диссертацию. Автором чётко выявлялась проблематика по вопросу, изучалась литература, определялись цели и задачи исследования, выбор пути их реализации, новизна, осуществлялось выполнение и анализ экспериментов, обсуждение результатов, их интерпретация и обобщение, формулирование основных положений и выводов.

Апробация работы. Материалы работы были доложены в ряде институтов и университетов, на 38 международных конференциях, съездах и конгрессах:

по стабильным изотопам: "2-я всемирная конференция по стабильным изотопам в питании и метаболических исследованиях", Ротердам, (Нидерланды, 1994); "14-й Американский пептидный Симпозиум", Колумбус, (США, 1995); "5-й Неапольский симпозиум по биологически активным пептидам", Капри, (Италия, 1996); "Конференция, посвящённая 1летию со дня рождения Преображенского", Москва, (Россия, 1996); "11-й международный симпозиум по каротеноидам", Лейден, (Нидерланды, 1996); "XI-й международный конгрессе по фотосинтезу", Будапешт, (Венгрия; 1998); "5-я Европейская конференции по биотехнологии водорослей", Потсдам, (Германия, 2003); "Симпозиум по Hansenula polymorpha", Алгеро, (Италия, 2004); "10-я международная конференция по прикладной фикологии", Кунминг, (Китай, 2005); "11-й интернациональный конгресс Фитофарм", Лейден, (Нидерланды, 2007);

EUROMAR 2008, Санкт Петербург, (Россия, 2008);

по мембранным белкам: "7-я международная конференция по ретинальным белкам", Зихрон Яков, (Израиль, 1996); "Интернациональная конференция по мембранным белкам", Амстердам, (Нидерланды, 2000); "8-я международная конференция по кристаллизации биологических макромолекул", Сандестин, Флорида, (США, 2000); "Европейский колледж:

Как получить белок"? Гронинген, (Нидерланды, 2003); "14-й Камерино Нордвикерхаут симпозиум по прогрессу в области химии рецепторов", Камерино, (Италия, 2003);

"Международная конференция Биобизнес Азия", (Тайвань, 2005); "Нидерландский инновативный семинар", Пекин, Шанхай (Китай, 2005); семинар о технологиях PLI в Биосаенс парке Кэмбриджа, (Великобритания, 2005), "Международная конференция БиоАзия 2006", Хайдарабад, (Индия, 2006) и "БиоБангалор 2006", (Индия, 2006) "XVIII Менделеевский конгресс по прикладной и общей химии", Москва, (Россия, 2007);

по спектороскопическим методам: 39-я, 40-я и 41-я конференция по экспериментальной ЯМР, Азиломар, Калифорния, (США, 1998, 1999, 2000); "3-я Европейская конференция по ЯМР биомолекул меченных стабильными изотопами", Оксфорд, (Великобритания, 1998); cимпозиум "Перенос энергии в биологических системах", Оеирас, (Португалия,1998); "3-й международный симпозиум по инфракрасной и рамановской спектроскопии", Вена, (Австрия, 1998); Лаборатория физической химии, Швейцарский Федеральный Институт Технологии, Цюрих, (Швейцария, 1999); Институт Ботаники Университета Мюнхен, (Германия, 1999); "Альпийская конференция по ЯМР твёрдого тела", Шамони МонБлан, (Франция, 1999); Симпозиум по внутреннему и внешнему переносу электрона, Вилдбад Креут, (Германия, 2000); международный симпозиум "Будущее ЯМР твёрдого тела в биологии", Лейден, (Нидерланды, 2000); Центр Томографии и Спектроскопии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Москва, (Россия, 2007), "EUROMAR 2008", Санкт Петербург, (Россия). Новые технологии по [U-SIL] и биофизическим исследованиям структуры и функций биомолекул были представлены на научном семинаре фирм Солвей Фармацевтикалз, Вейсп, (Нидерланды, 2004), ГлаксоСмисКляйн, Стивенэдж, (Великобритания, 2005) и на телеконференции Эли Лилли, (CША, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 23 научные статьи, свыше 40 тезисов научных докладов, 2 публикации в книгах, Европейский патент, заявленный в РФ, США, Европе, Австралии, Канаде, Японии, c решением 2010 г о выдаче в РФ и Австралии.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 310 страницах, содержит 33 таблиц, 89 рисунков, включает оглавление, введение, общую характеристику работы, главы - От источника к целевому продукту (1); Меченные стабильными изотопами аминокислоты и пептиды (2); Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых и млекопитающих и белки-мишени (3); Структурно-функциональные исследования мембранных комплексов: стратегии тотального мечения стабильными изотопами (4);

Заключение; Приложения. В каждой из глав представлен обзор литературы, включающий новейшие данные по рассматриваемым вопросам c общим библиографическим списком свыше 500 наименований.

Работа выполнена при поддержке грантов NWO, проекта ZonMW 014-81133 T.A. Егоровой по программе по стимулированию инновационного исследования медицинских препаратов и предпринимательства в Нидерландах, компанией PLI, Лейден.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ГЛАВА 1. ОТ ИСТОЧНИКА К ЦЕЛЕВОМУ ПРОДУКТУ: ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 13C, 15N 1.1. Потенциал меченных стабильными изотопами биологически активных соединений Развитие разрешающей способности и детекции аналитических инструментов МС, ЯМР, ИК, Рамановской спектроскопии открывают новые перспективы для применения меченных стабильными изотопами 13C, 15N, 2H, 18O целевых продуктов для решения задач в структурной биологии, протеомике, метаболомике. В данной работе рассмотрены вопросы специфики эффективного введения стабильной изотопной метки 13C, 15N, H для различных организмов, как прокариот (археи, бактерии), так и эукариот (грибы, водоросли, клеточные линии насекомых и млекопитающих), изучения химического состава биомасс, выделения целевых продуктов, определения степени обогащения и последующего биофизического исследования.

Особое внимание уделялось разработке методик и подходов по эффективному [U-SIL] в клеточных линиях насекомых и млекопитающих, как наиболее перспективных для производства функциональных белков-мишеней и терапевтических белков, а также по получению экстрактов для метаболического профилирования. Выбор микробиологического источника и условий культивирования являлся определяющим параметром, приводящим к определённому составу биомассы для выделения различных биологически активных соединений (Рис. 1, Таб. 1). Полученные в работе соединения характеризовали и исследовали с помощью биофизических методов ЯМР, Фурье-ИК, МС.

Аминокислоты Неоксантин Светособирающий комплекс Стеролы Виолаксантин Реакционные центры ПНЖХ Лютеин Аминокислоты -Каротин -Каротин BPheo a Бастериородопсин Зервамицины Pheo a Pheo a, Pheo b BChl a Аминокислоты Chl a Chl a, Chl b Водоросли Растения Бактерии Археа Дрожжи Грибы Компоненты Компоненты Компоненты Компоненты ростовых сред ростовых сред ростовых сред ростовых сред Разработка питательных сред для роста клеток насекомых и млекопитающих Клеточные линии млекопитающих Клеточные линии насекомых Гистаминовый рецептор H1R человека Рис. 1. Выборочные примеры получения целевых продуктов, меченных стабильными изотопами.

Таблица 1. Источники для получения (меченных стабильными изотопами) целевых продуктов Таксономическая принадлежность Вид Фототрофные пурпурные несерные бактерии Rhodobacter sphaeroides R-(Rhodospirilleae) Rhodopseudomonas acidophila 100 Rhodopseudomonas palustris 170Археи, экстремальные галофильные бактерии Halobacterium salinarum ATCC 293Метилотрофные облигатные бактерии Methylobacillus flagellatum ATCC 514 Methylobacterium extorquens 8PM Метилотрофные факультативные бактерии Brevibacterium methyllicum B56Красные водоросли Cyanidium caldarium SAG 16.(Rhodophyta) Galdiera sulfuraria SAG 17. Porphyridium purpureum ATCC 501Диатомовая водоросль Phaeodactylum tricornutum UTEX 6 (Bacillariophyta) Зелёные водоросли Chlorella viridus ATCC 164(Chlorophyta) Scenedesmus obliquus CCAP 276/3C Синезелёная водоросль Spirulina platensis UTEX 6 (Cyanophyta) Бурые водоросли Undaria pinnatifida KU-2(Phaeophyceae) Dictyota dichotoma KU-10 Ectocarpus siliculosus KU-11Растение Chenopodium rubrum (Chenopodiaceae) Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris NRRL-Y-114 Hansenula polymorpha CBS 47 Saccharomyces cerevisiae ATCC 130Гриб Emericellopsis salmosynnemata 336 IMI 583Клеточная линия насекомых Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) CRL-17 Chinese hamster ovarian (CHO) ATCC CC1-Клеточные линии млекопитающих Human embryonic kidney (HEK 293) ATCC CRL-15Следует отметить растущую значимость потенциала водорослей как источника меченных стабильными изотопами биологически активных соединений. На примере культивирования бактерий была показана зависимость между условиями культивирования и выходом целевых продуктов, таких как мембранно-белковые компелексы. Были подобраны условия для получения автолизатов из биомасcы дрожжей для их применения в качестве компонентов сред для клеточных линий насекомых и млекопитающих. Разработан мониторинг состава биомасс из различных природных источников с помощью анализа методом Фурье-ИК.

1.2 Водоросли для биотехнологии: от вида к продукту В настоящее время растёт популярность выделения различных биологически активных веществ из водорослей. Водоросли исследуются как источники фармакологически активных соединений и других высокоценных молекул, как например, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), пигменты, такие как хлорофилл, -каротин, астаксантин и фикобилипротеины, стерины, витамины, такие как A, B1, B2, B6, B12, C, E, никотинат, биотин, фолиевая и пантотеновая кислоты, полисахариды, токсины и другие соединения. Известно применение экстрактов водорослей в медицинских целях. Водоросли, как, например, Chlamydomonas reinhardtii, представляют собой клеточные фабрики для производства терапевтических и биотехнологических белков. Ожидается растущий рынок новых лекарственных препаратов на основе водорослей. Фотосинтетическая природа и популярность водорослей позволяет производить на их основе меченную стабильными изотопами 13C, 15N, 2H 15 биомассу из относительно недорогих неорганических молекул (13CO2, NO3-, H2O) для последующего получения высокоценных молекул. С учетом того, что цена CO2 ($34 за 1 г CO2, $117 за 1 г 13C) ниже цены [U13C6] глюкозы ($140 за 1 г [U13C6]-D-глюкозы, $350 за 1 г C), фотоавтотрофное получение меченых соединений из различных водорослей представляет собой экономический интерес.

Штаммы водорослей использовали из коллекции культур водорослей и простейших (CCAP), из коллекции культур Университета Техас, США, и Университета Кобе, Япония (Таб.

1). Выбор штамма водорослей был основан на составе их биомасс при заданных условиях выращивания с учётом потенциального применения различных продуктов на их основе:

компонентов питательных сред для клеточных линий насекомых и млекопитающих, выделения индивидуальных аминокислот, пигментов, ПНЖК и фитостеролов. Водоросли культивировали в фотоавтотрофных условиях. В случае C. caldarium и G. sulphuraria в качестве источника 15N использовали (15NH4)2SO4, N 99%, ("Cambridge Isotope Laboratories", США), и в качестве источника 13C -13CO2, 13C 99%, ("Gas-Oil", Калининград, Россия). Эксперимент по 15N-мечению 13 13 проводили в ёмкостях объёмом 10 л каждая, а для введения C и C, N использовали специальные установки, представляющие собой две соединённые между собой с помощью силиконового шланга колбы пеницилинового типа ("Scott Duran") объёмом 8 л каждая или колб объёмом 1 л. В обоих случаях использовалась качалка Gio Gyrotory, "New Brunswick Scientific", выращивание проводили при температуре 27 C при 40 об/мин. Освещение подавалось от 12 ламп Osram HQL-A 80 W, закреплённых на специальном каркассе сверху культур, на расстоянии 60 см, и составляло 8000 Люкс. CO2 поступал в систему из резинового балона ("Oxford Instruments", Великобритания) с помощью насоса (Anker, типа N853 KTE). Перед выполнением экспериментов через всю систему пропускали аргон.

Инокулят выращивали при температуре 25 C и интенсивности света 3000 Люкс, его использовали в объёме 0.05% для выращивания биомассы. Процесс проводили в течение нескольких месяцев, что позволяло получать в лабораторных условиях более 1 кг влажной [USIL] биомассы. Примеры включают получение биомасс S. obliquus, G. sulfuraria, C. caldarium.

На Рис. 2 показано определение степени обогащения [U-15N] C. сaldarium методом LC-MS/MS.

(M+2H)2+ N, природное "GEFLSNTQLDALS" (C66 H109 N17 O24) белка PHCB_CYACA N, 99% (M+2H)2+ Рис. 2. Оценка введения изотопной метки 15N в [U-15N] биомассу С. caldarium. По результатам LC-MS/MS анализа трипсинового лизата биомассы, степень обогащения N составляет 99% в случае [U-15N] биомассы, что соответствует теоретическим расчётам изотопного распределения.

Белковые экстракты природной и [U-15N] биомасс обрабатывали трипсином ("Roche Diagnostics") и анализировали методом LC-MS/MS с использованием системы UltiMate 30Proteomics MDLS ("Dionex") и системы ионных ловушек amaZone ("Bruker Daltonics").

Идентификацию белков проводили на природном образце с использованием Mascot 2.2, ("Matrix Sciences Inc") и базы данных NCBI. На Рис. 2 в качестве примера обозначены пики 761.8 m/z (M+2H)2+ и 770.3 m/z (M+2H)2+, соответствующие пептиду с последовательностью "GEFLSNTQLDALSK" из природной и [U-15N] биомассы.

Для проведения контролируемого процесса использовали фотобиореактор (0.14 м x 0.м, 0.01 м3) с рециркуляцией газа при низком давлении с помощью насоса. В биоректоре выращивали микроводоросль P. tricornutum и получали [U-15N], [U-13C] и [U-15N,13C] биомассы.

Свежую среду приготавливали из морской воды, из которой удаляли углерод. Инокулят выращивали при искуственном свете (230 µEм-2сек-1) и температуре 20 °C на среде Мана и Майера и использовали в объёме 5% для засева в фотобиореакторе. Для получения [U-15N] биомассы использовали Na15NO3, 15N 98%, ("Isotec", США) в качестве источника 15N. Реактор функционировал в полунепрерывном режиме при периодическом отборе культуры и замене её свежей средой с производимостью 0.3 г/л биомассы в день. С помощью данного процесса получили более 160 г [U-SIL] биомассы. Для повышения эффективности использования меченых субстратов, осуществляли реутилизацию неорганического углерода из супернатанта с помощью процесса подкисления/десорбции, а также использовали Na15NO3 в минимальных концентрациях. Биомассу собирали после исчерпывающего использования 15NO3-.

По данным элементного анализа конверсия СO2 в биомассу составила 89.2%, а его количество в супернатанте составило 6.9 %. Эффективность конверсии N в биомассу составила 97.8 %, а содержание в супернатанте - 1.3 %. Эффективность введения изотопной метки C определяли после метилирования свежей биомассы по уровню мечения жирных кислот с помощью GC-MS с использованием колонок Agilent CG-6890N и MS-5973N размером 30 м x 0.25 мм, покрытых 5% фенилметилсиликоном и He в качестве газа-носителя. Степень обогащения жирных кислот составляла для 14:0 98.6%, 16:0 99.3%, 16:1 98.7%, 18:1 99%, 20:99.1%. Пример масс-спектров для C14:0 приведён на Рис. 3. Эффективность использования меченых субстратов составила 90%, эффективность мечения стабильными изотопами 15N и 13C выше 96%, что позволяет выделять различные соединения с высокой степенью обогащения в целях их применения для медицинских и биохимических исследований.

Примеры включают получение [U-SIL] гидролизатов для последующего выделения индивидуальных аминокислот (глава 2), получение экстрактов для составления питательных сред в целях эффективного мечения клеточных линий млекопитающих и насекомых (глава 3), получение стеринов, жирных кислот, а также хлорофилла и феофитина в целях изучения лиганд-белковых взаимодействий в фотосинтетических мембранных комплексах (глава 4).

Рис. 3. GC-MS спектр С14:0 жирных кислот, 2500выделенных из биомассы P. tricornutum: природной и No 13C-labelled C, природное [U-13C] (13C 98%).

