WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи










ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА


Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов  в процессе онто- и иммуногенеза у животных

16.00.03. – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2009

       Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко»

Научный консультант:  доктор биологических наук, профессор

  Верховский Олег Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Поляков Виктор Филиппович

доктор медицинских наук, профессор

Булычева Татьяна Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Емельяненко Петр Алексеевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита  диссертации состоится _____ __________2009 г. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени  К.И.Скрябина (109472, Москва, ул. Академика  Скрябина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени  К.И.Скрябина.

Автореферат разослан _____  ______________ 2009 г. 

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор  Грязнева Т.Н. 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


       

Актуальность темы. Иммунная система создавалась  в процессе эволюции для распознавания биологических структур, опасных для жизни организма. В основе иммунных реакций лежит межклеточная кооперация трех основных популяций клеток: Т-, В-лимфоцитов и макрофагов.  Эти клетки в различных комбинациях, на разных этапах иммунного ответа включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р.,2008). Принцип их действия основан на существовании рецепторов, которые могут быть связаны с клеткой или секретироваться  в виде антител. Изучение рецепторных свойств  и функций этих клеток предоставляет отличную возможность для оценки молекулярных факторов онто- и иммуногенеза.

В практическом аспекте оценка состояния иммунной системы основывается на количественной характеристике иммунокомпетентных клеток и антител, и является основой контроля эффективности и безопасности вакцин, иммунокорригирующих препаратов, использующихся в ветеринарии  (Дамбаева С.В. и соавт.,2000,  Обухова О.О. и соавт., 2004, Крапивина Е.В. и соавт.,2005, Донник И.М. и соавт.,2005, Крапивина Е.В. и соавт.,2006, Шахов А.Г и соавт,2006,  Дегтярев В.П, 2006).

Следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных изучены недостаточно. В частности,  механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации. Ответы на эти вопросы будут способствовать разработке эффективных и безопасных вакцинных препаратов – основу специфической профилактики болезней животных.

В-, Т-клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами, были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation – символом CD  и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека.  30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF),  при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат  общие структурные элементы и  характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Рабсон А.,2006, Ройт А.,2000, Бурместер Г.-Р,2007 и др.).  IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы обеспечивают иммунную защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток, способствуя многочисленным клеточно-функциональным связям с нервной, эндокринной и другими системами.

Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязывающих белков IgSF большой интерес представляют рецепторы находящиеся на поверхности Т- и НК-клеток (CD2), макрофагов  (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR – антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы, определения эффективности применения вакцин и препаратов, используемых для химиотерапии и иммунопрофилактики (Ющук Н.Д., и соавт.,1994, Макарков А.И. и соавт., 1997, Иллек Я.Ю. и соавт.,2003, Кирюхин А.В. и соавт., 2003,  Добротина Н.А. и соавт.,2005,  Артюхов В.Г и соавт., 2006)

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан  комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения в организме на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Дергачева Т.И. и соавт.,2000, Булычева Т.И. и соавт.,2000, Щеголева Л.С. и Добродеева Л.К.,2003,  Haines D.M. и  West K.H ,2005, Саидов М.З. и соавт.,2006, Высочин И.В. и соавт.,2006). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

       Цель настоящей работы – функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза животных с использованием разноплановых методов оценки Т- и В- систем иммунитета.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие  задачи:

- разработать способы получения препаратов для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, М, А  (IgG, IgM, IgA) в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и  мышей;

-  оптимизировать методы идентификации и количественного определения  субпопуляций Т- лимфоцитов,  В- лимфоцитов и макрофагов с помощью реакции розеткообразования (Е-РО), определения фагоцитарной активности и иммуноцитохимического анализа с использованием моноклональных антител (РИФ и ИПО);

с помощью усовершенствованных методов:

-  изучить функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных клеток (Т- лимфоциты, В-лимфоциты, макрофаги) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза;

-  дать функциональную и рецепторную характеристику IgM крупного рогатого скота, находящегося в растворимой и связанной (sIgМ) формах, в различные периоды онтогенеза; 

- провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.

       Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ 01.01.05 М (МП), 01.02.01 М ГНТП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественно определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», «Разработать методы иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител для оценки иммунного статуса животных и иммунологической эффективности различных биологических препаратов», 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

       Научная новизна.

       Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

       Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота  (Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.90 г.);

-  Разработан способ выделения иммуноглобулина  А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение №2277421 от 5 апреля 2005 г.).

- Разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение №2288008 от 27 ноября 2006 г.)

- Разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток  для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение №2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.

Определены количественные показатели Т- лимфоцитов и макрофагов, а также уровень экспрессии рецепторных белков IgSF на Т- лимфоцитах мышей  в процессе поствакцинального иммуногенеза.

       

       Практическая значимость

       Практическая значимость исследования определяется тем, что систематизированы  экспериментальные данные  о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные научно-методические рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии

На основании результатов проведенных исследований разработаны: 

- «Набор компонентов  для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота  методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ№9388-0039-00008064-96, 1996 г;

- Временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота  методом радиальной иммунодиффузии №13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- Методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные в установленном порядке Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

-  Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол№1);        

- Методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2);

       - Методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом  иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2).

       Получена серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке ЗОЛОТАЯ ОСЕНЬ «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.) и золотая медаль на 10-й  «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.)

       Автор удостоен медали «Лауреат ВВЦ» в  1998 и в 2008 гг. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных.



Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:

- на Всероссийской  научно-практической  конференции, посвященной  30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000 г.;  Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург,  2001 г.; Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина, 2004; научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии», Москва, ВИЭВ, 2005 г.; секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2005 г.,2008 г.; Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов», Москва, 2006 г.;Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко, Москва, 2006 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института,2006 г.; 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS), Гдыня-2006 г., Сан-Себастьян - 2007 г., Эгмонд -2008 г.; Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», Москва, 2008 г.; Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ, 1995-2008 г.; межлабораторном заседании научных сотрудников ВИЭВ, 2009 г.

       Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т- лимфоцитов,  В- лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза; 

-  функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных ILT - клеток  млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях.

       Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ в периодических изданиях, материалах научных конференций и международных форумах (12 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, в том числе монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных»).

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоя­тельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., профессор, член-корр. РАСХН Ю.Н.Федоров, к.б.н. Т.А.Чеботарева, к.в.н. А.И.Жаданов, к.б.н. И.В.Третьякова , к.в.н. М.Н.Борисова. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методи­че­ской помощи научному консультанту д.б.н., профессору О.А.Верховскому,  д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову, за организацию научных исследований д.в.н., профессору В.В.Субботину, научным сотрудникам ВИЭВ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 310 страницах компьютерного  текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 29 таблицами и 55 рисунками, включающими 43 микрофотографии. Список литературы включает  379 источника, из них  206 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

       

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко в период 1985-2008 гг.

В качестве объектов исследования  использованы различные виды животных -  мыши линии BALB/c, гибриды  F1 (BALB/c х DBA/2)  и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, куры, серебряные караси,  карпы.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг)  и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы и периферическая кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка»  и «Биссеровский»  Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о.Лисий. Образцы крови норок и SPF-кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.

Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано  более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.

       При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО Ветзвероцентр).

       IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученых препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови  крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза  в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Изофокусирование белков проводили в системе «Phast System» (Pharmacia, Швеция) по методике, предложенной фирмой. Иммуноблоттинг осуществляли в буферной системе H.Towbin et al (1979).

Рис.1. Общая схема исследований

Гипериммунизацию кроликов породы Шиншилла с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским.

       Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии – РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Кондрахин И.П. и соавт., 1985), теофиллиновом тесте  (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании  (Лебедев К.А. и соавт.,1981).

Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам.        Исследование  механизмов межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в  реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (Горбачева Л.Д. и соавт., 1981).

Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест – ЦТТ (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток – ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию непрямой иммунофлуоресценции – РИФ (Новикова М.С.,1990).

Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми мето­дами с исполь­зованием про­граммы Excel для Windows. Значение крите­рия достоверности оценивали по таблице вероятно­стей Стьюдента-Фи­шера в зависимости от объема анализи­руемого ма­териала. Вероятность различий считалась существенной при р < 0,05.

       

Результаты исследований


Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с ILT- рецепторами

       

       Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные – связанные с мембраной,  ILT- рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей  работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IgG, IgM, IgA и клеток с ILT–рецепторами.

Выделение IgG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота

Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и  молозива крупного рогатого скота является IgG, для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации -глобулинов сыворотки крови и молозива на Sephacryl S-300 и Sepharose 6B были получены препараты IgG с примесями. В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов G  использован другой способ разделения белков – ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка.

При сравнении двух методов выделения  IgG, нами установлено, что использование ионообменной хроматографии является более эффективным для получения данного изотипа иммуноглобулинов крупного рогатого скота. 

