WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА 

Людмила Анатольевна

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ  ИЗМЕНЕНИЯ  В  ОРГАНИЗМЕ ПИТАЮЩИХСЯ  КЛЕЩЕЙ  ИКСОДИН  (IXODINAE),  ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ  КЛЕЩЕЙ  С ОРГАНИЗМОМ  ХОЗЯИНА  И  ПАТОГЕНАМИ

03. 00. 19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации  на  соискание  ученой  степени

доктора  биологических  наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ  -  2007

Работа выполнена  в  лаборатории паразитологии Зоологического института РАН

Научный консультант Чл.-корр. РАН,  доктор  биологических наук БАЛАШОВ  Юрий Сергеевич

Официальные оппоненты:

  доктор биологических наук, профессор  БЕЛОЗЕРОВ Валентин Николаевич

  доктор биологических наук, профессор  КОРЕНБЕРГ  Эдуард Исаевич

  доктор медицинских  наук, профессор  КОЗЛОВ Сергей Сергеевич

  Ведущая организация ФГОУВПО Санкт-Петербургская  государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится « 13 »  ноября 2007  г. в 14 часов на заседании диссертационного совета  Д 002.223.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук Зоологического института РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.,1, факс: (812) 328-29-41.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Зоологического института РАН

Автореферат разослан «___»____________  2007 г

 

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук ОВЧИННИКОВА

Ольга Георгиевна

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

 

Актуальность темы. Иксодовые клещи представляют группу высокоспециализированных кровососущих членистоногих, паразитирующих на наземных позвоночных животных.  В процессе длительной эволюции у иксодид (Ixodidae) развился комплекс морфофункциональных адаптаций к кровососанию и эктопаразитизму в первую очередь на млекопитающих и птицах (Балашов, 2004). Всем иксодидам свойственна жизненная форма длительно питающихся временных эктопаразитов. Личинки, нимфы и самки питаются однократно, каждый акт питания занимает от 3-6 у неполовозрелых особей до 6-12 сут у самок и сопровождается многократным  увеличением массы и размеров тела по типу неосомии  (Балашов, 1998). В связи с этим у особей одной фазы на стадиях свободного существования и питания существуют глубокие морфофункциональные различия.  Иксодиды на каждой фазе развития  чередуют периоды свободного существования и паразитизма, которые  различаются  глубокими морфофункциональные изменениями.  Суммарное время питания  на всех фазах значительно меньше периода свободного непаразитического существования.  Однако, период питания является определяющим для продолжения онтогенеза особи, а морфо-функциональные изменения в организме питающихся клещей становятся основным регулирующим механизмом  в системе отношений паразита с хозяином - прокормителем, что является  базой  образуемой ими природной паразитарной системы.  В состав такой паразитарной системы могут входить многие виды микроорганизмов, простейших, нематоды, часть из которых является возбудителями инфекций и инвазий позвоночных.  Медико-ветеринарное значение иксодид  огромно вследствие их способности передавать при укусах многие виды возбудителей трансмиссивных инфекций, а также сохранять и накапливать их в периоды между питаниями. От собранных в природе иксодовых клещей было выделено более 100 вирусов, более 30 видов риккетсий, несколько видов бактерий, простейшие и филлярии, многие из которых патогенны для человека и животных (Балашов, 1995).

Клещей сем. Ixodidae,  насчитывающего около 680 видов, принято разделять на 2 группы: Prostriata и  Metastriata (Horak e. a., 2002), в современной русскоязычной литературе  чаще применяют разделение на два подсемейства: Ixodinae и Amblyomminae (Филиппова, 1997). Количество надвидовых группировок в  Metastriata и в Amblyomminae различно, а Prostriata  и  Ixodinae представляют один род Ixodes.  Данные систематики, морфологии, экологии, зоогеографии, а также молекулярной таксономии показывают на целесообразность подобного разделения и  свидетельствуют о раннем эволюционном разделении этих двух стволов (Балашов, 2004).  К клещам рода Ixodes, образующего  подсем.  Ixodinae, относится  241 вид (Horak e. a., 2002).

  При сходстве общей схемы паразито-хозяинных отношений у клещей подсемейств Ixodinae  и  Amblyomminae у них выявлены значительные отличия  в различных аспектах этих отношений, в частности морфофункциональной реализации основных жизненно важных процессов, таких как питание, пищеварение, слюноотделение.  Морфологические различия представителей этих двух подсемейств затрагивают основные системы органов. Кроме отличия в системе определения пола существуют вариации числа хромосом. Обе группы отличаются друг от друга строением выводных протоков самок, строением секреторных альвеол слюнных желез, строением дермальных желез, местом формирования линочного шва, а также особенностями прикрепления при питании (Балашов, 1998).  Это обстоятельство позволяет предполагать, что морфофункциональная реализация жизненной схемы у клещей этих двух подсемейств иксодид различна.

Обращает внимание факт отсутствия общих возбудителей  у представителей подсем. Ixodinae  и  Amblyomminae.  Это указывает на наличие специфических особенностей  у видов этих двух подсемейств и целесообразность их морфофункциональных исследований. К числу важнейших процессов, регулирующих комплекс паразито-хозяинных отношений клеща с возбудителями и прокормителями, относятся морфофункциональные перестройки кишечника и слюнных желез питающихся клещей. На стадии питания многие иксодины способны получать и передавать возбудителей трансмиссивных инфекций, судьба которых, в свою очередь, зависит от согласованности их циклов с морфофункциональными изменениями и способности к диссеминации в организме клеща.

  Морфология и физиология основных систем органов клещей подсемейства Amblyomminae детально исследованы и описаны в нескольких, ставших классическими, обзорах (Балашов, 1967; Атлас..., 1979; Physiology of ticks, 1982; Sonenshine, 1991). Значительно меньше оказались изученными представители подсемейства Ixodinae (Таежный...,1985; Балашов, 1998), однако уже имеющиеся данные показывают значительные различия в строении и физиологии  представителей этих подсемейств, так что экстраполировать данные морфологии амблиоммин на представителей р. Ixodes нам представляется ошибочным.

  Таким образом, необходимость продолжения исследований морфофункциональных изменений у питающихся иксодин не вызывает сомнений. Особенно важными являются исследования основных систем органов иксодин, которые участвуют и находятся под непосредственным влиянием процессов питания и пищеварения - кишечник, слюнные железы, а также особенности прикрепления при питании.

  Актуальность проведения данного исследования заключается в том, что несмотря на детальное изучение морфологии и физиологии иксодовых клещей (сем. Iodide) на примере представителей подсемейства Amblyomminae, морфофункциональные особенности клещей подсемейства Ixodinae долгое время оставались не исследованными. Накопившиеся  к настоящему времени данные свидетельствуют о принципиальных морфологических отличиях представителей двух подсемейств. Важно отметить, что факты  переноса иксодинами возбудителей трансмиссивных инфекций, таких как клещевой энцефалит и иксодовые клещевые боррелиозы, делают исследования этих клещей не только актуальными, но и практически важными.

  Цель и задачи исследования.  Целью настоящего исследования является изучение морфофункциональных изменений в организме питающихся иксодин и их значения в регуляции клещём отношений с природными прокормителями и  патогенами на примере боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l.

  Для выполнения исследования были поставлены следующие задачи:

  1. Изучить динамику питания и морфофункциональные перестройки в центральном отделе кишечника и в дивертикулах на протяжении питания  нимф и самок клещей рода Ixodes.
  2. Исследовать особенности морфофункциональных изменений при действии факторов, дестабилизирующих питание клещей (отсутствие оплодотворения у самок, иммунизирующие кормления на лабораторных животных).
  3. Выяснить особенности морфофункциональных изменений в слюнных железах самок клещей рода Ixodes  в голодном состоянии и на протяжении всего периода питания.
  4. Исследовать особенности прикрепления при питании клещей рода Ixodes на  их природных прокормителях, мелких млекопитающих, птицах, ящерицах. Провести сравнительный анализ особенностей питания иксодин на амниотах.
  5. Провести сравнительный анализ морфофункциональных изменений в организме питающихся самок клещей подсем. Ixodinae  и  Ambliommynae.
  6. Выявить особенности  формирования резистентности у рыжих полевок, основных прокормителей преимагинальных фаз иксодин в лесных экосистемах северо-запада России.
  7. Исследовать  значение морфофункциональных перестроек в организме питающихся клещей иксодин для  получения, сохранения и передачи патогенов, на примере боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l.

  Научная новизна.  Впервые проведено исследование изменений в кишечнике и слюнных железах на протяжении всего многодневного питания иксодин. Показано, что неосомия, или доразвитие организма клеща на стадии питания, происходит в результате образования, функционирования и смены нескольких морфофункциональных пластов кишечных клеток, обеспечивающих  пищеварение. Впервые исследована динамика образования перитрофического матрикса различными пластами кишечных клеток на протяжении питания, обсуждается его роль в пристеночном пищеварении и защитная функция. Исследована динамика гранулосекреторной активности слюнных желез самок иксодин, показано изменение секреторных продуктов на протяжении питания. На основании обширных литературных данных об иммунохимическим факторах слюны и собственных морфофункциональных исследований клещей сделана попытка анализа фармакологических свойств  секретов разных типов гранулосекреторных альвеол  на протяжении питания.

Впервые  описаны особенности питания и прикрепления клещей на представителях основных групп природных прокормителей (мелких млекопитающих, воробьиных, ящерицах) в сравнении с лабораторными животными. Показано, что у природных прокормителей при питании иксодин развивается воспаление продуктивного характера с образованием струпа, фибринового конуса и коллагеновой капсулы, локализующей очаг. Доказано, что при питании иксодины не образуют цементного футляра, в отличие от амблиоммин.

  Впервые  проведено исследование (иммуноферментный анализ) противоклещевой резистентности рыжих полевок из природы, основных прокормителей преимагинальных фаз иксодин, полученные данные проанализированы с учетом сезонной динамики активности иксодин и результатов лабораторных кормлений. Показано, что третья часть природной популяции рыжих полевок в условиях северо-запада России формирует иммунитет к таежному клещу.

Исследованы локализация, трансовариальная и трансфазовая передачи боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. у таежного клеща. Установлено, что развитие боррелий  в организме клеща адаптировано не только к морфофункциональным изменениям у каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз в онтогенезе. Сделан вывод о том, что существование у клещей рода Ixodes специфических морфо-функциональных особенностей, таких как наличие перитрофического матрикса и пристеночное пищеварение, слабо выраженное внекишечное пищеварение, отсутствие фагоцитоза и цементного футляра, обеспечивает их участие как специфических переносчиков возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов и клещевого энцефалита в природных очагах этих инфекций, в отличие от представителей амблиоммин, не обладающих этими особенностями.

Обосновано положение о том, что в регуляции паразито-хозяинных отношений в природных очагах трансмиссивных инфекций основное значение имеет синхронизация морфофункциональных изменений в организме питающихся иксодин и их согласованность с защитными реакциями организма прокормителя, особенно в местах питания клещей, что обеспечивает возможность циркуляции патогенов.

Теоретическое и практическое значение работы определяется новыми данными о регуляции паразито-хозяинных отношений между питающимися клещами, их прокормителями и возбудителями боррелиозов. Они реализуются на клеточно-организменном уровне системой морфофункциональных перестроек в организме питающихся клещей  рода Ixodes, основных переносчиков клещевого энцефалита и боррелиозов в России.  Результаты исследования открывают широкие перспективы в дальнейшем  исследовании паразито-хозяинных отношений иксодин, переносчиков возбудителей опасных инфекций.

Сведения, приведенные в работе, могут быть использованы в вузах при чтении лекций в курсах паразитологии и акарологии, а также могут найти применение при разработке систем контроля  клещей ветеринарными и санитарно-эпидемиологическими службами.

Основные положения, выносимые на защиту.

Морфофункциональные изменения в организме питающихся клещей иксодин строго синхронизированы с защитными реакциями в организме хозяина-прокормителя на протяжении всего периода питания.

Гистопатологические изменения в местах питания иксодин на прокормителях происходят в последовательности, характерной для раневого воспаления. Цементный футляр иксодины не образуют.

  В основе пищеварения у иксодин лежит смена морфофункциональных пластов  кишечных клеток. Перитрофический матрикс формируется на поверхности  кишечных клеток всех морфофункциональных пластов на протяжении всего периода питания, разделяет зоны внутриклеточного и полостного пищеварения и, вероятно участвует в пристеночном пищеварении.

Развитие боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. в организме клеща адаптировано не только к морфофункциональным изменениям  в организме каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз  особи в онтогенезе.

Апробация результатов работы.  Результаты исследований прошли апробацию на российских симпозиумах (XI – 1998 г. и XII – 2002 г. Съезды Русского Энтомологического Общества, VII – 1999 г.  и VIII – 2004 г. Акарологические совещания, Республиканские научные конференции 2000,2002 гг., В. Новгород «Роль кровососущих насекомых и клещей  в лесных экосистемах России»), участвовала в11-th International Course “ Biology of Disease Vectors”, Cheske Budejovice, June 16-30, 2001, в Отчетных научных сессиях зоологического института РАН, в 30-м и 35-м Чтениях, посвященных памяти академика Е.Н. Павловского (ЗИН РАН, ВМА).

  Публикации. Всего диссертантом опубликовано 32 работы, из них по теме диссертации – 24 работы, все в рецензируемых журналах  из списка ВАК.

  Объем и структура диссертации.  Диссертация  изложена на 237 страницах  машинописного текста и состоит из  введения,  7 глав, выводов, списка литературы (317 наименования, из них 91 - на русском языке). Работа проиллюстрирована 14  таблицами и 164 рисунками, включающими в основном оригинальные микрофотографии гистологических и электронно-микроскопических препаратов.

  Благодарности.  Автор выражает признательность сотрудникам лаборатории паразитологии Зоологического института РАН, оказавшим помощь и поддержку.

Представленная работа на разных этапах была поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проекты № 96-04-48389, 96-15-97882, 99-04-49658, 02-04-48666)  и Грантом поддержки ведущих научных школ (№ НШ-1664.2003.4)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1.  МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

  Исследования морфофункциональных изменений в организме питающихся клещей подсемейства Ixodinae проводили на клещах из культуры лаборатории паразитологии Зоологического института РАН (Ixodes pacificus Cool et Kohls, 1943, I. pavlovsky Pom., 1946, I. persulcatus Schulze, 1930, I. ricinus (L., 1758) и I. scapularis Say, 1821)  и клещах (I. persulcatus, I. ricinus), собранных в природных биоценозах северо-запада России в Ленинградской, Новгородской и Псковской обл. в 1994-2006 гг.

Морфофункциональные изменения кишечника питающихся нимф были исследованы на примере нимф клещей  I. pacificus,  I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis  при развитии без диапаузы (при 97%-ной влажности и 21-23С  в режиме 18 ч света и 6 ч темноты). Морфофункциональные изменения кишечника нимф в состоянии диапаузы исследовали на нимфах I. ricinus L. (при 97%-ной влажности, 16-18С  в режиме 16-14 ч света и 8-10 ч темноты). Для гистологических исследований использовали голодных и питающихся нимф через 10,18,24,36,44,60,69,84,96,108 ч после присасывания, а также через 10,20,30,40,45,50 и 60 сут после отпадения. Клещей фиксировали целиком в 9% -ном формалине и спирт-формалине, надрезая кутикулу. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином.

Исследование морфофункциональных изменений кишечника питающихся самок было проведено на оплодотворенных голодных и питающихся самках клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis из лабораторной культуры. Для гистологических исследований использовали оплодотворенных голодных и питающихся самок через 9-12 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение всего периода  питания, а также через 3, 5, 10, 15, 20 и 33 сут после отпадения. Клещей вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4), желудок и пары дивертикулов, имеющие общие основания (1+2+3, 4+5, 6+7 пары), фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине, а затем исследовали отдельно.  Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином, а также выявляли двухвалентное железо по образованию турнбулевой сини.