20001500Таким образом, нами учитывалась 1000взаимосвязь между выбором вида водоросли, 500влиянием условий культивирования на выход целевого продукта, а также эффективность 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 3m/z 2500конверсии меченных стабильными изотопами 98% of 13C-labelled C, 98% 2000предшественников. Всё большую актуальность 1500приобретают [U-SIL] соединения из водорослей 1000в качестве стандартов для исследований, как в экологии, так и в диагностике. Помимо этого, 500разработка методов эффективного [U-SIL] 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 3m/z является весьма актуальной в связи с прогнозируемым увеличением количества лекарств на основе водорослей.

Abundance 112211111111111112A bundance 1222111111 1.3 Археи и бактерии Изучение пигментов и мембранных белков фотосинтетических бактерий методами ЯМР и ИК обсуждается в главе 4. Использовали пурпурные несерные бактерии Rps. palustris, Rps.

acidophila, Rb. sphaeroides, принадлежащие к Proteobacteria. [U-13C,15N] биомассу из Rps.

palustris получали культивированием на среде, содержащей [U-13C,15N] гидролизат водорослей (EMBL). [U-13C,15N] биомассу Rps. acidophila получали при росте на среде, содержащей [UC,15N] гидролизат водорослей и [U-13C,15N] сукцинат аммония.

Rps. acidophila культивировали анаэробно при температуре 35° C и различной освещённости. После 4 дней культивирования при достижении клетками при 860 нм OD 2см-1 или 270 см-1 при освещённости 1000 люкс и 3000 люкс соответственно клеточную биомассу собирали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 10 минут. СК2 и СК1-РЦ выделяли по стандартной методике и концентрировали с помощью Centricon Plus-20 на фильтровальной установке (Biomax 100, 100.000 NMWL, "Millipore") до достижения OD 300500 см-1 при 850 нм для СК2 и 880 нм для СК1-РЦ. Мембранные комплексы хранили при температуре -80 °C. Чистоту белков характеризовали определением соотношения ODB850/OD2для СК2 и ODB880/OD270 для СК1-РЦ, которое составило 3.2-3.5 и 1.7-2.2 соответственно в зависимости от расположения фракций вдоль градиента. Изменение интенсивности света при культивировании позволяло изменять соотношение между комплексами. Было найдено, что, соотношение между СК2 и СК1-РЦ изменялось от 8:1 до 4:1 при интенсивностях света 10Люкс или 3000 Люкс. При изучении стабильности было показано, что СК2 более устойчив к изменению температур по сравнению с СК1-РЦ, в случае СК1-РЦ наблюдали, что при 4 °C соотношение ODB880/OD270 уменьшалось вплоть до 0.5 за 24 часа. Это учитывали при выделении мембранных комплексов и их изучении.





Было уделено особое внимание эффективности введения SIL, а также масштабированию процесса. Пример оценки 2H в [U-2H] B. methylicum показан на Рис. 4.

Рис. 4 ИК спектры биомассы археи B. methylicum: [U-2H] * (a) и природной (б). Обозначен сдвиг вибрационных полос С-H в области 2800 см-1 в область 2260 см-1 в результате С-2H.

Введение изотопной метки 2H составило не мене 96%.

б Примером служит получение [U-2H] биомасс H.

а salinarum в биореакторе объёмом 0.5 л культивированием * на среде, содержащей 2H2O (I.E. 99,85%, "Изотоп", РФ) и Длина волны (см-1) [U-2H] автолизат M. flagellatum, с выходом биомассы не менее 6 г/л. Степень 2H обогащения оценивали методом MALDI MS по содержанию 2H в 2,3ди-О-дифитанил-глицерине, которое составило 96,6%. Получение пурпурных мембран и [U-2H] бактериородопсина расширяет возможности для их использования в бинанотехнологии.

Поглощение (OD) 1.4 Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред Известен целый ряд клеточных фабрик для производства терапевтических белков и белков-мишеней. Примерами являются бактерии, как E. coli, дрожжи, клеточные линии насекомых и млекопитающих. Также описана экспрессия белков в растениях и фотосинтетических бактериях. Успешно развивается система бесклеточной экспрессии генов для водорастворимых белков, но её применение для эукариотических мембранных белков ограничено. Питательные среды для клеток-хозяев отличаются составом и метаболическими предшественниками, необходимыми для достижения высокой степени SIL. Системы экспрессии, обеспечивающие как милиграммовые количества функциональных белков, так и доступное [U-SIL], основаны на E. сoli и дрожжах, поскольку питательные среды для их роста характеризуются простым составом и содержат 15N соли аммония и 13C глюкозу, метанол, или ацетат в качестве источника азота и углерода. Однако, получение белков в функциональном виде в этих клетках-хозяевах, в том числе большинства мембранных белков, является непростой задачей ввиду агрегации с телами включения, требованиями шаперонов для фолдинга или отсутствия соответствующей посттрансляционной модификации. Наиболее часто для этих целей используются клеточные линии насекомых и млекопитающих, но для их культивирования требуются питательные среды довольно сложного состава.

Прямое замещение индивидуальных аминокислот и других метаболических предшественников в средах известного состава на меченные стабильными изотопами аналоги привело бы к стоимости сред от 20,000 до 100,000 Eur за один литр. Это представляет собой финансовый барьер для [U-SIL] эукариотических мембранных белков, особенно с учётом их сравнительно низкого уровня экспрессии в функциональном виде и необходимостью получать миллиграммовые количества очищенных белковых препаратов для структурных исследований.

Использование бакуловирусной системы экспрессии (BVES) для клеточных линий насекомых, например, позволяет достичь функциональные уровни экспрессии от 0.1 мг/л для рецептора аденозина человека A1 до 5 мг/л для гистаминового рецептора человека H1R. Похожий уровень экспресси наблюдается и в клетках млекопитающих.

В связи с этим возникает необходимость в разработке эффективного и доступного метода для мечения эукариотических мембранных белков стабильными изотопами. Наш подход для клеток насекомых и млекопитающих основан на составлении сред, содержащих высококачественные [U-13C,15N] дрожжевые экстракты в качестве более дешёвых компонентов по сравнению с индивидуальными аминокислотами и органическими кислотами. С использованием контролируемых условий выращивания в биореакторе было проведено сравнение трёх штаммов дрожжей H. polymorpha (ATCC #34438), P. pastoris (ATCC #76273) и S.

cerevisiae (ATCC #13057) с учётом конверсии глюкозы в биомассу, выхода экстрактов и их влияния на рост клеток насекомых и млекопитающих. Оценку воспроизводимости партий биомасс и контроль их качества проводили методом ИК. Введение изотопной метки определяли с помощью Фурье-ИК (Рис. 5) и LC-MS/MS (Рис. 6).

Рис. 5. ИК спектры биомассы H. polymorpha: [U-15N] (a), [U-13C,15N] (б) и природной (в). Коррекция базовой линии выполнена при 1950 cm-1. Введение изотопной метки составило не менее 98% по 15N и 99% по 13C.

в Значительные сдвиги амида I (в основном, б представляющие валентные колебания СO, 1620-16а см-1) и/или амида II (деформационные колебания пептидной связи NH и CN, 1520-1560 см-1) в ИК спектре свидетельствуют о высокой степени Длина волны (см-1) изотопного обогащения 13C и 15N. На примере [U-15N]Hp показан заметный сдвиг амида II и на примере [U-13C,15N]Hp показан заметный сдвиг как амида I, так и амида II по сравнению с колебательными полосами для природной Hp (Рис. 5).

Дрожжи культивировали с использованием среды "Invitrogen" и среды, описанной Хайне и соавторами для N мечения. Поскольку наличие молочной кислоты в составе этой среды не оказывает значительного влияния на выход биомассы, при проведении 13C и 15N, 13C экспериментов её исключали из состава, и в качестве источника C использовали [U-13C6] 15 глюкозу (13C 99%, "CIL"). Источником N служил NH4Cl (15N 98%+, "Sigma Aldrich"). В качестве основы для приготовления новых сред использовали супернатант предыдущей клеточной культуры, при этом компоненты среды, за исключением NH4Cl, добавляли в концентрациях соответствующих среде Хайне. Среды автоклавировали в течение 50 минут при o 121 °C. Биопроцесс проводили при температуре 30 C в биореакторе (Bioflo3000; "New Brunswick Scientific") объёмом 5 л с контролируемыми параметрами. Биореактор засевали 510% культурой. Использовали статический режим и его комбинацию с режимом с подпиткой.

Мониторинг роста клеток производили измерением OD при 600 нм и веса влажной биомассы.

Режим с подпиткой инициировали после фазы статического режима при добавлении в культуру 50% (w/v) раствора глюкозы со скоростью 3.64 мл/ч в режиме градиета от 1 до 10 % в течение 2 часов с последующим добавлением 10% глюкозы до её полного усвоения и последующего роста в течение 3–12 часов. Биомассу собирали центрифугированием в течение 15 минут со скоростью 5000 x g. Супернатант отделяли, биомассу промывали 20 мл miliQ воды и центрифугировали в течение 15 мин при 5000 x g. Биомассу хранили либо в замороженом виде при 20 °C или лиофилизованном виде. Выход биомассы соcтавлял 12-18 г/л, конверсия глюкозы - 38-44 % в пересчёте на сухой вес, причём выход в режиме с подпиткой был на 2535% выше по сравнению со статическим.

Интенсивность поглощения (OD) N "IINEPTAAAIAYGLDK" "SSGSSYPSLLQCLK" природное (C75 H124N18O24) белка TRYP_PIG 13 белка HSP71_PICAN С природное N,99% N,99% С 99% 15 Рис. 6. Оценка введения изотопной метки N и С в [U-15N], [U-15N,13C] биомассу H.

polymorpha. По результатам LC-MS/MS анализа трипсиновых лизатов биомасс, степень обогащения 15 составляет 99% для N и 99% для С, что соответствует теоретическим расчётам изотопного распределения. Пики 830.4 m/z, 839.4 m/z и 877.0 m/z соответствуют пептиду "IINEPTAAAIAYGLDK" из природной, [U-15N] и [U-15N,13C] биомасс. Пик 763.9 m/z присутствует во всех спектрах и относится к пептиду фермента трипсина ("Roche Diagnostics"), который использоли для гидролиза.

Для экстракции дрожжей использовали 12 г влажной биомасcы, суспендированной в мл milliQ в ёмкости объёмом 50 мл ("Greiner") с последующим озвучиванием в течением 5 мин ультразвуком. Экстракцию проводили 2% (об/об) этанолом при температуре 50 oC в течение часов при pH 8. Супернатанты фильтровали через 10,000 cut-off мембранный фильтр, а затем лиофилизовали. Экстракты получали с выходом 32-37%. Экстракты, приготовленные из биомасс, полученных в режиме с подпиткой, имели наилучшие показатели в качестве компонентов питательных сред. За основу была выбрана описанная методика их приготовления при начале режима подпитки после 16 ч культуры в стационарной фазе. При этом в целом использовалось 22.5 г глюкозы при 20 ч выращивании, и конверсия глюкозы в биомассу составляла 34-37%.

Клеточные линии бабочки-совки S. frugiperda Sf9 и млекопитающих (яичников китайского хомячка, CHO, и почек эмбриона человека, HEK 293) использовали для тестов дрожжевых экстрактов как компонентов среды. Использовали бессывороточные среды известного состава: IPL-41 для Sf9 и DMEM/F12 для CHO и HEK-293 ("Invitrogen"), где коммерческий дрожжевой экстракт в среде IPL-41 или индивидуальные аминокислоты и органические кислоты в среде DMEM/F12 заменяли приготовленным согласно разработанной методике дрожжевым экстрактом. Для определения оптимальных концентраций тестировали различные концентрации экстракта: 0.10%, 0.40%, 0.80%, 1.00% и 1.20%. Каждую лунку 96– луночных планшет заполняли Sf9 клетками в среде X-press ("Lonza Benelux") или CHO или HEK 293 в DMEM/F12 при плотности 2x104 клеток на ячейку. Клеточные линии Sf9 и HEK2инкубировали 12 ч в увлажнённом контейнере при температуре 27 C или 37 C соответственно.

Затем среду заменяли 100 мкл среды на основании IPL-41 или DMEM/F12 с добавлением экспериментального экстракта и инкубировали в течение 3 дней. Клеточную жизнеспособность и рост определяли добавлением 10 мкл реагента WST-1 ("Roche Diagnostics"). По истечении 0.5, 1, 2 и 4 ч измеряли OD при 450 нм, в качестве стандарта использовали OD при 655 нм.

Наилучший рост Sf9 отмечался при использовании 0.4% экстракта из H. polymorpha (Рис. 7).

Для роста HEK 293 оказались подходящими экстракты из H. polymorpha и S. cerevisiae (Рис. 8).

Рис. 7. Сравнение влияния дрожжевых экстрактов на рост клеточной линии Sf9. Экстракты P. pastoris (1), H.

polymorpha (2), S. cerevisiae (3) исследовались при концентрациях 0.1%, 0.4%, 0.8%. Скорость роста в среде IPL41 с коммерческим экстрактом ("Sigma Aldrich") принята за 1.

Представлены средние значения трёх независимых экспериментов.

Концентрация экстрактов дрожжей, % Рис. 8. Влияние дрожжевых экстрактов на рост HEK 0.1% 0.4% 293. Использовали среды следующего состава: 1-DMEM/F12;

2-DMEM/F12 с коммерческим экстрактом. 3-DMEM/F12 с экстрактом из H. polymorpha; 4-DMEM/F12 с экстрактом из P.

pastoris; 5-DMEM/F12 с экстрактом из S. cerevisiae.

Экстракты добавляли в концентрациях 0.1% и 0.4%.

Представлены средние значения пяти независимых экспериментов. Сходные результаты были получены для CHO.

Таким образом, разработан метод получения Питательные среды для НЕК 2экстрактов и исследовано их использование в качестве компонетов питательных сред.

Показано, что экстракты на основе H. polymorpha оказали наибольший положительный эффект при выращивании Sf9, а для CHO и HEK293 наилучшие свойства проявили экстракты на основе S. cerevisiae и H. polymorpha. Экстракты из биомассы, полученной в режиме выращивания с подпиткой и при её сборе в конце логарифмической фазы роста, проявляли наилучшие свойства. Аналитические исследования по скринингу открыли новые возможности для эффективного мечения в эукариотических клетках-хозяевах в целях производства белковмишеней и фармацевтически важных молекул. Например, замещением индивидуальных аминокислот в среде DMEM/F12 на 0.1 % автолизат H. polymorpha уже можно достичь сокращения расходов по формулированию питательных сред для [U-SIL], по меньшей мере, в пять раз, основываясь лишь на стоимости индивидуальных аминокислот.

-450– 6Активность A A (OD) -450– 6Активность A A (OD) 1.5 Мониторинг состава биомасс из различных источников с помощью ИК При работе с микробиологическими источниками важен аналитический метод контроля качества партий биомасс, а также метод определения их химического состава. Основные классы биомолекул (белки, липиды, углеводы) могут быть охарактеризованы с помощью колебательной спектроскопии ввиду их поглощения в различных частотных диапазонах средней ИК области, за счёт характерных полос поглощения колебаний характеристических групп: 1500-1700 см-1 для полос амида I (валентных колебаний СO) и амида II (деформационных колебаний CN и NH амидной группы пептидов); 1700-1750 см-1 для валентных колебаний C=O групп в сложных эфирах липидов и 2800-3000 см -1 для валентных колебаний CH ацильных цепей липидов; 1000-1200 см-1 для колебаний C-OH и C-O-C групп углеводов. По сравнению с дальней ИК областью, бльшее количество полос и с лучшим разрешением может быть получено в средней ИК области. В результате исследований разработан ИК метод для определения состава биомасс из различных источников.

Биомассы были предоставлены компанией "Protein Labelling Innovation (PLI)", Нидерланды. В качестве стандартов использовали креатин фоcфокиназу из мышцы кролика, EC 2.7.3.2 ("Boehringer"), яичный фосфатидилхолин ("Avanti Polar Lipids") и солодовый экстракт из крахмального гидролизата (CAS 8002-48-0, "Sigma-Aldrich"). Выбор основан на схожести соответствующих областей спектров стандартов и биомасс. Например, при выборе белка-стандарта сравнивали ИК спектры биомассы со спектральной библиотекой белков c известной вторичной структурой, основанной на данных кристаллографии. Схожесть амидной области в ИК спектрах креатин фосфокиназы и биомасс изучаемых источников показана на Рис. 9. С помощью стандартов получали калибровочные кривые.