       

Разработка способа получения IgА из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота

       Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA  и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной.

       Как видно на иммуноэлектрофореграмме (рис.2)  в сыворотке крови и в молозиве доминирующим иммуноглобулином является IgG, при этом в крови концентрация IgA очень низкая (~ 1,0 мг/мл), а в молозиве – наиболее высокая из всех биологических жидкостей. В носовом секрете количество S-IgA значительно преобладает  над иммуноглобулинами других изотипов и на иммуноэлектрофореграмме не видно других линий, кроме полос преципитации соответствующих IgA. В бронхоальвеолярных смывах также преобладают S-IgА,  концетрация которых не превышает 0,24 мг/мл.

Рис.2. Иммуноэлектрофореграмма различных биологических жидкостей КРС. лунках 1- сыворотка крови, 2- сыворотка молозива, 3 носовой секрет, 4 слезный секрет, 5 бронхо-альвеолярные смывы, 6 иммунохимически чистый sIgA; в траншеях антисыворотка против -глобулинов КРС)

       

       Содержание IgA в слезах достаточно высокое, достигает 2,72 мг/мл, но как видно на иммуноэлектофореграмме в слезной  жидкости присутствуют и другие белковые примеси. Таким образом,  наиболее оптимальной биологической жидкостью для выделения S-IgA служат носовые секреты и сыворотка молозива.

       Для выделения S-IgA сыворотку молозива животных  обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и  этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl). Для выделения S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота носовой секрет в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Тris-HCl буфера рН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR.

       Иммунохимическую чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.

Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них  достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и  IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).

       

Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM рогатого скота

В 1990 г. нами была получена коллекция гибридом, секретирующих МкА к IgМ рогатого скота, открывшая перспективу разработки различных тест-систем на их основе (табл.1).


Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител

Клоны

Изотип

Изоэлектри-

ческая

точка

IgG

IgA

IgM

Тип эпитопа

Пента

мер

Цепи

L

С2

IgG1

6,85

-

-

+

-

-

конформационный

С4

IgG1

7,35

-

-

+

-

-

конформационный

G9

IgG1

7,35

-

-

+

-

-

конформационный

С11

IgG1

7,35

-

-

+

+

-

линейный

В3

IgM

8,45-8,5

-

-

+

+

-

линейный

Как видно из таблицы 1, полученные МкА взаимодействали только с IgM, не реагируя  IgG и IgА. По результатам иммуноболоттинга,  МкА клонов С2, С4 и G9 взаимодействали только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере эпитопов на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами. МкА клонов С11 и В3 взаимодействовали не только с нативной молекулой, но и с тяжелой полипептидной цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА. В результате проведенных исследований были отобраны МкА С2 и G9, взаимодействующие с нативной молекулой IgM и сохранившие титр в РДП 1:32 после лиофилизации.

На основе полученных МкА С2 и G9 приготовлены реагенты для количественного определения уровня IgМ рогатого скота в биологических жидкостях организма животных в РДП и мембранных IgM (sIgM) В-клеток методами РИФ и ИПО.


Выделение  иммуноглобулинов  G1 из сыворотки крови  мышей (Mus. Musculus)

Для проведения иммунологических реакций, таких как иммунодиффузия, иммуноферментное окрашивание клеток или иммунофлуоресценция, необходимо было получить моноспецифические антисыворотки к Ig  мышей.

Исходным материалом для выделения иммуноглобулинов мышей служила сыворотка крови беспородных мышей, которую двукратно осаждали сульфатом аммония 50%  насыщения при 40С в течение 18-20 час. Осадок отделяли центрифугированием при 1000g (45 мин.) и растворяли в физиологическом растворе, после чего проводили диализ в фосфатном буфере. Осажденные -глобулины концентрировали в ПЭГ-40000. Образцы при концентрации белка 10-20 мг/мл  наносили на колонку с Sephacryl S-300.

Для дополнительной очистки полученных элюатов использовали ионообменную хроматографию на  DEAE Sepharose 6B в градиенте NaCl. Иммунохимически чистый IgG1 получали при 0,1 М NaCl. В результате  были получены иммунохимически чистые препараты IgG1 с концентрацией белка 1,6 мг/мл.

С использованием иммунохимически чистых препаратов IgG и IgA крупного рогатого скота и IgG1 мышей были изготовлены моноспецифические антисыворотки, которые использовались в дальнейших исследованиях по определению уровня иммуноглобулинов и количества иммунокомпетентных клеток, несущих на своей поверхности  иммуноглобулины (sIg-клеток)  при различных формах иммунного ответа.


       

Применение различных вариантов реакции розеткообразования для определения функциональной активности иммуноцитов

       Ведущая роль в реакциях приобретенного иммунитета принадлежит лимфоцитам, ответственным за специфическое распознавание патогенных организмов. Взаимоотношения лимфоцитов с антигенами и между собой осуществляется посредством рецепторов клеточной мембраны, которые с помощью соответствующих внутриклеточных молекул трансформируют антигенный сигнал в клеточные реакции.

       Спонтанное розеткообразование (РО) основано на присутствии на мембранах лимфоцитов рецепторов к эритроцитам. У человека это адгезивная молекула CD2, для которой на эритроцитах барана существует соответствующий лиганд CD58 (LFA-3).

       Параллельно с РО изучено наличие CD2-  и CD19- (аналог розеткообразующих клеток с рецептором к третьему компоненту комплемента) молекул на мембране лимфоцитов мышей методом РИФ с использованием МкА к рецепторам CD2 и CD19 мыши (табл.2).

       


Таблица 2. Сравнительная оценка уровня Т- и В-клеток методами розеткообразования и иммунофлуоресценции (M±m)

п/п

Источники

клеток

Е-РОК

CD2-клетки

Коэф.

корр.(r)

ЗС-РОК

CD19-клетки

Коэф.

корр.(r)

Т-клетки

В-клетки

Е-РО

РИФ

Е-РО

/РИФ

Е-РО

РИФ

Е-РО/

РИФ

1

Кровь

21,0±1,7

11,3±0,8

0,5*

11,6±1,2

13,2 ±0,9

0,9

2

Лимфатичес-

кие узлы

54,5±2,2

33,3±1,6

0,97

34,0±1,5

13,5±1,0

0,99

Тимус

26,5±0,8

20,7±1,0

0,67

9,1±0,3

4,5±0,6

0,83

4

Костный мозг

41,1±2,5

44,8±2,1

0,98

14,2±1,4

22,9±1,3

0,97

5

Селезенка

25,2±0,3

10,7±0,9

0,86

22,3±0,4

25,2±1,5

0,87

Примечание. Р<0,01, * - р<0,05, n=100

       

       Как видно из таблицы  2 , содержание иммунокомпетентных клеток с Е-розеткообразующим рецептором выше в крови (21,0%), лимфатических узлах (54,5%) и селезенке (25,2%), чем уровень CD2-клеток (11,3%, 33,3%, 10,7% соответственно). Степень сопряженности между  иммунологическими параметрами Т- и В-клеток, определяемых в РО и РИФ, установлена при высоких значениях коэффициента корреляции.

Оптимизированы методы антигенного розеткообразования (А-РО), теофиллиновый тест, реакция контактного взаимодействия тимоцитов и макрофагов (РКВ) на лабораторных животных, позволяющие изучать  механизмы формирования иммунного ответа на антигены различной природы.


Разработка способа  идентификации В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относятся sIg, специфичные к одному определенному эпитопу антигена.  Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации и плотности распределения sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота у молодых и взрослых животных является перспективным направлением  исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза.  Возможно, что белки IgSF, функционирующие на поверхности мононуклеарных клеток (МНК)  и в циркулирующей крови, образуют своеобразную систему иммунного контроля поверхности не только иммуноцитов, но и клеток нервной и эндокринной систем.

Для изучения локализации sIg клетки и определения количества  В-лимфоцитов был  оптимизирован метод иммунопероксидазного окрашивания (ИПО) клеток с использованием моно- и поликлональных антител к Ig крупного рогатого скота и мышей. Было показано, что высокочувствительный метод ИПО является оптимальным для детального исследования модуляции Ig-рецепторов, функционирующих  как в мембранной (sIg) так и в цитоплазматической (cIg) формах. SIg, cIg  и секретируемые (Ig) белки IgSF,  являются также показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.

При постановке метода ИПО для раcщепления пероксидазы и визуализации реакции применяли 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК). При учете результатов к sIg-МНК относили лимфоциты с окрашенной мембраной, а к cIg-МНК – клетки с окрашенной цитоплазмой.

При апробации разработанного метода на мышах и анализе полученных результатов было установлено, что относительное содержание окрашенных клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - сIgМ, 27,5% - cIgG и 20,5% - сIgА, 10,3% лимфоцитов содержали sIgM-рецепторы. Эти данные подтвердили известный тезис о том, что костный мозг не только  поставляет клетки-предшественники различных популяций лимфоцитов, но и одновременно является местом синтеза антител.

