WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

Баева Вера Михайловна

       

 

  ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

  ЛЕКАРСТВЕННЫХ  РАСТЕНИЙ С

  ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-

  -БИОЛОГИЧЕСКИХ  МЕТОДОВ

  15.00.02- фармацевтическая химия, фармакогнозия

  Автореферат

  диссертации  на соискание ученой степени  доктора фармацевтических наук

 

  Москва - 2009

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская  академия

имени И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ физизико-химической биологии им. А.Н. Бело-зерского МГУ  им. М.В.Ломоносова 

Научные консультанты:

член-корр. РАМН, доктор фармацевтических наук

профессор Ирина Александровна Самылина

академик РАЕН, доктор биологических наук

профессор Андрей Сергеевич Антонов 

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор  Сокольская Татьяна Александровна

 

доктор фармацевтических наук  Баландина Ирина Анатольевна

доктор фармацевтических наук,

профессор Патудин Александр Васильевич

Ведущая организация:  ГОУ  ВПО Ярославская Государственная

медицинская академия

Защита состоится «  «___________2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09. при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова

(г. Москва, Никитский бульвар, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии  им. И.М. Сеченова  (117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49).

  Автореферат разослан  «  »  2009г.

 

  Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09.

доктор фармацевтических наук,  Наталья Петровна Садчикова

профессор

Общая характеристика работы

 

Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фар-мации. При введении таких растений в медицинскую практику  в первую оче-редь следует проводить целый комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченностъ границ вида.

  Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом,отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений при осуществлении за-готовки лекарственного  растительного сырья и создает необходимость опреде-ления глубины этой изменчивости на уровне  генома растения.

  Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размноже-ния (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибри-дов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей  и многие дру-гие являются перспективными для отечественной научной медицины. Разработка оптимальных методик изучения лекарственных растений будет спо-собствовать сохранению ценных сырьевых ресурсов (В.В.Алёхин, 1938).

  В связи с этим вопросы совершенствования определения равноценности ви-дов при изучении лекарственных растений с использованием новейших дости-жений науки обоснованы и своевременны. Актуально введение в практику оте-чественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сы-рья и расширение ассортимента препаратов обладающих противовоспалитель-ным, противоопухолевым лимфотропным и др., действием.

  Также актуальным является расширение арсенала методов определения под-линности. Это может быть сделано в настоящее время, в частности с привлече-нием наиболее современных и перспективных молекулярно-биологических ме-тодов.

Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс (V.Grant, 1981),  который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная су-перструктура достигает полного развития.Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.

  В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых – Vulgares  не яв-ляется монотипной и её границы до сих пор не ясны (S. Frhner, 1986),так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических ага-мных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный ком-плекс (V.Grant, 1981). Для  некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис (К.П.Глазунова, 1977,1987). У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии много-численных форм,групп особей или отдельных экземпляров,среди которых  мно-гие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, разме-ры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значитель-ные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Евро-пейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые ис-следователи относят к  манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, та-ких как м. балтийская, м. изящная, м.остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная (К.П. Глазунова, 1990). Другие исследователи к популяции ман-жетка обыкновенная относят до двенадцати видов (С.К. Черепанов,1981),  также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у раз-ных авторов.

  Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарствен-ных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.

  Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заста-вило прибегнуть к привлечению дополнительных молекулярно-биологических методов, в частности,  для характеристики геномов.

  Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методичес-ких подходов к изучению лекарственных растений с использованием молеку-лярно-биологических методов актуальна.

  Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка  методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов», № 01.200.110546.

Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволю-ционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: «Геносистематика и молекулярная фило-генетика про- и эукариот», № госрегистации: 0187.0095927

  Цель и задачи исследования. Цель исследования – разработать методичес-кие подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогнос-тические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных  лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определить характер изменчивости в популяциях модельного рода манжетка – Alchemilla L., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными прай- мерами (RAPD-метод)

2. Оценить внутривидовую и популяционную изменчивость на фоне отсутствия  корреляции с внешними устойчивыми морфологическими признаками его видов.

3. Изучить возможность применения характеристик геномов в фармакогности-ческом анализе. Провести сравнительное изучение с использованием RAPD-анализа лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфо-логических групп.

4. Показать возможность использования для изучения перспективных и лекар-ственных растений секвенирования ДНК с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и  интрон гена petD (petB-petD) и  на примере рода Аnthylis L., Провести филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.

5. Провести изучение химического состава полифенолов и аминокислот ман-жетки, исследовать его взаимосвязь  со строением геномов лекарственных рас-тений.

6. Изучить вопросы стандартизации сырья трава манжетки, разработать крите-рии идентификации (внешние  и анатомические признаки, качественные харак-теристики), числовые показатели и установить их нормы.

7. Выявить природные запасы и определить урожайность травы манжетки.

8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с  аберратными формами размножения.

  Научная новизна результатов исследования. Показана возможность при-менения молекулярно-биологических методов для фармакогностического ана-лиза. С использованием RAPD-анализа, на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.

  Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и  химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изуче-ние полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных про изводящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по  сбору сырья.

  Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, RAPD-анализа и секвенирования для изучения лекарственных растений и для идентификации лекарственного растительного сырья на примере сырья расте-ний семейства розоцветные, бобовые, яснотковые, буковые, гречишные, кип-рейные, астровые.

  Проведено изучение сырьевой базы травы манжетки, установлены границы полиморфизма Alchеmilla vulgaris L., что позволило определить урожайность, при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий.

  Разработаны критерии  оценки подлинности и качества сырья – трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отечественной медицины.

Исследование безопасности  настоя травы манжетки показало, что он может быть отнесен к группе практически нетоксических средств, так как однократ-ное введение в желудок максимально возможной дозы настоя травы манжетки  не вызывало гибели животных в течение двух недель наблюдения, кроме того, выявлена его антиметастатическая  активность. 

  Разработан алгоритм изучения лекарственных растений народной медицины, (в том числе и для - обладающих аберратными формами размножения).

Практическая значимость полученных результатов. Нами показана воз-можность применения молекулярно-биологических методов для идентифика-ции лекарственного растительного сырья.

  Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высу-шенного лекарственного растительного сырья с использованием RAPD-анали-за. С использованием молекулярно-биологических и традиционных фармако-пейных методов установлены характеристики подлинности и качества травы манжетки и  разработаны проект Фармакопейной статьи «Трава манжетки», проект «Инструкции по сбору и сушке», а также проект Общей фармакопей-ной статьи «RAPD-анализ лекарственного растительного сырья».

  Изучены сырьевая база и  вопросы стандартизации сырья трава манжетки, в том числе подобрана методика количественного определения суммы флавоно-идов, определён и выделен ценный полифенол, обладающий противоопухоле-вой активностью – агримониин.

  На основании изучения геномов  и полифенольного комплекса для медицин-ского применения рекомендованы 12 видов рода Alchemilla L. Данные филоге-нетического анализа и ботанико-фармакогностического изучения легли в осно-ву проекта инструкции по заготовке сырья трава манжетки.

С помощью RAPD-анализа даны геномные характеристики 17-ти видам растительного сырья.

  Положения, выносимые на  защиту:

1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов  различных видов  рода манжетка – Alchemilla L., с использованием RAPD-анализа и определение характера изменчивости.

2. Данные применения RAPD-анализа для идентификации  лекарственного растительного сырья.

3. Результаты применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения.

4. Результаты изучения взаимосвязи строения геномов с содержанием полифе-нолов и аминокислот для изучаемых видов  рода манжетка.

5. Результаты изучения запасов травы манжетки.

6. Данные по стандартизации травы манжетки.

7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарст-венных растений с использованием молекулярно-биологических и фармако-гностических методов.

  Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарст-венной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном сим-позиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвя-щенной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996),  на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 21-25 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные направления и перспективы развития» (Москва,14-16 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Man-made Habitats” (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фито-терапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соедине-ниям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции «Со-временные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (1-3марта 2007г). 

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах - 9. 

Объем и структура диссертации

  Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 ри-сунков, 38 таблиц и 3  приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных иссле-дований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках). 

  В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологичес-ких методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекар-ственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамно-половой комплекс Alchemilla vulgаris L.- как источ-ник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы при-менения.