  Влияние оплодотворения на морфофункциональные перестройки в кишечнике самок исследовали на девственных самках I. ricinus, I. pacificus и I. persulcatus из культуры. Для гистологических исследований использовали голодных и питающихся самок на 3,4,5,6,8,11 и 12 сут после присасывания. Вскрытие клещей и подготовку гистологического материала проводили по описанным выше методикам.

Для выяснения влияния иммунитета хозяина-прокормителя на морфо-функциональные изменения в кишечнике при питании на иммунизированных хозяевах  использованы самки I. persulcatus и I. ricinus , полученные в течение и после 2-го и 3-го иммунизирующих кормлений на лабораторных кроликах. Иммунизация заключалась в трехкратном последовательном кормлении самок клещей (по 10 особей каждого вида) на одних и тех же кроликах с интервалом в 1 месяц. Гистологическая подготовка материала описана выше.

Изучение особенностей образования и функционирования перитрофического матрикса проведено на самках клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis из лабораторной культуры. Для гистологических исследований использовали голодных самок и самок на разных сроках питания (9-12 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение питания), а также самок через 3, 5, 10, 15, 20 и 33 сут после отпадения. Клещей вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4), желудок и пары дивертикулов, имеющие общие основания (1+2+3, 4+5, 6+7 пары), фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине, а затем исследовали отдельно.  Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином, а также выявляли двухвалентное железо по образованию турнбулевой сини. Материал для электронно-микроскопитческих исследований фиксировали в 2%-ном глютаральдегиде на 0.1 М фосфатном буфере с последующей дофиксацией 1%-ной четырех окисью осмия.  Дальнейшая обработка материала проводилась по стандартной методике. Заливочной средой служил эпон. Срезы изготавливали на ультратоме фирмы LKB, а затем исследовали на электронных микроскопах Tesla BS-500 и LEO-900.

Особенности строения и функционирования слюнных желез самок иксодин во время питания были исследованы на самках 5 видов рода Ixodes (Ixodinae):  I. pacificus , I.  pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis. Голодных самок и самок на разных сроках питания (1, 4, 9-12, 12-15, 15-20 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение питания) вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4). Для световой микроскопии слюнные железы фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине.  Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином. Для электронно-микроскопических исследований отпрепарированные слюнные железы I. persulcatus фиксировали в 2% растворе глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере с последующей дофиксацией 1% раствором четырехокиси осмия на том же буфере с добавлением сахарозы. Дальнейшая обработка материала проводилась по общепринятым методикам. В работе были использованы электронные микроскопы Tesla BS 500  и  LEO 900.

В основу работы по исследованию мест прикрепления клещей на природных прокормителях положен материал из природы - пробы кожи в местах присасывания и питания личинок, нимф и самок I. trianguliceps Birula, 1895  и личинок и нимф I. persulcatus на мелких млекопитающих: рыжей полевке (Clethrionomys glareolus Schr., 1780), красной полевке (C. rutilus Pall., 1779), обыкновенной бурозубке (Sorex araneus L., 1758),  малой бурозубке (S. minutus L., 1766), малой лесной мыши (Apodemus uralensis Pall., 1811). Для более детального изучения процессов, происходящих в местах прикрепления и питания клещей,  были использованы 25 особей рыжих полевок из культуры вивария лаборатории паразитологии Зоологического института. Биопсию кожи с питающимися клещами произвели у 20-и особей грызунов с последующей фиксацией через 2, 4, 12, 24, 39, 48, 69, 71 и 95 ч после присасывания. Пять особей через 15 сут после первого кормления были использованы для повторного, на них также кормили по 5 нимф. Материал фиксировали через 24,  48 и 72 ч после прикрепления. Для выведения лейкограммы у грызунов брали периферическую кровь до и после кормления. Биопсия кожи в местах питания нимф и самок I. trianguliceps и нимф I. ricinus и I. persulcatus на белых мышах, а также самок I. ricinus и I. persulcatus  на  кроликах произведена на разных сроках прикрепления для установления способности клещей этих видов к образованию цементного футляра. Всего исследовано более 250 проб кожи. Гистопатологию мест прикрепления изучали после фиксации материала 10% -ным формалином, спирт-формалином, глютаральдегидом или жидкостью Буэна. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы толщиной 5 и 7 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, азотнокислым серебром по Левадити. Часть материала после формалиновой фиксации исследовали в реакции иммунофлуоресценции с ФИТЦ мечеными сыворотками на иммуноглобулины белой мыши и кролика для определения видовой принадлежности тканей, окружающих ротовые части питающихся клещей.

  Для исследования особенностей гистопатологии  мест прикрепления и питания иксодин на птицах из природных биоценозов производили сборы клещей с воробьиных (Passeriformes) в Новгородской обл. В августе 1998 и июне 1999 гг. было отловлено 648 особей 38 видов  воробьиных. Клещи обнаружены лишь на 21 птице 10 видов (лесной конек (Anthus trivialis (L.)), зарянка (Erithacus rubecula (L.)), зяблик (Fringilla coelebs L.), лесная завирушка (Prunella modularis (L.)), снегирь (Pyrrhula pyrrhula (L.), садовая славка (Sylvia borin (Bodd.)), дрозд белобровик (Turdus iliacus L.), черный дрозд (T. merula L.), певчий дрозд (T. philomelos C.L.Brehm.), дрозд рябинник (T. pilaris L.)), всего было собрано 20 личинок и 64 нимфы таежного клеща.  Личинок, нимф и самок  I. lividus Koch, 1844 собирали в колонии  береговой ласточки (Riparia riparia (L.)) в песчаном карьере в Новгородской обл. в мае со взрослых птиц, а в июне и июле с птенцов.  Для гистологических исследований брали биопсию кожи  вместе с присосавшимися клещами. Материал фиксировали в 10% формалине и жидкости Буэна, заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Серийные срезы, толщиной 5 мкм, окрашивали азаном по Гейденгайну и азур-эозином. Всего исследована 31 проба кожи с I. persulcatus  и  10 -  с I. lividus.

Для исследования особенностей прикрепления при питании иксодин на пресмыкающихся в эксперименте были использованы пять особей Lacerta agilis. На трех ящериц были посажены нимфы I. ricinus, на двух -  нимфы  I. pacificus из лабораторной культуры. Для гистологических исследований было получено 19 кожных биоптатов, 12 с нимфами I.ricinus и 7 с нимфами I.pacificus. Биоптаты фиксировали в формалине и спирт-формалине, заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 и 7 мкм окрашивали азур-эозином и азаном по Гейденгайну.

Исследование резистентности рыжих полевок, природных прокормителей преимагинальных фаз иксодин в условиях биоценозов северо-запада России, проводили с использованием иммуноферментного анализа  (ELISA).  Пробы крови брали от живых особей рыжих полевок, отловленных  в сезон активности  личинок и нимф таежного клеща (с 20 августа по 30 сентября 2003 г и с 4 апреля по 29 сентября 2004г), всего исследовано 115  проб крови.  Рыжих полевок  (11 особей),  разводимых и выращенных в культуре лаборатории паразитологии Зоологического института,  использовали для опытных иммунизаций личинками и нимфами таежного клеща, полученных также в культуре лаборатории паразитологии. Количество прокармливаемых в лабораторном опыте личинок и  нимф было приближено к  средним показателям  паразитарной нагрузки в природной системе, которая составляет 3- 5 личинок  или 2-3 нимфы  на одну особь рыжей полевки (Григорьева, Третьяков, 1998). В результате первичного  иммунизирующего кормления  на 6 трехмесячных рыжих полевках напиталось 12  (по 2) нимф из 36 посаженных для кормления, на 5 рыжих полевках - напиталось 25 (по 5) личинок из 75.  При повторном  иммунизирующем кормлении через 4 недели такое  же количество  клещей было прокормлено этими же особями рыжих полевок. Негативным  контролем была сыворотка крови не иммунных рыжих полевок (3 особи 3-месячного возраста). Кровь от животных получали из ретроорбитального синуса, по 0.3-0.5 мл от каждой особи, соединяли в индивидуальных  микропробирках с цитрат-фосфатным буфером  и сохраняли при -21С  до иммуноферментного исследования. В качестве основы для антигена использовали слюнные железы самок таежного клеща, полученные  при анатомировании клещей, питавшихся в течение 2-3 сут. Дальнейшая подготовка антигена и исследование сывороток крови полевок было проведено на базе  НПФ “Helex” (Cанкт-Петербург)  по стандартной методике.

  Изучение особенностей природных очагов клещевых боррелиозов в условиях северо-запада России проводилось на севере Новгородской обл. в подзоне южной тайги с преобладанием еловых лесов.  За период 1995-1997 гг. в течение сезона активности клещей обследовано 928 зверьков мелких млекопитающих, с них собрано 357 личинок и 59 нимф I. persulcatus и 356 личинок и 71 нимфа I. trianguliceps. От мелких млекопитающих на боррелии исследовали мазки крови из полости сердца и мазки-отпечатки почек (Burgess e.a., 1990), окрашенные по методу Романовского-Гимза. Из личинок и нимф клещей изготавливали давленные прижизненные препараты, которые просматривали в режимах темного поля и фазового контрастов. Мазки из личинок и нимф клещей и мазки крови мелких млекопитающих после фиксации в ацетоне исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) с моноклональными антителами Н5332 и Н605, предоставленными д-ром Дж. Оливером (J. Oliver, Institute of Arthropology and Parasitology, Georgia Southern University, USA).  Серологические реакции проведены с соблюдением положительного контроля с Borrelia burgdorferi s. str. североамериканского штамма В-31 и отрицательного контроля на B. hermsii (Крючечников и др., 1993). За три полевых сезона обследовано 716 особей мелких млекопитающих, 352 личинки и 55 нимф I. persulcatus, 353 личинки и 65 нимф I. trianguliceps.

Материалом для исследования локализации боррелий в организме таежного клеща послужили преимагинальные фазы и взрослые клещи, собранные на флаг с растительности в Ленинградской, Новгородской и Псковской обл. в 1994-1996гг. Всего исследовано 363 взрослых клеща (202 самки и 161 самец), 27 личинок и 52 нимфы из природных популяций, а также 50 самок 62 самца, 130 личинок и 30 нимф, полученных в лаборатории от инфицированных самок из природы. Кусочки кишечника,  слюнных желез, мальпигиевых сосудов и яичников от клещей, вскрытых в ванночках с фосфатным буфером (рН 7.2), исследовали в темном поле, фазовом и аноптральном контрастах при увеличении х 600. Определение локализации боррелий в клещах основывали на методике серебрения по Левадити. Для этого инфицированные органы клещей фиксировали в 10%-ном формалине и обрабатывали 2%-ным азотнокислым серебром с последующим восстановлением пирогалловой кислотой. Далее органы клещей заливали в парафин и изготавливали из них срезы толщиной 5 мкм. Срезы заключали в канадский бальзам и просматривали при увеличении х 1200 и х1500 в масляной иммерсии.

Для выяснения распространения трансфазовой и трансовариальной передач  на зараженность боррелиями обследовано потомство 20 инфицированных боррелиями самок  I. persulcatus, включая 9 самок, собранных в природе, 6 самок первого и 5 - второго лабораторных поколений. Всего микроскопическими методами исследовано 250 личинок, 178 нимф, 59 самок и 70 самцов трех последовательных генераций, выращенных в культуре. При отлове мелких млекопитающих из природы собрано и обследовано 77 голодных личинок таежного клеща.  Из личинок и нимф готовили прижизненные давленые препараты, которые просматривали в режимах фазового контраста или  темного поля. Имаго вскрывали в фосфатном буфере и исследовали отдельно пробы из разных органов. Часть препаратов после фиксации в холодном ацетоне исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) с моноклональными антителами (МА) Н605 на флагелиновые белки спирохет рода Borrelia и Н5332 на ospA поверхностной  оболочки Borrelia burgdorferi s.l.  Серологические тесты проведены с соблюдением положительного  (на  B. burgdorferi s. str., B-31)  и отрицательного (на B. hermsii) контролей. В нРИФ исследовали мазки от 50 личинок, 50 нимф, 20 самок и 20 самцов первого поколения;  от 50 личинок, 10 нимф, 10 самок и 10 самцов из второй генерации и от 10 личинок и 10 нимф из третьей генерации лабораторной культуры, а также 77 голодных личинок из природы. Поскольку идентифицирование  возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов мы не проводили, и это  не входило в задачи исследования, отмечаем, что в работе учитывали все микроорганизмы,  выявленные в клещах в темном поле и фазовом контрасте и реагирующие на специфические белки рода Borrelia.

Яичники части напитавшихся инфицированных самок были исследованы на присутствие боррелий в электронном микроскопе. Отпрепарированные кусочки яичников фиксировали 2.5%-ным глютаровым альдегидом на фосфатном буфере с дофиксацией осмием. Дальнейшая обработка проводилась по обычной методике с заливкой в эпон. Ультратонкие срезы контрастировались водным раствором уранилацетата и цитрата свинца.

Глава 2.  ПРОЦЕСС ПИТАНИЯ (ДИНАМИКА КРОВОСОСАНИЯ),

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ  ПИТАНИЯ И ПИЩЕВАРЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ

Для иксодид принято выделять три стадии, или фазы питания на основании увеличения показателей массы тела клеща (Балашов, 1967, 1998; Akov, 1982; Sonenshine, 1991). Первая - подготовительная - занимает 24-36 ч после прикрепления клеща и характеризуется низкой  активностью протеолитических ферментов (Akov, 1982).  Вторая - стадия роста -  наиболее продолжительная фаза занимает период со 2-х по 7-е сут питания, за это время происходят значительные увеличения размеров покровов,  кишечника, слюнных желез, половой и выделительной системы питающегося клеща. Последняя стадия характеризуется быстрым питанием, в результате которого клещ достигает окончательной массы за 12-24ч до отпадения.

2.1. Процесс питания иксодовых клещей (динамика кровососания)

У исследованных  видов иксодин мы установили, что динамика кровососания  укладывается в общую схему питания, разработанную еще Лисом (Lees, 1952),  Балашовым (1972),  Китаока и Фуджисаки (Kitaoka, Fujisaki, 1976). Изменения массы тела самок  I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus,  I. ricinus, I. scapularis и насыщение клещей происходят в несколько этапов (табл. 1).

Таблица 1. Изменение массы (мг) тела самок клещей рода Ixodes во время питания.

Срок питания (сут)

I. ricinus

I. persulcatus

I. pavlovsky

I. scapularis

I. pacificus

Cpедние значения

голодные

1.82

1.98

1.73

1.85

1.94

1.86

0.5

3.8

3.0

2.9

3.2

4.5

3.5

1.5

4.5

5.1

4.7

4.7

4.9

4.8

2.5

6.1

6.3

6.3

6.8

7.1

6.5

3.5

7.8

9.2

8.3

8.9

8.5

8.5

4.5

11

11.5

10.8

11.3

11.8

11.3

5.5

12.4

12.8

13.1

14.1

16.4

13.8

6.5

20.2

43.2

52

48.6

43.3

41.5

8.5

34.3

65

70

70.3

48

57.5

10.5

48.5

110

90

89

55

78.5

Полное питание

248

480

250

140

199.5

263.5

  Незначительные изменения массы тела в 1 и 2 фазы питания сменяются интенсивным набором веса в конце второй и, особенно в третью фазу. Они носят выраженный скачкообразный характер,  первое значительное увеличение веса происходит на 5.5-6 сут, второе - на 9-10  сут питания. Изменения массы тела сопровождаются сходными морфо-функциональными перестройками кишечного эпителия.  Вследствие растяжения кишки поступающей кровью происходит увеличение полости кишечника, оно обеспечивается не только расправлением складом базальной мембраны кишечника, но и уплощением пищеварительных клеток 1-ого и 3 -гой морфофункциональных пластов. Пищеварение осуществляют эти и клетки промежуточных 2-ого  и 4-ого пластов.  В основе смены фаз пищеварения лежат глубокие морфофункциональные изменения  пищеварительной системы, и в частности кишечного  эпителия.  На протяжении 7-10 дневного питания в кишечнике самок клещей рода Ixodes одновременно с поглощением пищи происходят циклические изменения в составе кишечного эпителия,  сменяется пять морфо-функциональных пластов клеток: один секреторных и четыре пищеварительных.