В тимусе  обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% МНК с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано  7,5% МНК с sIgM, 7,1% -  sIgG и 6,3% - сIgА. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых  выявлены IgG-рецепторы, являются В-клетками памяти.

В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с IgG. Показано, что  IgG распределялся в клетках лимфатических узлов  следующим образом 5,0% - «ринг» - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3%- «петч» - неравномерное распределение окраски, 5,2% - «кэп» - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - «петч +эндоцитоз» - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм иммуноглобулиновых рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. До 70% фолликулов лимфатического узла  содержат зародышевые центры, состоящие, в основном, из пролиферирующих В-лимфоцитов, а на МНК преобладают IgG-рецепторы.

В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% МНК с sIgМ; 2,6% - sIgG; 3,8% - сIgА. Следует отметить, что IgA тимоцитов, спленоцитов, лимфоцитов костного мозга и лимфоидной ткани  кишечника обнаружены только в цитоплазматической форме. Таким образом, согласно полученным результатам, уровень IgA-В-лимфоцитов превышает (3,8%) количество IgG-клеток (2,6%), что согласуется с данными о том, что основными клетками, синтезирующими IgA, являются В-лимфоциты кишечника  (Conley M.E., 1987, Першин Б.Б. и соавт., 2001).

Больше всего В-лимфоцитов находится в  костном мозге и лимфатических узлах. При этом, у мышей в клетках  костного мозга преобладают cIg, что подтверждает его важную роль в синтезе антител. 

В иммунных реакциях большое значение имеет функциональное состояние фагоцитов, в частности макрофагов. В крово- и лимфотоке постоянно циркулируют антитела, проникающие через стенку сосудов проходят в различные полости организма и взаимодействующие с клетками. Нами установлено, что на перитонеальных макрофагах мыши, полученных методом адгезии на пластике и тщательно отмытых от экзогенных иммуноглобулинов, присутствуют Fc-рецепторы как к IgG  - 25,0%, так и к  IgM – 23,0% и к IgA – 21,0%.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод, который впоследствии  был использован для определения поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота. 

Динамика  ILT рецепторных клеток мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза

В ходе превращения стволовых клеток в лимфоциты, последние приобретают поверхностные антигены  CD, которые отличают их от других клеток. Клетки-предшественники лимфоцитов  проходят несколько стадий деления и созревания, взаимодействуя со своим микроокружением с помощью поверхностных гликопротеинов, участвующими в передаче сигнала. Активация Т-клеток возможна как по классическому (CD3-зависимому), так и альтернативному (CD2-зависимому) пути. Блокада CD-2-зависимого способа активации приводит к нарушению иммунных процессов (Талаев В.Ю., 1999). Поэтому уровень экспрессии данных ILT- рецепторов является функционально значимым в механизме формирования иммунного ответа. 


Динамика адгезивной активности лимфоцитов в процессе иммуногенеза (in vivo и  in vitro)

Иммунный ответ при вакцинации имеет ряд особенностей, определяемых спектром воздействия вакцины - стимулирующим или супрессирующим.  Учитывая, что иммуногенез начинается с активации клеток, а именно со структурных изменений их мембран, представляет интерес определение модуляции адгезивных молекул иммунокомпетентных клеток в процессах первичного и вторичного иммунного ответа.

Известно, что при кратковременной инкубации  лимфоцитов с антигеном, к которому сенсибилизированы данные лимфоциты,  происходит увеличение или уменьшение количества розеткообразующих клеток и, соответственно, изменяется число поверхностных  рецепторов лимфоцитов. В нашей работе метод стимуляции лимфоцитов in vitro (антигенное розеткообразование)  был использован для оценки динамики уровня розеткообразующих рецепторов лимфоцитов и макрофагов под действием вакцины в процессе иммуногенеза и  определения индекса сдвига, показывающего  активность иммунокомпетентных клеток.

Опытной группе белых мышей вводили подкожно по 0,2 см3 производственной вакцины против рожи свиней (Erysipelothrix rhusiopathiae) из штамма ВР (VR)-2 , контрольной - 0,2 мл физиологического раствора. Одну часть мононуклеарных клеток, полученных от этих групп мышей, инкубировали с вакциной, вторую –  с физиологическим  раствором в течение 30 мин. при t 37оС.  На 2, 7, 14  и  20 сутки после иммунизации проводили  количественное определение розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов, индекса стимуляции (ИС), характеризующих влияние вакцины на активность МНК тимуса и селезенки  мышей.

Результаты опыта  показали, что введение вакцины обуславливает  повышение количества Т- и В-клеток  в тимусе и  селезенке на протяжении всего срока исследования (табл.3).

Таблица 3. Процентное содержание Т- и В- лимфоцитов у мышей в процессе поствакцинального иммунного ответа (n=100)

Показатели

Сутки иммунного ответа

0

2

7

14

20

Тимоциты, %:

опыт.группа

контроль

7,0±0,2

15,0±0,32

66,5±1,2*.**

30,0±0,9*

49,5±1,0*.**

19,5±0,2

59,0±1,4*.**

37,0±1,0*

20,0±0,8

55,0±1,3*

В-спленоциты, %:

опыт.группа

контроль

8,7±0,1

8,0±0,2

60,0±2,0*.*

32,0±1,2*

30,0±1,8*.**

9,0±0,5

16,0±1,0*

12,0±0,35

10,0±0,3

31,0±0,8*

Примечание.  *.**  p< 0,05: * - по сравнению с контролем, ** -  между показателями с антигеном и без антигена. 

       Как видно из представленных в табл.3 данных, на 2, 7 и  14 сутки после иммунизации розеткообразующая активность лимфоцитов возрастает с 30,0% до 66,6% после инкубации с вакциной.  На 20 сутки - инкубация лимфоцитов с вакциной не стимулирует розеткообразование, а наоборот, приводит к его угнетению (с антигеном 20,0%, без антигена – 55,0%). 

Лимфоциты мышей контрольной группы не были активированы и  короткая инкубация с антигеном in vitro не привела к изменению уровня Т- и В-лимфоцитов (ИС=1,0). Как видно из табл. 4, функциональная активность иммуноцитов наиболее выражена на 7 сутки иммунного ответа (ИС=3,3-1,9),  а наименее – на 20-е (ИС < 1,0). 

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует о том, что иммуномодулирующее влияние  вакцины in vitro на активированные  лимфоциты выражается  в изменении количества рецепторов на поверхности Т- и В-клеток. При этом показано, что 30-минутного воздействия вакцины  на интактные лимфоциты недостаточно для изменения количества CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту системы комплемента на поверхности клеток (ИС=1,0). Аналогичная обработка лимфоцитов, иммунизированных животных, существенно увеличивало количество розеткообразующих лимфоцитов (ИС>1,0). Полученные показатели индекса стимуляции,  позволяют характеризовать влияние вакцины на лимфоциты, так величина ИС>1,0 свидетельствует о иммуностимуляции, а значение ИС< 1,0 – о снижении показателей иммунного ответа.

Таблица 4. Динамика показателей индекса стимуляции (ИС) в нагрузочном тесте с  вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Показатели

Сутки иммунного ответа

0

2

7

14

20

Тимоциты

0,4±0,02

2,2±0,2*

2,5±0,2*

1,6±0,3*

0,4±0,02

Т-клетки

селезенки

1,0±0,03

1,2±0,2

1,9±0,3*

1,5±0,1*

0,7±0,03

В-клетки

селезенки

1,0±0,03

1,9±0,3

3,3±0,5*

1,3±0,1

0,3±0,01

Примечание.  * - p< 0,05, n=100.

Таким образом, вакцина, используемая в данном эксперименте, способна модулировать экспрессию CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту системы комплемента. Этим подтверждается важная роль CD2-рецепторов Т-лимфоцитов в клеточном иммуногенезе, как в качестве адгезивных молекул, так и молекул альтернативной активации Т-клеток.

По результатам эксперимента установлена положительная корреляция между количеством розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов (r=0,84), а также количеством В- и Т-клеток селезенки (r=0,89). Высокие значения коэффициентов корреляции характеризуют сильную степень сопряженности между иммунологическими параметрами, что подтверждает существование межклеточной кооперации основных популяций лимфоцитов в процессе иммуногенеза. Параллельно показано, что наличие сильных корреляционных взаимосвязей свидетельствует об активации иммунной системы на фоне вакцинации.


Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК).