  Вторая глава посвящена описанию объектов исследования,  методик и мето-дов анализа, использованных в работе.

  В третьей главе приведены результаты применения RAPD-анализа при изу-чении самых распространённых  видов рода Alchemilla, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья – трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов по-зволивших предложить новый  метод изучения лекарственных растений  и ис-пользовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.

  В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биоло-гических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода Аnthylis L.) и RAPD-анализ различных видов сырья..

В пятой главе представлены результаты химического  изучения наиболее распространенных видов рода Alchemilla  и фракционное изучение полифено-лов травы манжетки, а  также изучения  её  аминокислотного и элементного состава.

Шестая глава посвящена фамакогностическому изучению травы манжетки и практическому применению полученных результатов.

  В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической ак-тивности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы ман-жетки.

  В приложении представлены проекты нормативных документов по примене-нию RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжетки-herba Alchemillaе, Фармакопей-ной статьи  трава манжетки - herba Alchemillaе.

  СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования. 

В качестве объектов исследования были собраны следующие виды Alchemilla L.: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка ост-ролопастная - Аlchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla bal-tica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая - Аlchemilla propinqua Lindb.fil.,манжетка горная - Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная-Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная – Alchemilla cymato-phylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная –Alchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alеch.).

  Определение дикорастущих видов проводили по ключам-определителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н.Тихомировым (1966 г.).

Выделение ДНК.  ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методи-ки Дж. Дрейпера (1989) с использованием  экстракции цетилтриметиламмония  бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

  Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определя-емых видов и близких родов:манжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Po- tentilla erecta Hampe.),а также репешок (Agrimonia eupatoria L.), собранных  в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Fi-lipendula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa  Thunb., ceм. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., ceм. Polygonaceae), череды  трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. ceм. Astera-ceae).

Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и  Quercus rubra L. ceм. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L.,сем. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им.М.В.Ломоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МW, MHA, LE и др. 

  Цветки иван-чая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. аngustifolium var. albiflorum Hausskn., ceм. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области.

  Листья мяты перечной (Мentha piperita L.) и монарды двойной (Monarda di-dyma L.),траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сeм. Lamiaceae) собирали в ботаническом саду ГОУ ВПО ММА им.И.М. Сече-нова.  Цветки боярышника собирали там же с боярышника кроваво-красного (Crataegus sanquinea Pall.), а цветки боярышника кавказского (Crataegus cau-casica C. Koch.,Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагрин-ском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечислен-ных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.

  Для построения филогении  язвенника использовали молекулярные маркеры  применяемые в геносистематике: внутренний транскрибируемый  спейсер-inter-nal transcribed spacer(ITS1 и ITS2)участок 18S-5.8S-26S ядерного рибосомально-го цистрона-участок ДНК, отвечающий за единичную функцию (I.Alwres,2003); хлоропластный  участок petB-petD относящийся к интронам II группы и состоя-щий из  куска экзона  petB, межгенного спейсера, экзона petD, интрона и куска экзона  petD(C.Lohne, 2005);а также хлоропластный маркер экзон rps16 из груп-пы II интронов (M.Clegg,1993; B.Oxelman,1997).

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК для язвенника прово-дили  методом циклического секвенирования с использованием набора реаген-тов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на

автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования «Геном» (Институт мо-лекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).

  Для  изображения филогенетических деревьев использовали методы макси-мальной экономии, максимального правдоподобия и дистанционный.

  Для исследований ценопопуляций манжетки была  использована методика сбора и обработки материала, а также терминология, разработанная А.А.Урано-вым и его учениками (1973, 1975, 1980, 1987). Были рассмотрены разновозраст-ные популяции изучаемых видов манжетки. В качестве единицы счёта исполь-зовали, как элементарный источник фитогенного поля, особь.

  При описании структуры и динамики ценопопуляций сбор сырья проводили в пределах одного участка ассоциации S=100 м (10х10) внутри её контура, на трансектах (метод трансект Л.Б.Заугольновой, 1976). В ресурсоведческой рабо-те  использовали методики разработанные А.И.Шретером (1966), и  В.Б.Кувае-вым  (1987). Урожайность сырья или плотность запаса рассчитывали на едини-цу площади (ц/га).

Фармакогностическое изучение сырья - трава манжетки: описание внешних признаков, микроскопический анализ, определение числовых показателей (вла-жность, зола общая и др.) проводили по фармакопейным методикам ГФ ХI, т.1 (1987) и т.2 (1990).

  Водные извлечения из сырья готовили в соответствии с ГФ ХI, т.2(1990) в со-отношении 1:10. Извлечения 30% спиртом, 70% спиртом и ацетоном готовили в соотношении 1:10. 

  Изучение полифенольного состава проводили с помощью хроматографичес-ких методов. В работе  была использована бумажная, тонкослойная, колоноч-ная хроматография и ВЭЖХ.

  Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответст-вии с требованиями ГФ Х1 (1987г) и с использованием пакета статистических программ “Statistica for“.Для  сравнительного изучения полифенольного, в част-ности флавоноидного состава настоев травы некоторых видов манжетки, наибо-лее часто встречающихся в естественных фитоценозах Подмосковья, был при-менён метод анализа – ВЭЖХ.  Исследования проводили на хроматографе  Per-kin Elmer, Diode Array, Detektor 235 C при длине волны 255 нм для флавонои-дов, и 280 нм - для фенолкарбоновых кислот.  Колонка 150 х4,6 мм с размером частиц 3 мкм,сорбент гиперсил С 18; элюент ацетонитрил (АСN): вода (рН 3,2).

Компьютерную обработку полученных данных проводили по стандартной программе “Turbochrom “. 

  Определение содержания суммы флавоноидов проводили с помощью спект-рофотометра Beckman DU-65. Количественное определение суммы флавонои-дов проводили после модификации соответствующих фармакопейных методик спектрофотометрически.

Доклинические исследования настоя манжетки проводили на лабораторных животных: DВА2; C57BI6 ; гибриды BDF1 и F1; беспородные мыши SHK. В ис-следовании использованы перевиваемые опухоли: лимфолейкоз L1210, эпидер-моидная карцинома легкого Льюис(LLC) и саркома-37 асцитная и солидная.

Методы оценки острой токсичности и антиматастатической активности.

Изучение токсического действия настоя травы манжетки 1:10 и определение диапазона терапевтических доз на интактных животных проводили при опти-мальном пути введения вещества в организм в диапазоне доз от неэффективной до максимально переносимой (МПД). Использовали диапазон однократных или курсовых доз (при любой длительности курса). Для каждой дозы определялся максимальный эффект по одному из возможных критериев.

С помощью построения графика доза-эффект определяли ЕД20, ЕД50 и ЕД90 – расчетные дозы, вызывающие торможение роста опухоли (ТРО) на 20%, 50% и 90%, соответственно. Затем рассчитывали терапевтические индексы (ТИ20, ТИ50 или ТИ90) как соотношение соответствующей летальной и эффективной доз. ТИ является единственным показателем избирательности противоопухоле-вого действия, рекомендуемое значение ТИ502. ТИ50 определяли по формуле: ТИ=ЛД50/ЕД50,где ЛД50 – доза, вызывающая гибель 50% здоровых животных.

Определяли оптимальные схемы терапии. Оценка эффективности терапии уста-навливали по увеличению продолжительности жизни, числу полных ремиссий или излечению.

  Оценку эффективности лечения,  противоопухолевого и антиметастатичес-кого эффекта определяли по торможению роста опухоли:

определяли 2-3 размера опухоли у каждого животного в группе, после чего вычисляли объем (V, мм3) опухоли по формуле:  V=a•b•c  или V=(a•b2)/2,

где a, b и с – длина, ширина и высота опухолевого узла. Затем вычисляли средний объем опухоли в группе Vср.

Степень торможения роста опухоли определяли по показателям ТРО и Т/С, вычисляемым по формулам: ТРО%=(Vконтроля-Vопыта)x100/Vконтроля,

  Т/С%=Vопытаx100/Vконтроля,

где V- средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах, со-ответственно, на конкретный срок; Т – леченая группа; С – контрольная группа; Т/С – величина, обратная ТРО. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток после окончания лечения.