2.2. Морфофункциональные особенности пищеварения иксодовых клещей

  Пищеварительная система иксодоидных клещей представлена ротовым аппаратом с предротовой полостью, парой слюнных желез, глоткой, пищеводом, средней кишкой, тонкой кишкой, ректальным пузырем и прямой кишкой, открывающейся анальным отверстием (Балашов, 1967).  Средняя кишка является самым большим органом в организме клеща, в ней происходят процессы переваривания полученной пищи и  депонирование резервных питательных веществ.

Средний  отдел кишечника, или средняя кишка,  состоит из короткого трубковидного центрального отдела, или желудка, и семи пар трубчатых дивертикулов, расположенных сверху над остальными внутренними органами. Несмотря на сложное морфологическое членение, все части средней кишки имеют сходное гистологическое строение. Стенки кишки построены из однослойного эпителия, клетки которого покоятся  на тонкой базальной  мембране, снаружи оплетенной сетью мышечных волокон. Кишечный эпителий представлен 3 типами клеток: резервными, пищеварительными и секреторными (Балашов, 1998).

Для иксодоидных клещей характерно сочетание трех форм пищеварения: внекишечного, полостного и внутриклеточного. Внекишечная фаза пищеварения, особенно развитая у иксодид, осуществляется за счет протеолитических ферментов слюны, в результате чего в кишечник всасывается гемолизированная кровь и продукты лизиса тканей хозяина. Полостное пищеварение ограничивается лишь первыми этапами физико-химического изменения крови, включающего удаление избыточной воды и солей,  лизис форменных элементов крови. Основная роль в усвоении пищи, как и у других паукообразных, принадлежит внутриклеточному пищеварению, и все процессы пищеварения (за исключением внекишечного) происходят исключительно в среднем отделе кишечника (Атлас..., 1979).

  Строение кишечных клеток и особенности внутриклеточного и полостного пищеварения были преимущественно исследованы у видов подсемейства Amblyomminae: Hyalomma asiaticum (Атлас.., 1979), Boophilus microplus (Agbede, Kemp, 1985,1987; Agyei e.a., 1992), Dermacentor variabilis (Tarnowski, Coons, 1989),  из иксодин только у Ixodes persulcatus (Таежный клещ.., 1985).  В результате обширных и разнообразных исследований на разных видах иксодоидных клещей установлено, что строение кишечника голодных  и питающихся клещей существенно отличается. У голодных особей эпителий средней кишки находится в состоянии “физиологической недоразвитости”, проявляющейся в отсутствии готовых к функционированию зрелых пищеварительных и секреторных клеток. Во время многодневного питания  клеща изменения кишечника  проходят в две фазы: медленное питание, или фаза роста, и быстрое питание, или насыщение. Во время питания кишечные клетки переходят в функциональное состояние, резервные клетки дают начало новым секреторным и  двум типам пищеварительных клеток (Балашов, 1967, 1998; Akov, 1982; Sonenshine, 1991).

2.2.1. Морфофункциональные изменения кишечника  нимф клещей рода Ixodes (Acarina; Ixodidae) во время и после питания с развитием без диапаузы и с диапаузой

На стадии питающейся нимфы кишечный эпителий представлен пищеварительными клетками личиночной фазы. Переваривание основной части пищи осуществляют пищеварительные клетки нимфальной фазы после отпадения клеща, в период линьки, предшествовавший аполизису. В переваривании пищи принимают участие пищеварительные клетки нимфы  только одной генерации. В период кровососания пищеварение осуществляют клетки личинки. Секреторные клетки у питающихся нимф не обнаружены, как, вероятно, и у личинок, в отличие от самок. Секреторные вакуоли формируются в пищеварительных клетках личинок. Все функционирующие клетки образуют на своей апикальной поверхности слой перитрофического матрикса. При бездиапаузном развитии у нимф наблюдается асинхронность в процессах смены систем органов одной жизненной фазы на другую. При линьке наблюдается замена кутикулы, трахейной системы, слюнных альвеол, формирование половой системы (Таежный клещ.., 1985), однако в период послелиночного доразвития и активности у голодной нимфы и в период питания кишечный эпителий представляют пищеварительные клетки личиночной фазы.  Смена пищеварительных клеток личиночной фазы на клетки нимфальной происходит постепенно в течение первых 5-10 сут после отпадения клеща. Смена клеточного состава органов при линьке не синхронизирована, а кишечник является наиболее стабильной в организме клеща системой, не подвергающейся гистолизу. Смена кишечного эпителия, вероятно, синхронизируется с последовательными этапами линьки и послелиночного доразвития, в которые в связи со сменой клеточных пластов в средней кишке преобладает полостное или внутриклеточное  пищеварение. Пищевые включения начинают откладываться в молодых пищеварительных клетках нимфальной фазы после отпадения клеща, на 10-15 сут. На 40-50 сут после отпадения клеща в полости кишки содержатся лишь скопления гематина, пищеварение заканчивается, пищеварительные клетки заполнены запасными пищевыми включениями.

Морфогенетическая диапауза, отличительным признаком которой является задержка линьки, по сути, приостанавливает процесс освобождения полностью сформированного в линочной полости клеща от старых покровов на период  неблагоприятных природных условий. Подготовка к таким задержкам развития происходит во время питания и последующих за ним 60 сут, в течение которых развиваются новые системы органов следующей фазы и в кишечнике аккумулируются запасные питательные вещества, обеспечивающие переживание особи до следующего периода активизации.

Переваривание пищи у нимф с развитием с диапаузой в первые сутки питания осуществляют пищеварительные клетки личиночной фазы, а после насыщения и отпадения клеща  - пищеварительные клетки нимфальной фазы. Cмена пищеварительных клеток личиночной фазы на клетки нимфальной происходит постепенно в течение  5-10 сут после отпадения клеща. Пищевые включения начинают откладываться в молодых пищеварительных клетках нимфальной фазы на 10-15 сут после отпадения клеща. На 40-60 сут после отпадения клеща в полости кишки содержатся лишь скопления гематина, полостное пищеварение заканчивается, пищеварительные клетки заполнены запасными пищевыми включениями. Описанные изменения синхронно происходят у нимф, развивающихся в состоянии диапаузы и без нее. В диапаузу вступают особи, завершившие полостное пищеварение, активное развитие организма прерывается на период действия неблагоприятных факторов, а пищевые резервы сохраняются в пищеварительных клетках до начала активизации особи на следующей фазе онтогенеза.

2.2.2. Морфофункциональные изменения средней кишки оплодотворенных и неоплодотворенных  самок клещей рода Ixodes (Acarina; Ixodidae) во время и после питания

  У голодных особей и в начале питания кишечный эпителий представлен пищеварительными клетками предыдущей, нимфальной, фазы и резервными клетками (Табл. 2). Через 1.5-2 сут после присасывания большинство пищеварительных клеток начинает отторгаться в полость кишки, они функционирую до 2-2.5 сут после присасывания. Через 24-36 ч после прикрепления клеща на смену этим клеткам приходят секреторные,  на 3 сут они преобладают в пласте кишечных клеток. В конце 4-4.5 сут после присасывания клеща секреторные клетки выделяют пищеварительные ферменты по голокриновому типу, с отторжением всей клетки целиком в полость кишечника.  На 4-4.5 сут стенку кишки выстилают пищеварительные клетки первого морфофункционального пласта. В этот период происходит первое значительное растяжение кишки и поглощение большой порции крови. Молодые пищеварительные клетки уплощаются. От крови, поступившей в полость кишки, их отделяет зона отторгнутых и разрушенных секреторных клеток. Пищеварительные клетки второго пласта появляются на 5.5-6 сут  после отторжения клеток первого, функционируют до 8-8.5 сут в центральном отделе кишки. На 8.5-10 сут после прикрепления клеща приходится потребление последней, наибольшей по массе порции крови. В усвоении этой порции  участвуют также пищеварительные клетки двух морфофофункциональных пластов, третьего  и четвертого.

  Пищеварительные клетки третьего пласта формируются под клетками второго в на 6.5-7 сут после прикрепления клеща.  После  отторжения пищеварительных клеток второго пласта они уплощаются, кишка растягивается, и ее объем увеличивается при поступлении крови. Клетки третьего пласта функционируют в желудке до 3-5-х сут после отпадения клеща. На 8.5-9 сут после прикрепления или на 1-2 сут после отпадения клеща под пищеварительными клетками третьего пласта формируются клетки четвертого. Они функционируют до конца жизни самки, не отторгаются, и в них формируются резервы, необходимые для завершения  оогенеза.

Таблица 2.  Морфофункциональные изменения в кишечнике самок клещей рода Ixodes во время питания.

Срок питания (сут)

Масса тела (мг)

Клетки  и содержимое кишки

Перитрофический матрикс (ПМ)

голодные

1.86

Пищеварительные клетки нимфальной фазы (ПКНФ), нагруженные гематином и резервные клетки. Незначительное количество гомогенного неклеточного содержимого.

Не обнаруживается.

Начало питания – 2.5

3.5 – 4.8

Рост ПКНФ с появлением и увеличением в них количества вакуолей, количество гематина незначительно. Начало роста секреторных клеток (СК). Начало отторжения ПКНФ на 2-2.5 сут. Гомогенный эозинофильно окрашиваемый тканевой экссудат, гранулоциты. Эритроциты в полости кишки появляются на 2-2.5 сут.

ПМ хорошо различим на поверхности пищеварительных клеток, базофильный. В области апикальной поверхности СК - четкая азурофильная зернистость, а на поверхности – тонкий слой ПМ.

2.5-4.5

6.5-11.3

Рост секреторных клеток и накопление в их цитоплазме секреторных вакуолей, отпадение секреторных клеток на 4-4.5 сут. Начало роста пищеварительных клеток 1-ого морфофункционального пласта (ПК1П). Эритроциты и незначительное количество лейкоцитов. Гемолиз эритроцитов в зоне контакта с СК.

Толстый слой ПМ эозинофильно окрашивается на поверхности секреторных клеток. Азурофильная зернистость в области апикальной поверхности молодых ПК1П.

4.5-5.5

8.5-13.8

ПК1П участвуют во внутриклеточном переваривании крови, в их цитоплазме накапливается значительное количество гематина. Появляются молодые пищеварительные клетки 2-ого морфо-функционального пласта (ПК2П). Полость кишки растянута 1-ой большой порцией крови. Гемолиз эритроцитов в полости кишки.

Тонкий слой ПМ на поверхности ПК1П.

5.5-7.5

11.3-48.5

Значительный рост ПК2П с заполнением ими полости кишки и практически полным перевариванием ее содержимого. Отпадение этих клеток на 7-8 сут. Рост молодых пищеварительных клеток 3-го пласта (ПК3П). Лейкоциты преобладают в пищевом коме, эритроциты малочисленны, кристаллы гуанина и гематин.

ПМ эозинофильно окрашивается на поверхности ПК2П. В области апикальной поверхности ПК3П отмечается азурофильная зернистость.

7.5-полное насыщение

48.5-263.5

Отпадение ПК2П. Рост и растяжение ПК3П, переваривание ими гемоглобина с накоплением в цитоплазме гематина. Появление молодых пищеварительных клеток 4-ого морфофункционального пласта (ПК4П). Поглощение 2-ой большой порции крови, и растяжение полости кишки. Гемолиз эритроцитов в зоне контакта с отторгнутыми ПК2П. Большое количество непереваренных лейкоцитов и кристаллы гуанина.

ПМ на поверхности ПК3П выглядит тонким эозинофильно окрашиваемым слоем.

Примечание: ПК1П, ПК2П, ПК3П, ПК4П – пищеварительные клетки 1,2,3,4 –ого морфофункциональных пластов, ПКНФ – пищеварительные клетки нимфальной фазы, ПМ – перитрофический матрикс, СК – секреторные клетки.

Внутриклеточное пищеварение у самок происходит в пищеварительных клетках 4-х последовательных морфофункциональных пластов.  Пищеварительные клетки всех пластов принадлежат одному типу, в них происходит внутриклеточное переваривание гемоглобина. Фагоцитоз  лейкоцитов у исследованных видов  иксодин не обнаружен.

  Кишечный эпителий функционирует послойно,  представляя единый морфо-функциональный пласт, состоящий из клеток, сходных по строению и функции. Основу каждого пласта составляют клетки одного возраста, о чем свидетельствует сходство формы клеток, количества включений и вакуолей. Однако отмечено диффузное расположение более старых клеток, лишенных апикальной поверхности, но сохранивших основную часть цитоплазмы с ядром, и вероятно продолжающих функционировать.  За период существования каждого морфофункционального пласта его клетки синхронно изменяют форму от  кубической к столбчатой и булавовидной, накапливают продукты обмена (гематин) или секреторные вакуоли, а затем отторгаются в полость кишки. Смене пластов предшествует увеличение количества недифференцированных клеток вблизи регенерационных гнезд, расположенных диффузно в стенке кишки. В  такие промежуточные периоды над клетками нового пласта располагаются булавовидные по форме клетки предыдущего. Кишечные клетки каждого пласта функционируют в желудке и дивертикулах синхронно, но в апикальных концах дивертикулов по сравнению с центральным отделом кишки, смена клеточных пластов может задерживаться не более чем на 12-24 ч.

Рис.  Схема изменений кишечного эпителия самок клещей рода Ixodes во время питания и после отпадения.

Обозначения: I – пищеварительные клетки нимфальной фазы, II – секреторные клетки, III, IV, V, VI – пищеварительные клетки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го морфофункциональных пластов, аз – азурофильная зернистость, бм – базальная мембрана, гм – гематин, мк – мышечные клетки, нк - недифференцированные клетки, ок – отторгнутые клетки, пв – пищевые включения, пм – перитрофический матрикс, св – секреторные вакуоли.

В течение всего периода питания клеща его кишечный эпителий динамично обновляется, претерпевая цикличные изменения, проявляющиеся в функционировании пяти морфо-функциональных пластов клеток имагинальной фазы (рис.).  Причем, процессы поглощения крови и ее переваривания не разобщены во времени, а происходят практически одновременно.

  Неоплодотворенные самки полного насыщения не достигают. Изменения массы тела самок исследованных видов  незначительны, за период питания их масса увеличивается в 25-29 раз и соответствует весу, который набирают оплодотворенные самки к концу фазы медленного питания на 6-8 сутки, масса тела оплодотворенных самок к концу питания увеличивается в 130-240 раз.

В переваривании поступающей в кишечник пищи у девственных самок участвуют пищеварительные клетки нимфальной фазы и два пласта пищеварительных клеток имагинальной фазы. Процесс кровососания у неоплодотворенных самок не завершается, а прерывается на второй фазе, когда происходит медленное питание и подготовка кишечника к третьей фазе - фазе быстрого питания.

Вторая фаза питания обеспечивает увеличение размеров кишечника с последующим интенсивным поглощением питательных веществ из кишечника, которые нужны прежде всего для развития яиц. Оплодотворение самок стимулирует начало эмбриогенеза, для которого необходимо поступление питательных веществ. Успешное завершение эмбриогенеза невозможно при потреблении тех количеств крови, которые может вместить кишечник голодной самки. Оплодотворение стимулирует доразвитие кишечника у самок, в результате которого он достигает размеров, позволяющих поглощать количества крови, необходимые для морфофункциональных перестроек самого кишечника, доразвития и функционирования слюнных желез и для развития яиц.