С целью изучения взаимосвязи между розеткообразующей активностью  Т-лимфоцитов и функциональной способностью  АПК взаимодействовать с тимоцитами, использованы два варианта реакции розеткообразования – лимфоцитов с эритроцитами барана и тимоцитов с макрофагами (реакция контактного взаимодействия макрофагов (РКВ). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериального и вирусной этиологии. В процессе иммунного ответа проводили исследования изменений адгезивных свойств перитонеальных макрофагов  и рецепторной активности Т-клеток лимфоидных органов у беспородных и линии BALB/c мышей. Определяя количество эритроцитов барана (ЭБ) на поверхности клетки, лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные -многорецепторные и неполные, малорецепторные. Клетку считали малорецепторной (мРОК), если она присоединила от 1 до 3 ЭБ, а если 6 - 9 ЭБ - многорецепторной (МРОК). Также определяли количество высокоаффинных Т-клеток и их корреляцию с показателями функциональной активности антигенпрезентирующих клеток (макрофаги) в процессе поствакцинального иммунного ответа.

Таблица 5. Показатели реакции контактного взаимодействия  в процессе  поствакцинального иммунного ответа

Группы

животных

Сутки иммунного ответа

0

1

2

3

7

10

14

21

1

(Т/ПМ)

26,0±

0,5

52,0±

0,7

70,3±

1,0

200,7±

12,0

21,0±

0,3

40,1±

0,4

21,0±

0,8

20,0±

0,7

2

(Т/ПМ)

30,5±

0,9

34,8±

0,32

212,3±

30,4

70,7±

0,91

56,1±

0,3

260,3±

35,9

125,5±

15,8

26,2±

0,4

Примечание. p< 0,05, n=100, Т/ПМ - число  адгезированных тимоцитов на поверхности 100 макрофагов. 1 группа – животные, иммунизированные ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, 2 группа – животные, иммунизированные производственной вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Результаты исследований показали, что адгезивная активность перитонеальных макрофагов зарегистрирована на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-е сутки после введения вирусных антигенов (табл.5).

По-видимому, этот процесс обусловлен различными  путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов в макрофагах.

Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул  МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в  первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2 сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдается резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, сопровождающейся морфологическими и биохимическими изменениями клеток (рис.3).

Рис.3. Реакция контактного взаимодействия перитонеальных макрофагов с тимоцитами (х600)

В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10–14 сутки) обусловлен  выполнением макрофагами роли эффекторных клеток. 

В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено  значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75% , контроль – 15%), число которых  на 2 сутки снижается вдвое. На 7 сутки поствакцинального иммунного ответа их уровень возрастает  в лимфатических узлах (50,2%, контроль – 11%) и тимусе (60,0%, контроль – 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных CD2-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций иммуноцитов. В тимусе  высокий уровень экспрессии CD2-рецепторов сохраняется до 14 суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).

Таким образом, на изменения клеточной поверхности макрофагов лабораторных мышей вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии CD2-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала внутрь Т-лимфоцита. Возрастание CD2-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.

В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на вирусную вакцину сопровождается увеличением экспрессии CD2-рецепторов на Т-клетках  только в костном мозге на 14 сутки после иммунизации. Это подтверждает  различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены.

Рис.4. Динамика содержания высокоаффинных Т-клеток в лимфоидных органах мышей после иммунизации вакциной против рожи свиней.

Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов в этот период была на уровне контроля. И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-е – вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами в функционировании иммунной системы.

В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что начальная фаза иммунного ответа  характеризуется умеренной экспрессией CD2-рецептора во всех лимфоидных органах, кроме костного мозга, тогда как завершившие стадию дифференцировки иммунные лимфоциты  отличались наличием на поверхности значительного количества CD2-молекул, что, по-видимому, связано с процессом стабилизации межклеточных взаимодействий (рис.4).

В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь между показателями Т-клеток в тимусе и крови (r=0,62). Сопряженность между данными параметрами объясняется поступлением части активированных тимоцитов в циркуляцию и перемещением их во вторичные лимфоидные органы.

Значительное повышение уровня высокоаффинных Т-клеток  в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на  контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. Прямая корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (r=0,65) свидетельствует о межклеточной кооперации Т-лимфоцитов этих органов в иммуногенезе. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии CD2-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифических лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию.

Можно предположить, что отрицательная корреляция  показателей адгезивной активности спленоцитов и макрофагов (r= -0,64), объясняется различными функциями регуляторных и эффекторных пулов иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа.

Таким образом, адгезивные свойства мембран иммуноцитов играет важную роль в формировании адекватного иммунного ответа. Известно, что именно система контроля над рецепторной активностью клеток в процессе эволюции, преобразовалась в систему иммунологического надзора, а именно в иммунную систему млекопитающих.

Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа


       Развитие и созревание В-лимфоцитов зависит от экспрессии пре-BCR (рецептор В-клеток для антигена), сформированного из молекул IgSF – sIgM и CD79, а также IL-7R  при отсутствии которых снижается количество периферических В-клеток. Для выбора наиболее адекватного метода определения sIg-клеток животных были изучены различные реакции идентификации. Наряду с методами ИПО и РИФ, для идентификации поверхностных рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест.

Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней в дозе 0,2 см3  двукратно с интервалом 30 суток. Контрольным животным вводили 0,2 см3 физиологического раствора. Процентное  содержание В-лимфоцитов определяли в селезенке в различные  сроки первичного и вторичного иммунного ответа (рис.5).

Как видно из данных на рис. 5, при первичном иммунном ответе увеличение процентного содержания В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль – 12,0%) , и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии sIg на клетках. Помимо количественного определения В- лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию IgG1 - основного изотипа иммуноглобулинов (рис.6).

В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток (рис.5) и уровень IgG1 (рис.6), тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.

В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются Ig-негативными. На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Этим подтверждается изменения количества В-клеток с sIg в процессе вакцинации.  Реакция в зародышевом центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные результаты динамики sIg-клеток методом ЦТТ подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки в иммуногенезе.

  Корреляционный анализ показателей ILT-рецепторных клеток при введении иммунотропных препаратов

       

Известно, что иммунотропные препараты широко используются  для профилактики вторичных иммунодефицитных состояний животных. В соответствии с задачами нашей работы, дальнейшим этапом исследований был анализ модификации мембранных структур иммуноцитов и определение корреляционной взаимосвязи показателей ILT-рецепторных клеток под воздействием препаратов, наиболее широко используемых в ветеринарии в качестве иммуномодуляторов.

В экспериментах использованы мыши линии BALB/c, F1 (BALB/c x DBA/2) и б\п белые мыши массой 16-18 г. Животным  вводили однократно, подкожно следующие препараты: 1 группе – селенопиран (0,1 см3), 2  –  риботан (0,2 см3), 3 – нуклеинат натрия (0,2 см3), 4 – физиологический раствор (0,2 см3). Определение  иммунологических показателей проводили на 1-е и 7-е сутки после инъекции препаратов (табл.6).

Таблица 6. Влияние иммунотропных препаратов на показатели клеточного иммунитета 

Показатели

Срок исследования (сутки)

1

7

1

7

1

7

Контроль

Селенопиран

Риботан

Нуклеинат Na

Т-клетки крови

%

19,8±

1,2

23,7±

0,7*

34,0±

0,7*

59,0±

1,2*

71,6±

2,0*

63,0±

1,6*

10,0±0,7

Т-клетки лимф.

узлов, %

15,3±

0,9

25,5±

0,7*

18,0±

0,9

40,5±

2,0*

53,5±

1,6*

50,0±

1,7*

10,5±0,2

Т-клетки тимуса

%

21,8±

0,7

17,3±

1,2

22,0±

0,9

43,5±

1,5*

42,7±

1,2*

67,0±

1,9*

26,5±0,8

Фаг.активность

ПМ %

10,4±

1,0

12,8±

0,9

24,4±

0,8*

36,9±

1,0*

20,0±

0,6*

10,5±

0,07

9,2±0,3

Фаг. индекс

2,5±

0,04

3,7±

0,04

7,3±

0,2*

6,6±

0,05*

4,0±

0,07

4,2±

0,1

3,2±0,06

Лейкоциты

тыс./мкл

3,2±

0,02

3,9±

0,3

4,5±

0,4

5,2±

0,07

5,7±

0,1

5,6±

0,03

4,2±0,05

Лимфоциты

%

60,6±

1,6

44,9±

1,5

34,1±

1,2

71,7±

1,9

41,0±

1,6

58,6±

1,9

49,0±0,7

Нейтрофилы

%

21,6±

0,9

50,7±

1,8

54,8±

0,9

23,6±

0,7

40,6±

1,4

34,2±

1,4

41,2±0,4

Моноциты

%

7,0±

0,8

4,1±

0,7

10,1±

0,5

4,5±

0,3

18,0±

0,7*

10,0±

0,2

9,6±0,1

Примечание:  p< 0,05: * - по сравнению с контролем

С целью характеристики межклеточной кооперации лимфоцитов и определения  корреляционной взаимосвязи между  иммунологическими показателями  на фоне введения иммунотропных препаратов, были установлены коэффициенты корреляции между иммунологическими показателями. Так при введении селенопирана и нуклеината натрия корреляционная взаимосвязь между числом Т-клеток крови и тимуса, тимуса и селезенки отсутствует, а между количеством Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов - имеет положительное значение (r=1,0). На высоком уровне значимости (р<0,01) наблюдалась корреляционная зависимость между розеткообразующей активностью клеток крови, тимуса и лимфатических узлов на фоне  введения  риботана (r=0,98).