Оценку антиметастатической активности проводили на карциноме легких Льюис, меланоме В-6 и Клаудмана, а также саркоме-37 характеризующихся вы-сокой интенсивностью ме­тастазирования и дающих макроскопические метаста-зы,доступные для каче­ственной и количественной оценки простыми способами. При оценке эффективности лечебных воздействий учитывали массу первичного опухолевого узла, частоту метастазирования  опухоли (ЧМ),среднюю массу ме-тастазов в пересчете на 1 мышь, рассчитывали индексы ингибирования метаста -зирования (ИИМ) и торможения роста опухоли в процентах (ТРО).

Частота метастазирования опухоли – процент животных с метастазами по отно-шению к общему количеству животных в группе. В случае лимфогенного мета-стазирования подсчитывали массу метастазов и среднее значение этого показа-теля в группе. В зависимости от количества и размера метастатических узлов в легочной ткани определяли степень поражения легких.

Индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ) рассчитывали по формуле: ИИМ = [(А х Вк) – (А х В)] х 100%/ Ак х Вк,

где Ак и А – частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опыт-ной групп; Вк и В – среднее число метастазов в легких в контрольной и опыт-ной группах.

Торможение метастазирования по средней массе легких (ТРМ%):

ТРО%=(сред. m легких контроля-сред.m легких опыта) х100/Vконтроля

Изучение геномов видов рода манжетка (как модельного)RAPD-методом

 

  Для установления молекулярно-генетического родства между апогамными видами и популяциями манжетки обыкновенной был применён получивший широкое распространение в последнее десятилетие прошлого века метод поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами со случайной произвольной по-следовательностью – RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – или AP (Arbitrary Primed) – анализ (Welsh J., 1990; Williams J.G.K, 1990), который  ус-пешно используется для оценки степени cходства геномов близкородственных организмов, относящихся к самым разным таксономическим группам.

На первом этапе  нами была предпринята попытка сравнительного изучения геномов  нескольких хорошо определяемых в природе видов: м.балтийской, м. изящной и м.городчатой. Первые две отнесены одними авторами, а последние две – другими авторами - к манжетке обыкновенной; для сравнения, в качестве устойчивого вида, не образующего агамный комплекс, использовали лапчатку прямостоячую. Для выделения сумарной ДНК использовали методику, предло-женную Дж.Дрейпером (1989) и случайные праймеры П17 и П20. Перед этим на-ми экспериментально были подобраны: реакционная смесь (объем полимеразы, количество магния хлорида, число, количество и состав праймеров: режим ПЦР и количество циклов. Для“DNA Thermal Cycler”“Perkin Elmer Cetus” (USA) был подобран следующий режим:

  денатурация 94 C – 2 мин } 94C – 1 мин }

  отжиг  25C -  2 мин } 2 цикла и  55C -  1 мин } 40 циклов

  элонгация 70 C - 2 мин }  72C – 1 мин }

  В качестве контроля ставили пробу без ДНК и пробу без праймера.  Продук-ты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере и фотографировали на пленку “Микрат” в проходящем УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

  В результате нами было установлено, что ДНК лапчатки прямостоячей отли-чается от ДНК манжеток по следующим молекулярным признакам: при одина-ковых условиях амплификации у манжетки стабильно амплифицируется набор фрагментов, отличающихся молекулярной массой. Реакция хорошо воспроизво-дится в стандартных условия в диапазоне концентраций ДНК от 10 до 20 нг. Введение в реакционную смесь второго праймера увеличивает число амплифи-цированных фрагментов ДНК для манжетки и изменяет их подвижность для фрагментов ДНК лапчатки.

  Сравнение продуктов амплификации ДНК репешка европейского,азиатского, лапчаток гусиной,ползучей и манжеток показало наличие отличающихся набо-ров полос с различной подвижностью, что позволило предположить возмож-ность дальнейшего использования этого метода для идентификации видов рода манжетка.

  Далее брали небольшое количество хорошо определяемых  видов из опреде-лённых мест обитаний: манжетка балтийская, собранная в Истринском районе и манжетка балтийская, собранная в парке ботанического  сада ММА им. И.М. Сеченова. Для них выявлены значительные  отличия, а именно, наличие у пер-вой - набора из восьми фрагментов амплифицированной ДНК,а у второй – то-лько из пяти, причем, нижние  две полосы, имеющие длину около 500 нуклео-тидов,(определённую относительно  маркёра λHind-lll) менее четкие. При этом манжетки, собранные в одном фитоценозе (Истринский район), изящная и горо-дчатая, хорошо различающиеся по внешним признакам, проявляли явное сход-ство наборов RAPD–фрагментов по шесть одинаковых полос. Эти виды объеди-нены С.К.Черепановым (1981) в одну группу - манжетка обыкновенная. 

  Набор фрагментов, амплифицированных для манжетки полулунной, из этого же фитоценоза и не относящейся вообще к манжетке обыкновенной, также как для манжетки балтийской представлен пятью полосами, но они отличаются по длине. Манжетка Линдберга, также как и полулунная, не относящаяся к группе манжетка обыкновенная и собранная в Щёлковском районе, давала на электро-фореграмме четыре фрагмента, из них последний – четвёртый более короткий, соответствующий фрагменту маркёра λHind-lll длиной менее 500 пн, характерен только для этого вида.

  Таким образом, проведённый RAPD-анализ ДНК манжеток дал обнадёжи-вающие результаты, показавшие возможность его  использования для иденти-фикации представителей сложных агамных комплексов.

На следующем этапе  для  исследования  объектами служили апогамные виды Alchemilla vulgaris L.s.ampliss., собранные в период цветения в Московской об-ласти – A.baltica (1 – Бот.сад ММА им И.М.Сеченова,  II – Истринский район), A.gracilis, A.subcrenata, A.hirsuticaulis ( I – Щёлковский район, II – Истринский район, К– Казахстан, предгорья Ала-тау, интродуцированая в Бот.саду ММА), А. propinqua, A.lindbtrgiana и A.semilunaris. Собранные листья замораживали и хранили при  -20С до выделения ДНК.

Полимеразная цепная реакция.

  Для амплификации использовали 10-ти членные олигонуклеотидные прай-меры П1-П4 с произвольной последовательностью:

П1 – 5- СТСАССGTCC-3,  П2– 5- ACGGTACCAG-3, 

П3 – 5- GATGACCGCC-3,  П4 – 5- AGGCGGGAAC-3.

М 1 2 3 4 5

Рис. 1. Электрофореграмма в 2% агарозном геле  RAPD-

  фрагментов ДНК A.hisuticaulis с разными праймерами (П)

  М – маркёр длины – перевар ДНК фага рестриктазой PstI.

  1 – П1 ; 2 - П 2; 3 - П3 ; 4 - П 4; 5 - П4

  Реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала 1 ед. Taq полимеразы “Prome-ga”, в буферном растворе, предлагаемом фирмой, по 100 мкМ dATP,  dTTP,  dCTP,  dGTP,  1мкМ праймера, 4 mM MgCl2 и 10-20 нг ДНК. ДНК амплифици-ровали в течение 36 циклов в програмируемом термостате “Циклотемп” (СТМ, Москва) в режиме: денатурация – 1 мин 94С, отжиг – 1 мин 37С, элонгация – 2 мин 72С. Продукты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере и фотогра-фировали на плёнку  “Микрат”  в проходящем УФ-свете (305 нм) после окра-шивания бромистым этидием.

Компьютерный ввод изображений и их обработка проведены с использова-нием видеоденситометра и програмных продуктов фирмы “itti” (USA). Построение фенограммы осуществлено невзвешенным парно-групповым мето-дом с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием пакета про-грамм “Восторг” (ИЦИГ РАН, Новосибирск).

  Результаты и обсуждение. Количество продуктов амплификации, выявляе-мых как отдельные полосы после электрофореза, в реакции при использовании конкретного праймера с определённой последовательностью нуклеотидов зави-сит от количества сайтов связывания праймера, т.е. участков последовательнос-ти ДНК, комплементарных данному праймеру в обеих цепях ДНК исследуемо-го генома и/или от их относительного сродства. Поэтому RAPD-паттерны для каждого конкретного праймера будут состоять из различного количества полос.