Рис. 9. Сравнение ИК-спектров биомасс и стандарта: креатин фосфокиназы (а); Cc (б); Hp (в).

Выявлены колебательные полосы амида I и амида II в области 1655 и 1545 см-1. Основные различия в около 2900 и 1240 см-1 связаны с вкладом липидов в препаратах различных биомасс. На спектре в) показана углеводная полоса в области 1080 см-1.

б а В ИК спектрах преобладают колебательные полосы амида I и амида II в области 1658 см-1 и 1545 см-1 соответственно, Длина волны (см-1) форма которых зависит от вторичной структуры белков в образце. Полоса амида II служит основанием для количественного определения содержания белка. Более того, она характеризуется лучшим линейным ответом, особенно для белков с высоким содержанием -спиральных сегментов.

Поглощение (OD) Как правило, 0.5 мг измельчённой лиофилизованной биомассы суспендировали в 0.4 мл воды и наносили на кюветы с окнами из AgCl ("Fisher Scientific"), с последующим упариванием воды в течение 2-3 ч с помощью изопотенциальной спиновой сушки и получением сухой плёнки. Поскольку получение гомогенного препарата имеет решающее значение, образцы готовили также в виде сухой плёнки путём равномерного распределения суспензии объёмом 150 мкл на AgCl окнах для достижения кругового распределения образца диаметром 12.3 мм c последующим высушиванием в вакууме над силикагелем ("Merck"). ИК спектры были получены при комнатной температуре на спектрометре Mattson Cygnus 100 FTIR ("Madison Instruments", США), оборудованном узкополостным MCT детектором, охлаждаемым жидким азотом. Использовали следующие параметры: разрешение, 2 см-1; число суммарных интерферограм, 256; скорость движения зеркала, 1.27 см/сек; диапазон волновых чисел, 4000-750 см-1. Получение и обработку результатов спектрального анализа проводили с использованием программного алгоритма обработки данных EXPERT IR (Mattson), для проверки применяли OPUS-NT 5.0 ("Bruker"). Статистический анализ выполняли с использованием MATLAB 7.3.0 ("The Matworks Inc."). ИК-метод компьютеризирован и требует менее двух минут для регистрации спектра. В Tаб. 2 представлены результаты ИКисследований состава биомасс из источников различной таксономической принадлежности.

Таблица 2. Результаты ИК анализа состава биомассы из различных источников. Представлены средние значения трёх независимых экспериментов. Для образцов, измеренных элементным анализом, количество N (%N*6.25) указано в скобках.

Источники Сокращённое название Белки, % Липиды, % Углеводы, % C. caldarium Cc 61±2 (72) 18±2 21±G. sulfuraria Gs 68±3 7±1 25±C. viridus Cv 22±1 18±2 61±S. obliquus So 33±3 24±2 43±P. tricornutum Pt 41±3 (40) 29±2 30±S. platensis Sp 12±1 (27) 15±2 69±M. extorquens Me 75±2 (77) 16±2 9± H. polymorpha Hp 52±2 (39) 18±3 30±P. pastoris Pp 11±2 (14) 10±1 79±S. cerevisiae Sc 48±2 (50) 18±2 34±Содержание белка определяли по площади под профилем полосы амида II в области 1545 см-1. Ввиду гетерогенного состава липидов в различных источниках, их содержание определялось интегрированием популяции колебаний C-H в области между 2984 и 2780 см-1.

Содержание углеводов определялось интегрированием полос C-OH в области 1180 и 1133 cm-1.

В результате линейного регрессионного анализа были получены калибровочные графики, в соответствии с которыми анализировали состав биомасс. С учётом коррекций базовой линии и последующим интегрированием в области колебаний 1590 и 1477 см-1 на образцах с известным содержанием креатин фосфокиназы была получена калибровочная линия (Рис. 10).

Интеграционные пределы выбирали с учётом возможности измерения SIL белков.

Количественный анализ липидного содержания проводили путём определения площади под полосой при 2854 см-1 (симметричные C-H валентные колебания -CH2- групп, в основном, в липидной ацильной цепи). Применяли двухточечные коррекции интервала базовой линии в области от 2880 до 2830 см-1 для предотвращения перекрытия с небольшими вкладами в поглощение симметричных валентных колебаний связей метильных групп. Поскольку в некоторых случаях полоса при 2854 см-1 проявляется слабо в виде неразрешённого плеча, была использована полная область C-H валентных колебаний (2984 - 2780 см-1), представленная колебательными полосами групп CH2- и -CH3. На основании спектра креатин фосфокиназы (Рис. 11) видно, что колебания белка вносят вклад в область от 2984 до 2780 см-1, в основном, за счёт колебаний метильных групп в боковых цепях нейтральных аминокислот. В результате липидная фракция может быть несколько переоценена. Из соотношения площади области 2780-2984 и области амида II в спектре креатин фосфокиназы определили, что вклад белковой части в область C-H колебаний в спктрах биомасс составляет 40 ± 10% от области амида II.

Содержание липидов определяли вычитанием вклада белковой части из общей интегрированной площади в области 2780-2984 cм-1 (Рис. 11).

Присутствие углеводов в образцах биомасс оценивали на основании сложной, но характерной группы полос в области между 1185 и 950 см-1 (Рис. 12). В связи с перекрытием многих полос в этой области, трудно достичь более детального соотнесения сигналов. Хотя для количественного определения углеводов известно использование основной колебательной полосы в области 1080 см-1, этот подход не является подходящим в качестве общего метода, поскольку в этой же области выявлены -PO2- симметричные колебания фосфолипидов и ДНК, а также Si-O колебания, характерные, например, для биомасс диатомовых водорослей. В ИК спектре наблюдается характерная полоса в области 1150 см-1 C-O валентных колебаний.

Несмотря на то, что состав углеводов в биомассах сильно варьирует, в ходе исследования был проведён полуколичественный анализ. Интегрирование полосы при 1151 см-1 в области между 1180 и 1133 см-1 с использованием двухточечного интервала привело к высокому коэффициенту корреляции. Значение погрешности составили ±0.06 (Рис. 12). Первоначально общее количество белков, липидов и углеводов принимали за 100 %, при этом не учитывали содержание аминокислот, нуклеиновых кислот и других метаболитов. Данные ИК сравнивали с результатами CHNOS элементного анализа.

А) Б) Рис. 10. А) Характерные полосы амида I и амида II в ИК спектрах для креатин фосфокиназы (а); Cc (б); Hp (в).

в Основное отличие в области 1450 и 1740 см-1 объясняется вкладом липидов а препаратах биомасс. Вертикальные линии показывают границы интегрирования и их положение б на базовой линии. Б) Калибровочный график для определения содержания белка в препаратах биомасс.

Показана зависимость площади под полосой амида II в а области от 1580 и до 1485 см-1 от количества белка в образце (в мг).

Длина волны (см-1) Содержание белка (мг) А) Б) Рис. 11. A) Характерные полосы C-H валентных в колебаний в ИК спектрах для для яичного фосфатидилхолина (а) (полоса при 3015 см-1 представляет CH колебания в cis ненасыщенных ацильных цепях, в спектре б биомасс эта полоса практически не выражена); Cc (б); Hp (в).

Вертикальные линии показывают интегральные границы и их положение на базовой линии. Б) Калибровочный график для определения содержания липидов в препаратах биомасc.

а -Площадь под полосами между 2984 и 2780 см отражает количество липидов в образце (в мг).

Длина волны (см-1) Содержание липидов (мг) А) Б) Рис. 12. А) Характерные полосы валентных C-O и O-H деформационных колебаний углеводов в ИК спектрах в для гидролизате крахмала (а); Cc (б); Hp (в). Вертикальные линии показывают границы интегрирования. Б) б Калибровочный график для определения содержания углеводов в биомассах. Площадь под полосами между 11а и 1133 см-1 отражает количество углеводов в образце (в мг).

Длина волны (см-1) Содержание углеводов (мг) Выявили, что для большинства биомасс (Pt, Me, Pp и Sc), данные ИК находятся в хорошем согласии с элементным анализом, но для Hp, Cc и Sp наблюдали некоторые отклонения (10-16%). В случае, когда присутствуют значительные количества других азотсодержащих соединений, таких как, например, короткие пептиды, аминосахара, хлорофиллы, фосфолипиды и нуклеотиды, белковое содержание может быть переоценено. ИК метод позволяет селективно определять содержание белка с воспроизводимостью ± 3%, в зависимости от выбора стандарта. Было найдено, что содержание белка в Cc, Gs и Me превышает 60 %, а бимассы Pt и So содержат сравнительно много липидов.

Также показали, что для негомогенных образцов более подходящим является метод ATR.

Таким образом, был разработан довольно простой и быстрый полуколичественнный ИК метод определения химического состава биомасс, который позволяет осуществлять контроль воспроизводимости партий биомасс, выбирать источники, изменять условия выращивания в зависимости от целевого назначения биомассы, например, для выделения аминокислот из белковых гидролизатов, или ПНЖК из биомасс с их высоким содержанием в липидной фракции. Метод применим к биомассам, меченным стабильными изотопами (15N, 13C, 2H).

-15Поглощение (OD) Площадь A ( см *OD) --29Поглощение (OD) Площадь A ( см *OD) -( см *OD) Поглощение (OD) Площадь A -11ГЛАВА 2. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ АМИНОКИСЛОТЫ И ПЕПТИДЫ ДЛЯ ПРОТЕОМИКИ И СТРУКТУРНОЙ БИОЛОГИИ 2.1. Меченные стабильными изотопами аминокислоты Доступность меченных стабильными изотопами аминокислот расширяет возможности их использования для протеомики при различных стратегиях мечения, таких как SILAC, U-SIL, а также для структурной биологии. Нами был разработан новый метод препаративного выделения индивидуальных аминокислот в миллиграммовой шкале, основанный на ОФ-ВЭЖХ с использованием предколоночной модификации с помощью карбобензоксихлорида (Z-Cl).

Метод тестировали на примере гидролизата уреазы из соевых бобов и применяли для препаративного выделения Z производных аминокислот из гидролизатов биомасс различного микробиологического происхождения: водорослей, галофильных и метилотрофных микроорганизмов. Например, [U-2H] аминокислоты со степенью обогащения H 97-98% выделяли из биомасс M. flagellatum. Введение изотопной метки оценивали на Finnigan MAT 144 S спектрометре (США) c использованием метода ионизации электронным ударом.

Независимо от биологического источника белка, аминокислоты выделяли с выходом 68-89% и хроматографической чистотой 96-99%. С помощью разработанного метода выделяли Phe и Leu из культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов. Выделение аминокислот проводили в два этапа: c использованием градиентной элюции и рехроматографии полученных фракций в изократическом режиме. Для аналитической хроматографии использовали колонки Econosil C18, 5 мкм; 4.6 x 250 мм и элюенты вода/ТФУ 100/0.5 (об/об) и ацетонитрил/ТФУ 100/0.5 (об/об); для препаративной - колонку Silasorb C18 5 мкм; 4.6 x 250 мм.

Разработанный метод позволяет получать 2H, 13C, 15N, 18O аминокислоты из различных источников. Индивидуальные SIL аминокислоты могут быть использованы для пептидного синтеза, а также в качестве компонентов питательных сред, как для селективного мечения белков, например, бактериородопсина, так и в [U-SIL] стратегиях.

2.2. Меченные стабильными изотопами пептаиболы Пептиды, образующие ионные каналы, такие как зервамицин, похожи по функциональности на более сложные белки, образующие ионные каналы. Для изучения структуры и функции зервамицинов, их взаимодействия с мембраной и молекулярного механизма ионной проводимости методами ЯМР и ИК были получены специфически SIL пептаиболы зервамицины в результате культивирования гриба E. salmosynnemata. Для введения метки выбрали два ароматических аминокислотных остатка Trp-1 и Phl-16, поскольку предполагается, что эти N- и C- концевые аминокислоты могут играть важную роль в механизме открытия и закрытия каналов (Рис. 13). Поскольку питательные среды для роста E.

salmosynnemata содержат глюкозу, крахмал, мелассы, пептон, дрожжевой экстракт и неорганические компоненты, они не могут быть применены для специфического введения стабильной изотопной метки. Поэтому была разработана специальная синтетическая среда, содержащая меченые метаболические предшественники в повышенных концентрациях для предотвращения de novo биосинтеза.

Зервамицин – IC: Ac-Trp*-Ile-Glu-Iva-Ile-Thr-Aib-Leu-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phl* Зервамицин – IIA: Ac-Trp*-Ile-Gln-Aib-Ile-Thr-Aib-Leu-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phl* Зервамицин – IIB: Ac-Trp*-Ile-Gln-Iva-Ile-Thr-Aib-Leu-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phl* Рис. 13. Первичная структура пептидных антибиотиков зервамицина IC, IIA и IIB. Iva Dизовалин Aib аминоизобутановая кислота Hyp – гидроксипролин Phl - фенилаланинол.

Аминокислоты, меченные стабильными изотопами обозначены*.

В качестве метаболических предшественников использовали [2H5]L-Phe в случае [2H5]LPhl-16; [2H5]L-Trp или [1'-15N]- антраниловую кислоту для получения [2H5]L-Trp-1 или [1'N]L-Trp-1 соответственно. Зервамицины выделяли экстракцией метанолом и бутанолом с последующей гельфильтрацией и ОФ ВЭЖХ. Для гельфильтрации использовали колонку Sephadex LH-20 (1.5 x 55 см). В качестве элюента служил метанол, детекцию фракции зервамицинов проводили при 280 нм. ВЭЖХ выполняли на приборе Pharmacia LKB 2248.

Результаты аналитической ВЭЖХ представлены на Рис. 14.

Рис. 14. Хроматограма, полученая в результате ОФ-ВЭЖХ для зервамицинов IC, IIA, IIB. Колонка SuperPаc Spherisorb ("Pharmacia") ODS 5 мкм, 250 x 4 мм, мобильная фаза MeOH/CH3CN/H2O (62.5/22.5/15.0 об/об/об); изократический режим, скорость 0.4 мл/мин; флуоресцентное детектирование ex 287 нм, em 348 нм.

Для препаративного разделения использовали колонку Europrep 60-10 C18 10 мкм, 250 x 4 мм. В результате изократической элюции были получены зервамицин IС и смесь зервамицинов IIA и IIB. Контроль специфического введения метки проводили с помощью метода FAB-MS на JEOL JMX SX/SX 102A спектрометре (Япония). В спектре в области низких масс регистрируются пики 58 (Aib), 70 (Pro), Время, мин 72 (Iva), 86 (Ile и Hyp), 101 (Gln), 120 (Phl), 201 (ацетил-Trp). В области спектра высоких масс, показанных на Рис. 15, чётко видны моноизотропные пики пептидов IIA и IIB в катионной форме при 1847 и 1861, а также ряд пиков типа В-последовательных ионов.

Рис. 15. Масс спектр смеси зервамицинов IIA, IIB, полученный с применением метода FAB-MS, c характерной ионизацией ионов по типу В. Пики типа В-последовательных ионов характеризуют наличие в образце зервамицинов IIA и IIB и подтверждают последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

Результаты MS/MS спектра подтверждают аминокислотную последовательность в каждом из пептидов. Что касается Leu, Ile и Hyp, то их идентификация произведена на основе вторичной фрагментации, с учетом разрыва C-C связи в случае Leu и Ile. В MS для зервамицинов IIA и IIB обнаружены моноизотопные пики [M+Na]+ 1852 (IIA) и 1866 (ZIIB) соответственно (Рис. 16). Изотопное обогащение определялось соотношением между интенсивностью пика [M+Na]+ природного соединения и пиками [15N] или [2H5] меченых соединений c учетом коррекции вклада, приходящегося на соединения, присутствующие в среде. Из проведенного анализа видно, что мечение стабильными изотопами L-Phe определяется вкладом на 68% [2H5], 27% [2H4], 5% [2H3]; а в случае для L-Trp вкладом на 67% [2H5], 28% [2H4], 5% [2H3]. Это соответствует степени мечения ароматических колец для обеих аминокислот 92.5%. С учётом того, что интенсивности пиков природного зервамицина при 1861 (92%) и полностью меченого пептида при 1866 (92.5%) примерно равны, и, принимая во внимание точность определения стабильной изотопной метки 2%, можно считать, что интенсивность пика зервамицина IIB при 1866 представлена вкладом [2H5]-, [2H4]-, и [2H3]- соединений.