Из результатов эксперимента следует, что степень сопряженности между исследуемыми иммунологическими показателями при введении иммунокорректоров различна.  Однако во всех группах постоянно сохранялась прямая корреляция показателей Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов (r=0,89), абсолютного числа розеткообразующих лимфоцитов крови и лейкоцитов (r=0,95), содержания лимфоцитов и Т-клеток тимуса (r=0,9). Одновременно наблюдалась сильная обратная корреляционная взаимосвязь  между содержанием лимфоцитов и нейтрофилов (r=-0,9), абсолютным числом лейкоцитов и моноцитов (r=-0,88),  уровнем розеткообразующих тимоцитов и количеством нейтрофилов (r=-0,9), между содержанием моноцитов и уровнем Т-клеток периферической крови.

Таким образом, можно считать, что применение иммунотропных препаратов сопровождается образованием функциональных связей между степенью розеткообразующей активности ILT-рецепторных клеток крови и лимфатических узлов и количественным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов.

Наши данные согласуются с результатами, полученными Михайленко А.А. и соавт.(2002), по корреляционному анализу и установлению корреляционных констант иммунной системы. На основании проведенных исследований, мы предлагаем диагностический алгоритм при оценке эффективности иммунотропных препаратов, включающий следующие показатели:

  1. Положительная корреляция между розеткообразующей активностью клеток периферической крови и лимфатических узлов ( > 0,7);
  2. Положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов;
  3. Отрицательная корреляция между показателями количества нейтрофилов и Т-клеток  тимуса (> –0,7)

Разработанная схема позволяет определить уровень корреляционной связи по трем соотношениям, которые показывают адекватную реакцию иммунной системы на вводимые препараты.

Параллельно с определением показателей клеточного иммунитета,  методами РДП и РИД, определяли содержание иммуноглобулинов в крови и надосадочной жидкости суспензий клеток тимуса, селезенки и лимфатических узлов. Результаты исследований показали, что иммунотропные препараты риботан и селенопиран стимулировали синтез IgG1 и IgG2a. При этом концентрация IgG1 в надосадочной жидкости суспензии клеток селезенки на 7 сутки после их применения составила 2,0 и 2,3 мг/мл (в контроле – 1,6 мг/мл).

Таким образом, в результате проведенных исследований,  установлено, что при введении иммуномодуляторов изменяется розеткообразующая активность  Т-клеток; сопровождающаяся антителогенезом, что подтверждает активацию всех звеньев иммунной системы.


  Характеристика растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза

В онтогенезе дифференцировка в зрелые Т- и В-клетки сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия cIgM на поверхности клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезе.  Модуляция  количества sIg или  блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно sIg связывают антиген на поверхности В-лимфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам.

Нами были изучены формы локализации sIg на поверхности В-клеток  в периферической крови у телят и взрослых животных  в рамках исследования механизмов клеточной активации и анергии в процессе онто- и иммуногенеза.  Количество sIgM-лимфоцитов определяли методами ИПО и РИФ; уровень IgM, IgG, IgA – в РИД. В исследованиях использованы МкА и поликлональные антитела к Ig крупного рогатого скота,  полученные на первом этапе исследований.

  Формы локализации  рецепторов sIgM- лимфоцитов  в периферической крови  коров

В опытах использовали периферическую кровь крупного рогатого скота черно-пестрой породы в возрасте 4-5 лет. Иммунопероксидазное окрашивание клеток позволило определить количество sIgM-клеток, изучить модуляцию рецепторного аппарата в процессе  дифференцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку. Различные формы распределения sIg на поверхности В-клетки продемонстрированы на рис.7.

Известно, что sIgM присутствует на мембране практически всех субпопуляций В-клеток, но с различной плотностью, играющей важную роль в дифференциации клеток (Сидорова Е.В.,2006).  Так негативная и позитивная селекция В-лимфоцитов зависят от плотности антигенных рецепторов на клеточной поверхности. Связывание рецептора с его лигандом сопровождается не только изменением конфигурации рецептора, но и его движением в мембране клетки. На поверхности клетки в результате этого рецепторы могут собираться в форме «петч» (неравномерное распределение sIg по периметру клетки) и «кэп» (скопление sIg на одном из полюсов клетки) с последующим погружением их в цитоплазму – эндоцитоз (рис.7б).

Подобно другим поверхностным белкам, sIg свободно перемещаются в билипидном слое плазматической мембраны клетки и при образовании комплекса с  антигеном концентрируются на одном из полюсов клетки («кэппинг»- эффект рис.7-а,б). Виноградова Т.В. и др.(1995) отмечали, что основной формой расположения sIg на поверхности В-лимфоцита человека является «петч»/эндоцитоз (65%).

а  б


 

в  г




Рис. 7. Различные формы распределения поверхностных иммуноглобулинов по периферии В-лимфоцитов. а,б   «кэп», эндоцитоз, в «петч», г «шеддинг»

В результате проведенных исследований нами установлено, что  В-клетки в периферической крови коров с окрашенной мембраной  в форме «петч»/эндоцитоз составляют  68,9±3,9%, «петч» - 15,0±3,3% (рис.7-в), «ринг» (равномерное распределение sIg по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» - 5,6±1,9%.

Исследование форм локализации sIg представляет теоретический и практический интерес, поскольку под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов,  изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о  способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита (Артюхов В.Г.и др.,2006; Новиков В.В., 2007).

Образование «кэпов» на мембране лимфоцита способствует оптимальному концентрированию иммунных комплексов на одном из полюсов клетки для образования кластеров, подвергающихся эндоцитозу.

Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. sIg взаимодействуя с антигеном,  посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент, где он подвергается деградации.

Помимо механизма поглощения лигандосвязанных рецепторов показан феномен сбрасывания рецепторов (шеддинг) (рис.7-г). Кластеры, состоящие из агрегированных  комплексов антиген/sIg на одном из полюсов клетки, отделяются от  поверхности клетки в окружающую среду. Процессы эндоцитоза и «шеддинга» являются неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки. 

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о присутствии в периферической крови крупного рогатого скота В-клеток с различной локализацией поверхностных иммуноглобулинов. Основной формой распределения sIg на мембране В-лимфоцита является  «петч»/эндоцитоз.


  SIgM-клетки и IgM-антитела  в развитии иммунной системы у телят


Важной задачей наших исследований является разработка специфичного метода для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота и изучения механизма дифференцировки лимфоцитов из общей лимфоидной клетки-предшественницы, поскольку первыми Ig, появляющимися в цитоплазме В-клетки, являются тяжелые цепи IgM (-цепи).

В эксперименте использовали периферическую кровь телят (n=15). Для постановки метода ИПО к взвеси лимфоцитов (1-2х106 кл/мл)  добавляли 1-3% раствор лимонной кислоты, отмывали пять раз в 0,2 М фосфатно-cолевом буфере (PBS)  рН 7,2 и инкубировали с 10-15% сывороткой крови лошади в RPMI-1640 в течение 60 мин. при 220С. Повторно отмывали  в РВS. Затем 20 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло, высушивали, фиксировали (ацетон : этанол) и добавляли раствор МкА к IgМ рогатого скота в рабочем разведении.

Рис.8. sIgM-клетки периферической крови телят, окрашенные иммунопероксидазным методом900)

Далее клетки отмывали 3 раза в РВS, высушивали и наносили антитела к Ig мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (НПЦ «МедБиоСпектр). После отмывки и инкубации клетки на предметных стеклах обрабатывали AEC, промывали и высушивали. Клетки, специфически окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами (рис.8).

При микроскопическом исследовании препаратов установлено, что  клетки периферической крови телят, экспрессирующие sIgM, составляют  19,2%. Кроме того, в результате иммуноцитохимического анализа в крови обнаружены  сIgM- клетки, которые не окрашиваются по периметру из-за отсутствия sIg (рис.9).  Такие клетки могут быть пре-В-клетками  с цитоплазматическими -цепями или плазматическими клетками, секретирующими IgМ.

       

Рис.9. cIgM-клетки (цитоплазматическая форма) периферической крови крупного рогатого скота900)

Таким образом, установлено, что в периферической крови телят присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки. Основные показатели, характеризующие sIgM-клетки и IgM-антитела (секретируемая форма IgM) В-системы иммунитета телят приведены в табл.7.