2.2.3.  Морфофункциональные изменения средней кишки самок клещей рода Ixodes (Acarina; Ixodidae) во время иммунизирующих кормлений на лабораторных животных

Резистентность хозяина влияет на питание и последующее развитие клеща и вызывает значительные отклонения основных экологических количественных показателей. Происходит уменьшение количества напитавшихся клещей вследствие гибели некоторых из них при прикреплении и на более поздних сроках питания, удлиннение времени питания, уменьшение массы крови, поглощенной напитавшимися особями, снижение процента перелинявших личинок и нимф, а также уменьшение числа отложенных яиц и вылупившихся из них личинок (Таежный ..., 1985; Балашов, 1998; Agbede, Kemp, 1986; Wikel, 1996).  Естественно предположить, что все эти отклонения являются следствием нарушений питания клеща, чему должно свидетельствовать проявление не  только внешних признаков, но и глубоких морфологических изменений пищеварительной системы.

Поглощений значительных количеств пищи у самок за период иммунизирующих кормлений не происходит. У самок клещей I. persulcatus за время первого неиммунизирующего кормления масса тела увеличивается в 200-240, а у самок I. ricinus - в 130-150 раз. (Григорьева, 2003), а при иммунизирующих кормлениях эти показатели резко сокращаются до  25.5-27 и 16-17 раз, соответственно.  При иммунизирующих кормлениях (2-е или 3-е кормление на одном и том же животном) на лабораторных кроликах питание клеща прерывается на второй фазе. Наблюдается смена пищеварительных клеток нимфальной фазы и двух морфофункциональных пластов пищеварительных клеток имагинальной фазы, секреторные клетки отсутствуют. Клещ завершает питание и отпадает, когда последний пласт пищеварительных клеток находится на начальных этапах активности. Потребляемые количества крови не достаточны  для ритмичного функционирования кишечника, вследствие чего питание прерывается на второй фазе и полного насыщения не происходит. Мы считаем, что это связано с нарушением поступления крови в полость кишки питающегося клеща, что, возможно, является результатом воздействия какого-либо фактора противоклещевого иммунитета неспецифических хозяев-прокормителей.

2.3. Перитрофический матрикс: особенности образования и функционирования

В пищеварительном тракте большинства насекомых имеется неклеточный слой, отделяющий эпителиальные клетки кишки от поглощаемой пищи. Этот слой принято называть перитрофической мембраной (Jacobs-Lorena, Oo, 1996). Термин “перитрофическая мембрана” ввел Бальбиани (Balbiani) в 1890 г. Для иксодовых клещей понятие “перитрофическая мембрана” впервые применили Радзинска с соавторами (Rudzinska e.a., 1982) в связи с описанием проникновения Babesia microti  через  эту структуру при питании Ixodes scapularis на хомячках.

Перитрофический матрикс (ПМ) принято рассматривать в качестве физиологического и механического барьера, отделяющего область полостного пищеварения, обладающего избирательной проницаемостью, а также предохраняющего кишечный эпителий от повреждений частицами пищи (Zhu e.a., 1991; Eisemann et Binnington, 1994; Tellam e.a., 1999; Tellam et Eisemann, 2000; Wang et Granados, 2001). 

Нами установлено, что ПМ отсутствует у голодных самок клещей рода Ixodes и начинает образовываться на поверхности клеток в средней кишке через 9-12 ч  после прикрепления и через 24 ч в дивертикулах. Нами подтверждено предположение (Diehl e.a., 1996)  о том, что в образовании ПМ участвуют микроворсинки клеток. Первые отложения пузырьков с электронноплотным содержимым, аналогичным веществу ПМ начинают появляться именно в области микроворсинок щеточной каймы, так что последние оказываются окруженными  этим веществом.

Образование ПМ на поверхности каждой клетки кишечника происходит автономно. ПМ не является перманентной структурой, он образуется и функционирует на поверхности каждой новой клетки. Образование ПМ происходит на протяжении всего периода питания на поверхности пищеварительных клеток нимфальной фазы, секреторных клеток, пищеварительных клеток. Наибольший период функционирования ПМ наблюдался у пищеварительных клеток последнего, 4-ого морфофункционального пласта. Вещество ПМ идентифицировали через 30 сут после отпадения самок клещей. ПМ имеет в основном гомогенную тонкогранулярную структуру, хотя в его состав входят и немногочисленные микрофибриллы, Отмечен значительный полиморфизм в ультраструктуре ПМ на разных сроках кровососания. Возможно, изменения в ультраструктуре ПМ связаны изменением функциональной роли этого образования в разные периоды переваривания крови. В течение первой половины питания переваривание за счет ферментов, образующихся в секреторных клетках и выделяющихся в полость кишки (Балашов, 1998), в то время как на более поздних этапах питания и после отпадения преобладает внутриклеточное пищеварение. Можно предположить, что в период преобладания полостного пищеварения ПМ играет в основном роль защитного образования, предохраняющего поверхность кишечного эпителия от действия гидролитических ферментов. ПМ, имеющий пористую структуру, разделяет пространство средней кишки на эндоперитрофическое пространство, в котором продолжается деятельность пищеварительных ферментов и экзоперитрофическое пространство, куда через пористый ПМ проникают фрагменты частично расщепленных компонентов крови, переваривание которых завершается внутриклеточно.

2.4. Сравнительная характеристика особенностей морфофункциональных преобразований кишечника у клещей подсемейств Ixodinae  и Amblyommynae на протяжении питания

У клещей  подсемейства Ixodinae  и Amblyomminae существует значительное  сходство  общей схемы питания. Собственно питание (1-2 недели) подразделяется на период роста (практически весь период питания) и период растяжения (последние 12-24 ч питания). Переваривание поступающей пищи осуществляют несколько генераций кишечных клеток - пищеварительных и секреторных, преобладание первых способствует внутриклеточному пищеварению, а вторых - полостному (Балашов, 1967, 1998; Атлас.., 1979; Akov,1982; Sonenshine, 1991).

Однако  при сходстве общей схемы у клещей  подсемейства Ixodinae  и Amblyomminae выявлены значительные различия. Иксодины поглощают  частично гемолизированную кровь,  следовательно,  внекишечное пищеварение у них выражено незначительно. Переваривание крови начинается в полости кишки при помощи ферментов секреторных клеток. Зону полостного пищеварения отделяет перитрофический матрикс, регулирующий размеры компонентов, поступающих для внутриклеточного пищеварения. Наличие перитрофического матрикса, возможно, свидетельствует о пристеночном пищеварении. У них не обнаружен фагоцитоз форменных элементов крови  (Григорьева, 2003, 2004, 2005; Григорьева, Амосова, 2004). 

Амблиоммины  поглощают гемолизированную ферментами слюны кровь. Для них характерны все три типа пищеварения: внекишечное, полостное и внутриклеточное. Их кишечные клетки не имеют перитрофического матрикса, а внутриклеточное пищеварение возможно при помощи фагоцитоза (Балашов, 1967; Атлас.., 1979; Agbede, Kemp, 1985).

 

Глава 3.  РОЛЬ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ В ПИТАНИИ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ

  Секреты слюнных желез на протяжении питания клеща, оказывают антикоагулирующее, иммунорегулирующее и противовоспалительное действие на хозяина, чем обеспечивают насыщение кровососа, таким образом, в регуляции паразито-хозяинных отношений на период питания слюнные железы имеют главенствующее значение.

Морфология и функионирование слюнных желез клещей, а также компоненты слюны, секретируемые клещами во время питания детально изучены и описаны в нескольких обзорах, причем большинство исследователей указывает на неидентичность основных типов альвеол, образующих структуру железы у представителей двух подсемейств (Binnington, Kemp, 1980; Ribeiro, 1987, 1995; Sauer e.a., 1995, 2000; Bowman e.a. 1997). Обнаружено участие секретов слюнных желез в сохранении, активизации и передаче возбудителей трансмиссивных инфекции  (Stark, James, 1996; Titus, Ribeiro, 1990; Nuttall, 1999; Kuthejlova e.a., 2001).  Большинство исследователей указывает на 4-5 функций слюнных желез: образование цементного вещества, обеспечивающего приклеивание клеща в месте питания;  регуляция состава и свойств получаемой пищи, или осморегуляция;  подавление воспалительной реакции хозяина прокормителя;  иммуномодулирующее действие.

Слюнные железы представляют собой парный гроздевидный орган, занимающий латеральные части идиосомы. Каждая железа имеет альвеолярное строение.

  Всем иксодовым клещам свойственны альвеолы 1 типа, названные пирамидальными. Их главная функция состоит в поддержании водного баланса в организме клеща и секреции гипертоничной слюны на протяжении всего периода питания.

Гранулосекретирующие альвеолы составляют каудальную часть слюнных желез, занимают орган более чем на 2/3. Названы так из-за накапливания в цитоплазме их клеток крупных гранул секрета, видимых в световой микроскоп. У самок иксодовых клещей  различают два типа гранулосекретирующих альвеол: альвеолы 2-го и альвеолы 3-го типа, а у самцов подсемейства Amblyomminae обнаружены альвеолы 4 типа. Входящие в состав этих альвеол секреторные и интерстициальные клетки принято обозначать строчными латинскими буквами (a,b,c,d,e,f). У  самок клещей подсемейства Amblyomminae альвеолы 2 типа в базальной части состоят из нескольких крупных клеток а,  апикальную часть образуют клетки типа b  и с (Атлас..., 1979; Chinery, 1973; Binnington, 1978; Walker, e.a., 1985).  Известно, что у голодных самок  амблиоммин базальную часть альвеол 2 типа занимают крупные клетки а, заполненные секреторными гранулами (Балашов, 1994,1998), а с началом питания эти клетки освобождаются от секрета и спадаются. В свою очередь клетки b и с начинают увеличиваться в размерах с начала питания, и их цитоплазма заполняется секретами. До конца питания эти клетки становятся основными гранулосекретирующими элементами альвеол 2 типа.

Наиболее многочисленны в слюнных железах альвеолы 3 типа. В базальной части альвеолы располагается несколько крупных клеток d, заполненных секретом у голодных клещей.  Эти клетки заполнены сложными гранулами, состоящими из субъединиц, им отводят основную роль в формировании прикрепительного цемента амблиоммин (Binnington, 1978; Walker, et al., 1985; Sonenshine, 1991). Центральное и апикальное положение занимают  клетки e и f. С началом питания альвеолы 3 типа быстро увеличиваются в размерах и на 3-4 сут достигают своей окончательной величины, превращаясь в тонкостенные пузырьки. У питающихся особей клетки d и e  освобождаются от секреторных гранул, а главной функцией альвеол 3 типа становится регуляция водно-солевого баланса, которую осуществляют клетки f,  цитоплазма которых образует лабиринт из переплетающихся цитоплазматических тяжей и межклеточных полостей (Атлас.., 1979, Sonenshine, 1991).

  Из клещей подсемейства Ixodinae  наиболее изучены  Ixodes persulcatus (Балашов, 1979; Таежный.., 1985) и  I. holocyclus (Binnington, Stone, 1981). В альвеолах 2 и 3 типов обнаружено по 2 типа гранулосекретирующих клеток, а, b и d, e , соответственно. Считается, что клетки а, b и d  содержат секрет уже у голодных самок. В первые дни питания полностью освобождаются от секрета клетки а, клетки b приступают к накоплению и выделению секрета (Таежный.., 1985). Клетки d  и e  освобождаются от секрета в течение первых 2-3 сут, клетки d  дегенерируют, а e  выполняют впоследствии функцию осморегуляции  (Таежный.., 1985).

  Исходя из факта различного строения слюнных желез у представителей подсемейств Amblyomminae и Ixodinae, следует ожидать, что структурные компоненты слюнных желез отличаются по секреторной активности и функциональному назначению на протяжении всего периода кровососания клеща.

3.1.  Изменения состояния слюнных желез на протяжении питания

  На исследованном материале мы установили, что у голодных самок клещей рода Ixodes слюнные железы представляют собой компактный парный орган, с мелкими  альвеолами, визуально в структуре органа преобладают трахейные трубки и выводные протоки. Крупные секреторные гранулы обнаруживаются в базальных клетках (d) альвеол 3-го типа, причем при проводке через спирты и окрашивании стандартными гистологическими красителями гранулы не воспринимают или слабо воспринимают окраску, что возможно свидетельствует об их липоидной природе. Клетки альвеол 2-го типа имеют интенсивно окрашиваемую основными красителями цитоплазму и крупные ядра, в базальной и апикальной частях альвеол удавалось идентифицировать слабую грануляцию цитоплазмы клеток.  В клетках а, как у голодных клещей, так и в течение всего периода питания, основным типом гранул являются гомогенные электронно-плотные гранулы диаметром 3.0-3.5 мкм.  Второй тип секреторных продуктов представлен гранулами большего размера (4.0-6.0 мкм) с тонкогранулярным содержимым низкой электронной плотности. Гранулы обоих типов заполняют цитоплазму клеток а  еще до начала кровососания и выводятся в первые его часы, на что указывает присутствие через 6-8 ч после прикрепления клеток, содержащих лишь единичные гранулы. Клетки b  отличаются присутствием электронно-плотных гранул меньшего диаметра. Таким образом, в течение кровососания секреторные продукты этих клеток меняются, по крайней мере, дважды. В период голодания в них накапливаются гранулы диаметром 2.0-2.5 мкм, которые выводятся сразу после прикрепления клеща к хозяину. В первые часы питания в клетках b  наблюдаются плотные гранулы диаметром 1.0-1.2 мкм, а начиная с 15-18 ч после прикрепления и до окончания питания - плотные гранулы 0.7-0.9 мкм.

Пик секреторной активности альвеол 3 типа  приходится на первые сут питания. Через 4 ч после присасывания  большинство d  клеток альвеол 3 типа освободилось от секрета,  либо этот процесс заканчивается уже в первые сутки после прикрепления клеща.  Для клеток d  характерны крупные электроннопрозрачные гранулы, которые образуются еще до начала кровососания и выводятся в просвет альвеол в конце первых сут после прикрепления, что сопровождается разрушением клеток. В  цитоплазме клеток e  голодных клещей содержатся гомогенные электронно-плотные гранулы диаметром 2.0-2.5 мкм, которые через 6 ч после начала питания заменяются плотными гранулами диаметром 1.2-1.5 мкм, исчезающими из клеток в первые часы вторых сут питания. Таким образом, секреторная активность альвеол 3 типа заканчивается в конце первых - начале вторых сут кровососания, при этом клетки d  дегенерируют, а клетки e, по-видимому, меняют функцию, формируя в конце питания классический базальный лабиринт, характерный для осморегуляторных эпителиев. На вторые сутки отмечается истончение стенок альвеол 3 типа, а на 3 сутки они представляют собой тонкостенные пузырьки.

Таким образом, динамика гранулосекреторной активности по данным световой микроскопии складывается из двух этапов: 1 - активность альвеол 3 типа, продолжающаяся от начала присасывания (особенно на 3-4 ч после присасывания) на протяжении последующих 2-3 сут; 2 - активность альвеол 2 типа, проявляется началом секретирования в первые часы после присасывания, а интенсивное выделение секретов наблюдается со2-х сут до конца питания клеща (Табл. 3).

Таблица 3. Изменение секреторной активности гранулосодержащих клеток альвеол слюнных желез самок клещей рода Ixodes.

Альвеолы 2 типа, 

клетки a

Альвеолы 2 типа,

клетки b

Альвеолы 3 типа,

клетки  d

Альвеолы 3 типа,

клетки e

Световая микроскопия

I. pacificus,

I. pavlovsky,

I. persulcatus, I. ricinus,

I. scapularis

базофильная грануляция цитоплазмы клеток у голодных самок,  секреция с первых часов питания и интенсивное выделение со 2 сут до конца питания.

образование секреторных гранул и без значительных накоплений их выведение; активность от начала и до конца питания.

секреторные гранулы  у голодных самок, клетки  освобождаться от секрета в первые  3 ч питания.

накапливают и выделяют секрет в течение первых 3 сут питания клеща.

Электронная микроскопия

I. persulcatus

гомогенные электронно-плотные гранулы 3.0-3.5 мкм и гранулы 4.0-6.0 мкм с тонкогранулярным содержимым низкой электронной плотности у голодных самок, начинают выводиться в первые ч питания, секретируются в течение всего питания. 