Рис. 16. Масс спектр зервамицина IIA и IIB А) с 1847.А) природным содержанием изотопов и Б) [2,3,4,5,6, -2H5] - 1861.Phl-16.

Провели ряд экспериментов со средами, содержащими различные концентрации метаболических предшественников. Было выявлено, что при высоких концентрациях глюкозы (160 мг на m/z 100 мл среды) вместо меченых по Trp-1852.2 1866.Б) зервамицинов IC, IIA, IIB основными продуктами являлись немеченые [Leu-1, Aib-4]- и [Leu-1, Iva-4]зервамицины, о чём свидетельствует появление пиков при 1774 и 1787 соответственно. Различная эффективность введения меченых метаболических предшественников обьясняется de novo m/z метаболическим биосинтезом из немеченых предшественников, содержащихся в среде. Таким образом, в ходе работы были получены зервамицины типа IC, IIA и IIB (Рис. 13), меченные стабильными изотопами по следующим аминокислотным остаткам: [2', 4', 5', 6', 7' – 2H5]L-Trp-1 (2H; 78%), [1' -15N]L-Trp-1 (15N, 55%) и [2',3',4',5',6'– H5]L-Phl-16 (2H; 82%); при этом разбавления стабильной изотопной метки по другим аминокислотным остаткам не наблюдалось.

ГЛАВА 3. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ: ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВ-МИШЕНЕЙ 3.1 Меченные стабильными изотопами клеточные линии млекопитающих Cуществует ряд коммерческих сред для клеточных линий млекопитающих и насекомых, включающий как среды с добавлением эмбриональных сывороток телят, так и синтетические бессывороточные среды. В настоящей работе исследовалась возможность замены дорогостоящих метаболических предшественников, в первую очередь, аминокислот и органических кислот в синтетических средах на специально приготовленные экстракты, полученные из биомасc различных микробиологических источников. Было выбрано и исследовано более 30 различных типов микроорганизмов, получено и проанализировано более 700 различных автолизатов, гидролизатов и экстрактов. При этом был изучен биотехнологический потенциал природных источников различных таксономических классов и проведены расчёты по себестоимости производства меченых биомасс с учётом стоимости метаболических предшественников и их конверсии в целевой продукт. Воспроизводимость состава биомасс контролировали методом ИК. Исследовали различные условия гидролиза и экстракции. Аминокислотный анализ (ОФ-ВЭЖХ, FMOC) использовался для качественной и количественной оценки аминокислот. Выявили, что комбинация компонентов сред на основе дрожжей и красных водорослей приводила к наилучшим результатам. Результаты успешного замещения индивидуальных аминокислот на дрожжевые экстракты в питательных средах для клеточных линий CHO и HEK 293 описаны в главе 1.4. На Рис. 17 приведено сравнение роста клеточной линии CHO в различных средах.

Рис. 17. Сравнение роста клеточной линии CHO в 2.2.различных питательных средах: 1-Ex-Cell 302 ("JRH"); 21.1.DMEM/F12; 3-модифицированная DMEM/F12 без 1.1.аминокислот; 4-модифицированная DMEM/F12 без 1.1.аминокислот, с дрожжевым экстрактом; 5- PLI m 1.1.1.1.0.0.Питательные среды нового состава PLIm 0.0.0.0.поддерживают рост CHO и HEK 293 c использованием 0.0.в их составе комбинации 0.1% - 0.2% автолизата 0.0.1 2 3 4 1 2 3 4 Cell culture media for CHO Питательная среда для CHO дрожжей с 0.05% гидролизатом или автолизатом водорослей. Степень введения изотопной метки определяли по 15N, поскольку сдвиг колебаний по амиду II легко детектируется с помощью ИК. На Рис. 18 показана область ИК спектра с основными пиками белка для немеченых и [U-15N] мембран CHO, полученных из клеток, выращенных на немеченой и [U-15N] среде PLIm. После проведения трёх пассажей клетки осаждали центрифугированием, получали мембранные плёнки, которые анализировали методом ИК.

Cell growth Рост клеток Рис. 18. Определение эффективности N мечения с помощью ИК. В то время, как для колебаний амида I (C=O) при 1650 cм-1, не наблюдаются сдвиги, связанные с N мечением, полоса амида II (C-N-H) характеризуется сдвигом от 1546 см-1 в немеченых мембранах до 1528 см-1 в [U-15N] мембранах, что свидетельствует об эффективности введения 15N выше 90 %. Плечо у полосы амида I представляет вклад Nсодержащих групп боковых остатков аминокислот Arg, Lys, Trp, Pro, Asn, Gln, His и аминогрупп фосфолипидов.

Длина волны (см-1) С помощью замены индивидуальных аминокислот и органических кислот в среде DMEM/F-12 на меченые автолизаты дрожжей и водорослей достигается значительное уменьшение расходов по мечению стабильными изотопами. С учётом того, что стоимость 13C, N меченых экстрактов составляет 4000 Eur за г и что в состав питательной среды входит 0.10.2% экстракт, а также на основании стоимости индивидуальных аминокислот и органических кислот, был сделан вывод о 8-кратном уменьшении расходов для питательной среды в случае CHO и 6-кратном в случае HEK 293. В случае для [U-15N] оценили 3-4- кратное уменьшение расходов. Выбор клеточной линии зависит от функционального уровня экспрессии выбранной молекулы, включая белок мишень или молекулу терапевтического действия. С помощью разработанных сред возможно также селективное мечение в специальных условиях, путём добавления к питательной среде избытка тех индивидуальных аминокислот в немеченом виде, которые предполагается иметь в немеченом виде. Экстракты клеток млекопитающих могут быть использованы для метаболического профилирования при разработке новых профилактических фармакологических и диетических подходов для чувствительных тестов при ранней диагностике в целях предотвращения заболеваний.

Таким образом, [U-SIL] в клетках млекопитающих открывает новые перспективы для решения задач в структурной биологии, протеомике, метаболомике.

3.2 Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых Для мечения клеточных линий насекомых доступно лишь несколько питательных сред (BioExpress 2000, "CIL"), но информация об их составе неизвестна. Наша методология основана на разработке питательных сред, скрининге оптимальных условий роста клеточных линий насекомых и накопления белка. На основе разработанной методологии c использованием BVES в клеточной линии Sf9 был получен фармакологически важный белокмишень, [U-15N] H1R человека (Рис. 19).

Поглощение (OD) Клеточные линии Ген белка-мишени насекомых или млекопитающих Разработка Методы молекулярной биологии Питательных сред Экспрессия гена Компоненты сред в клеточной фабрике Методы выделения, очистки Микробиологические, и реконституции белка-мишени биохимические методы Белок-мишень (протеолипосомы) Изучение биоразнообразия меченный стабильными изотопами микробиологических источников Фармацевтические фирмы Биофизические методы для Биотехнологические фирмы Структурная информация структурно-функциональных Государственные учреждения исследований (MAS ЯМР, ИК) Разработка новых лекарств (рациональное конструирование) Рис. 19. Схема получения белков-мишеней для ЯМР и конструирования новых лекарственных препаратов. Получение [U-SIL] Н1R человека.

Использовали клеточную линию Sf9, которую постепенно адаптировали из бессывороточной питательной среды Xpress ("Lonza") к условиям роста в среде с 95% IPL-41 и 5% Xpress в T25-колбах (25 cm2, "Greiner"). Эти же условия использовали для поддержания культуры в проточной культуре. Адаптацию проводили сначала в адгезивной культуре, а затем во вращающихся колбах. Исследовали уменьшение концентрации аминокислот в IPL-41 с шагом 10% по сравнению с исходной и вплоть до 10% от начальной концентрации.

Наблюдали, что при концентрации аминокислот в среде менее, чем 10-20% от их содержания в IPL-41, клетки продолжали расти, но производство рекомбинантного белка значительно уменьшалось. Этот процесс может быть частично восстановлен путём добавления 0.8% автолизата дрожжей. Для контроля роста клеток и производства белка использовали анализ с помощью 96 лунных плашек в периодическом и непрерывном режиме. Адаптацию клеток и накопление белка в непрерывной культуре сравнивали для ряда коммерческих сред фирм "Gibco", "Sigma", "JRH", "Spectra Gases" ("CIL"), "Hyclone", "Perbio", "Cambrex". Для демонстрации накопления мембранного белка выбрали белки класса GPCR: пигментные белки родопсин (Rh) и green cone (GC) со сравнительно хорошей экспрессией в активном виде и фармацевтически важный белок-мишень H1R. Мембранные белки получали в препаративных количествах в колбах и в биореакторе. Единственный известный аналог [U-SIL] среды поддерживал рост клеток незначительно, но при этом целевой белок не производился.

Для мечения стабильными изотопами в sf9 в качестве основной питательной среды была выбрана среда IPL-41 с известным составом. В разработанной нами среде для [U-15N], [U-13C] или [U-15N,13C] мечения состав и концентрация микроэлементов, солей и витаминов соответствовала их составу и концентрации в IPL-41; в случае C мечения использовали NaH13CO3. Исследовали возможность замены сахарозы и мальтозы глюкозой, а также роль витаминов и органических кислот. Было показано, что добавление витаминов в концентрации, превышающей 4-кратную, не оказывает влияния на рост Sf9, и что сахароза и мальтоза может быть заменена 7.74 мM глюкозой. Также все органические кислоты среды IPL-41 могут быть исключены из её состава при наличии в ней 0.4% дрожжевого экстракта. Было установлено, что липидные экстракты водорослей улучшали рост клеток и накопление белка. C использованием разработанных питательных сред удалось достичь уровня производства H1R, равного 2-6 мг/л. В качестве демонстрации, для получения H1R человека с введённым на Сконец полигистамином (Ht-H1R) использовали среду PLI-In1, содержащую 0.4 % [U-15N] экстракт из H. polymorpha, 0.1 % [U-15N] автолизат из водоросли C. caldarium и NH4Cl в качестве источника 15N, а также индивидуальные аминокислоты в концентрации, варьирующей в пределах 10-20% от их состава в IPL-41. В питательную среду добавляли липидный экстракт водоросли C. caldarium в концентрации 5 мл/л, экстракт готовили растворением 50 мг липидной фракции в 1 мл этанола. pH питательной среды устанавливали до 6.2 и осмолярность поддерживали при 340 мосмоль kг-1 с помощью NaCl. Cреду стерилизовали через 0.микронный фильтр и хранили при 4 °C. Сравнение различных питательных сред для Sfпоказано на Рис. 20. При тестировании компонентов разработали протокол скрининга с использованием WST-1 реагента для измерения плотности клеток.

2.1.Рис. 20. Влияние питательных сред на рост 1.клеточной линии sf9. 1- Insect Xpress; 2- IPL-41; 3- IPL-41, 1.1.2 без дрожжевого экстракта; 4- PLI-In1; 5–BioExpress-201.0.Рекомбинантный бакуловирус, содержащий к0.0.ДНК, кодирующую Ht-H1R человека, получали по 0.0.известной методике, очищали с помощью анализа 1 2 3 4 Питательные среды для SfCell culture media for Sfбляшкообразования и амплифицировали с помощью стандартных методов. Адаптированные Sf9 выращивали в 75 мл колбах, содержащих разработанную среду PLI-In1, до достижения плотности 4-6 x 106 кл/мл, инфектировали рекомбинантным бакуловирусом при факторе множественной инфекции 2.0. На 4-й день клетки собирали центрифугированием (10 мин, 5000 g) и температуре 4°C. Функциональность проверяли радиологическим анализом с использованием 14C-мепирамина. Рекомбинантный HtH1R очищали с помощью металлоаффинной хроматографии с использованием Ni2+ Ni-NTA ("Qiagen") (Рис. 21). Ht-H1R человека элюировали 150 мM имидазолом и хранили в замороженном виде при -80°C. Уровень продукции [U-15N] H1R составлял 3-6 мг/л, чистота выше 90%. В целях улучшенной стабильности получали протеолипосомы путём смешивания с липидами сои с использованием циклодекстриновой экстракции.

6-450– -46Relative cell growth Активность A A (OD) Activity A A – (OD) Рис. 21. Электрофорез H1R человека на SDS/PAGE (12%) с последующим иммуноанализом. Использовали методы выделения H1R, разработанные нидерландскими партнерами группы профессора Де Грипа.

Из мембранных препаратов выделили около 10 мг [U-15N] H1R человека. Процесс может быть масштабирован с получением заданных количеств меченого рецептора. Степень обогащения стабильными изотопами определяли с помощью ИК, при разрешении 8 cм-1 и спектральном диапазоне 4000-800 cм-1 квантифицированием сдвигов колебательных полос спектра. Для уменьшения расходов, связанных с дорогостоящими меченными стабильными изотопами аминокислотами, использовали среду, содержащую 10-20% немеченых аминокислот в соответствии с IPL-41, производство белка было инициировано помещением клеток в среду с [U-15N] или [U-13C,15N] экстрактом дрожжей. В случае однократного выращивания введение изотопной метки в клеточный белок составило 30-40%, но при повторных пассажах уровень мечения составлял 75-85%. Для получения более высокого уровня обогащения необходимо проведение 5-пассажей и полное замещение 10-20% индивидуальных аминокислот на меченые аналоги. Для анализа ЯМР твёрдого тела клеточные мембраны, содержащие 5 мг [U-15N] H1R, помещали в мм CRAMPS ротор и спектры регистрировали на спектрометре Bruker 750 МГц при 200 K и скорости вращения 8-12 kГц. Анализ спектров ЯМР твёрдого тела на ядрах N подтвердил введение изотопной метки в H1R (Рис. 22): в спектре чётко выражено введение N в пептидный скелет и боковые группы аминокислотных остатков пептидной цепи.

Рис. 22. N 1D MAS ЯМР спектр клеточных мембран Sf9, содержащих [U-15N]H1R человека. Спектр зарегистрирован на 750 МГц спектрометре Bruker AV-750 с MAS частотой kГц, число сканирований 5000. Использовали TPPM протоновую развязку при поле силы кГц rf и CP 1H-15N времени смешивания 2 мсек.

Основной резонанс при 120 м.д. представляет сигналы N пептидного скелета, его боковые полосы от вращения обозначены как*.

Остальные резонансы представляют собой резонансы N боковых цепей аминокислот. В качестве свидетеля использовали резонанс азота глицина при 34.3 м.д.

Таким образом, было продемонстрировано получение [U-15N] H1R человека в клеточной линии Sf9 с использованием BVES и новой питательной среды PLI-In1, позволяющей достичь 8-10 кратного уменьшения стоимости. Разработанная методология представляет возможности для эффективного получения [U-SIL] белков-мишеней в миллиграммовых количествах, что является решающим для разрешения 3D структуры методом ЯМР твёрдого тела и для использования при рациональном конструировании лекарств.

ГЛАВА 4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ:

СТРАТЕГИИ ТОТАЛЬНОГО МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 4.1 Характеристика [U-13C, 15N] пигментов: химические сдвиги 13C,1H, 15N в растворе и твёрдом теле BChl а, производное многоконтурного хромофора порфирина, представляет собой один из основных пигментов пурпурных бактерий. Он отличается от Chl а тем, что содержит в пиррольном кольце ацетильную группу вместо винильной; а второе пиррольное кольцо его восстановлено (Рис. 23). Другим важным пигментом в фотосинтетической цепи переноса электрона является BPheo а, который отличается от BChl a отсутствием Mg2+ и наличием двух протонов. BPheo а может быть получен из BChl а в кислых условиях. Возможность получения информации о структуре лиганда и лиганд-лигандным или лиганд-белковом взаимодействии была изучена на примере этих фотосинтетических пигментов. Выбор пигментов объясняется, как лёгкостью их получения, так и их значением в фундаментальных исследованиях, технике и в медицине. Для проведения MAS ЯМР исследований пигментов в мембранном комплексе необходимо было, пpежде всего, охарактеризовать пигменты в свободном виде (Рис. 21).