  Кроме того, на количество и интенсивность полос оказывают влияние усло-вия проведения реакции амплификации-концентрация и степень очистки ДНК, температура отжига праймера, концентрация MgCl2, число циклов амплифика-ции.  Для каждого праймера необходимо было подобрать оптимальные усло-вия, при которых амплификация происходит эффективно и даёт воспроизводи-мые результаты. Последующее строгое соблюдение этих условий проведения реакции гарантировало надежность полученных результатов.

  Четыре имевшиеся в нашем распоряжении праймера  П1 – П4  были пред-варительно проверены в реакции амплификации с A.hirsuticaulis (рис. 1). Установлено,что все праймеры активны в реакции амплификации и служат за-травкой для синтеза наборов специфических фрагментов ДНК. Количество и длина амплифицированных с каждого праймера фрагментов, как и следовало ожидать, неодинаковы. В последующих опытах был использован праймер П2,  приводящий к RAPD-спектру с наибольшим количеством полос (рис. 1).

  Для  оптимизации условий реакции было исследовано влияние изменения температуры отжига праймера, концентрации MgCl2  и концентрации ДНК на набор продуктов реакции. Установлено, что результаты хорошо воспроизводят-ся в диапазоне температуры отжига от 30 до 37С и концентрации MgCl2 2,5 – 4,0 мМ, а также при разведении исходных растворов ДНК в  отношениях от

М  1  2 3 4  5  М  6  7  8  9 10 10  М

  Рис. 2. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma)

  RAPD-фрагментов ДНК

  1.- A.semilunaris, 2.- A.gracilis, 3.- A.baltica (1), 4.- A.baltica (П),

  5.- A.subcrenata, 6.- A.propinqua, 7.- A.lindbergiana, 8.- A.hisuticaulis (1),

  9.- A.hisuticaulis (K), 10.- A.hirsuticaulis (П) c праймером П2

М – маркёр длины – перевар ДНК фага рестриктазой PstI.

 

1:10 до 1:100. Для последующих опытов были использованы разведения 1:50, что соответствует содержанию 10-20 нг ДНК в реакционной смеси.

  Разделение амплифицированных фрагментов ДНК апогамных видов популя-ций  Alchеmilla при электрофорезе в агарозном геле (рис.2),с последующим сканированием и математической обработкой полученных результатов с помо- щью компьтерных программ позволило установить, что исследуемые апогам-ные виды и популяции характеризуются специфическими RAPD-спектрами. Различия касаются как наличия/отсутствия полос одинакового размера у раз-ных видов, так и изменения относительной интенсивности некотоых полос.

  Рис.3. Распределение амплифицированных фрагментов ДНК разной

молекулярной массы у исследованных видов манжетки 

(обозначения  см. рис.2).

На рисунке 3 показано присутствие амплифицированных фрагментов ДНК с указанием их размеров, а в таблице 1 – матрица состояний бинарного признака наличия/отсутствия (1/0) полос с одинаковой электрофоретической подвижнос-тью в RAPD  – спектрах изученных растений. Минорные полосы слабо выявля-ющиеся на электрофореграммах рассматривались как отсутствующие, и им приписывалось значение 0.

  По этим данным рассчитана матрица различий между видами и популяциями манжетки,по которой построена фенограмма (рис.4).Полученные данные свиде-тельствуют,что как апогамные A.vulgaris L.Ampliss.,так и популяции одного ви-да различаются по RAPD-спектрам, при этом диапазоны уровней сходства меж-ду популяциями и видами могут перекрываться.

Обращает внимание, что две популяции A.hirsuticaulis из Московской облас-ти гораздо более сходны между собой, чем с популяцией того же вида из Казах-

стана.Какого-либо соответствия характера кластеризации на фенограмме со схемами таксономии Alchemilla В.Ротмалера (1936) и С.В. Юзепчука (1941)  не прослеживается.

  Таким образом, полученные данные  результов RAPD – анализа свидетельст- 

вуют об отсутствии  различий  уровней внутри- и межвидовой генотипической изменчивости в группе A.vulgaris.Определение степени изменчивости подмос-ковных  видов рода манжетка показало, что из  всех видов только A.gracilis и  A.baltica ведут себя как монофилетические групппы, A.glaucescens и A.hirsuti- caulis вместе также образуют монофилетическую группу. Все остальные виды не проявляют себя как монофилетические.

  A.glaucescens, A.hirsuticaulis, A.monticola и A.sarmatica вместе образуют мо-нофилетическую группу. Все четыре вида относятся к секции Plicatae, согласно

 

Рис. 4. Фенограмма сходства RAPD-спектров ДНК видов

  Рода Alchemilla, построенная методом UPGMA по данным

  матрицы в таблице 1; d –процент различий 

S. Frhner (1990), но поV. Rothmaler (1936) они принадлежат, соответственно, к двум подсекциям. Образцы A.semilinaris образуют монофилетическую линию, а  все образцы A.subcrenata объединяются вместе  и близки  к образцам секции Plicatae. A.acutiloba и A.gracilis перемешаны друг с другом, но по-видимому, вместе образуют монофилетическую группу. Положение A.glabricaulis и A.bal-tica неопределённо. A.gracilis, по-видимому, образует отдельную ветвь. Все ос-тальные виды расположены вперемешку друг с другом и не могут считаться монофилетическими.

  Расшифровка радиограмм и электрофореграмм, компьтерная математическая обработка полученных результатов анализа показала отсутствие в изучаемых популяциях манжетки предковых видов и невозможность построения из этих видов филогенетического дерева, хотя некоторые наборы RAPD-фрагментов  были сходны для нескольких видов, особенно взятых из одного фитоценоза,

что может говорить о их гибридогенном происхождении. Величина внутриви-довой и внутрипопуляционной изменчивости оказалась очень высокой.

  Таким образом, применение геномного анализа позволило характеризовать геномы  видов манжеток, преимущественно как гибридные, что дает возмож-ность рекомендовать для сбора траву всех видов манжеток, как близкородст-венных и обладающих сходным биосинтезом БАВ, что дает возможность про-гнозировать близкий состав биологически активных веществ.

Применение RAPD анализа для идентификации

  лекарственного растительного сырья.

  В отечественной и мировой литературе отсутствуют данные о применении молекулярно-биологических методов для изучения лекарственного раститель-

Рис. 5. Электрофореграмма амплификатов ДНК свежих и высушенных

  листьев  двух видов дуба-Quercus с праймером  3‘-CGGCCCCTGT-5‘ 

1-молекулярный маркер; 2-контрольный опыт;

3-фрагменты ДНК свежих листьев дуба черешчатого;

4-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба черешчатого;

5-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба красного 

ную для его идентификации.  Прежде всего необходимо было адаптировать ме-тодику  выделения ДНК из сухого сырья и подобрать условия амплификации.

Наилучшими оказались следующие условия проведения реакции амплифика-ции для термоциклера фирмы Perkin Elmer-Cetus Instruments:

- денатурация – 94С – 1 мин; отжиг – 36С – 1мин; синтез – 72С -1 мин.

(* В последнем цикле эта стадия длится 3 мин).  При сравнении результатов ампли-фикации установлено, что RAPD-набор ДНК свежего и высушенного сырья от-личается по количеству и расположению фрагментов, вследствие деградации ДНК при сушке (рис. 5). Разделение и обнаружение фрагментов ДНК, получен-ных в результате реакции амплификации, проводили методом электрофореза в 2 % геле агарозы. Выделение  и амплификацию ДНК из сухого сырья: цветков

с листьями боярышника кроваво-красного и боярышника кавказского, травы череды трёхраздельной и череды поникшей,а также цветков иван-чая узколист-

 

Рис. 6.  Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma)

  продуктов RAPD ДНК  растительного сырья:

1- боярышника крововокрасного - Crataegus sanquinea Pall.),

2- боярышника кавказского - Crataegus caucasica C.Koch. Cratz.et Mesp.

3- череды трёхраздельной - Bidens tripartitus L.

4- череды поникшей - Bidens cernuus L.

5- иван-чая узколистного - Chamaenerium angustifolium (L.) Scop.

6- иван-чая узколистного - Ch. angustifolium var. albiflorum Hausskn.

7- горца почечуйного (красного)- Polygonum persicaria L.

8- горца почечуйного (зеленого)- Polygonum persicaria L.