электронно-плотные гранулы 2.0-2.5мкм накапливаются у голодных клещей и выводятся сразу после прикрепления; в первые ч питания появляются плотные гранулы 1.0-1.2 мкм, а с 15-18 ч  и до конца питания - плотные гранулы 0.7-0.9 мкм

крупные электроннопрозрачные гранулы накапливаются у голодных самок и выводятся в 1 сут питания

гомогенные электронно-плотные гранулы 2.0-2.5 мкм образуются у голодных и выводятся в первые 6 ч питания, их заменяют плотные 1.2-1.5 мкм гранулы, выделяемые на 2 сут.

3.2.  Особенности функционирования слюнных желез  у клещей подсемейств Ixodinae  в сравнении с клещами подсемейства Amblyommynae на протяжении питания

  Голодные и питающиеся самки  клещей подсемейства Amblyomminae также содержат в слюнных альвеолах гранулы секрета, однако, разнообразие клеток, участвующих в образовании секрета, а также  более богатый по сравнению с иксодинами полипептидный состав. Это позволяет предполагать, что слюнные железы амблиоммин не только сложнее устроены, но их функциональная реализация шире.

  Основным отличием является способность  амблиоммин образовывать цементный футляр (Cyinery, 1973; Needham e.a., 1989; Jaworski e.a., 1991,1992) при питании и его отсутствие  у иксодин, что подтверждает  более бедный по протеинам секрет их слюнных желез. Отсутствие цементного футляра у иксодин было обнаружено еще  Павловским и Алфеевой (1941) на I. ricinus. В дальнейшем это было установлено для I. holocyclus (Binnington, Stone, 1981), а так же для I. pacificus, I. persulcatus, I. plumbeus, I. ricinus, I. scapularis, I. trianguliceps (Григорьева, 2001а, 2001б, 2002).

Кроме того, предполагается (Атлас.., 1979; Binningtone, 1978; Megaw, Beadle, 1979; Krolak et.al., 1982; Walker et al., 1985), что формирование цементного футляра у клещей подсемейства Amblyomminae обусловлено состоящими из субъединиц сложными гранулами, образующимися в клетках, локализованных в альвеолах 2 типа и в альвеолах 3 типа. Отсутствие таких гранул в клетках слюнных желез  самок I. persulcatus, так же как и данные, полученные на лишенном цементного футляра I. holocyclus (Stone, Binnington, 1989),  так же подтверждают, что клещи подсемейства  Ixodinae не способны образовывать цементный футляр.

Сопоставление наших данных с результатами других электронномикроскопических исследований показало значительное разнообразие секреторного материала и клеточного состава гранулосодержащих альвеол у амблиоммин. Каждый тип секреторных продуктов приурочен к определенному типу клеток. Клеточный состав альвеол 2 и 3 типов разнообразен, причем для его описания не существует единой номенклатуры, что затрудняет сравнение результатов, полученных разными авторами. Так, альвеолы 2 типа включают от 3-х видов содержащих гранулы клеток  у  Н. asiaticum (Атлас..,1979) и A. americanum (Krolak et.al., 1982) до 4-х у R. appendiculatus (Walker et al., 1985) и R.  sanguineus (Megaw, Beadle, 1979), пяти - у D. variabilis (Coons, Roshdy, 1973), или даже шести - у B. microplus (Binnington, 1978).  Наибольшее число  видов клеток характерно для короткохоботковых клещей (Dermacentor, Rhipicephalus, Boophilus, Haemaphysalis по классификации Moorhouse, 1969 (Kemp, Stone, Binnington, 1982)), ротовые части которых в период кровососания проникают в ткани хозяина, не выходя за пределы эпидермиса. У длиннохоботковых (Ixodes, Amblyomma, Aponomma, Hyalomma), чьи ротовые части достигают дермы, разнообразие секретирующих клеток меньше. Это, возможно, отражает  более сложное взаимодействие короткохоботковых амблиоммин с хозяином. Полученные нами данные  о смене продуктов секреции в a  и  b  клетках альвеол 2 типа и в е клетках альвеол 3 типа в течение питания у  иксодин позволяют предположить, что в процессе становления паразито-хозяинных отношений между иксодидами и позвоночными проблема секретирования разных компонентов слюны у разных групп иксодид решалась по-разному. У длиннохоботковых иксодин и амблиоммин, для которых характерно небольшое число видов клеток в гранулосекретирующих альвеолах (Атлас.., 1979; Binnington, Stone, 1981; Krolak et.al., 1982), смена секреторных  продуктов с течением времени происходит по типу стимулируемой секреции за счет функционирования одной и той же клетки, а  у короткохоботковых амблиоммин проблема решается путем возникновения большого числа видов клеток, каждый из которых секретирует особый продукт в ответ на внешние стимулы.

    1. Значение секретов слюнных желез иксодид в регуляции защитных механизмов прокормителей

  Динамика выделения клещем различных белков еще остается нерасшифрованной. Поэтому основной информацией, на которую приходится полагаться, является срок питания самок, из слюнных желез которых выделено то или иное вещество. Так, например, большинство белков, обладающих иммунорегулирующим действием, накапливается в слюнных альвеолах II типа на 3 сут питания и содержатся в изобилии на 5 сут питания. К таким белкам относится  иммуносупрессор из I. ricinus  - Iris, 43 kDa (Leboulee et al., 2002), который подавляет активность Т-лимфоцитов и макрофагов, иммуносупрессор из слюны I. scapularis, 5kDa (Urioste et al., 1994), супрессор лимфоцитов из слюнных желез D. andersoni, 36-43 kDa (Bergman et al., 1995) и интерлейкины и интерферон из слюны I. ricinus (Kopecky et al., 1999), однако есть сведения о иммуносупрессивном действии слюны голодных самок I. ricinus (Rolnikova et al., 2003).

Исходя из периодизации заживления естественных ран, характерных для позвоночных, принято выделять 2 стадии раневого процесса. На 1-4 сут после ранения (1 стадия) активизируются факторы внутрисосудистой свертываемости крови и противовоспалительные процессы, что соответствует фазам альтерации и экссудации воспалительного процесса и входит в систему гемостаза.  На 4-10 сут (2 стадия) активизируются процессы регенерации тканей ( Хем, Кормак, 1983; Краткая.., 1989). Для того чтобы проигнорировать защитную систему прокормителей клещ для успешного завершения насыщения должен выделять со слюной вещества,  препятствующие заживлению и усиливающие кровотечение, причем на первых этапах естественный ход раневого процесса “устраивает” паразита, что соответствует, вероятно, первым 2 сут питания.  Далее клещ должен активно влиять на продолжение процесса, изменить его естественный ход, приостановить регенерацию тканей. В этот период увеличивается содержание белков в слюне. Белки, являясь антигенами, вызывают активизацию иммунной системы хозяина, что может вызвать отторжение питающегося клеща. Начиная с 3-х сут питания, клещ должен вводить в рану хозяина не только вазодилятаторы, обеспечивающие существование пищевой полости  и получение им  крови, но и иммуномодуляторы, сдерживающие развитие  антител и подавляющие иммунитет хозяина.  Это подтверждают иммунохимические исследования, в ходе которых были выделены из слюны клещей, питающихся на 3-5 сут, факторы, обладающие сосудорасширяющим и иммуносупрессивным  действием. 

  Разобщенность иммунохимических и морфологических исследований не позволяет нам с точностью судить о месте локализации или  синтеза тех или иных факторов слюны в альвеолах слюнных желез  иксодовых клещей. Однако существование двух типов секреторных альвеол и временное разделение их секреторной и выделительной активности позволяют предположить, что  активность секретов клеток a и b альвеол 2 типа и клеток d  альвеол3  типа  у клещей рода Ixodes  в  первые часы и сутки питания направлена на предотвращение гемостаза,  усиление вазодилятации, а у амблиоммин и на образование материала цементного футляра. Секреторная активность альвеол  II типа в большей степени проявляется, начиная с 3 сут питания, когда в организме хозяина-прокормителя начинают активизироваться факторы иммунитета, и продолжается до конца питания клеща, обеспечивая его полное насыщение благодаря содержанию в слюне в этот период иммуномодулирующих протеинов. Эти процессы, вероятно, обеспечиваются веществами, входящими в состав электронно-плотных гранул a и b клеток, которые содержатся в их цитоплазме, начиная со 2-х сут кровососания.

  Какова причина длительных процессов питания и связанной с его обеспечением сложной активностью слюнных желез, формирование которых в процессе эволюции иксодовых клещей, вероятно, не было случайным явлением? Продолжительный период питания иксодовых клещей является лишь внешним основанием для их выделения в группу временных паразитов с  длительным питанием по классификации Балашова (1982). Глубинная причина длительного питания кроется в  онтогенезе: развитие по типу неосомии, свойственное иксодовым клещам, позволяет особям приступать к питанию  с органами, не завершившими свое развитие.  За этот период масса тела клещей увеличивается в 100-250 раз, значительным преобразованиям и росту подвергаются многие органы, в том числе,  слюнные железы и кишечник.  То есть в течение стадии медленного питания происходит рост  кишечника и подготовка к заполнению его тем количеством крови, которое будет необходимо и достаточно для развития яиц. Возможность длительного питания и роста обеспечивается сложной секреторной активностью слюнных желез, сдерживающей поэтапно защитные механизмы хозяина-прокормителя,  что указывает на согласованность и синхронизацию морфо-функциональных изменений в организме питающихся самок иксодовых клещей.

Глава 4. ПРОЦЕСС ПРИКРЕПЛЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ И  ОСОБЕННОСТЕЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ У ХОЗЯЕВ-ПРОКОРМИТЕЛЕЙ

Иксодины - временные эктопаразиты с длительным питанием. Это особый тип паразитизма, требующий от паразита специальных адаптаций, поскольку средой его  обитания на время питания служит кожа, обладающая комплексом защитных реакций. Средние сроки питания на млекопитающих и птицах личинок и нимф иксодин  составляют 3-7 сут, самок 5-10 сут (Балашов, 1998). За это время происходят параллельные изменения, как в организме паразита, так и в организме хозяина, в частности в местах прикрепления. 

Патогенное воздействие иксодового клеща при многодневном питании стимулирует развитие у прокормителя комплекса последовательных реакций. Он включает местное воспаление в очаге проникновения ротовых органов в кожу, а также иммунный ответ хозяина по типу аллергической реакции замедленного типа (Балашов, 1982). 

  Гистопатологические изменения в коже прокормителей при питании клещей рода Ixodes из группы Prostriata были исследованы на примере млекопитающих и птиц (Наумов, 1959, 1963; Калягин и др., 1976; Moorhouse, 1969; Eveleigh et al., 1974; Binnington, Stone, 1981; Brossard, Fivaz, 1982; Kemp e.a., 1982). В отношении рептилий подобные исследования не проводились. Однако, единодушия в отношении клещей рода Ixodes у авторов, исследовавших эту проблему нет. До последнего времени  эти вопросы оставались спорными, и о способах прикрепления клещей рода Ixodes при питании и их способности к образованию цементного футляра не было единого мнения. Из-за неоднозначной трактовки гистопатологических изменений в местах питания  клещей преувеличивается роль цементного футляра и др. структур в процессах передачи и сохранения возбудителей трансмиссивных инфекций. Эти обстоятельства позволяют нам рассмотреть вопросы питания клещей на природных прокормителях более детально.

4.1. Особенности воспаления у млекопитающих из природы и лабораторных животных

В местах прикрепления и питания  клещей всех фаз трех видов рода Ixodes (I. trianguliceps, I. ricinus, I. persulcatus) установлено сходство в положении ротовых частей и гистопатологических изменениях в тканях хозяев. Ротовые части глубоко погружаются в кожу  прокормителя, пронизывая эпидермис, сосочковый слой дермы, так что апикальные концы гипостома и хелицер в зависимости от длины ротовых частей располагаются на разной глубине в сетчатом слое дермы. Ротовые части оказываются  полностью заключенными в тканях хозяина. Гнатосома  прикрепляющегося клеща располагается к поверхности кожи прокормителя под углом 40-45%.  Процесс погружения ротовых частей в кожу продолжается не более 60 мин. Защитная реакция хозяина  начинается с экссудативного воспаления в ответ на перфорацию. Из разорванных тканей и капилляров кожи выделяются внутриклеточная и внутритканевая жидкости и кровь. Примерно через час после начала присасывания образуется фибрин, и смесь сворачивается, а каудально направленные зубцы гипостома и хоботка оказываются заключенными в застывшей массе.  Тонкий (3.9 мкм) и хрупкий слой фибрина представляет практически слепок с ротовых частей клеща.

Возникший в коже очаг воспаления стимулирует прилив крови и отек, что внешне проявляется припухлостью и покраснением места присасывания клеща. Поступающая к ротовым частям кровь пока не потребляется клещём, а вытекает по микропространствам между ротовыми частями и конусом из выпавшего фибрина на поверхность кожи, окружая свободную часть гнатосомы и пальпы, так что за 40-48 ч с начала прикрепления они оказываются окруженными многослойным струпом в «воронке», образовавшейся в результате отека кожи. В дерме увеличивается количество клеточного инфильтрата из молодых мезенхимальных клеток, моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. Уже через 10-12 ч после перфорации в сетчатом слое дермы увеличивается количество фибробластов. Через сутки появляются зрелые элементы - фиброциты, и начинает образовываться зрелая соединительная ткань. Через 24-30 ч из молодых коллагеновых волокон формируются разнонаправленные пучки вокруг очага воспаления, а через 1.5-2 сут они сливаются в капсулообразную структуру, толщиной 7.7-24.8 мкм при питании нимф. Коллагеновая капсула окружает ротовые части клеща, плотно прилегая к слою фибрина, на протяжении всей основы кожи и, особенно, ее сетчатого слоя. Формирование пищевой полости происходит примерно через 40-48 ч у личинок и нимф и 60-72 ч у самок после прикрепления. При формировании  пищевой полости происходит разрушение внутренних слоев коллагеновой капсулы и глубоких слоев дермы, окружающих верхушку ротовых частей. С началом образования пищевой полости заметно увеличивается количество нейтрофилов в тканях, окружающих ротовые части клеща.

Такие структуры характерны для мелких млекопитающих, природных прокормителей иксодид. У лабораторных мышей отмечали обильное выделение фибринозного экссудата, который, свернувшись, формирует толстостенный конус (до 11.3 мкм толщиной при питании самок I. trianguliceps) вокруг ротовых частей. Коллагеновая капсула у мышей не образуется, а вокруг фибринового конуса формируются нерегулярные пучки коллагеновых волокон. У кроликов образуется рыхлая капсула,  она состоит из не плотно упакованных разнонаправленных пучков коллагеновых волокон.

  Проведенная  реакция иммунофлуоресценции на срезах кожи кроликов, белых мышей и рыжих полевок в местах прикрепления клещей показала, что экссудат и ткани, окружающие ротовые органы клеща, принадлежат организму прокормителя. Слой фибрина вокруг ротовых частей клеща, свернувшаяся кровь - струп вокруг основания гнатосомы и пальп, а также кровь в предротовой полости между гипостомом и стволом хелицер в период кровососания обнаруживали ярко-голубую флуоресценцию после контакта и положительной реакции с  ФИТЦ-меченой видоспецифичной сывороткой в люминисцентном микроскопе. Коллагеновая капсула демонстрировала интенсивно-бордовую аутофлуоресценцию. Сопоставление результатов гистологических и иммунофлуоресцентных исследований подтверждает отсутствие цементного футляра у клещей трех видов рода Ixodes, рассмотренных в нашей работе.