Определение их структуры на атомном уровне путём характеристики химических сдвигов резонансов атомов 1H, 13C и 15N служит основой изучений лиганд-белковых взаимодействий.

А) Б) В) Mg Mg Mg Рис. 23. Химическое строение BChl a (A) и BPheo a (Б) Pheo a (B) по номенклатуре IUPAC.

Бактериальные пигменты выделяли из [U-13C,15N] (13C, 99%, N, 98%) биомасс Rps.

palustris, выращенных на среде с использованием [U-13C,15N] гидролизатов водорослей (EMBL).

Пигменты экстрагировали при 4 C ацетоном при мягком озвучивании в течение 2 мин c последующим центрифугированием в течение 10 мин при 5400 x g. Супернатант содержал каротиноиды, а осаждённую фракцию экстрагировали метанолом с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 5400 x g и высвобождением BChl a в супернатант.

Экстракт фильтровали через 0.45 мкм тефлоновую мембрану (TOSOH H-25-5), концентрировали на роторе при низком давлении, растворяли в н-гексан/2-пропанол/метанол 100/3/3 об/об/об. Пигменты выделяли с помощью НФ-ВЭЖХ с использованием колонки Sensupak, 1251-N, (250 x 4.6 мм внутр. диаметр), элюент - смесь н-гексан/2-пропанол/метанол 100/3/3 об/об/об. Основным пигментом является BChl a с фитильной цепью. [U-15N,13C] пигменты были выделены c чистотой 99% в количестве 80 мг, охарактеризованы оптической, ЯМР и ИК спектроскопией и использовались для различных исследований.

Выделение [U-SIL] пигментов, как растительных, Chl а и Pheo а; так и бактериальных, BChl а и BPheo а, позволило полностью охарактеризовать их в растворе и твёрдом теле и определить химические сдвиги атомов 13C, 15N и H. Измерения ЯМР в растворе проводились с помощью образца, содержащего 3 мг микрокристаллического пигмента, растворенного в 0.7 мл H6-ацетона и помещённого в 5 мл ЯМР ампулу. Образцы для ЯМР твёрдого тела были приготовлены путём помещения 7 мг пигмента в центр 4 мм CRAMPS ротора ("Bruker") для улучшения гомогенности. Условия проведения ЯМР исследований приведены на рисунках соответствующих спектров. Ранее было опубликовано отнесение химических сдвигов для Chl а и BChl а в растворе, которое по мере роста разрешающей способности ЯМР и разработки схем мечения стабильными изотопами периодически пересматривалось. Наше исследование позволило впервые произвести полное отнесение химических сдвигов в ЯМР спектрах пигментов, как в растворе, так и в твёрдом теле, что было достигнуто именно ввиду доступности [U-SIL] исследуемой молекулы, специализированного приготовления образцов для ЯМР исследований и применения высоких полей.

Преимуществом [U-SIL], при котором все атомы природного углерода замещены на 13C и все атомы природного азота замещены на 15N, является то, что ЯМР спектры регистрируются с применением лишь одного образца. Это позволяет не только наиболее рационально подойти к использованию времени и затрат труда для приготовления образцов, но и эффективно использовать дорогостоящее время ЯМР измерений. Исследования пигментов выполнялось на Bruker 600 MГц DMX-600 и Bruker 750 МГц DSX-750. Были получены одноядерные 2-D 13C13 1 C и гетероядерные H-13C, H-15N спектры; в случае ЯМР твёрдого тела применяли MAS ЯМР. Корреляционные спектры чётко позволяют наблюдать взаимодействие соседних атомов в молекуле. Для отнесения химических сдвигов сигналов 13C в растворе применяли методику COSY корреляционнной спектроскопии; в случае ЯМР твёрдого тела - методику RFDR. Для отнесения химических сдвигов сигналов H в растворе применяли методику PFG HMQC, в случае ЯМР твёрдого тела применяли СP/MAS корреляционную спектроскопию c методикой радиочастотного возбуждения FS-LG во время эволюции ядер 1H. Для отнесения химических сдвигов резонансов N в растворе использовали HMQC; в случае ЯМР твёрдого тела использовали TPM. В ЯМР в растворе и твёрдом теле cначала было проведено отнесение химических сдвигов сигналов C на основе диполярных корреляционных спектров. Это 1 послужило основой для определения химических сдвигов сигналов H в 2-D H-13C в гетероядерном корреляционном эксперименте (Рис. 24, 25).

А) Б) C C C C Рис. 24. Карта срезов 2D C-13C MAS ЯМР диполярного корреляционного спектра [UC,15N]BChl a (A) и [U-13C,15N]BPheo a (Б), зарегистрированного в магнитном поле 14.1 T при комнатной температуре, спиновой скорости 9000 ± 3Гц, времени поляризационного переноса 1 мсек.

Линиями показана связь между последовательными ближайшими корреляциями между атомами Поскольку химические сдвиги C довольно чувствительны к изменениям плотности атомного заряда, они служат источником информации об электронной структуре молекулы на атомном уровне. Химические сдвиги H, в свою очередь, служат основой для отнесения 15 химических сдвигов N в 2-D N-1H спектре. Использование высокой частоты вращения в ЯМР позволяет свести до минимума эффект вращательного резонанса и перекрывание между корреляционными пиками и боковыми полосами от вращения. При коротком времени переноса корреляции в MAS ЯМР спектрах вызваны ближайшими соседними атомами молекулы.

Например, для [U-13C,15N] BChl a выявлены цепочки корреляционных связей для 13C: C1–C2– C3–C4–C5–C6–C7–C8–C9–C10–C11–C12–C13; C14–C15–C16–C17; C18–C19–C20–C1. Наряду с этим, видны корреляции C2–C21 и C3–C31–C32 в кольце I; C12–C121 в кольце III; C13–C131– C132–C133 в кольце V. В фитильной цепи наблюдаются корреляции между p1–p2–p3–p4–p5– p6–p7–p8 и p3–p17. Хотя не наблюдается сильно выраженых корреляции между C7-C8; C8-C81;

C7-C71; C18-C181; C17-C171; C171-C172, эти сигналы чётко видны на диагонали.

А) Б) H 21-CH121-CH121-CH82—CH81-CH171-CHp16-CHp6-CH2 p7-CH2 181-CHp20-CH2 21—CH3 p20-CH7, 17,-CH p8-CH17, 18 -CH 82—CH8-CH p17-CH8-CH p5 -CH132-CH p17-CHp4-CHp11-CH 132-CH p18-CHp4-CHp5-CH18-CH 7-CH 134-CH 134-CHp1-CHp1-CH13 C C Рис. 25. Карта среза 2-D 1H-13C FS-LG MAS ЯМР спектра [U-13C,15N]BChl a (A) и [U-13C,15N]BPheo a (Б) (образец в виде кристаллической пудры), зарегистрированного в магнитном поле 14.1 T при комнатной температуре, спиновой скорости 13кГц±3Гц, времени поляризационного переноса 1 мсек.

Интерпретация спектров ЯМР в твёрдом теле на ядрах H довольно сложна в связи с комбинацией очень сильных гомоядерных диполь-дипольных взаимодействий между ядрами H и незначительной дисперсией их химических сдвигов. Хорошее разрешение может быть получено в H-13C корреляционной спектроскопии с учётом значительной дисперсии химических сдвигов C. Применение высоких магнитных полей и высоких частот вращения наряду с FSLG во время 1H эволюции позволяет достичь хорошего разрешения 1H резонансов.

Полный анализ химических сдвигов 13C, 1H, 15N в растворе и твёрдом теле атомов пигментов представлен в Таблицах 3-5. При сравнении H химических сдвигов в твёрдом теле и в растворе, например, для BChl a, существенная разница наблюдается для C21–CH3 и C121-CH3, что обусловлено эффектом кольцевых токов, связанных с образованием агрегатов в твёрдом теле. При сравнении химических сдвигов сигналов в спектрах двух пигментов в твёрдом теле наблюдаются следующие различия: в кольце I для C1 (-16.6), C2 (-5), C21 (-3.6), C3 (-8.6), C4 (16.0); в кольце II для C9 (4.7); в кольце III для C11 (-11.2) и для C14 (-14.7); в кольце IV для C(-9.0); и в кольце V для C131 (-3.6). Для метиновых углеродов разница составляет: C10 (-3.0), C(-2.4), C20 (-2.2). Результаты показывают, что структура и электронные состояния пигментов значительно зависят от наличия центрального иона магния в молекуле BChl a.

Таким образом, в работе проведено полное отнесение химических сдвигов ядер 13C, 15N, H в растворе и в твёрдом теле с помощью одного [U-SIL] образца, что демонстрирует возможности получения полной информации о структуре молекулы с помощью применения методов ЯМР и [U-SIL]. Для BChl a в растворе пересмотрены значения химических сдвигов для семи 13С в и впервые отнесены одиннадцать 13С резонансов, которые выделены в Таб. 3.

Таблица 3. Отнесение химических сдвигов резонансов ядер C для [U-13C,15N]BChl a и [UC,15N] BPheo a. *(м.д.) - химические сдвиги в ацетоне-d6-метаноле-d4 согласно Brereton et al. (1983) J.

Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 435 с коррекциями Oh-hama et al. (1985) Arch. Biochem. Biophys. 237(1), 72. С помощью aобозначены хим. сдвиги согласно Brereton et al., bобозначены хим. сдвиги, пересмотренные Oh-hama et al., и собозначены хим. сдвиги, пересмотренные Egorova-Zachernyuk et al. (2008) Magn. Res.

Chem. 46, 1074.. Химические сдвиги в acetone-d6 и в твёрдом теле, определённые в результате данной работы для обоих [U-SIL] пигментов, обозначены, как (м.д.) и ss (м.д.) соответственно. Точность химических сдвигов в ЯМР твёрдого тела составляет ~0.5 м.д.

Позиция BChl a BChl a BChl a BPheo a BPheo a ss ss 82 9.1 10.5 11.0 11.5 11.121 10.3 11.9 8.7 11.5 4.21 12.0 13.5 10.9 13.9 7.p17 14.1 16.1 16.3; 16.7 16.3 16.p18 21.2; 18.3a 20.5 20.5 20.5 21.p19 20.1; 19.8 20.0 19.8; 20.0 20.p20 20.0 20.0 20.0 20.p16 22.9 23.0 22.8 22.181 21.2 22.8 23.0 22.32 32.9 30.0 34.0 29.71 21.2 23.4 23.0 23.p5 23.8 25.3 25.0 25.3 27.p9 23.6 24.9 27.5 24.9 26.p13 23.2 25.5 25.0 25.0 26.172 31-27 29.4 32.5 31.5 31.171 31-27 30.5 30.5 31.3 31.81 31-27 30.8 30.0 30.7 31.p7 31.6; 31.4, 31.1a 33.3 33.5 33.2 34.p11 31.0 31.5 33.2 34.p15 28.6 31.0 28.6 29.p4 38.2;38.5a 40.2 39.4; 40.2 40.2 41.p6 37.6 37.5 37.6 38.p8 38.5 39.0 37.9 38.p10 36.2; 35.3 38.0 38.0 38.5 38.p12 37.8 38.0 38.5 38.p14 39.8 39.0 39.8 38.7 46.7 48.3 47.3 49.6 49.18 48.0 49.5 49.1 50.9 47.17 49.0 50.5 49.6 51.4 49.134 50.8 52.3 51.5 52.8 52.8 54.0 55.8 52.9 55.4 53.Позиция BChl a BChl a BChl a BPheo a BPheo a ss ss p1 59.8 61.7 60.3 61.7 60.132 65.0 65.7 63.3 65.5 62.20 94.2 (95.6b) 96.3 93.9 97.6 96.5 97.6 (99.0 b) 99.9 98,9 97.9 96.10 99.9 (101.6 b ) 102.4 99.7 100.2 96.15 107.1 (109.4 b ) 109.7 105.8 110.3 107.p2 117.2 119.3 119.9 119.4 120.2 127.6 142.0 c 140.9 138.5 135.12 135.1 124.0 c 120.0 121.3 117.13 130.6 124.1 129.2 125.3 122.3 137.7 c 135.7 135.0 127.p3 141.2 142.4 139.6; 141.9 143.0 142.11 147.9 149.5 147.1 139.3 135.4 147.9 (149.7 b ) 150.0 151.9 138.1 135.1 150.2 151.2 153.5 139.7 136.16 166.1 а (160.2 b ) 152.0 c 150.2 158.7 158.14 143.8 (158.1 b ) 160.8 c 160.6 148.7 145.9 140.6 (151.7 b ) 158.5 c 157.7 164.3 162.19 164.9а 167.3 168.8 171.7 171.6 140.6 168.9 c 170.0 172.4 168.133 170.7 171.6 169.9 170.27 171.173 171.7 173.4 174.5 173.0 173.131 187.5 189.0 188.4 189.3 184.31 197.6 199.3 194.6 199.2 192.Таблица. 4. Отнесение химических сдвигов (м.д.) резонансов ядер 15N для [U-13C,15N]BChl a и [U-13C,15N] BPheo a. (м.д.) – химические сдвиги в ацетоне согласно Limantara et al., (1995) Chem. Phys.

Lett. 236, 71. Химические сдвиги в растворе (м.д.) и твёрдом теле ss (м.д.) получены в данной работе для обоих [U-SIL] пигментов.

Позиция BChl a BChl a BChl a BPheo a BPheo a ss ss N-I 189.6 192.63 191.76 129.40 127.N-III 191.5 194.46 196.87 135.70 132.N-II 258.5 259.14 258.28 299.20 296.N-IV 259.1 261.71 258.28 308.30 303. Tаблица. 5. Химические сдвиги сигналов ядер H [U-13C,15N]BChl a и [U-13C,15N]BPheo a в растворе и твёрдом теле (м.д.). Химические сдвиги в ТГФ при 60°C (согласно Brereton et al. (1983) J.

Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 423) обозначены (м.д.). Химические сдвиги в растворе (м.д) и твёрдом теле ss (м.д.) получены в данной работе для обоих [U-SIL] пигментов. Точность химических сдвигов в твёрдом теле ~ 0.2 м.д.

Позиция BChl a BChl a BChl a BPheo a BPheo a ss ss 5 9.00 8.81 6.75 9.05 7.10 8.46 8.40 5.50 8.66 5.20 8.36 8.36 5.89 8.73 5.132 4.33 5.92 4.31 6.10 4.7 4.09 4.24 3.06 4.35 2.17 4.01 3.92 2.45 3.99 2.18 4.35 4.32 2.45 4.41 2.8 4.03 2.17 4.07 2.81 2.37/2.12 2.08 0.96 2.07 1.21 3.46 3.40 -0.84 3.32 3.03 3.01 0.96 2.07 1.71 1.73 0.85 1.80 0.82 1.15 1.09 -0.78 1.09 0.121 3.38 3.29 -1.02 3.181 1.68 1.65 0.86 1.134 3.71 3.76 3.46 3.76 4.171 2.53 2.37 0.96 2.171’ 2.33 2.172 2.42 2.45 0.96 2.172’ 2.13 2.p1 4.51 4.39 4.26 4.26 4.p2 5.24 5.13 5.45 5.20 5.p17 1.63 1.58 1.44 1.50 1.p4 1.95 1.91 1.49;1.67 1.93 2.p5 1.43 1.35 1.02 1.45 1.p15 1.17; 1.04 0.96 1.25 1.p6 1.04 1.09 0.79 1.17;1.04 1.p8 1.09 1.49 1.09 1.p10 1.13 1.49 1.09 1.p12 1.13 1.49 1.09 1.p14 1.11 1.49 1.04 1.p7 0.88 0.89 1.07 1.35;1.26 1.p11 0.86 0.89 0.96 1.28 1.p9 0.84 1.28 1.02 1.21 1.p13 1.21 1.02 1.21 1.p16 0.84 0.86 0.84 1.p18 0.81 0.40 0.82 1.p19 0.81 0.40 0.82 1.p20 0.83 0.40 0.92 1.4.2 [U-13C, 15N] лиганд в мембранном белковом комплексе: лиганд-белковые взаимодействия Получение [U-SIL] лигандов и отнесение химических сдвигов 13C, 1H, 15N в растворе и твёрдом теле позволило изучать лиганд-белковые взаимодействия. Объектами изучения были выбраны фотосинтетические мембранные комплексы, РЦ из Rb. sphaeroides R26 и CК2 из Rps.

acidophila. РЦ получали как c встроенным растительным, так и с бактериальным феофитином:

[U-13C]Pheo a и [U-13C,15N]BPheo a (Рис. 26). СК2 изучали с встроенным [U-13C,15N]BChl B8(Рис. 27). Исследования включали: выделение очищенного мембранного белка с солюбилизацией в детергенте; замещение лиганда в мембранном комплексе на [U-SIL] лиганд, приготовление образцов для ЯМР и ИК, их исследование и, наконец, интерпретация данных.