Таблица 7. Показатели В-системы иммунитета  у  телят

В-лимфоциты

(%)*

sIgM-клетки

(%)**

Концентрация

IgM (мг/мл) ***

Индекс IgM/В-клетки

M±m,

n=15

12,0±0,5

19,2±0,8

0,92±0,03

0,065±0,01

Примечание:  p<0,05, * - ЗС-РОК – CD19; **- ИПО; *** - РИД

Для  повышения информативности иммунологических исследований в таб.5 приведен индексный показатель гуморальной системы телят по  соотношению уровня IgM к количеству В-клеток. Согласно концепции Петрова Р.В. и соавт. (1995), постулирующей о взаимосвязи всех компонентов иммунной системы и изменение сбалансированности отдельных ее звеньев в условиях патологии, индексные показатели более адекватно отражают нарушения в иммунитете и повышают диагностическую значимость  иммунологического мониторинга.

       

Динамика  Ig и ILT-рецепторных клеток  у стельных коров

Одной из важнейших проблем ветеринарной науки и практики является проблема профилактики бесплодия и получение жизнеспособного молодняка. Успешное ее решение основано на знании механизмов регуляции репродуктивной функции  материнского организма в период плодоношения. Известно, что иммунная система организма во время беременности вместе с нервной и эндокринной системами определяет нормальное развитие плода и рождение здоровых телят. Поэтому оценка показателей иммунного статуса и изучение количественной динамики параметров иммунной системы стельных коров представляет значительный интерес как для характеристики взаимодействия между плацентой и иммунной системой, так и для разработки практических приемов коррекции воспроизводительной функции животных.        

Опыт проводили на двух группах коров, изначально подобранных по принципу аналогов (n=20). Первая группа включала коров  со сроком стельности 3-4 месяца, вторая – нестельных коров. Началом беременности у коров считали день последнего осеменения. Иммунологические исследования  проводили двукратно с интервалом 2 месяца.

Поскольку в наших исследованиях на лабораторных животных установлено,  что количество розеткообразующих клеток коррелирует с количеством CD2-лимфоцитов, определенных методом РИФ, на высоком уровне значимости (р<0,01), то на этом основании для количественного определения Т-клеток был использован метод розеткообразования (рис.10).

Рис.10. Т-клетки периферической крови крупного рогатого скот, реакция розеткообразования (х900)

Количество В-клеток определяли в РИФ. При постанове реакции 100 мкл взвеси МНК (0,5х106кл/см3) периферической крови обрабатывали 1,0%-3,0% раствором лимонной кислоты, затем центрифугировали в РВS и инкубировали в блокирующем растворе. После отмывки клетки помещали на предметное стекло, высушивали  и  фиксировали в растворе ацетона с метиловым спиртом.

Рис.11. IgM-клетки периферической крови крупного рогатого скота, реакция иммунофлуоресценции600)

Далее к фиксированным клеткам добавляли МкА к IgM рогатого скота (1:100). В качестве контроля на предметные стекла вместо МкА вносили 1%-ный раствор БСА. Клетки инкубировали, отмывали в PBS и добавляли  FITC-конъюгат (НПЦ «МедБиоСпектр»).  После инкубации и отмывки препараты просматривали под микроскопом (х600), используя 50% раствор глицерина в качестве иммерсионной среды. Учитывали светящиеся клетки в течение 24 часов после постановки реакции (рис.11).

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом РИД.

Результаты комплексных исследований приведены в табл.8.

       

Таблица 8. Динамика иммунологических показателей у стельных коров

Показатели

Группы животных

1

2

Контроль - 1

Контроль - 2

Т-клетки,%

абс.(х109/л)

32,6±1,1

1,7±0,1

42,8±2,5

2,8±0,3

28,6±2,1

1,8±0,09

31,0±3,2

1,6±0,05

В-лимфоциты,%

абс.(х109/л)

26,8±4,5

1,0±0,2

29,2±1,9

1,5±0,3

25,3±2,6

0,97±0,5

26,2±2,0

1,0±0,7

IgM  мг/мл

2,3±0,4

3,5±0,5

2,3±0,1

3,1±0,4

IgGмг/мл

21,6±1,0

26,0±1,6

19,7±2,2

20,7±3,3

IgAмг/мл

0,75±0,3

0,8±0,2

1,0±0,5

1,3±0,6

Примечание. p< 0,05. 1 – группа коров со сроком стельности 3-4 мес., 2  - группа  коров со сроком стельности 5-6 мес. Контроль 1 и 2 – средние показатели  нестельных коров с интервалом 2 мес.

Системные изменения иммунитета при стельности, в первую очередь, зависят от продукции гормонов и от иммунорегуляторного влияния плаценты.  При десмохориальном типе плаценты,  с  увеличением срока стельности у коров,  эпителий ворсин и крипт слущивается,  кровеносная система плода отделена от сосудов матери только соединительной тканью, что сказывается на функционировании плацентарного барьера. Благодаря такому строению, плацента коров не пропускает через клеточные слои из крови матери молекулы Ig, которые передаются теленку постнатально с молозивом.

Анализ данных, приведенных  в табл.6, свидетельствует о том, что в крови коров в период с 3-4 мес. до 5-6 мес. стельности увеличивается уровень IgG, которые путем транссудации поступают в молочную железу и постнатально с молозивом передаются теленку. В передаче IgG  из крови в молочную железу особая роль принадлежит Fcγ-рецепторам на поверхности эпителиальных клеток, а трансэпителиальный переход IgG  в молочную железу  достигает максимального значения за 2-3 недели до отела. В эти же сроки у стельных коров повысилось как относительное,  так и абсолютное количество Е-РОК в периферической крови. Данная тенденция наблюдалась также в контрольной группе, но была менее  выражена. Одновременно зарегистрировано незначительное повышение относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов, по-видимому, связанное с увеличением содержания иммуноглобулинов в периферической крови стельных коров.

Иммунная толерантность при беременности обусловлена  продукцией блокирующих антител, вызывающих модуляцию иммунного ответа. Клеточные рецепторы для IgG – FcR, экспрессируют макрофаги, НК-клетки, некоторые Т-клетки и нейтрофилы. Мономерный IgG связываясь с Fc-рецепторами  иммунокомпетентных клеток может изменять их биологическую активность. Возможно, что увеличение в крови стельных коров концентрации IgG обусловлено выполнением им функции антител, участвующих в супрессии иммунного ответа  на антигены плода.

Необходимо отметить, что в оценке функциональных возможностей иммунной системы играют важную роль корреляционные взаимосвязи.  Положительная корреляция уровня ранних (IgM) и поздних  (IgG) иммуноглобулинов, является критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей,  как в норме, так и при различных физиологических состояниях, в том числе при беременности (табл.9).

Таблица 9. Корреляция иммунологических показателей у коров

Показатели

Стельность

3-4 мес.

Стельность

5-6 мес.

Контроль

Т-клетки/В-клетки

0,64

0,84

0,5

IgG/IgM

0,27

0,73

0,3

IgM/IgA

0,25

0,56

0,4

IgG/IgA

0,3

0,71

0,47

Примечание. р<0,01 при сравнении показателей стельных коров

Из представленных в табл.9 данных видно, что корреляционные взаимосвязи между различными изотипами Ig в сыворотке крови контрольных животных  являются слабо положительными. Низкая степень сопряженности между  показателями IgG и IgA косвенно подтверждает относительную независимость системного и местного иммунитета. Дальнейшее повышение степени сопряженности между показателями иммунной системы в 5-6 мес. стельности подтверждает усиление рецепторной активности Т- и В-клеток у стельных коров по сравнению с контрольной группой. 

Таким образом, смена слабой корреляционной взаимосвязи на сильную свидетельствует о возрастании функциональной активности иммунокомпетентных клеток и, соответственно, активизации клеточных и гуморальных звеньев иммунной системы в период плодоношения.

Функциональные свойства иммунокомпетентных ILT-рецепторных клеток  у различных видов животных

       

Эволюционное развитие IgSF-рецепторов началось с возникновения шаперонов бактериальных клеток, имеющих Ig-fold (складчатое) строение, Thy-1  и Р0 - молекул прокариот и одноклеточных эукариот. Многие из этих белков представляют собой различные полимеры, в которых гомологичные Ig-структуры разных цепей взаимодействуют между собой. Каждая такая структура кодируется отдельным экзоном. По-видимому, данное семейство генов ведет свое происхождение от гена, кодирующего одну гомологичную структуру, похожую на Thy-1 или 2-микроглобулин. Новые члены семейства возникали путем дупликаций экзонов, генов и генных сегментов, кодирующих иммуноглобулиновые молекулы. 