  В результате проведенных исследований установлено, что в местах прикрепления и питания клещей I. trianguliceps, I. persulcatus и I. ricinus происходят сходные гистопатологические изменения. В основе их лежат последовательно развивающиеся стадии воспаления кожи. Ткани, окружающие ротовые части клеща, принадлежат прокормителю и являются фибриновым конусом и коллагеновой капсулой. Клещи перечисленных видов цементного футляра не образуют, и их ротовые органы находятся в непосредственном контакте с тканями хозяина. Образование пищевой полости связано с массовой инфильтрацией нейтрофилов. В основе кожной гиперчувствительности природных прокормителей, рыжих полевок, лежит дегрануляция тучных клеток при единичных базофилах и эозинофилах. При этом в периферической крови отмечены нейтрофильный лейкоцитоз и при повторных кормления 2-8-и кратное увеличение количества эозинофилов.

4.2. Особенности воспаления у птиц

В коже птиц в течение всего периода питания клеща развивается местный воспалительный процесс. У воробьиных он проходит по одной схеме. Воспаление инициируется альтерацией в результате погружения ротовых органов глубоко в кожу прокормителя, в сетчатый слой дермы.  К концу 1-х сут питания в месте прикрепления клеща отмечаем слабое утолщение эпидермиса у краев раны, незначительный отек соединительнотканной основы кожи, заполнение раневого дефекта фибрином и образование фибринового конуса вокруг ротовых органов паразита, появление клеточного воспалительного инфильтрата, состоящего из мононуклеарных лейкоцитов и клеток соединительной ткани, а так же первые признаки начала организации раны - увеличение количества фибробластов. На 2-е сут усиливаются пролиферативные процессы с тенденцией к образованию из пучков коллагеновых волокон коллагеновой капсулы. Коллагеновые волокна вплотную прилегают к фибриновому слою, окружающему ротовые органы, оплетают зубцы гипостома. В клеточном экссудате увеличивается доля полиморфноядерных лейкоцитов за счет эозинофилов и нейтрофилов. Начало образования пищевой полости приходится на конец 2-х сут питания клеща, что совпадает с увеличением количества нейтрофилов и их дегрануляцией вокруг капсулы, особенно в области апикальных концов ротовых органов. Образование коллагеновой  капсулы полностью завершается на 3-и сут, она поддерживается до конца питания клеща, а после его отпадения участвует в заживлении раны под струпом.

Таким образом, у воробьиных, естественных прокормителей иксодовых  клещей в природе, воспаление  кожи в месте присасывания клеща носит продуктивный характер, стенки коллагеновой капсулы в 2 раза толще образуемых  мелкими млекопитающими и примерно в 2-2.5 раза (22.5-45 мкм) толще ротовых органов. Экссудативная фаза сведена до минимума, толщина фибринового слоя вокруг ротовых органов 3.0-4.5 мкм при питании личинок и нимф и 10-11.25 мкм  -  самок I. lividus. В результате проведенных исследований кожи птиц в местах прикрепления и питания личинок и нимф I. persulcatus и личинок, нимф и самок I. lividus и сопоставления полученных данных  с более ранними установлено, что гистопатологические изменения в очаге проходят в последовательности, характерной для  раневого воспаления кожи. В результате экссудативной фазы закрывается раневой дефект, пролиферативная фаза приводит к организации (инкапсуляция) дефекта. Антигенное воздействие слюны клеща препятствует полной инкапсуляции ротовых органов, стимулирует образование обильного клеточного инфильтрата в зоне апикальных концов ротовых органов.

4.3. Особенности  воспаления  у  ящериц

Ротовые органы клеща, перфорируя кожу ящерицы между чешуйками, проникают глубоко в дерму. Они располагаются под углом в 40-45 к поверхности кожи, так что апикальный конец ротовых органов оказывается в основании впереди лежащей чешуйки.  При альтерации кожи происходит вытекание тканевого транссудата и крови, которая сворачивается при образовании фибрина. Это приводит к формированию вокруг ротовых органов фибринового конуса, толщиной 2.5 мкм.

Часть транссудата и крови вытекает на поверхность кожи и застывает вокруг основания гнатосомы, формируя струп. Ротовые органы клеща при проникновении в кожу повреждают коллагеновые волокна, стимулируя пролиферативную  стадию воспалительного процесса. Об этом свидетельствует увеличение количества фибробластов и фиброцитов в зоне альтерации. Плотные ткани дермы рептилий обладают исключительными регенеративными возможностями, так как представлены в основном пластами коллагеновых волокон. Вокруг фибринового конуса, окружающего ротовые органы, уже в конце 1-х сут после прикрепления образуется коллагеновая капсула, а к концу 2-х сут толстый слой коллагеновых волокон, расположенных циркулярно и  оплетающих зубцы гипостома, достигает наибольшей толщины - 100-150 мкм. Соотношение толщины фибринового слоя и коллагеновой капсулы составляет у ящериц 1:40 -1:60. Клеточный воспалительный инфильтрат представлен лимфоцитами, нейтрофилами и эозинофилами, причем, последние при быстром развитии воспаления оказываются в очаге уже на 2-е сут после прикрепления.

Гистопатологические изменения кожи рептилий в местах питания клещей рода Ixodes, аналогичны наблюдаемым у птиц и млекопитающих. Воспалительный процесс охватывает все слои кожи и в большей степени проявляется в дерме, в которой формируется толстая коллагеновая капсула. Ткани прокормителя окружают и плотно прилегают к  ротовым органам клеща. Клещи рода Ixodes при питании не образуют цементного футляра.

4.4. Сравнительный анализ особенностей прикрепления и питания клещей подсемейств Ixodinae  и Amblyommynae

  Успешное питание клеща в случае нахождения им хозяина-прокормителя возможно, если ему удается прорезать хелицерами эпидермис и закрепиться в образовавшейся ране.  Прорезывание кожи хозяина и последующее удерживание в течение нескольких суток в ране обеспечивается в первую очередь высокоспециализированным ротовым аппаратом и во вторую - способностью “приклеиваться” к коже при помощи секрета слюнных желез.

  Все клещи из группы Metastriata (подсемейство Amblyomminae) образуют цементный футляр. Его формирование у клещей подсемейства Amblyomminae: Hyalomma asiaticum (Атлас.., 1979),  Boophilus microplus (Binningtone, 1978), Rhipicephalus sanguineus (Megaw, Beadle, 1979), Amblyomma americanum (Krolak et al., 1982) и Rhipicephalus appendiculatus (Walker et al., 1985) связывают с секретом сложных гранул, состоящих из субъединиц и образующихся в а,d,e  клетках, локализованных в альвеолах 2 и 3 типов (Jaworski et al., 1991,1992). По химическому составу вещество цемента представляет собой смесь иммуногенных и неиммуногенных белков с включениями липидов и углеводов. Выделен главный компонент цемента,  белок с молекулярным весом 90 kDa, который обнаруживался как в d  и e клетках альвеол 3 типа, так и в цементном конусе, выделяемом Amblyomma americanum,  Dermacentor variabilis,  Rhipicephalus appendiculatus.

В отношении способности клещей из группы Prostriata (подсемейство Ixodinae) к образованию цементного футляра единого мнения не было (Moorhouse, 1969, 1973; Kemp et al., 1982),.

  В результате наших исследований установлено, что клещи рода Ixodes, проникая хелицерами и гипостомом глубоко в дерму, вызывают обильное истечение тканевой жидкости и крови, которые, сворачиваясь, обеспечивают закрытие раневого дефекта фибриновой пробкой. В ней клещи оказываются заключенными благодаря  сложной структурированной поверхности ротовых частей. Образующаяся позже коллагеновая капсула еще больше закрепляет клеща, т.к. зубцы гипостома оказываются практически переплетенными коллагеновыми волокнами прокормителя. Клещи рода Ixodes при питании не образуют цементного футляра.

4.5. Особенности гистопатологии кожи амниот при питании клещей

рода Ixodes

У представителей трех классов амниот (Reptilia, Aves, Mammalia) гистопатологические изменения в местах прикрепления и питания клещей подсемейства Ixodinae происходят по одной схеме, в последовательности, характерной для раневого воспаления кожи. В результате экссудативной фазы закрывается раневой дефект, пролиферативная фаза приводит к частичной инкапсуляции дефекта. Антигенное воздействие слюны клеща препятствует полной инкапсуляции ротовых органов, стимулирует образование обильного клеточного инфильтрата. Потребление его клещём приводит к формированию пищевой полости.  Ткани, окружающие ротовые органы клеща, принадлежат прокормителю и являются фибриновым конусом и коллагеновой капсулой (Табл. 4). Воспаление инициируется  проникновением ротовых органов клеща в кожу. Поступающие из раны кровь и тканевая жидкость, смешиваясь, застывают в струп после образования фибрина. Фибрин в ране начинает откладываться уже в течение  первого часа после перфорации, в нем оказываются заключенными хелицеры и зубцы гипостома.

Таблица 4. Структуры, образующиеся в местах прикрепления и питания клещей подсемейства Ixodinae на амниотах.

СТРУКТУРА И ЕЕ ОБОЗНАЧЕНИЕ В ЛИТЕРАТУРЕ

МЕСТОПОЛОЖЕНИЕ, ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВРЕМЯ ОБРАЗОВАНИЯ

СТРУП

″первичный сверток″ (Павловский, Алфеева,1941)”поверхностный конус” (Kemp e.a., 1982)

Структура образована из клеток  и плазмы крови, располагается на поверхности кожи прокормителя и окружает основание гнатосомы и пальпы присосавшегося клеща.

Проявляет ярко-голубую флуоресценцию после специфической  реакции с ФИТЦ мечеными сыворотками на иммуноглобулины белой мыши и кролика.

Первые часы после перфорации кожи клещём

ФИБРИНОВЫЙ КОНУС

“внутренний слой внутреннего конуса” (Kemp e.a., 1982)

Окружает ротовые органы клеща на всей глубине их проникновения в кожу прокормителя. Проявляет ярко-голубую флуоресценцию после специфической реакции с ФИТЦ мечеными сыворотками на иммуноглобулины белой мыши и кролика. Окрашивается в интенсивно-бордовый цвет азаном по Гейденгайну.

Первые часы после перфорации кожи клещём

КОЛЛАГЕНОВАЯ КАПСУЛА

“внешний слой внутреннего конуса”(Kemp e.a., 1982)

Окружает ротовые органы клеща на всей глубине их проникновения в кожу прокормителя, плотно прилегая к фибриновому конусу. Волокна капсулы оплетают зубцы ротовых органов клеща. Ткань капсулы проявляет качественную голубую окраску на соединительную ткань при использовании азанового метода по Гейденгайну, положительную реакцию с коллагеназой (Brossard, Fivaz, 1982), положительную красную окраску на коллаген по Ван-Гизону (Stevens, 1968), интенсивно-бордовую аутофлуоресценцию.

Начинает образовываться через 10-12 ч после прикрепления клеща. Сформирована через 1.5-2 сут у птиц и млекопитающих и в конце 1-х сут у ящериц.

К концу 1-х сут питания  отмечается слабое утолщение эпидермиса у краев раны, незначительный отек соединительно-тканной основы кожи, формирование струпа из крови, заполнение раневого дефекта фибрином и образование фибринового конуса вокруг ротовых органов паразита, появление клеточного воспалительного инфильтрата, состоящего из мононуклеарных лейкоцитов, гистиоцитов и фибробластов. Пролиферативные процессы усиливаются на 2-е сут, из пучков коллагеновых волокон образуется коллагеновая капсула за 2-3 сут после перфорации у птиц и млекопитающих и в течение первых сут у ящериц.  У прокормителей иксодин в природе воспаление кожи в месте присасывания клеща носит продуктивный характер. Соотношение толщины фибринового слоя и коллагеновой капсулы составляет у мелких млекопитающих 1:1.9 – 1:6.4, у воробьиных 1:7.5 – 1:10 и у ящериц 1:40 – 1:60. Формирование пищевой полости происходит примерно через 40-48 ч после прикрепления личинок и нимф  и 60-72 ч самок, что связано с увеличением количества нейтрофилов и их дегрануляцией.

  Для птиц и млекопитающих, природных прокормителей иксодовых клещей характерно усиление пролиферативной фазы воспаления с частичной инкапсуляцией паразита. У лабораторных и домашних животных преобладает экссудативная реакция, в результате которой ротовые органы клеща оказываются заключенными в толстостенный фибриновый конус. В окружающей его соединительной ткани накапливается обильный воспалительный клеточный инфильтрат, состоящий в начале преимущественно из клеток соединительной ткани и лимфоцитов, доля которых впоследствии уменьшается на фоне увеличения полиморфноядерных лейкоцитов, таких как эозинофилы и особенно нейтрофилы. Нейтрофильный лейкоцитоз приводит часто к гнойному воспалению в очаге питания клеща на лабораторных или домашних животных.

  Клещи подсемейства Ixodinae не образуют структур, подобных цементному футляру амблиоммин, и их ротовые органы находятся в непосредственном контакте с тканями хозяина. Несмотря на дезорганизующее влияние паразита и хозяина друг на друга устойчивость системы обеспечивается благодаря синхронизации развития паразита с особенностями хозяев, в частности со стереотипными защитными реакциями.

Глава 5.  ОСОБЕННОСТИ ПРОТИВОКЛЕЩЕВОЙ  РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ИММУННОГО СТАТУСА У  ПРИРОДНЫХ  И ЛАБОРАТОРНЫХ ПРОКОРМИТЕЛЕЙ ИКСОДИН

  Взаимоотношения иксодового клеща и прокормителя как участников системы ”паразит - хозяин” включают реакцию прокормителя в виде противоклещевой резистентности. Явление специфической  противоклещевой резистентности, как способности хозяев-прокормителей сопротивляться и противодействовать питающимся на них клещам, обеспечивается реакциями иммунитета.  Впервые явление противоклещевой резистентности было описано Трегером (Trager, 1939). Установлена противоклещевая резистентность у многих видов лабораторных и сельскохозяйственных животных (Wikel, 1996). 

Резистентность хозяина влияет на питание и последующее развитие клеща и вызывает значительные отклонения основных экологических количественных показателей, уменьшение количества напитавшихся клещей вследствие гибели некоторых из них при прикреплении и на более поздних сроках питания, удлинение времени питания, уменьшение массы крови, поглощенной напитавшимися особями, снижение процента перелинявших личинок и нимф, а также уменьшение числа отложенных яиц и вылупившихся из них личинок  (Таежный ..., 1985; Балашов, 1998; Agbede, Kemp, 1986; Wikel, 1996).

Противоклещевая резистентность формируется с участием реакций  гуморального и клеточного иммунитета (Лабецкая,1990; Wikel, 1996). Общей реакцией млекопитающих, птиц и рептилий на паразитирование иксодовых клещей является образование антител В-лимфоцитами на специфические антигены, выделяемые клещем при питании.

Тема развития противоклещевого иммунитета у прокормителей за последние годы получила широкое освещение в литературе. Большинство исследований посвящено молекулярным  и иммунологическим характеристикам слюнных (Jaworski et al., 1992; Kovar et al.,  2002; Lawrie et Nuttall, 2001; Leboulle et al.,2002; Needham et al., 1989; Valenzuela et al., 2002) и кишечных (Agbede, Kemp, 1986; Willadsen, Kemp, 1988) антигенов, выделяемых клещaми при питании. Действие этих белков распространяется на все этапы воспалительной реакции хозяина,  а также на врожденный и приобретенный иммунитет хозяина (Kopecky et al.,1998,1999).  Однако  большинство исследований проведено на лабораторных (белые мыши, морские свинки, кролики) и сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот), которые проявляют устойчивое развитие противоклещевой резистентности при повторных кормлениях клещей. 

  В природных экосистемах контакты иксодовых клещей с их естественными прокормителями осуществляются многократно на протяжении сезона активности клещей, но при небольшой численности одновременно нападающих паразитов, что не вызывают нарушения паразитарных систем. О наличии резистентности у хозяев-прокормителей говорит присутствие у них в крови определенного количества антител (АТ), выработанных организмом на специфический белок слюнных желез паразита.