[U-13C,15N] C. rubrum Rb. sphaeroides R-26 [U-13C,15N] Rps. palustris [U-13C,15N] BChl a [U-13C,15N] Chl a Реакционные центры (РЦ) [U-13C,15N] BPheo a [U-13C,15N] Pheo a Отнесение химических сдвигов 13C, 15N, 1H, ЯМР в растворе, MAS ЯМР в твёрдом теле, исследование методом Фурье ИК Замещение BPheo a в РЦ Замещение BPheo a в РЦ на [U-13C,15N] BPheo a на [U13C,15N] Pheo a РЦ с [U-13C,15N] Pheo a РЦ с [U-13C,15N] BPheo a Исследование лиганд-белкового взаимодействия с помощью MAS ЯМР твёрдого тела, Фурье ИК Рис. 26. Схема получения [U13C,15N] кофакторов (Сhl a, Pheo a, BPheo a) и исследования лиганд-белкового взаимодействия в фотосинтетических РЦ из Rb. sphaeroides R-26.

Rps. acidophila 10050 [U-13C,15N] Rps. palustris Светособирающий [U-13C,15N] BChl а комплекс (СК2) Отнесение химических сдвигов 13C, 15N кофакторов методом ЯМР в растворе, MAS ЯМР в твёрдом теле Замещение BChl a B8в CK2 на [U-13C,15N] BChl а [U-13C,15N] СК2 СК2 с [U-13C,15N] BChl а B8Исследование с помощью ЯМР твёрдого тела [U-13C,15N] Rps. acidophila 100Рис. 27. Схема получения а) СК2 из Rps. acidophila 10050 с [U13C,15N] BChl a B800 и б) [U13C,15N] СК2 из Rps. acidophila 10050.

4.2.1. Фотосинтетические РЦ с [U-13C] Pheo a В структурной биологии для понимания фотосинтеза на атомном уровне важно охарактеризовать электронную структуру кофакторов и опредилить их роль в молекулярном механизме конверсии фотохимической энергии. Хотя кристаллическая структура Rb.

sphaeroides R26 РЦ определена с разрешением 2.65 , некоторые фундаментальные вопросы о механизме разделения зарядов и цепи переноса электрона не выяснены. Два BPheo в РЦ химически идентичны, но только один (HA), функционирует как промежуточный акцептор электрона во время переноса электорна от донора (специальной пары BChl) к первичному электронному акцептору хинону цепи А, а второй, находящийся в цепи Б (HB), не вовлечен активно в перенос электрона. В связи с этим представляло особый интерес изучить электронные состояние покоя BPheo кофакторов, потенциально вовлеченных в нарушение симметрии между А и Б цепями в переносе электрона.

Рис. 28. Организация кофакторов в РЦ Rb. sphaeroides Rсогласно Ermler et al. (1994). Structure. 2, 925. Как обозначено схематично, кофакторы BPheo a, замещены на [U-13C] Pheo a.

Хорошо известны такие подходы к изучению лигандбелкового взаимодействия как сайт специфический мутагенез, модификация пигментов. В настоящей работе представлен новый подход, основанный на мультиспиновом мечении и 2D MAS ЯМР, при этом определяли электронные плотности индивидуальных атомов кофакторов на основании данных химических сдвигов пигмента в белковом кластере размера 1 кДа (Рис. 28). Этот подход позволяет полностью охарактеризовать лиганд в мембранном комплексе без необходимости привлечения сложных схем органического синтеза и получения целого ряда образцов, меченных стабильными изотопами по определённым положениям.

[U-13C]Pheo a, наряду с другими пигментами, такими как -каротин, лютеин, Chl a, Chl b, Pheo b, виолаксантин и неоксантин, выделяли из [U-13C] биомассы C. rubrum c использованием колоночной хроматографии, силикагеля как носителя, а в качестве элюента гексана с последующей элюцией c помощью смеси гексан-ацетон. Чистоту характеризовали с помощью спектров поглощения, ВЭЖХ и ЯМР. РЦ выделяли обработкой хроматофоров с помощью LDAO и последующей очисткой на DEAE-Sephacel согласно известному протоколу.

Замещение BPheo a в РЦ на [U-13C]Pheo a проводили инкубированием 22 порций по 10 мл каждая, содержащих 14 мкМ РЦ, 50 мкМ [U-13C]Pheo a, 0.1 % LDAO, 1мМ EDTA, 10 мМ Tris, pH 8 в 10% ацетоне в течение 90 мин при 42±0.5°C. После последующего охлаждения на ледяной бане денатурированный белок удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 6000 g, супернатант нагружали на колонку DEAE-Sephacel, промывали 60мМ NaCl, 0.1% LDAO, 10 мМ Tris, pH 8, 1 мМ EDTA. РЦ смывали с колонки с помощью 400 мМ NaCl, проводили диализ в течение 12 ч vs 0.025% LDAO, 10мМ Tris, pH 8 и 1мМ EDTA, повторно нагружали на колонку и удаляли в градиентном режиме 0-500 мМ NaCl, 0.025% LDAO, 10мМ Tris, pH 8, 1мМ EDTA, затем диализовали, после чего концентрировали с помощью 100 кДа фильтра. Выход РЦ с [U-13C]Pheo a составил 10%. Наличие трёх субъединиц (L,M, H) в РЦ подтверждали SDS-PAGE. Образец готовили помещением 40 мг РЦ в 4 мм MAS ротор.

Степень замещения на [U-13C]Pheo a контролировали с помощью оптических спектров поглощения (Рис. 29). В замещённом образце полоса поглощения при 535 нм, характерная для HB, отсутствует, и полоса 545 нм, характерная для HА уменьшена, что говорит, практически, о полном замещении HB и частичном замещении HА. На основании соотношения поглощения при 676 нм (Pheo a) и 890 нм (P, специальной пары BChl a) можно заключить, что 90% общего ВPheo а замещено на [U-13C]Pheo a. Неспецифично связанный или свободный Pheo a также поглощает при 676 нм, полоса при 760 нм показывает, что общее количество незамещённого BPheo a менее 20%. Таким образом, на основании оценки замещения при 676 нм и 760 нм можно заключить, что в образце содержится менее 10% несвязанного [U-13C]Pheo а.

А) Рис. 29. (A) Спектры поглощения нативных РЦ и РЦ с [U-13C] Pheo a, полученные при температуре 10K; (Б) Модифицированые РЦ Разностный спектр поглощения состояния P+QA- при 10 K, зарегистрированный через 1 мсек после возбуждения лазерной вспышкой при 890 нм.

Нативные РЦ Дополнительную информацию представляют Длина волны (нм) Б) изменения в поглощении в РЦ c [U-13C]Pheo а в связи с образованием P+QA- в результате освещения.

Отрицательный пик при 549 нм, характерный для случая, когда оба HА и HB замещены на Pheo а, и смещение полосы при 675 нм являются наилучшим обоснованием для оценки степени замещения. Сравнение изменения Длина волны (нм) поглощения при 549 нм относительно выцветания при 895 нм привело к выводу, что в образце присутствует 12% нативного ВPheo а. На основании амплитуды сдвига полосы поглощения при 675 нм по сравнению с выцветанием при 895 нм был сделан вывод о замещении 75% ВPheo а. Таким образом, в результате анализа спектров пришли к выводу, что весь бактериофеофитин в цепи HB и 65% ±5% HА был замещён на [U-13C]Pheo а.

1D CP/MAS ЯМР спектры, зарегистрированные на Bruker MSL-400, позволи отнести резонансы сигналов С5, C10, C15, C20 и C131. На основании 2D C-13C спектров были Поглощение (OD) Поглощение ( OD) охарактеризованы химические сдвиги Pheo a и использованы для изучения электронной структуры, поляризации и протонирования (Рис. 30). В спектре белка прослеживаются следующие корреляционные связи в молекуле Pheo кластера: C14(151)-C15(107)-C16(161)C17(52)-C171(32);C13(133)-C131(190)-C132(64)-C133(171); C4(137)-C5(97)-C6(156)-C7(136)C71(11);C3(136)-C31(129)-C32(121);C9(150)-C10(105)-C11(138)-C12(128)-C121(12). В фитильной цепи наблюдаются корреляции C172(29)–C173(173)–p1(59)–p2(117)–p3(144)–p4(41), p3-p17(17).

Для нахождения корреляций C172–C173 и p3/p17 использовалась спиновая скорость 10 кГц.

Концы фитильного остатка не задетектированы, вероятно, они едва упорядочены в образце, измеренном при низких температурах.

Рис. 30. Карта среза 2D C-13C MAS ЯМР C диполярного корреляционного спектра РЦ Rb.

sphaeroides R26 с [U-13C]Pheo a. Спектр зарегистрирован при температуре 230 K и спиновой скорости 8000 ± 3 Гц при использовании времени смешивания =1 мсек.

Хотя разница индивидуальных химических сдвигов небольшая, их систематическое наблюдение в отдельных областях молекулы позволяет выявить части молекулы, взаимодействуюшие с белком.

Cогласно данным ЯМР анализа, наблюдалось слабое взаимодействие пигментов с белком, C которое затрагивает углерод в положении 172 кольца IV и, возможно, кольцо V лиганда.

Возможно также, что углероды в положении p1 и p2 фитильного остатка слегка разупорядочены за счёт окружающего белка. Не замечено влияние Glu L104 на перетрубацию пигмента с активной стороны переноса электрона. Состояния протонирования оказались одинаковыми и можно заключить о большом сходстве в поведении двух Pheo а с точки зрения плотностей атомных зарядов для углеродов порфириновой структуры, что интересно наблюдать с учётом ассиметрии процесcа первичного разделения заряда в фотосинтезе.

4.2.1. Фотосинтетические РЦ с [U-13C,15N] BPheo a РЦ с [U-13C,15N]BPheo a получали по известному протоколу, но вместо детергента LDAO использовали TRITON X-100. Разработали новые экспериментальные условия фотонакопления в присутствии восстановителя и медиатора: дитионита натрия и цитохрома c или дитионита натрия и красителей, индиготетрасульфоната натрия и толуелена красного.

Состояние HA- характеризовали спектрами поглощения и с помощью ИК. Эксперименты фотоаккумуляции выполняли в растворе, а также в виде плёнки, полученной на CaF2 окне.

Например, при приготовлении плёнки, 35 мкл 0.2 мM РЦ с [U-13C,15N]BPheo a, солюбилизованных в 10мM Tris-HCl (pH 8.0)/0.1% Triton X-100, 6 мкл 2 мM ITS в воде и мкл 4 мМ NR в воде, помещали на CaF2 окно и частично высушивали в токе азота. Затем добавляли 6 мкл 0.2 M Na2S2O4 раствора в 1 M Tris буфере (pH 8) и после частичного высушивания в атмосфере азота образец накрывали вторым CaF2 окном (Рис. 31).

Рис. 31. Индуцируемые светом HA-/HA ИК разностные спектры для природных РЦ (a), РЦ c [U-13C,15N]BPheo a (б) и двойной разностный спектр (в). Просуммировано 50интерферограм. Спектры измерялись при а температуре 22°C б ИК спектры регистрировались на Bruker IFS 66 V, снабжённом MCT детектором. Разностные спектры получали в между спектрами, зарегистрированными во время освещения светом с выше 700 нм, и состоянием в темноте. Основными характеристиками являются отрицательные Длина волны (см-1 ) полосы при 1745, 1732, 1674 (с плечом при 1684 см-1), 1656 и 1623 см-1, свидетельствуюшие об исчезновении нейтрального состояния HA, и положительные полосы при 1703 и 1590 см-1, свидетельствующие о появлении HA-. Оба состояния включают изменения в электронном акцепторе и его связывании с белком, а также возможные изменения BChl и самого белка. Спектры характеризуются воспроизводимостью отрицательных полос при 1395 см-1 и положительных полос при 1466, 1373, 1347 и 1333 см-1.

Уменьшение интенсивности полос при 1590 см-1 и 1466 см-1 на более, чем 50% свидетельствует о замещении фотоактивного HA на [U-13C,15N] BPheo a с эффективностью 50%. Выход РЦ с U[13C,15N] BPheo a составлял 15%. Разностный спектр состояния HA-/HA в РЦ с [U-13C,15N]BPheo позволил найти отнесение сигналов BPheo a на фоне белковых сигналов.

4.2.3 СК2 с [U-13C,15N]BChl a. Электронная структура кофакторов, кофакторкофакторные и кофактор-белковые взаимодействия Наконец, с помощью [U-SIL] исследовали электронную структуру кофакторов BChl a B800 и BChla B850 в СК2. Отнесение химических сдвигов [U-13C,15N]BChl a и U-13C,15N]BChl a B800 в СК2 послужило основой для дальнейшего отнесения химических сдвигов для B800 и B850 в [U-13C,15N]СК2 при помощи расчётов функциональной теории плотностей. СК2 c [UC,15N]BChl a получали путём селективного замещения природного кофактора B800 на [U Изменение поглощения ( OD) C,15N]BChl a B800 по известной методике. [U-13C,15N]СК2 выделяли из биомассы, выращенной на среде, содержащей [U-13C,15N] гидролизат водорослей, 13C4 янтарную киcлоту или [U-13C,15N] суцинат аммония. После выделения СК2 его концентрировали до объёма мкл с использованием Centricon 100 кДа фильтра. Концентрированный образец переносили в CRAMPS ротор, содержащий 10 мг изучаемого белка. ЯМР спектры регистрировали на Bruker AV-750. На Рис. 32 показаны С-13С корреляции для кофакторов B800, B850 и B850.

Найдено электронное сходство между кофакторами B800, B850 и B850 в поляризации по оси бактериохлоринового кольца параллельно переносному дипольному моменту. Значительный сдвиг полосы Qy B850 по сравнению с Qy B800, объясняется, главным образом, перекрыванием бактериохлориновых колец B850 в СК2.

Рис. 32. Карта среза MAS 2D C-13C RFDR ЯМР спектра [UC,15N] СК2. Данные получены при 223 K со спиновой скоростью кГц и RFDR временем смешивания 2.5 мсек. Корреляции химических сдвигов атомов углерода B800, B850 и B850 обозначены в соответствии с IUPAC, как и .

Поскольку эффекты химических сдвигов распределены по хлориновому кольцу, а не локализованы на отдельных положениях углеродов, поляризация между кофакторами и белком происходит по механизму нелинейного диэлектрического ответа. Таким образом, с помощью [U-SIL] и 2D корреляционной ЯМР описали электронную структуру лигандов в белковом комплексе и изучили лиганд-белковое взаимодействие, тем самым продемонстрировали преимущества [U-SIL] для решения задач структурной биологии.

4.3. Тотально меченный стабильными изотопами мембранный белковый комплекс Следующей демонстрацией преимуществ [U-SIL] для решения задач структурной биологии явилось изучение 13C,15N корреляций в интегральном белковом комплексе размером 150 кДа, [U-13C,15N] СК2 Rps. acidophila 10050. Кристаллическая структура СК2 разрешена и он состоит из трёх асимметричных единиц, каждая из которых содержит три протомерных комплекса, состоящих из и апобелков, содержащих 53 и 41 аминокислотных остатка соответственно (Рис. 33), трёх молекул BChl, одного родопин-глюкозидного каротеноида и молекулы -октилглюкозидного детергента Трансмембранные хеликсы девяти апобелков упакованы с образованием цилиндра с радиусом 18 , а девять апобелков организованы таким образом c апобелками, что образуют внешний цилиндр 34 .

: M1NQGKIWTVV10NPAIGIPALL20GSVTVIAILV30HLAILSHTTW40FPAYWQGGVK50KAA N-конец Мембрану пронизывающая часть C-конец : ATLTAEQSEE10LHKYVIDGTR20VFLGLALVAH30FLAFSATPWL40H N-конец Мембрану пронизывающая часть C-конец Рис. 33. Аминокислотная последовательность и белковых субьединиц в СК2 Rps. acidophila 10050. Кристаллическая структура СК2 определена McDermott et al. (1995) Nature. 374, 517. Отнесение сигналов полученных на [U-SIL] образце выделено подчёркиванием.