       В состав IgSF также входят  однодоменные белки тимоцитов и Т-клеток (Thy-1), белок миелина Р0, 2-микроглобулин, адгезивный белок губок, тирозин-киназный рецептор дрозофилы (DTRK), рецептор кортикальных тимоцитов лягушки и человека и др. Эти молекулы обеспечивали межклеточную адгезию посредством гомофильного взаимодействия (Галактионов В.Г.,2004).В процессе эволюции многоклеточных произошел переход от гомофильного межклеточного взаимодействия к более совершенному гетерофильному взаимодействию для распознавания чужеродных агентов. Контактное взаимодействие иммунокомпетентных клеток посредством рецепторов является первым этапом в осуществлении антигенспецифических реакций. Кооперация  клеток друг с другом определяется «адгезивным кодом», то есть  определенным для каждой клетки набором мембранных белков. Определение этих белков для каждого клона лейкоцитов позволит понять механизмы ранней дифференцировки, филогенетической связи макрофагов, Т- и В-клеток в процессе становления иммунной системы. sIg-молекулы клеток являются чувствительной системой, реагирующей на изменения в макро- и микроокружении организма. В результате изучения и осмысления механизмов их многообразия и модуляции, возможно создание  эффективных и безопасных препаратов против постоянно изменяющих свои поверхностные антигены патогенных микроорганизмов.


Определение ILT-рецепторных клеток  у различных видов животных

Заключительным этапом исследований было определение ILT-рецепторных клеток  у различных видов животных с помощью метода спонтанного розеткообразования и нагрузочного теста с теофиллином. Теофиллиновый тест использован для оценки состояния цитоплазматических мембран иммунокомпетентных В- и Т- клеток, характеризующихся  колебанием уровня внутриклеточного цитоплазматического АМФ,  связанного с экспрессией CD2-рецептора. Для определения специфичности эритроцитов барана к мононуклеарным клеткам нами использованы клетки периферической крови млекопитающих, птиц и рыб (табл.10).

       Изучая феномен розеткообразования у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы – костистые рыбы, птицы, млекопитающие, было показано, что их лимфоциты обладают рецепторами к эритроцитам барана. Несмотря на то, что у этих видов животных структура иммунной системы различна, основные клеточные и молекулярные компоненты врожденного иммунитета достаточно консервативны.

Таблица 10. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов в крови  здоровых животных (M±m)

Вид животных

В-лимфоциты

(%)

Т-лимфоциты

Общее количество (%)

CD4-

хелперы

(%)

CD8-

цитотоксические

(%)

Норки, n=80

10,5±0,8

52,0±2,1

33,0±1,5

19,0±1,0

Куры, n=50

23,3±1,5

38,0±2,1

12,2±0,6

10,4±0,8

Рыбы, n=100

14,0±1,5

35,1±0,6

18,0±0,2

14,5±0,8

Примечание:  p<0,05

       Как видно из таблицы 10, количественные соотношения клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами, такими как CD2 (Т-клетки), CD19 (В-клетки), CD4, CD8, у данных видов животных одинаковы CD2: Т-клеток > В-клеток; Т-хелперов больше, чем цитотоксических лимфоцитов. Это доказывает функционально-рецепторный консерватизм Ig-подобных рецепторов лимфоцитов у различных видов животных. Анализ способности к розеткообразованию у исследуемых видов животных показывает различие рецепторной активности В-клеток. Это обусловлено тем, что В-система иммунитета в процессе эволюции развивалась позже Т-системы. У млекопитающих, птиц и рыб есть тимус – центральный орган иммунной системы, место дифференцировки Т-клеток до зрелых форм. Увеличение иммунорегуляторного индекса (соотношение        CD4 Т-хелперов к цитотоксическим CD8 Т-клеткам) от 1,3 у рыб и 1,2 у птиц до 1,7 у норок показывает различие в процессах дифференцировки Т-лимфоцитов, основанное на структурных особенностях  тимуса.

        Возможно, что CD2-рецепторы, как адгезивные молекулы, появляются одними из первых в процессе филогенеза иммунокомпетентных клеток позвоночных животных. Еще П.Эрлих впервые указал на отсутствие видовой специфичности рецепторов у животных различных видов. А по мнению Галактионова В.Г. (2004) филогенез клеток иммунной системы строится на рецепторной и функциональной общности клеток, участвующих в эволюционном процессе, в котором на пути от НК-клеток к Т-лимфоцитам сохранилось несколько общих рецепторов, указывающих на филогенетическую связь между этими клетками, в частности CD2.

       В настоящее время не вызывает сомнений определяющее значение белков суперсемейства иммуноглобулинов в развитии адаптивного иммунитета, основанного на врожденных механизмах защиты от инфекций. Иммунная система, как система специфического распознавания чужеродных структур, на ранних этапах эволюции начала свое становление с появлением иммуноглобулиноподобных доменов, стабилизированных дисульфидными связями. Именно из этой молекулярной, конформационной структуры, свойственной только членам суперсемейства иммуноглобулинов, построены клеточные рецепторы, ответственные за распознавание антигена, а межклеточная кооперация с участием IgSF является ведущим фактором в развитии иммунных реакций, обуславливающих функционирование иммунной системы, распознавание и деструкцию структур, зондирующих защитные возможности организма. Проведенные исследования показали, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембранными и  свободными  формами молекул иммуноглобулинов.  Определив модуляцию IgSF в онто- и иммуногенезе и консерватизм в филогенезе нами была показана возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы. В результате проведенных исследований было установлено, что ILT-рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток  определяет их функциональную активность и роль в фило-, онто- и иммуногенезе.

ВЫВОДЫ

       1. Разработаны способы получения иммуноглобулинов  A (S-IgA) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных. Показано, что оптимальной биологической жидкостью для выделения S-IgA служат носовые секреты крупного рогатого скота, а в связи с полиморфизмом иммуноглобулинов данного изотипа для его количественного определения следует использовать стандарт из гомологичного субстрата.

       2. Разработана технология получения и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам  мышей  и крупного рогатого скота, предназначенных для определения уровня иммуноглобулинов у животных. Экспериментально установлена возможность использования полученных антисывороток и моноклональных антител в иммуноцитохимических реакциях для  количественной оценки IgSF-содержащих клеток.

       3.  Приведены количественные показатели уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови коров в период 3-6 мес. стельности, которые составляют: IgG  - 29,2± 5,9 мг/мл, IgM – 2,6 ±0,6 мг/мл, IgA – 1,0± 0,3 мг/мл. Показано,  что иммунологический статус этих животных характеризуется значительным повышением концентрации IgG, который затем переходит в молозиво, где является основным изотипом иммуноглобулинов и доминирующим фактором колострального иммунитета.

       4. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с применением иммунопероксидазного окрашивания клеток на основе моно- и поликлональных антител. Установлено, что мембранные иммуноглобулины В-клеток периферической крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме  «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.

       5. С использованием реакции непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител установлено, что число sIgM-клеток в периферической крови крупного рогатого скота составляет от 0,97±0,5 х109/л  до 1,0±0,7 х109/л.  При этом количество sIgM-клеток у стельных коров  значительно выше и достигает значения 1,5±0,3 х109/л .

6. Цитохимическим методом определено количество sIgM-клеток в периферической крови телят 30-дневного возраста, находящееся в пределах 16,6±4,5% - 19,2±0,8%.

       7. Показана практическая эффективность применения реакции антигенного розеткообразования и контактного взаимодействия с макрофагами для  определения рецепторной активности иммунокомпетентных клеток в поствакцинальном иммунном ответе у лабораторных животных.

       8. Установлено, что воздействие in vitro вакцины против рожи свиней  на интактные лимфоциты мышей не оказывает значительного влияния на число CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту комплемента на поверхности клеток. Аналогичное воздействие на лимфоциты вакцинированных животных, приводит к повышению уровня экспрессии  рецепторов иммуноцитов, при этом индекс стимуляции равен 2,5-3,3 (в контроле 1,0). Двойной антигенный сигнал (in vivo и in vitro) усиливает экспрессию рецепторов в первые 14 суток иммунного ответа, когда в организме сохраняется достаточное количество активированных лимфоцитов.

9.  Определено различное воздействие антигенов бактериальной и вирусной этиологии на экспрессию ILT-рецепторов лимфоцитов, отражающую степень их активации. Так иммунизация мышей вакциной против рожи свиней приводит к образованию высокоаффинных  Т-клеток в первые сутки в костном мозге, а в последующие - в тимусе; при использовании вирус-вакцины высокоаффинные Т-лимфоциты обнаружены  в костном мозге на 14 сутки. Показана ведущая роль костного мозга в индукции рецепторной активности Т-клеток в поствакцинальном иммунном ответе.

       10. Установлено различное влияние антигенов бактериальной и вирусной этиологии на процесс активации макрофагов, который является более продолжительным при иммунизации животных бактериальным антигеном.  Так количество тимоцитов, взаимодействующих с перитонеальными макрофагами мышей на 2-10-14 сутки после введения вакцины против рожи свиней составило 212,3±30,4, 260,3±35,9 и 125,5 ±15,8 клеток/100 макрофагов соответственно (в контроле – 26,0±0,5). Более продолжительное повышение рецепторной активности поверхностных структур макрофагов и Т-клеток определяется различной МНС-рестрикцией иммунного ответа на бактерии и вирусы. 