Нами проведено иммуноферментное исследование проб крови рыжих полевок из природной экосистемы на северо-западе России в период наибольшей активности преимагинальных фаз таежного клеща.  Так же исследованы пробы крови рыжих полевок из лабораторной культуры после  однократных и повторных опытных кормлений на них личинок и нимф таежного клеща. Количество прокармливаемых в лабораторном опыте личинок и  нимф было приближено к  средним показателям в природной системе. В результате первичного  иммунизирующего кормления  на 6-и трехмесячных рыжих полевках напиталось 12  (по 2) нимф из 36 посаженных для кормления, на 5 рыжих полевках - напиталось 25 (по 5) личинок из 75. Показатели оптической плотности содержания АТ в крови опытных особей колебались в пределах 0.409-0.515 OD. В результате повторного иммунизирующего кормления клещей  в таких же количествах и  на тех же особях рыжих полевок через 4 недели значения оптической плотности содержания АТ  составило 0.412-0.517.  Негативный контроль, сыворотка крови неиммунных рыжих полевок (3 особи 3-месячного возраста) имел показатель оптической плотности 0.360-0.387. Содержание АТ в крови рыжих полевок из природы имел больший разброс. Из 115 исследованных проб крови содержание  АТ в пределах негативного контроля имели 25 особей (21%), содержание  АТ в пределах опытных значений - 50 особей (44%), выше опытных значений (0.520-0.677) - 40 особей (35%).  Содержание АТ на белки слюны таежного клеща в крови рыжих полевок указывает на формирование у них иммунитета при повторных кормлениях паразитов в природе.  Конкретные  цифровые выражения содержания АТ в виде его оптической плотности показывают, что у пятой части особей в природной популяции  паразитарная нагрузка низкая, не вызывающая существенных изменений в образовании АТ. Около половины особей природных популяций имеет среднюю нагрузку, приближенную к выбранной нами  для опыта, которая не вызывает негативных для внешнего состояния и здоровья прокормителей последствий и не формирует базовый уровень АТ, нейтрализующих  АГ (антигены) слюны паразитов.  И только 35% особей в популяции  проявляют уровень АТ  выше отмеченного в опыте, а значит? имеют большую паразитарную нагрузку,  которая способствовала выработке устойчивого иммунитета и считается по результатам метода положительным.

Таким образом,  полного отсутствия резистентности у природных прокормителей иксодовых клещей  нет, а особи из  природных популяций прокормителей неоднородны по своему  иммунному статусу, формирование которого связано с различной интенсивностью и величиной паразитарного груза. Сложная система взаимоотношений сочленов паразитарной системы прокормитель - иксодовый клещ, регулируемая на стадии питания клеща, остается устойчивой вследствие распределения паразитарной нагрузки между особями популяции прокормителя в соответствии с особенностями их индивидуальной и половозрастной активности на протяжении суток и сезона.  Средняя паразитарная нагрузка на отдельную особь прокормителя незначительна, а перманентный контакт большинства прокормителей с  разным количеством питающихся клещей из-за разной иммунизирующей дозы может привести или только к сенсибилизации или вызвать развитие иммунитета, проявляющегося стойким присутствием АТ в крови. Однако доля таких особей в популяции составляет лишь третью часть, что  вероятно является  фактором, регулирующим численность клещей в природных биогеоценозах.

Глава  6.  ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ИКСОДИН С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ИНФЕКЦИЙ

Иксодовые клещи группы Ixodes ricinus-persulcatus  являются переносчиками,  и резервуарами возбудителей  иксодовых клещевых боррелиозов (Филиппова, 1990; Коренберг, 1993). В настоящее время (Eisen, Lane, 2002) специфическими переносчиками боррелий группы Borrelia burgdorfery senso lato признаны клещи 12 видов рода Ixodes, 6 из них входят в комплекс I. ricinus - I. persulcatus (I. affinis, I. jellisoni, I. pacificus, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis) и 6 видов не являются членами этого комплекса.

Боррелии представляют группу микроорганизмов из отряда спирохет (Spirochetales), широко распространенные в границах видовых ареалов клещей - переносчиков в лесном поясе Евразии и Северной Америки. Возбудитель  из группы Borrelia burgdorfery s. l. циркулирует в природе между клещами и многими видами наземных позвоночных, включая человека. Передача боррелий осуществляется трансмиссивным путем в период питания клещей. К настоящему времени известно 11 геновидов боррелий, включенных в комплекс видов Borrelia burgdorfery s. l. , причем патогенными для человека признаны 4 вида: Borrelia burgdorfery s. str., B. garinii, B. afzelii  и B. bissettii (Bergstrom et al., 2002).  Считают, что около 100 видов диких позвоночных могут  быть неспецифическими резервуарами для боррелий, однако показано, что специфическими резервуарами боррелиоза в дикой природе  являются мелкие млекопитающие родов Neotoma и Peromyscus в Северной Америке, Apodemus и Clethrionomys в Евразии и несколько видов птиц.  Поэтому выделяют два типа трансмиссионных циклов передачи боррелий:  грызун - клещ  и птица - клещ (Kurtenbach et al., 2002).

В настоящее время  установлено, что на территории России главными переносчиками Borrelia burgdorfery s. str., B. garinii, B. afzelii, патогенных для человека, являются I.  ricinus,  I. persulcatus, однако, обнаружение возбудителя в клещах I. trianguliceps  и I. pavlovsky, жизненные циклы которых не связаны с человеком, указывает на существование независимых от основных переносчиков путей сохранения и передачи возбудителей боррелиоза. В качестве прокормителей клещей, как грызуны, так и землеройки могут быть специфическими резервуарами возбудителя  на территории России (Korenberg et al., 2002). Иксодовые клещевые боррелиозы (Коренберг, 1996) существуют в виде природных очагов и поддерживаются благодаря циркуляции возбудителя между клещами и позвоночными-прокормителями. Классическая трехчленная структура очагов усложняется в связи с существованием и взаимодействием на одной территории нескольких видов переносчиков, способных передавать боррелий нескольких геновидов одновременно (Gorelova et al., 1996). На территории России особый интерес  представляют отношения I. ricinus - I. persulcatus - I. trianguliceps, где  два первых  вида являются переносчиками Borrelia burgdorferi s. l. для человека, а третий - не связан с человеком и питается на мелких млекопитающих (Высоцкая, 1951; Бобровских, 1983). В литературе для личинок и нимф I. ricinus, I. persulcatus и I. trianguliceps определен единый круг прокормителей - мелких млекопитающих: Sorex araneus, S. minutus, Apodemus uralensis, , A. flavicollis, Clethrionomys glareolus, Microtus arvalis (Филиппова, 1977). Использование одних и тех же видов мелких млекопитающих в качестве прокормителей создает достаточные предпосылки для обмена возбудителями у видов, относящихся к комплексу  I. ricinus - I. persulcatus (Филиппова, 1990) и между  I. persulcatus  и  I. trianguliceps (Korenberg et al., 1996).

6.1. Особенности природных очагов клещевых боррелиозов в условиях северо-запада России

  Нами установлено, что из 13 видов мелких млекопитающих (Sorex araneus, S. minutus, S. isodon, S. caecutiens, Apodemus uralensis, A. flavicollis, Clethrionomys glareolus, C. rutilus, Microtus arvalis, M. rossiameridionalis, M. oeconomus, M. agrestis, Sicista betulina), прокармливающих иксодовых клещей на территории Новгородской области, доминируют рыжая полевка и обыкновенная бурозубка. Они по сумме лет исследования составили 43.1% и 33.5% , соответственно. Структура комплекса мелких млекопитающих лабильна, и при видимых доминантах значительную долю в разные годы составляют малая лесная мышь, малая бурозубка и обыкновенная полевка.

Преимагинальные фазы I. trianguliceps в наибольшем количестве отмечены на обыкновенной и малой бурозубках. В прокармливании личинок таежного клеща наибольшее значение имеет рыжая полевка. Распространенные в одних и тех же местообитаниях личинки и нимфы I. persulcatus  и  I. trianguliceps проявляют наибольшую активность в разные периоды сезона, так что паразитарные нагрузки распределяются сравнительно равномерно на разные возрастные  группы доминирующих видов прокормителей.

Зараженность мелких млекопитающих боррелиями пропорциональна доле их участия в прокармливании клещей. Стабильную инфицированность проявляет рыжая полевка. Наибольшее число инфицированных зверьков отмечено среди бурозубок в 1995г -44.9%. Однако этот показатель оказался неустойчивым, и в 1997 гг. он снизился до 0.98%. Среди обыкновенных полевок и лесных мышей, отловленных в течение 3-х сезонов, инфицированными оказались 9.1% и 1.4% особей, соответственно. Средняя зараженность мелких млекопитающих боррелиями за период исследования уменьшалась с 34.7% в 1995г. до 11% - в 1996г. и 4.9% - в 1997г.

Продолжительность периода, в течение которого клещи, питающиеся на мелких млекопитающих с боррелиемией, могут получать возбудителя, составляет 110-120 дней, с середины - конца мая до середины сентября, т.е. практически весь сезон активности иксодовых клещей. Из отловленных млекопитающих сохранять Borrelia burgdorferi s. l. до следующего сезона активности клещей могут рыжая, обыкновенная и красная полевки, бурозубки и малая лесная мышь. В начале сезона активности у представителей этих видов регистрировали боррелиемию.

6.2. Локализация боррелий в организме клеща Ixodes persulcatus

Анализ распределения боррелий в организме таежного клеща выявил четкую связь накопления и локализации возбудителя с физиологическим состоянием клеща-переносчика. Питание клещей стимулирует миграцию боррелий с поверхности кишечных клеток к базальной мембране кишечника, их накопление и дальнейшую миграцию в другие внутренние органы. Возбудитель локализуется и мигрирует по многочисленным межклеточным пространствам в стенке средней кишки, слюнных железах и других внутренних органах клеща. Обнаружена локализация боррелий внутри кишечных клеток и клеток слюнных альвеол таежного клеща. Способность возбудителя сохраняться в слюнных железах и других органах на стадии линьки объясняет существование  генерализованной инфекции у голодных особей и ее усиление при последующем питании. Соответственно клещи этого вида  потенциально способны к передаче боррелий позвоночным сразу после прикрепления или в начале кровососания. Присутствие боррелий в слюнных железах голодных I. persulcatus определяет более высокую эффективность этого вида в передаче возбудителя клещевого боррелиоза по сравнению с I. ricinus и I. scapularis.

6.3. Трансовариальная и трансфазовая передачи боррелий таежным клещём

  Роль трансовариальной передачи боррелий клещами в природных очагах инфекций, по-видимому, определяется видовой принадлежностью переносчика и боррелии. Так, в европейских очагах боррелиоза  трансовариальная передача боррелий считается одним из основных механизмов циркуляции возбудителя в природе (Randolph, Craine, 1995), а в Северной Америке ей придают второстепенное значение (Mount et al., 1997).

Обязательным условием сохранения боррелий в популяции клещей и их передачи позвоночным животным, безотносительно к существованию трансовариальной передачи, должна быть достаточно эффективная трансфазовая передача возбудителя от напитавшихся личинок перелинявшим из них нимфам и от нимф - имаго.

Нами установлено, что вид I. persulcatus  обладает исключительной способностью к трансовариальной передаче боррелий из группы Borrelia burgdorferi s. l. Почти 100% потомства инфицированных самок были заражены боррелиями и столь же высокая инфицированность обнаружена у собранных в природе голодных личинок. Полученные трансовариально боррелии передавались по циклу развития клеща нимфам и имаго, и далее особям двух следующих поколений. При электронно-микроскопическом исследовании боррелии были обнаружены в яичниках, возбудители локализовались в клетках ножки и внутри прикрепленных к ним ооцитов, находящихся на стадии, предшествующей началу вителлогенеза, либо на ранних стадиях образования желтка.

Судя по достаточно низким показателям трансовариальной и трансфазовой передач боррелий (Bellet-Edimo et al., 1996; Gern et al., 1996), патогенных для человека, абсолютной способность  к  передаче обладают далеко не все известные геновиды, а в основном те, которые считаются непатогенными для человека.

6.4. Значение морфофункциональных особенностей клещей рода Ixodes  в процессах получения, сохранения и передачи возбудителей в природных очагах трансмиссивных инфекций (на примере боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l.)

Способность иксодин к вертикальной передаче возбудителей и редкое многодневное питание, чередующееся со свободными непаразитическими периодами, определяют их исключительные возможности передачи возбудителей. Длительное сохранение возбудителя в организме  клеща  между периодами питания указывает на высокую степень адаптации возбудителя к организму переносчика.  Комплекс адаптаций обеспечивает возможность проникновения в полость средней кишки и последующую диссеминацию в полость тела и внутренние органы клеща.

Кишечник является наиболее стабильным местообитанием боррелий  на периоды между питаниями, что  демонстрирует практически 100% -ное их обнаружение в полости кишки голодных особей.  Обладая адгезивными свойствами, боррелии занимают пристеночное положение и располагаются на апикальных поверхностях кишечных клеток. Уже в первые сутки питания при попадании начальных порций пищи в полость кишки  отмечается миграция возбудителя. Основной способ  миграции - продвижение по межклеточным пространствам, причем ему способствует то обстоятельство, что с началом питания в кишечнике клеща начинаются постоянные процессы смены эпителия. Покинувшие апикальные поверхности кишечных клеток, боррелии скапливаются в области базальной мембраны и соединительнотканной оболочки, окружающей кишечник и все органы клеща. Рыхлая многослойная сеть, состоящая из соединительнотканных волокон, мышечных элементов, трахеол, оплетающая все органы клеща, вероятно, является вторым после кишечника местом, где накапливается возбудитель и по которому он с легкостью проникает во все остальные органы. Свободные спирохетообразные формы боррелий, распространяющиеся по жидким средам организма клеща, встречаются крайне редко.  А адгезивные свойства боррелий и их склонность к соединительнотканным структурам проявляются в организме клеща не меньше, чем в организме теплокровного прокормителя. 

Дальнейшее распространение возбудителя по организму клеща, которое могло бы обеспечить  трансмиссивную передачу его теплокровным или трансовариальную передачу следующим поколениям переносчика, связано только со способностью боррелий проникать в клетки специализированных органов. Так боррелии содержатся в соединительнотканных оболочках слюнных альвеол особенно  I  и  II  типов голодных самок и нимф, однако уже в первые часы питания часть возбудителя может проникать в секретирующие клетки гранулосодержащих альвеол. Попадание возбудителя в клетки ножек и внутрь прикрепленных к ним ооцитов разных стадий развития в яичниках способствует трансовариальной передаче.  Передача боррелий по циклу развития клеща, или  трансфазовая передача, возможна только если возбудитель окажется в органе, который не подвергается гистолизу и последующему гистогенезу тканей следующей фазы. Единственным таким органом в организме клеща является кишечник, в котором происходит внутриклеточное пищеварение полученной  во время кровососания пищи с последующим депонированием запасных пищевых резервов, необходимых для метаболических превращений, как на этапе гистогенеза, так и в период голодания особи после линьки. Заселение других органов, которые формируются заново на каждой фазе онтогенеза, у голодных особей, вероятно, происходит из кишечника.

  Развитие боррелий в организме клеща чрезвычайно адаптировано не только к морфо-функциональным изменениям  в организме каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз  особи в онтогенезе, что свидетельствует о синхронизации их развития с морфофункциональными изменениями в организме основного переносчика, каким является таежный клещ.

Глава 7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.  СИНХРОНИЗАЦИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПЕРЕСТРОЕК В ОРГАНИЗМЕ КЛЕЩЕЙ РОДА IXODES  И  ИХ СОГЛАСОВАННОСТЬ С ЗАЩИТНЫМИ ПРОЦЕССАМИ В ОРГАНИЗМЕ ХОЗЯИНА ПРОКОРМИТЕЛЯ

Иксодины приобрели систему морфофункциональных адаптаций  к длительному контакту с защитными факторами организма прокормителя, лишь преодолев которые возможно полное насыщение.