[U-13C,15N]СК2 выделяли из биомассы Rps. acidophila по известным методикам, очищали гель-фильтрацией, чистоту проверяли SDS-PAGE и характеризовали оптическими спектрами поглощения. Солюбилизированный белок концентрировали до объема 30 мкл и образец в количестве 10 мг помещали в 4 мм CRAMPS ротор. Спектры ЯМР твёрдого тела регистрировали на спектрометре Bruker 750 МГц DSX-750, что позволило достичь повышенного разрешения и чувствительности по сравнению с использованием стандартного оборудования. Использовали 4 мм трёхканальный MAS датчик. Применяли MAS спиновые частоты 8 и 12 кГц и температурные диапазоны от -10 С до -50 С. При повышении температуры наблюдали незначительное повышение разрешения.

На Рис. 34 изображены резонансы пептидного скелета NiCOi-1, и NiCi. В NCO спектрах наблюдается, по меньшей мере, 10-15 разрешённых пиков в области 120 м.д. (химические сдвиги для N). В NCA спектрах детектируется целый ряд разрешённых резонансов ввиду 15 дисперсии C. В спектре наблюдаются пики с разрешением 1.2 и 1 м.д. для N и C соответственно. Таким образом, чётко наблюдаетя 35-40 максимумов пиков, что соответствует количеству аминокислотных остатков мембранной части и апобелка. Особый интерес в NCA спектре (Ni-Ci) представляют пики при 42-46 м.д. и 47-49 м.д. для 13C, которые отнесены к остаткам Gly и Ala соответственно. Также, отнесены C при 63.2 и 63.6 м.д. остатков Pro.

А) Б) Рис. 34. Гетероядерные (N,C) корреляционные спектры [U-13C,15N]СК2. C несущая частота применена вне CO и C области C спектра. Показаны корреляции для трёх P (I-III).

Для обоих Pro наблюдаются резонансы C и коррреляции (Ni-COi-1) Pro предыдущих аминокислотных остатков апобелка.

Наблюдается дополнительная слабовыраженная корреляция типа NC (147 м.д. и 62.5 м.д.), которая может быть отнесена к третьему остатку Pro в С-части мембранного белка. На основании статистических данных химических сдвигов в растворе, были отнесены C сигналы Val, Ile, Ser, Thr. C резонансы S, T, G, V, I и P обозначены пунктирными лияниями. В целом, наблюдаются корреляции для трёх Pro, а также дополнительно C и CO корреляции Pro с предыдущим аминокислотным остатком апобелка.

Дополнительная информация была получена в результате 2D NCC экспериментов (Рис.

35), когда NCC корреляции комбинированы с элементом гомоядерного поляризационного переноса. Например, химический сдвиг N при 90 м.д. характерен для Arg. Согласно первичной структуре, имеется лишь один Arg остаток с позицией 20 в апобелке. Таким образом, было найдено отнесение сигналов для R20 (56,2 м.д.) и R20 (31.6 м.д.) (Рис. 35).

Также отнесли R20, R20, R20 при 157.3 м.д., 32 м.д., 28.5 м.д. соответственно. Корреляция резонансов для R20 прослеживается и в СCC области спектра. C помощью сравнения области CCC или с помощью дополнительных гомоядерных CC корреляционных экспериментов проводили идентификацию аминокислотных остатков и находили химические сдвиги для C аминокислот в пептидной последовательносим белка. На основании интенсивности сигнала Arg найдено отнесение сигналов для 4-х Gly. Что касается Thr, то для них часто характерен химический сдвиг C при 60 м.д. и C при 20 м.д. Как видно из спектра, для значений 15N наблюдается три группы пиков 107-111 м.д., соответствующих корреляциям Thr-C-. Количество групп соответствует количеству остатков Thr. Различие между Ser и Thr было достигнуто на основании различной топологии их боковых цепей, в результате чего обнаружили 2-3 Ser корреляции. Наблюдали, что в случае мембранного комплекса разница в химических сдвигах по 15N составляет около 5 м.д. по сравнению с глобулярными белками; а химические сдвиги для 13C твёрдого тела схожи с химическими сдвигами в растворе.

А) Рис. 35. 2D NC-CC спектры [UC,15N]СК2. Выявлены N-C-C корреляции боковых цепей (Рис. A) и скелета (Рис. Б).

SPECIFIC CP перенос использовался для отделения резонансов углерода в области м.д. Время спиновой диффузии (CC) 8 мсек позволяет в пептиде перенос по двум Б) дополнительным связям типа CCC. На рисунке A), выявлены резонансы боковой цепи R. На рисунке Б), обозначены корреляции в скелете пептида.

Дополнительные корреляции в области 20 м.д., вероятно, соответствуют Ala и Ile. В общей сложности, чётко выявлено более 14 корреляций для этих двух типов аминокислот в части белка, пронизывающего мембрану. На основании характерной информации по химическим сдвигам боковых цепей, найдены корреляции для A, и I-2 при 15N 115 и 119 м.д. соответственно.

Характерные сдвиги для N Pro позволяют отнести области их сигналов. Наконец, наблюдается закономерность по отношению к химическим сдвигам для Val, Ile, Ile и Val1.

Рис. 36. Комбинированный NC-CC 2D эксперимент переноса [U-13C,15N]СК2. Примененяли SPECIFIC CP перенос к резонансам CO около 178 м.д. Время спиновой диффузии (CC) 8 мсек позволяет перенос по дополнительным связям в пептиде типа CO-CC. A или T содержащие пары (i,i+1) обозначены в виде S(Ci)/Ai+1, T(Ci)/Vi+1 и A(C,i)/Ti+1.

Корреляционная область для трёх пар обозначена AiIi+1.

На Рис. 36, где показана алифатическая область N-CO-CC, выявлены выраженные корреляции, включающие G субединицы (G18T19). Показано отнесение сигналов для G15I16, G21S22 - и G24L25 - апобелка. Корреляции в области 20 м.д. преимущественно отнесены к остаткам с A: A36T37 мембраннопронизывающей части и A1T2 N–концевой части белкового сегмента. Характерные химические сдвиги позволяют отнести S35A36 и проиндентифицировать T при 66 м.д. сегмента V23T24V25 апобелка. На спектре видно 6 дополнительных AX пар, которые соответствуют 3AI, 2AL и одной AF паре в мембране. Полное рассмотрение информации на основании описанных спектров и результатов Ni-(COCC)i-1 позволяет найти последовательную связь между аминокислотными остатками. NCO перенос позволяет наблюдать топологию предыдущих аминокислотных остатков полипептидной цепи (Таб. 6).

Таблица 6. Основные химические сдвиги 13C и 15N резонансов аминокислотных остатков в CKОстаток NH C C C C аминокислоты (м.д.) (м.д.) (м.д.) (м.д.) (м.д.) P12 133.4 63.1 27.9 26.0 46.G15 107.8 45.I16 118.8 59.1 31.6 30.5 14.0(2) P17 137 63.6 27.5 25.6 46.G21 106.8 43.S22 115.5 58.2 56.T24 108.4 58 66.8 18.V25 121.8 64.G18 107.5 44.T19 107.3 59.5 67.2 17.R20 124.5 56.4 28.5 31.6 56.G24 110.5 45.L25 121.S35 114.5 60.A36 118.8 48.2 19.T37 109.9 57.6 67.1 19.В результате подготовлена почва для экспериментов, связанных с когерентными шагами C-13C переноса, 3-х мерной корреляционной спектроскопией и схемами гетероядерных NC спин-спиновых развязок, которые должны привести к более детальному анализу. Улучшение разрешения может быть достигнуто с применением более высоких спиновых скоростей или более сильных полей. Дополнительная информация может быть получена на основе мультиквантовых экспериментов. На примере фотосинтетических объектов показано, что MAS ЯМР позволяет проводить структурные исследования в целых мембранных белковых комплексах и получать информацию, которую в настоящее время невозможно получить другими спектроскопическими методами.

Таким образом, в ходе работы показаны возможности и преимущества методологий [U-SIL] и MAS ЯМР для получения информации о лиганд-белковом и лиганд-лигандовом взаимодействии с использованием одного образца, а также продемонстрирована возможность получения белка-мишени, [U-15N] H1R человека в липосомальной форме в миллиграммовых количествах, что решает проблему доступности меченных стабильными изотопами белковмишеней. Это вносит существенный вклад в дальнейшую разработку методологий для определения 3-х мерной структуры белка-мишени методом ЯМР и использования информации для последующего моделирования in silico при конструировании новых лекарственных средств.

Наши исследования позволяют получать как терапевтические белки, так и белки-мишени в клеточных линиях насекомых и млекопитающих, и открывают новые возможности для разработки лекарственных препаратов и для протеомики.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ Разработан мультидисциплинарный инструмент для рационального конструирования лекарственных препаратов, состоящий из следующих элементов: технологий мультиспинового мечения как лиганда, так и белкового комплекса, высокой степени эффективности введения изотопной метки в целевой продукт, аналитических методов определения степени обогащения стабильными изотопами, а также методов контроля химического состава биомасс. Внесён вклад в развитие методологий ЯМР и Фурье ИК для структурно-функциональных исследований белковых комплексов, включая фармацевтически важные белки-мишени. Наряду с вкладом в разработку лекарственных препаратов, созданы новые возможности для разработки фармакологических и диетических подходов и ранней диагностики.

1. Исследованы возможности стратегии [U-SIL] и показаны её преимущества для структурно-функционального изучениия лиганд-белковых взаимодействий в мембранных комплексах с помощью методов MAS ЯМР и ИК. Выбраны объекты и изучены, как [U-SIL] лиганд в мембранно-белковом комплексе, так и целый [U-SIL] белковый комплекс.

13 2. Изучена эффективность биосинтетического введения C, N в различные прокариотические и эукариотические источники. Примерами являются получение [U-13C,15N] биомасс представителей трёх доменов организмов археи, прокариотов и эукариотов:

метилотрофных и фотосинтетических бактерий, грибов, дрожжей, водорослей, клеточных линий насекомых и млекопитающих. Изучен биотехнологический потенциал микробиологических источников и исследованы условия культивирования для получения биомасс с определенным химическим составом. Оценена конверсия метаболических предшественников в конечный продукт.

3. Разработан анализ химического состава биомасс c помощью ИК, который позволяет оценивать воспроизводимость, проводить качественную оценку состава биомассы без привлечения экстракции, а также количественно определять уровень введения стабильной изотопной метки.

4. Разработаны методики выделения аминокислот из гидролизатов биомасс различных природных источников в виде карбобензоксипроизводных и в свободном виде. Доступность меченых аминокислот расширяет возможности их использования для протеомики и структурной биологии в различных стратегиях мечения, таких как SILAC, U-SIL.

5. Из экстрактов биомассы и культуральной жидкости E. salmosynnemata выделены пептаиболы зервамицин IC, IIA и IIB, меченные по следующим аминокислотным остаткам:

[2',4', 5',6',7'–2H5]L-Trp-1, [1'-15N]L-Trp-1 и [2',3',4',5',6'–2H5]L-Phl-16. Выявлено, что Тrp может синтезироваться из метаболического предшественника антраниловой кислоты, а фенилаланиол из Phe. Разработанный метод является основой для получения меченных стабильными 13 15 изотопами C, N и H зервамицинов по позициям Trp-1 и Phl-16 или их комбинации.

Изменение концентрации глюкозы в питательной среде оказывает значительный эффект на суммарный выход зервамицинов и на соотношение между IIA:IIB. Найдено, что при повышенных концентрациях Trp в питательной среде основными продуктами являлись зервамицины [Leu-1; Aib-4]- и [Leu-1, Iva-4].

6. На основе экстрактов биомасс природного происхождения разработаны составы новых питательных сред PLIm для эффективного и экономичного мечения стабильными изотопами в клеточных линиях млекопитающих CHO и HEK 293. PLIm позволяет уменьшить стоимость цен питательных сред в 4-8 раз для CHO и в 3-6 раз для HEK-293 в случае N и C,15N соответственно с учётом цен индивидуальных аминокислот. Тем самым созданы возможности для получения в клеточных линиях млекопитающих меченных рекомбинантных белков, как белков-мишеней, так и терапевтических белков.

7. На основе экстрактов биомасс природного происхождения разработаны составы новых питательных сред PLI-In1 для эффективного и экономичного мечения стабильными изотопами в клеточных линиях насекомых. Показано, что комбинация компонентов сред на основе дрожжей и красных водорослей даёт наилучшие результаты и позволяет достичь 8-кратного уменьшения стоимости сред. На основании PLI-In1 в клеточной линии Sf9 получен функциональный [U-15N]H1R человека. Доступность его в миллиграммовых количествах (7-мг) открывает возможности для анализа с помощью ЯМР твёрдого тела и ИК в целях получения информации об атомной структуре белка-мишени.

8. Получены и охарактеризованы c помощью ЯМР в растворе и в твёрдом теле [UC,15N]BChl a, [U-13C,15N]BPheo a. Для BChl a в растворе пересмотрены опубликованные ранее другими авторами значения химических сдвигов для семи атомов С в и впервые отнесены одиннадцать С резонансов, что достигнуто на одном образце с применением [USIL]. Полное определение химических сдвигов резонансов атомов 1H, 13C, 15N в молекулах этих соединений создало фундаментальную основу для изучения последующих лиганд-белковых взаимодействий в фотосинтетических белках, что представляется важным с точки зрения применения порфириновых производных в медицине.

9. Разработана новая концепция использования мультиспинового мечения стабильными изотопами и ЯМР твёрдого тела, которая позволяет относить химические сдвиги меченых кластеров лигандов в белковом комплексе с помощью одного образца. Преимущества продемонстрированы на фотосинтетических объектах для характеристики кофактора и его взаимодействия с белком на примере РЦ из Rb. sphaeroides R26 c [U-13C] растительным Pheo a и с [U 13C,15N] бактериальным BPheo a; а также на примере СК2 из Rps. palustris с [U-13C,15N] BChl a B800 для характеристики кофактора и его взаимодействия с белком и кофакторкофактор взаимодействий в случае [U-13C,15N] СК2. При этом:

a) Разработан новый метод определения эффективности замещения BPheo a на [UC,15N] BPheo с помощью ИК. В связи с этим разработаны новые экспериментальные условия фотонакопления HA-, и охарактеризован пигмент. Эффективность замещения определена на основании уменьшения интенсивности ИК полос при 1590 см-1 и 1466 см-1 в спектре HA-/HA и составила выше 50%. Метод позволил отделить вибрационные полосы пигмента от поглощения белкового окружения.

б) Исследовано поведение двух кластеров феофитинов размером около 1 кДа в мембранном белковом комплексе размером 100 кДа. Наблюдалось лишь слабое взаимодействие пигментов с белком, затрагивающее углерод в положении 172 кольца IV и, возможно, кольцо V лиганда. Влияния Glu L104 на перетрубацию Pheo a со стороны активной цепи переноса электрона не замечено. Состояния протонирования пигментов оказались одинаковыми, что указывает на большое сходство двух феофитинов с точки зрения плотностей атомных зарядов для углеродов порфириновой структуры, а это вызывает особый интерес, принимая во внимание асимметрию процесса первичного разделения заряда в фотосинтезе.

в) При исследовании электронной структуры кофакторов BChl a B800 и BChl a B850 в СК2 найдено электронное сходство между B800, B850 и B850 в поляризации по оси бактериохлоринового кольца параллельно переносному дипольному моменту. Значительный сдвиг полосы Qy B850 по сравнению с Qy B800, объясняется, главным образом, перекрыванием бактериохлориновых колец B850 в СК2. Поскольку эффекты химических сдвигов распределены по хлориновому кольцу, а не локализованы на отдельных положениях углеродов, поляризация между кофакторами и белком происходит по механизму нелинейного диэлектрического ответа.

10. Изучены гетероядерные C-15N корреляции в [U-SIL] мембранном белковом комплексе методом MAS ЯМР на примере СК2 из Rps. acidophila 10050 размером 150 кДа.