М – маркер длины (перевар ДНК фага рестриктазой Psd)

ного (розовой формы и белой), травы горца почечуйного (растущих рядом зелё-ной и красной) проводили по модифицированной нами методике. Результат разделения представлен на рисунке 6. На полученных электрофореграммах,

Таблица2. Стадии методики выделения и амплификации ДНК

  лекарственного  растительного сырья.

Стадия

Сущность методики

Теоретическое обоснование

1. Пробо-

подготовка

измельчение до порошка

(менее 0,5мм)


2.Экстрак-

ция

→ СТАБ буфером (70С) + меркаптоэтанол → пробирку встряхивают, инкубируют при Т= 70С и центрифугируют ⇒отбирают жидкую фазу

Меркаптоэтанол добавляют для инактивации ферментов.

3.Очистка

Жидкая фаза + смесь хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) → встряхивают → центрифугируют ⇒ осадок денатурированных белков

  Осаждение белка

4.Выделение

ДНК

жидкость над осадком +

изопропанол

перемешивают стекл.капил -ляром ⇒ аморфный студ-необразный осадок ДНК и полисахаридов.

Далее ДНК «наматывают» на капилляр → погружают в пробирку с 96% этанолом →  погружают в пробирку с водой до растворения ДНК.

изопропанол добавляют для осаждения ДНК

96% этанол необходим для удаления полисаха-ридов, т.к. полисахари-ды осаждаюся в спирте, а ДНК растворяется в воде.

5. Реакция амплифика-

  ции

ДНК+ праймеры +буферный раствор Tris-HCl+ дезоксинуклеозидтрифосфаты + MgCl2 + Taq-полимераза →термоциклер→разделение электрофорезом ⇒

окрашенные фрагменты  ДНК.


  Рис. 7. Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов RAPD ДНК

листьев:1- монарды двойчатой - Monarda didyma L, 2- мяты перечной- Мentha

  piperita L;

травы: 3- чабреца- Thymus serpillum L.), 4- мелиссы- Melissa officinalis L.;

цветков 5-манжетки обыкновенной – Alchemilla vulgaris L., 6-таволги вязолис-тной- Filipendula  ulmaria Max.), 7-розы морщинистой - Rosa rugosa  Thunb., - маркер длины.

(рис. 6) четко видны  различия наборов RAPD-фрагментов боярышников и обих видов череды, а RAPD-спектры для ДНК иван-чая  розового и белого – а также

для двух рас горца почечуйного были идентичными, что говорит о их генети-ческой равноценности.

При изучении RAPD-спектров ДНК, выделенной из разных видов  сухого сырья: цветков, листьев и травы  растений, относящихся к разным семействам: Lamiaceae  и Rosaceae: листья монарды, листья мяты перечной, трава чабреца, трава мелиссы; цветки манжетки, цветки таволги, лепестки шиповника на  элек-трофореграмме  наблюдались дискретные полосы, выявляющие  межвидовые различия - фрагменты ДНК отличающиеся подвижностью (размерами) и их ко- личеством (рис. 7). 

  Проведённые нами исследования показали возможность применения данного метода для идентификации сырья лекарственных растений.

Нами разработаны оптимальные методики для RAPD-анализа 13 родов, от-носящихся к 5 семействам. 

  Применение секвенирования для изучения лекарственных растений

и лекарственного растительного сырья

  Применение секвенирования для филогенетического анализа рода Anthylis L., также показало перспективность его использования для изучения лекарствен-ных растений народной медицины. Установлено, что род Anthylis L., проявляет себя как монофилетическая группа с высокими уровнями поддержки при ана-лизе как ядерных, так и хлоропластных маркеров. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthylis vulneraria L.,(рис. 8) 

характеризуется рядом уникальных морфологических особенностей, как отде-льный подрод, что подтверждается  данными об инделях: вставках из 6 п.н

(АТААСА) на участке  petB-petD. Эти молекулярные маркеры (индели) также могут быть рекомендованы для идентификации лекарственного растительного сырья молекулярно-филогенетическими методами. 

Изучение состава БАВ травы манжетки.

  Нами было проведено изучение полифенольного комплекса: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, танинов и аминокислотный состав  видов рода Alche-milla L.Предварительное сравнительное изучение химического состава манже-ток:  остролопастной, балтийской, изящной, собранных в июне 1990 года и в сентябре 1991 года в Истринском и Одинцовском районах Московской области показало сходство спектров поглощения спиртовых извлечений и сходство хро-матографического разделения: одинаковое количество зон адсорбции с Одина-ковыми Rf в различных системах растворителей. Далее исследование водных извлечений проводили с помощью метода ВЭЖХ. Идентификацию проводили по сопоставлению времен удерживания пиков соединений на хроматограмме с пиками стандартных образцов и совпадению УФ-спектров соединений с УФ-

  Рис. 8. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ

  по участку ITS 1-2.

спектрами стандартных образцов. В водном извлечении были идентифицирова-

ны фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, коричная; флавоноиды – рутин, кверцетин, кемпферол (рис. 9). Определено, что в водном извлечении рутин составляет 50% и более суммы всех флавоноидов (табл.3).

Таким образом, в результате сравнительного химического изучения разных ви-дов манжетки,  собранных в нескольких районах Московской и на севере Туль-ской области, нами была установлена сходность химического состава полифе-

  Рис. 9. Хроматограмма водного извлечения  травы манжетки:

  1 - галловая кислота; 2 - хлорогеновая кислота; 3 - кофейная  кислота; 

  4 - рутин; 5 - коричная кислота; 6 - кемпферол; 7 - кверцетин

Таблица 3. Содержание полифенолов в траве некоторых видов Alchemilla

----------------------------------------------------------------------------------------------------

  !  Содержание полифенолов,  в  %

Вид манжетки  !галловой к-ты !  рутина ! гиперозида !  кверцетина 

---------------------------------------------------------------------------------------------------

1. A.gracilis 9,5 28,7 14,2  7,8

2. A.gracilis 8,5 28,0 11,9  7,6

3. A.baltica  11,2 39,4 10,5  7,0

4. A.hirsuticaulis* 6,5 35,8 29,0  3,5

5. A.conglobata 10,1 32,3 19,3  5,5

6. A.gracilis  10,3  32,2 15,3  7,6

---------------------------------------------------------------------------------------------------

* A.hirsuticaulis  попадает в сырьё как допустимая примесь, ее % - содержание невелико.

нольных соединений этих видов это послужило основанием для дальнейших исследований. Для более полного изучения полифенольного комплекса прово-дили фракционное изучение ацетонового извлечения травы манжетки, в кото-ром одна из фракций нами была идентифицирована как танин –агримониин.

Выделение агримониина. Нам удалось выделить из  травы манжетки  димер-ный эллаготанин – агримониин, который был идентифицирован прямым срав-нением спектра со спектрами известных образцов как агримониин, с помощью Н ЯМР, C ЯМР  и ПМР анализа.  Полученные данные подтверждили пра-вомерность химической структуры  агримониина – как одного из первых ди-мерных эллаготанинов, имеющих природное происхождение. Ранее  японскими исследователями похожие соединения были выделены из  некоторых растений также семейства розоцветные двух видов гравилата, репешка волосистого и эндемичной лапчатки [Okuda T., 1995].

 

Рис. 10. Хроматограмма агримониина.

Рис.11. Спектры основных пиков.

Хроматограмма свидетеля представлена на рисунке 10.Здесь агримониин ви-ден, как главный пик с несколькими минорными компонентами. Время удержи-вания агримониина 27 минут, а его УФ-спектр (рис.11) поглощения имеет мак-симумы при 220 и 280 нм.

  Определили фракции, содержащие очищенный танин (рис. 10) их упарили и высушили. Получили белое с желтоватым оттенком вещество – агримониин, идентификация которого была проведена ранее.  Водный раствор агримониина, полученного путем препаративной колоночной хроматографии был использо-

Рис.12. Хроматограмма водного извлечения (1) и агримониина (2)

ван в качестве свидетеля и для выявления расположения пика агримониина на хроматограмме водного извлечения. Сначала провели хроматографирование водного раствора свидетеля. Затем хроматографировали водное извлечение. По

времени удерживания и УФ-спектру поглощения в сравнении с раствором сви-детеля на хроматограмме был идентифицирован агримониин (рис. 12). При изу-чении отдельных фракций танинов нами установлено, что олигомерные танины манжетки представляют собой соединения, близкие по строению с агримонии-ном. Они имеют разное время удерживания на хроматограмме, но у них одина- ковый УФ-спектр с максимами поглощения при 220 и 280 нм, как у агримони-ина.