11. Показано, что вторичный иммунный ответ на введение Т-независимого антигена 2 типа (ТН-2) характеризуется  увеличением количества В-клеток костного мозга и селезенки.  Установлено увеличение количества IgG1 в селезенке, что  подтверждает участие Т-клеточных факторов в ТН-2-иммуногенезе.

       12. Предложен диагностический алгоритм для изучения эффективности иммунотропных препаратов на модели лабораторных мышей, включающий следующие показатели: положительная корреляция (> 0,7) между розеткообразующей активностью клеток периферической крови и лимфатических узлов; положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов; отрицательная корреляция (> –0,7) между нейтрофилами и Т-клетками тимуса. Разработанная схема позволяет определять уровень корреляционной связи по трем соотношениям, характеризующим сбалансированность иммунной системы.

       13. Впервые установлена филогенетически детерминированная рецепторная и функциональная общность CD2-рецепторных клеток у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы (костистые рыбы, птицы, млекопитающие) и отличающихся строением иммунной системы.

14. Показано, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембранными и  свободными  формами молекул иммуноглобулинов, а межклеточная кооперация ILT- клеток обуславливает их количественные изменения и является ведущим фактором в развитии иммунного ответа у различных видов животных.

       


ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен комплексный подход к оценке Т- и В-клеточных звеньев иммунной системы крупного рогатого скота и мышей,  который может быть использован для определения  эффективности иммунотропных препаратов,  используемых в ветеринарной практике РФ. 

       Разработанные методы могут быть использованы для изучения модуляции клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами в онто-,  иммуно- и  филогенезе, что дает возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы различных видов животных.

       Для проведения иммунологического мониторинга животных рекомендованы  индексные показатели, которые  более адекватно отражают нарушения иммунитета, чем отдельные его параметры. Использование индексных показателей в значительной мере повысит диагностическую эффективность оценки состояния иммунной системы животных.

       Разработанные методы использованы для оценки иммунного статуса морских млекопитающих, хомячков Кэмпбэлла (Phodopus campbelli) в рамках программы по оценке здоровья популяций  животных, обитающих в естественных условиях.



СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ


Монографии, патенты РФ, методические рекомендации

1. Ездакова И.Ю. Рецепторы иммунного узнавания у животных. – М.:Компания Спутник+.- 2008.- 88 с.

2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота / Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. // Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.1990 г.

3. Федоров Ю.Н. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А.// Патент на изобретение № 2277421 от 5.04.2006 г.

4. Федоров Ю.Н. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных/ Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А. //Патент на изобретение № 2288008 от 5.04. 2006 г.

5. Федоров Ю.Н. Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. //Сборник « Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины».-2008.-4.- С. 144-158

6. Ездакова И.Ю. Способ определения антител/ Ездакова И.Ю. //Патент на изобретение № 2293330 от 4.07.2005 г.


Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

7. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом «вестерн-блоттинга»/ Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др.  // Сельскохозяйственная биология. – 1993.- № 6.- С. 135-141.

8. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Сологуб В.К. Феоктистова Т.А. , Федорова И.П., Ездакова И.Ю. // Сельскохозяйственная биология.- 1995.-№ 4.-С. 94-99

9. Жаданов А.И. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. / А.И.Жаданов, И.Ю.Ездакова, О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров // Ветеринария.-2000.- №11.- С.22-26.

10. Федоров Ю.Н. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Федоров Ю.Н., Верховский О.А., Жаданов А.И., Ездакова И.Ю.// Доклады РАСХН.- 2000.-№ 5.-С. 42-44.

11. Ездакова И.Ю. Динамика количества  Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Жаданов А.И. // Цитология.- 2001.- Т. 43.- № 9-. С. 858.

       12. Ездакова И.Ю. Количественное определение иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии / Ездакова И.Ю., Борзенко Е.В., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н.  // Сельскохозяйственная биология.- 2002.-№ 2.-С. 118-122.

13. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентные клетки серебряного карася /Ездакова И.Ю., Борисова М.Н., Дьяконов Л.П. //Ветеринария.-2005.-№ 12.-С. 28-31

       14. Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (Carassius auratus gibelio)/ Ездакова И.Ю., Борисова М.Н. // Ветеринарная патология.-2007.-№ 2.- С. 205-207

15. Ездакова И.Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров/ Ездакова И.Ю. //Ветеринарная патология.- 2007.-№ 2.-С. 148-151.

       16. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих – новое направление экологической иммунологии / Ездакова И.Ю., Соколова О.В. // Веткорм.-2008.-№ 4.- С. 14-15

       17. Ездакова И.Ю. Динамика розеткообразующих клеток кур  в онтогенезе / Ездакова И.Ю., Чуйко О. М., Чадина Е.О. //Ветеринарная патология.-2008.-№ 2.-С. 62-64

       18. Ездакова И.Ю. Локализация  IgМ в В-клетках периферической крови крупного рогатого скота/ Ездакова И.Ю.  // Аллергология и иммунология.- 2008.- Т. 9.- № 3.-С. 274


Статьи в других периодических изданиях, в материалах конференций и сборниках научных трудов

19. Феоктистова Т.А. Иммуноферментный метод количественного определения IgA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота / Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Борзенко Е.В.  // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. – Щелково: ВНИиТИБП.- 2000. - C. 279-281.

20. Разработка и совершенствование методов оценки В-системы иммунитета у животных / Верховский О.А., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н, Ездакова И.Ю. и др. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч.тр. – Щелково:ВНИиТИБП.- 2000. - C. 273-275

21. Yu.N. Fedorov. Quantitation of total IgG-, IgM-, and IgA-secreting cells in mice immunized with live erysipelas vaccine and challenged with the virulent strain of Erysipelothrix rhusiopathiae/ Yu.N. Fedorov, A.I.Zhadanov, O.A.Verkhovsky, I.Yu.Ezdakova.  //Sixth International Veterinary Immunology Symposium. -2001.- 206.- Р.174 (PS8:22). 

22. Борзенко Е.В. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Борзенко Е.В., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А. // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т. 73.- С. 217-221

       23. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / Ездакова И.Ю., Федоров И.Ю., Третьякова И.В.  // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т.73.- С. 200-204

24. Феоктистова Т.А. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Сологуб В.К. // Труды ВИЭВ.-2003.- Т. 73.- С. 197-200

25. Ездакова И.Ю. Динамика показателей клеточного иммунитета при введении препаратов с иммунотропной активностью / Ездакова И.Ю., Третьякова И.В.// Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина.- М: МГАВМиБ.-2004.-С. 190-194

26. Ездакова И.Ю. Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Ханис А.Ю., Боряев Г.И. // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч.тр.- Щелково:ВНИиТИБП .-2004.- С. 47-52.

       27. Sokolova O.V.Adaptive changes of the serum immunoglobulins level in the black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncates)/ Sokolova O.V., Denisenko T.E., Ezdakova I.Yu.  // Marine Mammals and man in coastal ecosystem: Can they co-exist? : Abstracts book.-Gdynia:ECS.- 2006.- P.180.

28. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /Ездакова И.Ю.// «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 472-474.

29. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 475-477.

30. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / Ездакова И.Ю.  // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар.- 2006.- С. 400-403.

31. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» : Сб. науч.тр. – Щелково:ВНИиТИБП.-2006.- С. 157-160.

32. Ездакова И.Ю. Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / Ездакова И.Ю., Субботин В.В. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» : Сб. науч.тр. – Щелково:ВНИиТИБП.-2006.- С. 182-187.

33. Данилевская Н.В. Фармакологические эффекты пробиотика Лактобифадол при его назначении глубокостельным коровам / Данилевская Н.В., Ездакова И.Ю., Кудинов В.В.// Веткорм.- 2006.-№ 6.- С. 24-25.

34. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / Ездакова И.Ю.  // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 1.-С. 11-12.

       35. Ездакова И.Ю. Определение показателей В-системы иммунитета телят/ Ездакова И.Ю.  // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 10-11.

       36. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 11-13.

37. Ezdakova I.Yu. The cross-reactivity of the blood serum albumens from Steller sea lion pups (EUMETOPIAS JUBATUS) / Ezdakova I.Yu., Sokolova O. V., Denisenko T. E., Burkanov V. N. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.-Egmond aan Zee:ECS- 2008.- P. 191-192.

       38. Sokolova O.V .The Ladoga ringed seal (Pusa hispida ladogensis) as a species – indicator of the influence of global warming on the wild population of the marine mammals/ Sokolova O.V ., Lisitsina T. Yu., Ezdakova I.Yu., Denisenko T. E.  // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.- Egmond aan Zee:ECS.- 2008.-  P. 151-152.

       39. Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / Ездакова И.Ю.  //«Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.- 2008.- С. 329-332.

       


 






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.