Отнесение химических сдвигов в результате анализа спектров ЯМР твёрдого тела (NCO, NC;

Ni(C,C)i; Ni(C,C,C)i; Ni(C,C,C)i-1, связано, в основном, со спиральной частью мембранного комплекса, что позволило получить новую структурную информацию и внести существенный вклад при определении 3-х мерной структуры белковой части комплекса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ СТАТЬИ 1. Егорова T.A., Ерёмин С.В., Мицнер Б.И., Звонкова Е.Н, Швец В.И. Метод препаративного выделения аминокислот в виде бензилоксикарбонилпроизводных из белковых гидролизатов. //Биотехнология. - 1993.- 5, 2432.

2. Егорова T.A., Мосин О. В Ерёмин С.В., Карнаухова Е.Н., Мицнер Б.И., Звонкова Е.Н, Швец В.И.

Препаративное выделение аминокислот в виде бензилоксикарбонильных производных из белковых гидролизатов из различных источников. //Биотехнология. -1993.- 8, 21-25.

3. Egorova T.A., Eremin S.V., Mitsner B.I., Zvonkova E.N., Shvets V.I. Isolation of individual amino acids from various microbiological sources using reversed-phase high performance liquid chromatography. //J. Chromatogr.-Biomed.

-1995.- 665, 53-62.

4. Egorova-Zachernyuk T.A., Shvets V.I., Versluis K., Heerma W., Creemers A.F.L., Nieuwenhuis S.A.M., Lugtenburg J., Raap J. Preparation of site-specifically labelled zervamicins, the antibiotic peptaibols produced by Emericellopsis salmosynnemata. // J. Pept. Sci. -1996.- 2, 1-10.

5. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич А.М., Швец В.И. Исследование биосинтеза аминокислот штамом Brevibacterium methylicum во время роста на дейтерированной воде. // Биотехнология. - 1996.- 3, 3-12.

6. Мосин О.В., Егорова Т.А., Складнев Д.А., Юркевич А.М., Швец В.И. Получение бактериородопсина меченного стабильными изотопами по аминокислотным остаткам ароматических аминокислот. // Биотехнология. 1996.- 4, 27-34.

7. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т. А., Швец В.И. Оценка степени обогащения аминокислот меченных 2 стабильными изотопами H и C полученных из бактериальных объектов, с помощью масс спектрометрии.

//Биоорганическая химия. -1996.- 22 (10), 861-874.

8. Мосин О.В., Складнев, Д.А., Егорова Т. А., Швец В.И. Методы получения аминокислот и белков меченных стабильными изотопами 2H, 13C, 15N, 18O. // Биотехнология. -1996.- 10, 24-40.

9. Складнев Д.А., Мосин О.В. ЕгороваТ.А., Еремин C.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии – источники аминокислот меченных стабильными изотопами D и 13C. //Биотехнология. -1996.- 5, 25-34.

10. Egorova-Zachernyuk T.A., van Rossum B., Boender G-J., Franken E., Ashurst J., Raap J., Gast P., Hoff A., Oschkinat H., DeGroot H.J.M. NMR Characterization of protein-pheophytin interactions in Rhodobacter sphaeroides R-photosynthetic reaction centers, from multispin pheophytin enrichment and 2-D MAS NMR dipolar correlation spectroscopy. //Biochemistry-US. -1997.- 36, 7513-7519.

11. Egorova-Zachernyuk T.A., Remy A., Shkuropatov A.Ya., Gast P., Hoff A.J., Gerwert K., DeGroot H.J.M. Efficient conditions for the photoaccumulation of HA - in the photosynthetic reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26 with uniformly labelled bacteriopheophytin monitored by Fourier transform infrared difference spectroscopy. //Vibr. Spectrosc.

-1999.- 19, 347-352.

12. Matysik J., Alia Hollander J.G., Egorova-Zachernyuk T. A., Gast P., DeGroot H.J.M. A set-up to study photochemically induced dynamic nuclear polarization in photosynthetic reaction centres by solid-state NMR. //Indian J.

Biochem. Biophysics. -2000.- 37(6), 418-423.

13. Egorova-Zachernyuk T.A.,Hollander J., Frazer N., Gast P., Cogdell R., Hoff A.J., DeGroot H.J.M., Baldus, M.

Backbone correlations in a fully labelled membrane protein complex at ultra high magnetic fields. //J. Biomol. NMR. 2001.- 19, 243-214. Egorova-Zachernyuk T.A., Hollander J., Frazer N., Gast P., Cogdell R., Hoff A.J., DeGroot H.J.M., Baldus, M.

MAS NMR on a [U-13C, 15N] light-harvesting complex from Rps. acidophila 10050. //In The Future of Solid State NMR in Biology. -2001.- Kluwer Publisher. P.115. Remy A., Boers R.B., Egorova-Zachernyuk T.A., Gast P., Lugtenburg J., Gerwertn K. Assignment of methoxy vibrations of ubiquinone-10, QA and QB in the reaction centre of Rhodobacter sphaeroides by means of FT-IR spectroscopy and specific isotopic labelling. //Eur. J. Biochem. -2003.- 270(17), 3603-3609.

16. van Gammeren A.J., Hulsbergen F.B., Kiihne S., Hollander J.G., Buda F., Egorova-Zachrnyuk T.A., Frazer N., Cogdell R., DeGroot H.J.M. Selective chemical schift assignment of both B800 and B850 bactreriochlorophylls in uniformly [13C, 15N] labeled light harvesting complex from Rhodopseudomonas acidophila strain 10050 by solid state NMR at ultra-high magnetic field. //J. Am. Chem. Soc. -2005.-,3213-3219.

17. Acien Fernandez F.G., Fernandez Sevilla J.M. Egorova-Zachernyuk T.A., Molina Grima E. Cost-effective production of 13C, 15N stable isotope labeled biomass from phototrophic microalgae for various biotechnological applications. //Biomol. Eng. -2005. - 22, 193-200.

13 18. Egorova-Zachernyuk T.A., van Rossum B., Erkelens K., DeGroot H. Characterization of unformly C, N enriched bacteriochlorophyll a and bacteriochlorophyll b in solution and in solid state: assignment of the 13C, 1H and 15N chemical shifts. //Magn. Reson. Chem. -2008.- 46, 1074-1083.

19.Егорова-Зачернюк Т.А., Складнев Д.А., Швец В.И. Биотехнологическое получение высокодейтерированных пурпурных мембран галобактерий для нанобиотехнологии. //Биотехнология. -2008.- 6, 60-72.

20. Pistorius A., DeGrip W.J. Egorova-Zachernyuk T.A. Monitoring of biomass composition from microbiological sources by means of FT-IR spectroscopy. //Biotechnol. Bioeng. -2009.- 103, 123-129.

21. Egorova-Zachernyuk T.A., Bosman G., Pistorius A., DeGrip W.J. Production of yeastolates for uniform stableisotope labelling in eukaryotic cell culture // Appl. Microbiol. Biot. -2009.- 84, 575-581.

22. Егорова-Зачернюк Т.А., Босман Г.Й.С.Г.М., ДеГрип В.Й., Швец В.И. Введение стабильной изотопной метки в гистаминовый рецептор человека Н1R: перспективы для рациональной разработки лекарств. //Доклады Академии Наук. Биохимия, биофизика, молекулярная биология. -2010.- 433(2), 257-261.

23. Egorova-Zachernyuk T.A., Bosman G J.G.C.M., DeGrip W.J. Uniform stable-isotope labelling in mammalian cells: formulation of a cost-effective culture medium. // Appl. Microbiol. Biot. -2010.- DOI: 10.1007/s00253-010-2896-5.

ПАТЕНТНАЯ ЗАЯВКА WO 2005/005616 A3; приоритет от 11.07.2003 г. PCT/NL03/00514. Egorova-Zachernyuk, T.A. Compositions and methods for stable isotope labelling of biological compounds. Решение о выдаче патента в РФ от 1.07.2010 и в Австралии от 21.07.2010.

ОСНОВНЫЕ ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ (ОБЩЕЕ ЧИСЛО 42) 1. Egorova T.A., Eremin S.V., Zvonkova E.N., Shvets V.I. Preparative isolation of individual amino acids from various microbiological sources by means of RP HPLC. //2-nd World Conference. Stable Isotopes in Nutritional and Metabolic Research. Rotterdam, The Netherlands. -1994.- P.2. Egorova T.A., Shvets V.I., Versluis K., Heerma W., Lugtenburg J., Raap J. Specifically stable isotope labelled peptide antibiotic zervamicines produced by Emericellopsis salmosynnema. //14-th American Peptide Symposium, Columbus, Ohio, USA. Thesis. -1995-. P.23. Egorova-Zachernyuk T.A., Ogrel Al., Raap J. Stable isotope labelled peptaibol zervamicin. Biosynthesis and chemical synthesis. //Конференция, посвященная 100 летию со дня рождения Преображенского. -1996.- Москва.

Российская Федерация. P.153-155.

4. Egorova-Zachernyuk T.A., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biotechnological preparation of deuterium, nitrogen-stable isotopically double labelled bacteriorhodopsin. //7-th International Conference on Retinal Proteins, Zichron Yaacov, Israel, Thesis. -1996-. P.5. Egorova-Zachernyuk T.A., Raap J., Oschkinat H., Gast P., Frank H., DeGroot H.J.M. Investigation of carotene/chlorophyll a interactions in solution by 1-D and 2-D NMR correlation spectroscopy. //11-th International Symposium on Carotenoids. Leiden, The Netherlands, -1996-. P.16. Egorova–Zachernyuk T.A., van Rossum B., Boender G-J., Raap J., Gast P., Hoff A., Oschkinat H., DeGroot H.J.M.

Characterization of cofactors in a membrane protein with multispin enrichment and C MAS NMR dipolar correlation spectroscopy. //The 39-th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference. The Asilomar conference Center.

Pacific Grove, CA. USA. -1998.- P.7. Egorova-Zachernyuk T.A., Remy A., Shkuropatov A.Ya., Gast P., Hoff A.J., Gerwert K., DeGroot H.J.M. Efficient conditions for the photoaccumulation of HA - in the photosynthetic reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26 with uniformly labelled bacteriopheophytin monitored by FT-IR in Photosynthesis: Mechanisms and Effects. Volume II. // Proceedings of the XI International Congress on Photosynthesis. Budapest, Hungary, -1998.- Kluwer Academic Publishers.

P.755-758.

8. Egorova-Zachernyuk, T.A., Fraser, N., Cogdell, R., Gast, P., Hoff,A., DeGroot H.J.M. Characterization of bacteriochlorophyll B800 in СК2 of Rhodopseudomonas acidophila with 2-D C MAS NMR dipolar correlation spectroscopy. //The Alpine Conference on Solid State NMR. Chamonix-Mont Blanc, France. -1999.- P.101.

9. Egorova-Zachernyuk T.A., Hollander J., Fraser N., Cogdell R., Gast P. Hoff A., DeGroot H.J.M., Baldus M.

, Backbone and sidechain correlations of a uniformly C,15N labelled membrane protein complex at ultra-high magnetic fields. //41 Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference. Asilomar, CA, USA. -2000.- P 201//8-th International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. Sandestin, Florida, USA, -2000.- P.210. Egorova-Zachernyuk T.A. Structure Based Drug Design: Perspectives of Solid State NMR.//CamerinoNoordwijkerhout Symposium, Camerino, Italy. -2003.- P.11. Egorova A.D., van Wyk L., Willems H.J.J., Egorova-Zachernyuk T.A. Design of novel media for membrane protein production in photosynthetic bacteria. //5-th European workshop on Algal Biotechnology. Potsdam, Germany 2003.- P.6.

12. Egorova-Zachernyuk T.A. Application of stable isotope labelled products from algae: new opportunities for structure based drug design and solid state NMR. //The 10-th International Conference on Applied Phycology. -2005.- Kunming, China, P.43.

13. Egorova-Zachernyuk T.A., Pistorius A.M.A., DeGrip W.J. Determination of stable isotope incorporation by Fourier Transform infrared spectroscopy: new opportunities for proteomics and metabolomics. // Phytopharm 2007 11-th International congress, Leiden, The Netherlands. -2007.- P13.

14. Egorova-Zachernyuk T.A., Willems H., Lamers E., Bosman G.J.G.C.M., DeGrip W.J. Stable isotope labelling of drug targets for structure based drug design: the human histamine H1 receptor. Мечение стабильными изотопами белков-мишеней для рациональной разработки лекарственных препаратов: гистаминовый рецептор H1R человека.

//XVIII Международный Менделеевский конгрес, Москва, Россия. Tезисы. -2007.- P.472.

15. Egorova-Zachernyuk T.A., DeGrip W.J. Stable isotope labeling of drug targets and protein therapeuticals in insect and mammalian cells. //Euromar. St. Petersburg. Russian Federation. -2008.- P. 473.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ATR (attenuated total reflection) - смягчённое полное отражение APCI (atmospheric pressure chemical ionization) - химическая ионизация под атмосферным давлением CID (collision induced dissociation) - вызванная столкновениями диссоциация CD (circular dichroism) - круговой дихроизм COLOC (correlated spectroscopy via long range couplings) - корреляционная спектроскопия через спинспиновое взаимодействие удалённых атомов COSY (correlated spectroscopy) - корреляционная спектроскопия CP (cross polarization) - кросс-поляризация Cw (continues wave) - стационарная развёртка частоты DFT (density functional theory) - теория функциональной плотности DRIFT (diffuse reflectance infrared Fourier transform) - диффузионный отражательный инфракрасный Фурье перенос ESI (electrospray ionization) - электроспреевая ионизация ENDOR (electron nuclear double resonance) - электронно-ядерный двойной резонанс FAB (fast atom/ion bombardment) - бомбардировка быстрыми атомами FS-LG (frequency-switched Lee-Goldburg) - переключение частоты по Ли-Голдбургу FT-IR (Fourier transform infrared) - инфракрасная спектроскопия c Фурье преобразованием FTICR (Fourier transform ion cyclotron resonance) - Фурье трансформ ионный циклотронный резонанс FSD (Fourier self-deconvolution) - Фурье самодеконволюция GPCR (G-protein coupled receptors) - G-белок сопряженные рецепторы HMBQ (heteronuclear multiple-bond correlation) - гетероядерная корреляционная спектроскопия через несколько связей HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence) - гетероядерная корреляционная спектроскопия с многоквантовым переносом когерентности HOHAHA (homonuclear Hartmann Hann) - гомоядерная корреляционная спектроскопия с использованием эффекта Хартмана-Хана ISD (isopotential spin-drying) - изопотенциальная спиновая сушка LC (liquid chromatography) - жидкостная хроматография LSI (liquid secondary ionizatio) - вторичная жидкостная ионизация MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) - лазерная десорбция/ионизация, индуцированная с помощью матрицы MAS (magic angle spinning) - вращение под магическим углом NMR (nuclear magnetic resonance) - ядерный магнитный резонанс (ЯМР) NOESY (nuclear Overhauser effect spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера RFDR (radio-frequency-driven dipolar recoupling) - диполярная развязка, вызванная радиочастотами PFG (pulsed field gradient) - импульсный градиент магнитного поля RIA (relative isotope abundance) - относительное изотопное распространение ROESY (rotational nuclear Overhauser effect spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат SILAA (stable isotope labelling amino acids) - меченные стабильными изотопами аминокислоты SILAC (stable isotope labelling with amino acids in cell culture) - мечение стабильными изотопами с помощью аминокислот в питательной среде TOCSY (total correlation spectroscopy) - полная корреляционная спектроскопия TPPM (two pulse phase modulation) - двухимпульсная фазовая модуляция USIL (uniform stable isotope labelling) - тотальное (всеобщее) мечение стабильными изотопами [U-13C, 15N] - тотальное (всеобщее, по всем положениям углерода и азота) мечение стабильными изотопами 13C, 15N ZQ (zero quantum), нуль-квантовый Chla a (chlorophyll a) - хлорофилл a Pheo a (pheophytin a) - феофитин a BChl a (bacteriochlorophyll a) - бактериохлорофилл a BPheo a (bacteriopheophytin a) - бактериофеофитин a СК2 (light harvesting complex 2) - светособирающий комплекс 2 (СК2) РЦ – (reaction centers) - реакционные центры (РЦ) H1R (histamine 1 receptor) - гистаминовый рецептор первого типа






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.