Таблица4. Содержание свободных аминокислот  в траве некоторых

видов Alchemilla vulgaris L.

!  !  Содержание свободных аминокислот, в мг на 1мл

! -----------------------------------------------------------------------

! Аминокислота !  М.изящная м.балтийская  м.городчатая

Аспаргиновая кислота+

аспаргин

 

0 .04

  0.04

0.04

треонин 

  0.06

  0.06

0.06

Серин

  0.07

  0.07

  0.07

Глутаминовая кислота+

глутамин

  0.09

  0.09

  0.09

пролин

  0.45

  0.45

0.45

Глицин

  0.01

  0.01

0.01

Аланин

  0.05 

  0.05

0.05

Цистин

  0.02

  0.02

0.02

Валин

  0.06

  0.06 

0.06

метионин

  0.00

  0.00

0.00

изолейцин

  0.04

  0.04

0.04

Лейцин

  0.03

  0.03

0.03

тирозин

0.01

  0.01

0.01

фенилаланин

0.03

  0.03

0.03

оксилизин

0.13

  0.13

0.13

Лизин

0.01

  0.01

0.01

гистидин

0.01

  0.01

0.01

аргинин

0.01

  0.01

0.01

Сумма

1.14

1.14

1.14

  В результате этого исследования определено, что в водное извлечение из сы-рья переходит весь комплекс полифенолов: фенолкарбоновые кислоты, флаво-ноиды и олигомерные танины.

Изучение аминокислотного состава.

  Изучение аминокислотного состава трёх видов рода манжетка: показало его идентичность (табл. 4). Из  20-ти обнаруженых аминокислот в водном извлече- нии  преобладают пролин и оксилизин (0,45 мг/мл и 0,13 мг/мл соответствен-но). Обладая высокой биодоступностью, они обуславливают, наряду с другими БАВ (полифенолы, макро- и микроэлементы) травы манжетки широту спектра фармакологической активности её препаратов и могут служить маркерами, на-ряду с другими, подлинности сырья и качества настоя. Этu и данные получен-

ные с помощью RAPD-анализа позволилu нам рекомендовать к медицинскому применению, для сбора траву всех изученных видов рода Alchemilla L., и рас-сматривать эти виды как производящие сырье – трава манжетки.

Фармакогностическое изучение травы манжетки.

  Фармакогностическое изучение травы манжет позволило разработать крите-рии оценки подлинности и качества этого ценного сырья, а также разработать систему мероприятий по рациональному использованию природных ресурсов Alchemilla L.sp.Последняя включает описание производящих растений, позволя-ющее определять их в природе; и проводить выявление зарослей, пригодных для сбора сырья; даны рекомендации по условиям сбора, сушки и хранения сы-рья, а также режим эксплуатации зарослей.

Внешние признаки сырья приведены в таблице № 5: трава манжетки пред-ставляет собой смесь листьев и цветоносов с цветками и бутонами.  Микроскопия травы манжетки  позволила выявить особенности анатоми-ческого строения стебля, листа, черешка и чашелистиков (табл.6), опушение, строение клеток-идиобластов с друзами, одинаковые для всех изученных видов, которые могут служить диагностическими признаками подлинности сырья. 

Качественный анализ сырья. На основании качественных фармакопейных ре-акций  установлено, что водное извлечение травы манжетки (1:10) даёт поло-жительную цианидиновую пробу на флавоноиды с металлическим магнием или 

Таблица № 5.  Внешние признаки сырья манжетки обыкновенной

№ п/п

Диагностический признак

Характеристика признака

  С Т Е Б Е  Л  Ь

1

Форма

Округлый

2

характер поверхности

Опушенный

3

характер ветвления

Разветвленный

4

Размеры

длина

диаметр

до 10 см

до 4 мм

5

Цвет

светло-зеленый

  Л И С Т Ь Я

1

Листорасположение

очередное

2

форма листовой пластинки

округло-почковидная и веерообразная

3

Размеры

длина

ширина

до 6 см

до 4 см

4

наличие черешка

стеблевые

у розеточных

- сидячие

– длиной до 5 см

5

строение листа

простые, лопастные

6

Жилкование

пальчатонервное

7

Край

зубчатый

8

Опушение

верхней стороны листа

с нижней стороны

малоопушенная

более опушенная

9

Цвет

верхней стороны

нижней стороны

зеленый

светло-зеленый

  Ц В Е Т К И

1

тип соцветия

дихазиальное, клубочковидное

2

строение цветка

строение околоцветника

актиноморфный

простой  4-х – мерный, чашечковидный с подчашием

3

Цвет

желто-зеленые

Запах сырья

Слабый

Вкус сырья

Горьковатый

 

Таблица 6.  Сравнительная характеристика микроскопических диагнос-

  тических  признаков травы манжетки отдельных видов

Диагностический  признак

A.gracilis  A.baltica

A.semilunaris  A.hisuticaulis

  1. кольцевое располо-жение тканей стебля
  2. аномоцитный

устьичный комплекс

  1. волоски простые
  2. друзы 
  3. три концентрических

сосудисто-волокнистых

  пучка в черешках

+  +

+  + 

+  +

+  +

+ +

+  +

+  +

+  +

+  +

+  +

цинком и концентрированной. хлористоводородной кислотой (красное окраши-вание), с раствором хлорида окисного железа – чёрно-зелёное окрашивание – 

полифенолы.

  На бумажной хроматограмме ацетонового извлечения, в системах 1-БУВ 4:2:1 и П-15% уксусная кислота, детергент желтая кровяная соль проявляет большинство соединений полифенольного комплекса – самое яркое –агримо-

ниин.

  На ВЭЖХроматограмме идентифицированы пики фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, в частности- рутина (рис. 9); олиготанина–агримониина (рис.12).

  Экспериментально подобранные нами требования к пробоподготовке для 

RAPD-анализа позволяют проводить идентификацию цельного и высокой сте-пени измельчения,как свежего так и высушенного сырья, соответственно ха-рактеризующегося набором из шести-восьми фрагментов амплифицированной ДНК, причем, нижние  две полосы, имеют длину менее 500 пар нуклеотидов, (определённую относительно  маркёра λHind-lll).

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья, а также для по-рошка из него: сумма флавоноидов в пересчёте на рутин, влажность, зола об-щая, зола, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, пожел-тевшие и блёклые листья; черешки листьев и цветоносы длиннее 10 см, органи-ческая примесь, минеральная примесь, характеризующие качество сырья, определены нами экспериментально  и установлены их нормы.

Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин проведено по подобранным нами и адаптированным фармакопейным спектро-фотометрическим методикам. Ошибка метода составила ±5,16%.” При изуче-нии вопросов стандартизации нами установлены нормы содержания основной группы БАВ.

Результаты валидации методик качественного и количественного анализа

БАВ и суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Валидационной проверке подвергались методики качественного и количест-венного определения биологически активных веществ: полифенолов, флавоно-идов и агримониина квалификационные исследования заключались в оценке их воспроизводимости и устойчивости стандартных растворов, подверженных ли-нейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества, достигаемой чувствительности определения, расчете метрологичес-ких характеристик и выявлению систематических погрешностей анализа. Резу-льтаты валидации показали высокую чувствительность определения (до 0,005 %) и строгость линейных зависимостей аналитических сигналов от содержания флавоноидов (коэффициенты корреляции составили 0,998), что определяет вы-сокую точность анализа. Это выражается в хорошей воспроизводимости резу-льтатов, а также  в статистически доказанной правильности определения.

Сделанные выводы дают возможность считать разработанную методику при-годной для достоверного количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин для травы манжетки.

При разработке системы мероприятий, способствующих сохранению качест-ва сырья до его применения, необходимо учитывать динамику содержания и фи зико-химические свойства БАВ, содержащиеся в нём.

Таблица 7.  Содержание суммы флавоноидов в траве манжетки

в зависимости от сроков хранения

Год проведения сбора|  Содержание суммы флавоноидов, %

1996 2,85±0,15*

1995 2,78±0,25

1994 2,07±0,18

1993 1,78±0,28

1992 1,75±0,33

* До 1997 года собирали всю надземную часть манжетки, не отделяя черешки и  жёсткую часть цветоносов.