В основе смены фаз пищеварения лежат глубокие морфофункциональные изменения пищеварительной системы, и в частности кишечного эпителия. На протяжении 7-12 дневного питания в кишечнике самок  и 3-6 дневного питания нимф клещей р. Ixodes одновременно с поглощением пищи происходит наращивание тканей кишечника в результате образования “новых генераций” кишечных клеток. Процессы  поглощения и переваривания крови не разобщены, а происходят практически одновременно.

Вместе с увеличением продолжительности кровососания увеличивается период тесного контакта клеща с организмом хозяина-прокормителя. Глубокое проникновение ротовых органов питающихся клещей в основу кожи прокормителя вызывает нарушение целостности капилляров, необходимое для успешного  кровососания.  Гистопатологические изменения в местах прикрепления и питания клещей  рода Ixodes  на амниотах происходят в последовательности, характерной для  раневого воспаления кожи. В результате экссудативной фазы закрывается раневой дефект, пролиферативная фаза приводит к организации дефекта с образованием коллагеновой капсулы. Антигенное воздействие слюны клеща препятствует полной инкапсуляции ротовых органов, стимулирует образование обильного клеточного инфильтрата. Потребление его клещём приводит к формированию пищевой полости.  Ткани, окружающие ротовые органы клеща, принадлежат прокормителю и являются фибриновым конусом и коллагеновой капсулой.  Клещи подсемейства Ixodinae не образуют структур, подобных цементному футляру амблиоммин, и их ротовые органы находятся в непосредственном контакте с тканями хозяина.

Деструктивное действие со стороны клеща вызывает активацию защитных реакций со стороны хозяина. Функцию регуляции сложного комплекса защитных реакций хозяина выполняют слюнные железы клеща на протяжении всего периода питания.  Чтобы проигнорировать защитную систему прокормителей клещ для успешного завершения насыщения должен выделять со слюной вещества,  препятствующие заживлению и усиливающие кровотечение. Существование двух типов секреторных альвеол и временное разделение их секреторной и выделительной активности позволяют предположить, что  активность секретов клеток a и b альвеол 2 типа и клеток d  альвеол 3  типа  у клещей рода Ixodes  в  первые часы и сутки питания направлена на предотвращение гемостаза,  усиление вазодилятации. Секреторная активность альвеол  2 типа в большей степени проявляется, начиная с 3 сут питания, когда в организме хозяина-прокормителя начинают активизироваться факторы иммунитета, и продолжается до конца питания клеща, обеспечивая его полное насыщение благодаря содержанию в слюне в этот период иммуномодулирующих протеинов. Эти процессы, вероятно, обеспечиваются веществами, входящими в состав электронно-плотных гранул a и b клеток, которые содержатся в их цитоплазме, начиная со 2-3-х сут кровососания.

Несмотря на дезорганизующее влияние паразита и хозяина друг на друга устойчивость системы обеспечивается благодаря синхронизации морфо-функциональных изменений паразита с особенностями воспалительного процесса хозяев. Возможность длительного питания и роста  организма клеща обеспечивается сложной секреторной активностью слюнных желез, сдерживающей поэтапно защитные механизмы хозяина-прокормителя. Это указывает на согласованность и синхронизацию морфофункциональных изменений в организме питающихся иксодовых клещей.

  Проявления иммунитета  у прокормителей из природы сдерживается благодаря выраженным пролиферативным свойствам воспалительной реакции, с  уменьшением клеточной инфильтрации поврежденных тканей и  ослаблением экссудативной реакции в месте питания клеща, а также секретами гранулосодержащих альвеол слюнных желез, выделяемых в строгом порядке в течение питания клеща. Однако полного отсутствия резистентности у природных прокормителей иксодовых клещей  нет. Прокормители из природных популяций неоднородны по своему  иммунному статусу, формирование которого связано с различной интенсивностью и величиной паразитарного груза. Сложная система взаимоотношений сочленов паразитарной системы прокормитель - иксодовый клещ, регулируемая на стадии питания клеща, остается устойчивой вследствие распределения паразитарной нагрузки между особями популяции прокормителя. Средняя паразитарная нагрузка на отдельную особь прокормителя незначительна, а перманентный контакт большинства прокормителей с  разным количеством питающихся клещей из-за разной иммунизирующей дозы может привести или только к сенсибилизации или вызвать развитие иммунитета, проявляющееся стойким присутствием АТ в крови. Однако доля таких особей в популяции составляет лишь третью часть, что  вероятно является  фактором, регулирующим численность клещей в природных биогеоценозах.

Адаптации  иксодин к паразитизму на позвоночных  включают морфо-функциональные изменения организма клеща на стадии питания, которые согласуются с особенностями воспалительной и иммунной реакций хозяина-прокормителя и синхронизированы с ними.

ВЫВОДЫ

1. Во время питания  и после его завершения эпителий в кишечнике клеща динамично обновляется, претерпевая цикличные изменения, проявляющиеся в функционировании  нескольких морфофункциональных пластов клеток. Процессы поглощения крови и ее переваривания не разобщены во времени, а происходят практически одновременно.

2.  Переваривание основного количества пищи у нимф с развитием с диапаузой и без нее осуществляют пищеварительные клетки личиночной и нимфальной фазы во время питания и отпадения клеща. Смена пищеварительных клеток личиночной фазы на клетки нимфальной происходит постепенно в течение первых 5-10 сут после отпадения клеща. В морфогенетическую диапаузу вступают особи, завершившие  полостное пищеварение, что позволяет прервать активное развитие организма на период действия неблагоприятных факторов, а также сохранить пищевые резервы до начала активизации особи на следующей фазе онтогенеза.

3. У оплодотворенных самок в пищеварении участвуют  клетки нимфальной фазы, секреторные клетки и 4-е морфофункциональных пласта пищеварительных клеток.  Секреторные клетки обеспечивают полостное пищеварение.  Внутриклеточное пищеварение происходит в пищеварительных клетках  4-х последовательных пластов. Секреторные и пищеварительные клетки образуют на своей поверхности перитрофический матрикс, наличие которого свидетельствует о зрелости и функциональной активности клеток, и возможно является признаком пристеночного пищеварения у иксодин.

4. В переваривании поступающей в кишечник пищи у девственных самок участвуют пищеварительные клетки нимфальной фазы и два морфофункциональных пласта пищеварительных клеток имагинальной фазы. Кровососание не завершается, полного насыщения не происходит. Оплодотворение стимулирует доразвитие кишечника, в результате которого он достигает размеров, позволяющих поглощать количества крови, необходимые для  продолжения онтогенеза.

5. При иммунизирующих кормлениях на лабораторных кроликах питание клеща прерывается на второй фазе, полного насыщения не происходит, наблюдается смена пищеварительных клеток нимфальной фазы и двух морфофункциональных пластов пищеварительных клеток имагинальной фазы,  пласт секреторных клеток отсутствует.

6.  Кишечные клетки каждой генерации формируют перитрофический матрикс (ПМ). Он отсутствует у голодных самок клещей рода Ixodes и начинает образовываться на поверхности клеток в средней кишке через 9-12 ч  после прикрепления. Имеет в основном гомогенную тонкогранулярную структуру.  ПМ функционирует на поверхности клеток, по мере их старения утолщается и отторгается вместе с этими же клетками в просвет кишки. ПМ у иксодин, возможно, выполнять защитную функцию, предохраняя клетки кишечного пласта от  прямого действия полостного содержимого, разделяет зоны полостного и пристеночного пищеварения. ПМ, обладая избирательной проницаемостью, регулирует размеры пищевых компонентов в экзоперитрофическом пространстве.

7. При сходстве общей схемы питания у клещей  подсемейства Ixodinae  и Amblyomminae выявлены значительные различия. Иксодины поглощают частично гемолизированную кровь, следовательно,  внекишечное пищеварение у них менее выражено. Основное переваривание крови начинается в полости кишки при помощи ферментов секреторных клеток. Зону полостного пищеварения отделяет перитрофический матрикс. У них отсутствует фагоцитоз.

Амблиоммины  поглощают гемолизированную ферментами слюны кровь. Для них характерны все три типа пищеварения: внекишечное, полостное и внутриклеточное. Их кишечные клетки не имеют перитрофического матрикса, а внутриклеточное пищеварение возможно при помощи фагоцитоза (Балашов, 1967; Атлас.., 1979; Agbede, Kemp, 1985).

8. Возможность длительного питания и роста  организма клеща во время питания обеспечивается сложной секреторной активностью слюнных желез, сдерживающей поэтапно защитные механизмы хозяина-прокормителя.  Динамика гранулосекреторной активности складывается из двух этапов: 1 - активность альвеол 3 типа, продолжающаяся от начала присасывания (особенно на 3-4 ч после присасывания) на протяжении последующих 2-х сут; 2 - активность альвеол 2 типа, проявляется началом секретирования в первые часы после присасывания, а интенсивное выделение секретов наблюдается со2-х сут до конца питания клеща. Возможно, в процессе становления паразито-хозяинных отношений между иксодидами и позвоночными, у иксодин с небольшим числом видов клеток в гранулосекретирующих альвеолах происходит смена секреторных  продуктов в каждом типе клетки в течение времени  питания, а  у большинства амблиоммин возникает большое число видов клеток, каждый из которых секретирует особый продукт в ответ на внешние стимулы.

9. Гистопатологические изменения в местах прикрепления и питания клещей  рода Ixodes  на амниотах происходят в последовательности, характерной для  раневого воспаления кожи. Ткани, окружающие ротовые органы клеща, принадлежат прокормителю и являются фибриновым конусом и коллагеновой капсулой. У прокормителей иксодовых  клещей в природе воспаление  кожи в месте присасывания клеща носит продуктивный характер.  Клещи подсемейства Ixodinae не образуют структур, подобных цементному футляру амблиоммин, и их ротовые органы находятся в непосредственном контакте с тканями хозяина.

10. В природных экосистемах преобладает относительно невысокая численность клещей на их главных хозяевах при умеренной напряженности противоклещевого иммунитета. Только третья часть природной популяции рыжих полевок в условиях северо-запада России формирует иммунитет к таежному клещу. Полного отсутствия резистентности у природных прокормителей иксодовых клещей  нет, а члены  природных популяций прокормителей неоднородны по своему  иммунному статусу, формирование которого связано с различной интенсивностью и величиной паразитарного груза.

11. Морфофункциональные изменения  в организме клеща на стадии питания, согласуются с особенностями воспалительной и иммунной реакций хозяина-прокормителя и синхронизированы с ними.

  12. Развитие боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. в организме клеща адаптировано не только к морфо-функциональным изменениям  в организме каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз  особи в онтогенезе, что свидетельствует о синхронизации  развития возбудителей  иксодовых клещевых боррелиозов с морфофункциональными изменениями в организме основного переносчика, каким является таежный клещ.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1.  Григорьева Л.А. Землеройки как резервуар боррелий на северо-западе России // Паразитология. 1996. Т. 30.  № 5. С. 470-472.

2. Григорьева Л.А.  Боррелиоз лабораторных кроликов // Паразитология. 1996. Т. 30.  № 2. С. 185-187.

3. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А.  Локализация боррелий в организме клеща Ixodes persulcatus (Ixodidae)// Доклады Академии Наук. 1997. Т. 352. № 1. С. 130-132.

4. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А., Оливер Дж. Локализация боррелий в организме клеща Ixodes persulcatus на разных стадиях развития//  Паразитология. 1997. Т. 31.  № 2. С. 97-103.

5. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А., Оливер Дж. Межвидовые скрещивания иксодовых клещей группы  Ixodes ricinus- persulcatus // Доклады Академии Наук. 1998. Т. 361. № 5. С. 712-714.

6. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А.  Трансовариальная передача боррелий Borrelia burgdorferi s.l.  таежным клещем Ixodes persulcatus (Ixodidae)// Доклады Академии Наук. 1998. Т. 363. № 3. С. 422-424.

7. Григорьева Л.А., Третьяков К.А.  Особенности паразитарной системы иксодовые клещи - боррелии - мелкие млекопитающие на северо-западе России  // Паразитология. 1998. Т. 32.  № 5. С. 422-430.

8. Балашов Ю.С., Амосова Л.И., Григорьева Л.А.  Трансовариальная и трансфазовая передачи боррелий таежным клещём Ixodes persulcatus (Ixodidae)//  Паразитология. 1998. Т. 32.  № 6. С. 489-494.

9.  Балашов Ю.С., Григорьева Л.А., Оливер Дж. Репродуктивная изоляция и межвидовая гибридизация иксодовых клещей группы Ixodes ricinus- I. persulcatus (Acari; Ixodidae) // Энтомологическое обозрение. 1998. Т. 77. № 3. С. 716-724.

10. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А.  Особенности питания и прикрепления Ixodes trianguliceps (Ixodidae) на мелких млекопитающих в природе // Доклады Академии Наук. 1999. Т. 369.№ 3. С. 416-419.

11. Григорьева Л.А., Бабкин А.В. Применение метода серебрения в диагностике поздних кожных поражений у человека при иксодовых клещевых боррелиозах //  Паразитология. 1999. Т. 33.  № 3. С. 267-269.

12. Григорьева Л.А.  Гистопатологические изменения кожи мелких млекопитающих в местах питания клещей Ixodes trianguliceps, I. persulcatus и I. ricinus (Ixodidae)// Паразитология. 2001. Т. 35.  № 3. С. 177-183.

13. Григорьева Л.А.  Гистопатологические изменения кожи птиц в местах питания клещей рода Ixodes (Acari: Ixodidae)// Паразитология. 2001. Т. 35.  № 6. С. 490-495.

14. Григорьева Л.А.  Гистопатологические изменения кожи  ящериц (Reptilia: Lacertidae) в местах питания клещей рода Ixodes (Acari: Ixodidae)// Паразитология. 2002. Т.36, №5, С. 375-378.

15.  Балашов Ю.С., Бочков А.В., Ващенок В.С., Григорьева Л.А., Третьяков К.А.  Структура и сезонная динамика сообщества эктопаразитов рыжей полевки в Ильмень-Волховской низине // Паразитология. 2002. Т. 36, № 6, С. 433-446.

16. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А.  Гистопатологические особенности питания клещей рода Ixodes (Acari: Ixodidae) на амниотах // Доклады Академии Наук. 2002. Т. 385. №.1. С. 126-129 .

17. Григорьева Л.А.  Морфофункциональные изменения средней кишки самок клещей рода Ixodes (Acari: Ixodidae) во время и после питания// Паразитология. 2003. Т.37, №3, С. 169-176.

18. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А.  Цитологические изменения средней кишки иксодовых клещей рода Ixodes во время и после питания // Доклады Академии Наук. 2003. Т. 393. №.1. С. 130-133.

19. Григорьева Л.А., Амосова Л.А.  Особенности перитрофического матрикса в кишечнике самок клещей рода Ixodes (Acari: Ixodidae)// Паразитология. 2004. Т.38, №1, С. 3-11.

20. Григорьева Л.А.  Морфофункциональные изменения кишечника нимф клещей рода Ixodes (Acari: Ixodidae) во время и после питания // Паразитология. 2004. Т.38, №3, С. 219-224.

21. Григорьева Л.А. .  Морфофункциональные изменения средней кишки неоплодотворенных самок клещей рода Ixodes (Acarina: Ixodidae) во время и после питания// Паразитология. 2005. Т.39, №4, С. 265-269.

22. Григорьева Л.А. .  Морфофункциональные изменения средней кишки самок клещей рода Ixodes (Acarina: Ixodidae) во время иммунизирующих кормлений// Паразитология. 2006. Т.40, №4, С. 363-370.

23. Григорьева Л.А. Морфофункциональные изменения кишечника нимф Ixodes  ricinus (ACARINA: IXODIDAE) на стадии диапаузы // Паразитология. 2007. Т.41, №1, С. 23-27

24. Григорьева Л.А.,  Амосова Л.И. Морфофункциональные изменения слюнных желез самок иксодовых клещей подсемейств IXODINAE  и AMBLYOMMINAE (ACАRINA:  IXODIDAE) во время питания и их значение // Журнал эвол. биохимии и физиологии. 2008. (в печати).







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.