Так как в траве манжетки флавоноиды относятся к одной из главных групп дей-ствующих веществ, обуславливающих основные фармакологические эффекты, проводили изучение  стабильности содержания суммы флавоноидов в траве манжетки, заложенной на хранение в 1992 году в сухом, защищенном от света месте. Проведенное исследование показало, что со временем (по истечении двух лет хранения) этот показатель значительно уменьшается, сырье выгорает. Результаты спектрофотометрического определения содержания суммы флаво-ноидов в пересчете на рутин представлены в таблице  7, где  видно, что хранить траву манжетки дольше двух лет нерационально.Таким образом, трава манжет-ки должна храниться по общему списку в защищенном от света, хорошо проветриваемом помещении не более двух лет.

  Срок годности экспериментально установлен – 2 года.

Ресурсоведческое  исследование

  На основании проведенного ресурсоведческого  исследования природных по-пуляций манжетки установлено, что для изученных популяции характерно до-минирование A.gracilis (до70%), A.baltica(15%), A.subcrenata (10%) и все оста-льные виды составляют менее 5% * (рис.13);  определено, что проективное пок-рытие в среднем охватывает 70±15% учетной площадки; сбор свежего сырья должен составлять около 50% от всей биомассы, одна особь при этом дает 20-35 грамм

свежего сырья, занимая площадь от 0,25 до 0,50 м; коэффициент усушки – со-ставил 4. В результате расчетов определено, что 1% проективного покрытия даёт 0,9±0,1 грамм сухого сырья  при ежегодной заготовке сырья с соблюде-нием ресурсосберегающих требований. 

  Рис.13. Диаграмма соотношения видов Alchemila в популяции

Манжетка входит в ценокомплекс в составе злаково-манжетково-разнотрав-

ной ассоциации; разнотравье представлено следующими видами: купырь лес-ной – Anthriscus silvestris (L) Hoffm, дудник  лесной–Angelica sylvestris L., хвощ лесной – Equisetum sylvaticum L., вербейник монетчатый – Lysimachia nummu-laria L., герань лесная – Geranium sylvaticum L., лапчатка прямостоячая – Poten-tilla erecta (L.) Raeusch., вероника дубравная–Veronica chamaedrys L.,горошек заборный -Vicia sepium L.,зверобой пятнистый – Hypericum  quadrangulum L.,и др.Эти виды могут попадать в сырье, как органическая примесь (не более 10%).

  Расчеты среднего выхода сырья с одного квадратного метра проводили за  пять лет. Они составили: 56,32±5,87г(2001г),  45,46±3,45г(2002г),

  65,67±8,35г(2003г),  35,52±4,57г(2004г); 72,26±9,06 г(2005г).

  Проанализировав полученные данные, установили, что урожайность травы манжетки находится  в зависимости от погодных факторов вегетационного пе-

риода, при этом  выход сухого сырья травы манжетки может составлять в сред-нем до 5,5 ц/га.

Таким образом, нами установлено, что  манжетка образует сплошные невы-сокие заросли – «куртины», поэтому определение урожайности можно прово-дить по проективному покрытию, «цена» 1% будет равна  около 0,9 г, а урожай-ность травы манжетки в среднем составляет 5,5 ц/га. Т.о. установлен объем ежегодных заготовок.

Определение острой токсичности и специфической активности травы манжетки показало, что настой из нее относится к классу нетоксичных, макси-мально переносимая доза настоя МПД≈LD10. Установлено, что настой травы манжетки обладает антиметастатическим действием (ТРМ более 25%) при ран-нем начале лечения (на модели опухоли карциномы Льюис), при этом настой обладает способностью ингибировать процесс рецидивирования опухоли у жи-вотных. При пероральном введении настоя травы манжетки мышам в дозе 7,0 мг/кг способствует снижению метастазирования саркомы 37 на 29%. По пред-варительным данным настой травы манжетки в дозе 13,7 мг/кг per os значите-льно увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой-37 в сравнении с контролем. Также определена перспективность его применения при комбинированной терапии.

  Обсуждение результатов Лекарственные растения, применяемые отечест-венной  народной медициной составляют более 600 видов, а разрешенных к ме-дицинскому применению, включенных в Государственный Реестр – 260 видов, причем многие из них не образуют промышленно значимых зарослей или вклю чены в Красную Книгу. Кроме того, ухудшение экологической обстановки, ант-ропогенное воздействие на места обитания многих ценных  лекарственных ви- дов сокращают их природные запасы. Все это вызывает необходимость актив-нее изучать и внедрять лекарственные растения народной медицины для расши-рения сырьевой базы получения отечественных лекарственных средств.

  Для этого необходимо разработать научно обоснованные методические под-ходы к изучению лекарственных растений Флоры России, создать алгоритм, по-

  Схема 1. Алгоритм изучения лекарственных растений. 

зволяющий наиболее полно изучать и эффективно внедрять их  в научную ме-дицину. 

  Научно обоснованная схема изучения лекарственных растений народной ме-дицины должна содержать следующие этапы:

-Выявление лекарственного растения наиболее часто применяемого для  лечения определенного вида патологий;

-Изучение жизненного цикла растения и возможности введения его в  культуру;

-Изучение природной сырьевой базы;

-Выявление биологически активных веществ, определяющих фармакологическую активность лекарственного сырья;

-Определение показателей подлинности и качества сырья;

-Разработка нормативных документов на сырье

- Изучение биологической активности

- Клинические испытания

и представлена на схеме 1. 

  На основании этого алгоритма были проведены исследования для  разработ-ки нормативных документов. Результаты исследования перспективных лекарст-венных растений были положены в основу методических указаний по изучению растений Флоры России.

В результате изучения особенностей биологии лекарственных растений бы-ло установлено, что для идентификации видов, обладающих аберратными фор- мами размножения необходимо использовать молекулярно-биологические ме-тоды  анализа. Они позволяют четко очертить круг видов, относящихся к расте-

ниям, производящим сырье, а также определить его подлинность в препаратах из него высокой степени измельчения.

  Поскольку эти методы достаточно точны, доступны, воспроизводимы и рас-ширяют возможности фармакогностического анализа, считаем необходимым включить нормативные документы на них в последующее издание Государст-венной Фармакопеи.

  Проведенные исследования позволили разработать методические подходы (алгоритм) для изучения лекарственных растений народной медицины, облада-ющих сложной таксономией и аберратными формами размножения, образую-щих агамные комплексы и др. Схема 1., а также разработать нормативные доку-менты на перспективное лекарственное растительное сырье трава манжетки (проект Фармакопейной статьи и Инструкции по сбору и сушке), кроме того, проект общей Фармакопейной статьи  «RAPD-анализ лекарственного расти-тельного сырья».

  ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью RAPD-анализа  на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер измен-чивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между ви дами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и по-пуляционной изменчивости.

2. Изучена взаимосвязь между строением геномов видов рода манжетка и стабильностью химического состава БАВ. В качестве химических маркеров определены рутин, гиперозид, галловая и кофейная кислоты, агримониин, пролин и оксилизин.

3. Разработаны критерии  оценки подлинности и качества сырья – трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отчественной медицины, эти данные вошли в проекты Фармакопейной статьи и Инструкцию по сбору и сушке.

4. Изучение полифенольного состава травы манжетки от разных производящих видов показало его сходство и позволило  дать чёткие рекомендации по  сбору сырья.

5. Показана возможность применения RAPD для видоидентификации лекарст-венного растительного сырья и молекулярно-биологических методов для даль-нейшего изучения лекарственных растений на примере 17 видов сырья растений, относящихся к 11-ти родам и к 7-ми семействам. Разработан проект Общей Фармакопейной статьи «RAPD-анализ лекарственного растительного сырья».

6. Установлена возможность использования применения секвенирования ДНК перспективных и лекарственных растений с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и  интрон гена petD (petB-petD) и  на примере рода Аnthylis L.,и проведен филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.

7. Выявлено отсутствие токсичности и определена специфическая активность настоя травы манжетки.

8. Определена урожайность перспективного сырья – трава манжетки: при еже-годных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий, она состав-ляет  до 5,5  ц/га.

9. В  результате проведенного фармакогностического изучения перспективных лекарственных растений с использованием  молекулярно-биологических мето-дов  обобщенны экспериментальные данные и дано теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения при комплексном изучении пер-спективных лекарственных растений, применяемых в народной медицине.

10.  Разработан алгоритм изучения сложных в таксономическом отношении ви-дов и родов этих растений в том числе и обладающих аберратными формами размножения.

  Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Баева В.М. Динамика накопления дубильных веществ цветков иван-чая узко-листного по фазам онтогенеза.-Деп.во ВНИИМИ, МРЖ, № 6, 1986, раздел ХХП, публ.1051.

2. Баева В.М., Барабанов Е.И. «Микроэлементный состав иван-чая узколист-ного и препарата “Ханерол” // Фармация, 1994, № 6.-С.4-6.

3. Баева В.М., Павкин А.В.”Морфолого-анатомические особенности строения представителей рода манжетка”.-Сб.”Актуальные вопросы медицины”- Материалы Всероссийской студенческой конференции, посвященной 50-летию АМН России, 4-6 октября 1994.М., 1994. – С.60.

4. Баева В.М., Сасов С.А.”Сравнительное изучение химического состава пред-ставителей рода манжетка”.- “Современные аспекты изучения лекарственных растений”. - Научные труды, т. ХХХ1У, М.- 1995.- С.242-244.

5. Баева В.М., Боброва В.К.”Сравнительное изучение геномов представителей рода манжетка”.- Материалы докладов Российской национальной конференции “Формирование приорететов лекарственной политики”.М., 1995 28-29 июня. – С.165-166.

6. Баева В.М., Боброва В.К.”Геномный анализ рода манжетка”.- Тезисы док-ладов Первого международного симпозиума “Новые и нетрадиционные рас-тения и перспективы их практического использования” (1-5 августа 1995 г) Пущино – 1995.- С.24-25.

7. Баева В.М. “Изучение манжеток ботанического сада ММА им. И.М.Сече-нова” “Лекарственные растения ботанического сада” – Материалы тезисов научной конференции, посвященной 50-летию ботанического сада ММА  им. И.М.Сеченова.- М., 1996. – С.40.

8. Баева В.М., Боброва В.К. «RAPD – перспективный анализ для изучения лекарственных растений». – Научные труды: «Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях», т. ХХХ1У, часть П. М., 1997.-С.174-177.

9. Баева В.М., Володин Ю.Ю., Толкачёв В.Н. Спектрофотометрическое опре-деление суммы флавоноидов манжетки // Международный конгресс по анали-тической химии 15-21 июня 1997 г. Тесизы докладов, М., 1997. – Россия. Абстракт, № 2. – С.46.

10. Баева В.М., Боброва В.К., Троицкий А.В., Антонов А.С. RAPD-анализ ДНК рода манжетка // Фармация, 1998 № 2.- С.38-41.

11. Баева В.М. Перпективы применения геномного анализа для изучения лекарственных растений // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г. – С. 345.

12. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для опреде-ления качества лекарственного растительного сырья».  У Российский нацио-нальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г.- С.346.

13. Баева В.М., Глазунова К.П. Манжетка обыкновенная –перспективное ле-карственное растение // У Российский национальный конгресс «Человек и ле-карство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998. – С.358.

14. Баева В.М., Сасов С.А. Флавоноидный состав цветков иван-чая узко-листного // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Тезисы докладов, М., 21-25 апреля 1998.- С. 358-359.

15. Баева В.М. Микроэлементный состав травы манжетки // Материалы науч-но-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные на-правления и перспективы развития». МЗ РФ. М., 14-16 мая 1998. – С.109.

16. Баева В.М., Глазунова К.П. «Применение пыльцевого анализа для опреде-ления загрязнённости лекарственного растительного сырья». Сб. «Фармацевти-ческая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения». Научные тру-ды, том ХХХУП, ч. П, М., 1998.- С.145-149.

17. Baeva V.M., Sepp S., Antonov A.S. et and. Genetic and morfological variabiliti in same microspecies of agamous Alchemilla L. Ineternacional Symposium “Plant Evolution in Man-made Habitats. – August 10-15.1998. – S. 93.

18. Баева В.М., Глазунова К.П. Изучение морфо-генетической изменчивости у видов рода манжетка // Сб. «Современные проблемы фармацевтической науки и практики». Научные труды, том ХХХУШ, ч. П. М., 1999.- С.155-158.

19. Баева В.М., Коваленко Т.Ф. RAPD-анализ листьев дуба // Сб. «Фармация на современном этапе – проблемы и достижения». Научные труды, том ХХХ1Х, часть П, М., 1999. – С.196-198.

20. Баева В.М.,Можайский А.М. Изучение полифенольного состава водных из-влечений травы некоторых видов манжетки // Фармация, 2001, № 5.– С. 25-26.

21.  Баева В.М., Козин С.В. Изучение токсичности настоя травы манжетки // УШ Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов М., апрель 2001. – С.442.

22. Баева В.М., Сасов С.А., Ярцева И.В. Изучение полифенольного состава травы манжетки // У1 Симпозиум по фенольным соединениям 28-30 апреля 2004 Москва. Тезисы докладов М., 2004.- С.96.

23. Баева В.М. «Лечение растениями. Основы фитотерапии». М., 2004.- С.202.

24. Баева В.М., Потанина О.Г., Самылина И.А., и др. Пыльца, как  анатомо-диагностический признак при определении подлинности лекарственного рас-тительного сырья // Материалы съезда  и конференции. 9-й международный  съезд «Фитофарм 2005». Конференция молодых учёных Европейского фито-химического общества (Растения и  здоровье).С.-Петербург 22-25 июня 2005 г.- С.283-289.

25. Баева В.М.Полиморфизм  лекарственных  растений // Фармация, 2005, № 6.- С. 40-42.

26. Баева В.М. Изучение запасов перспективного лекарственного сырья - трава манжетки //«Традиционная медицина - 2007». Сб.научн.трудов конгресса, посвя-щенного 30-летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии.Москва, 1-3 марта 2007.-С.30-32.

27. Баева В.М., Сасов С.А.Полифенолы травы манжетки // Фармация, 2007, № 8.- С. 9-10.  .

28. Баева В.М., Мурин И.И.Изучение аминокислотного состава настоя и порош-ка травы манжетки //«Традиционная медицина» № 1 [8] 2007.- С.53-56.

29. Баева В.М. Использование методов молекулярной биологии для идентифи-кации лекарственного растительного сырья // «Традиционная медицина 2007». Сб. научн. трудов конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии. Москва, 1-3 марта 2007.-С.32-33.

30. Баева В.М., Ермакова В.А, Сорокина А.А., Самылина И.А.и др. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М., 2007.- С.672.

31. Баева В.М. Современный подход к изучению лекарственных растений // Сб. научных трудов.  Г.Москва 14-16 марта 2008 года. М .2008. - С. 268-271

32. Баева В.М. Фармакогностическое изучение и стандартизация сырья трава манжетки.//Сб. научных трудов.  Г.Москва 14-16 марта 2008 года. М .2008.- С.231-232.

33. Баева В.М., Сасов С.А. Полифенолы травы манжетки // Фармация. – 2007. - № 8.- С.9-10.

34. Монастырева Н.А., Баева В.М.Изучение состава полифенольного комплекса травы монарды методом ВЭЖХ.Тезисы итоговой научной студенческой конфе-ренции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Москва.2007.-С.-22.

35. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние настоя травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата – циклофосфаминда // Тезисы У Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»- Российская Федерация, г. Москва.- 2008.-с.307, 545 С.

36. Баева В.М., Вальехо-Роман К.М., Смигуллин Т.Х. Перспективы изучения лекарственных растений с использованием секвенирования ДНК на примере рода Anthyllis L.// Фармация.2009, № 3.- С.23-26.

37. Баева В.М., Монастырева Н.А. Применение RAPD-анализа для изучения лекарственного растительного сырья // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009, №2. – С. 29-31.

38. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние агримониина и суммы поли-фенолов, выделенных из травы манжетки, на общую токсичность противоопу-холевого препарата циклофосфамид // Российский биотерапевтический журнал. – 2009. - № 2 // Материалы УШ Всероссийской научно-практической конферен-ции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 21-22 апреля 2009 г.- С.55. 

 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.