WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

КЛИМОВ Николай Тимофеевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ДИОКСИДИНА И ДОКСИЦИКЛИНА И ИХ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ МАСТИТЕ

У КОРОВ

16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией

16.00.07 – ветеринарное акушерство и биотехника

репродукции животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Воронеж – 2009

Работа выполнена в отделе патологии воспроизводства и молочной железы и лаборатории экспериментальной фармакологии ГНУ Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии

Научные консультанты:        доктор ветеринарных наук, профессор

                                               Шабунин Сергей Викторович        

                                                заслуженный деятель науки РФ,

                                              доктор ветеринарных наук, профессор

Париков Виталий Александрович

                                             

       Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ

доктор ветеринарных наук, профессор

                                                Аргунов Муаед Нуртдинович

                                                заслуженный деятель науки РФ

                                                доктор ветеринарных наук, профессор

                                                Никитин Виктор Яковлевич

                                                доктор ветеринарных наук, профессор

                                                Турченко Алексей Николаевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет

Защита состоится «___» декабря 2009 г на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.01 во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте патологи, фармакологии и терапии Россельхозакадемии по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, д. 114-б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «___» ноября 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук                                        Т.И. Ермакова

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.

Актуальность темы. Воспаление молочной железы – мастит у коров имеет широкое распространение и наносит огромный экономический ущерб за счет снижения удоев, санитарных и технологических качеств молока, преждевременной выбраковки высокопродуктивных коров, заболеваемости новорожденных телят, затрат на лечение больных животных (Д.Д. Логвинов с соавт., 1970; Г.В. Зверева, 1971; В.И. Мутовин, 1974; Н.К. Оксамитный, 1982; В.И. Беляев с соавт., 1983; И.С. Загаевский, 1986; А.П. Солдатов, 1986; М.Г. Миролюбов, 1988; В.Я. Никитин, 1988; В.А. Париков, 1990; А.Я. Батраков, 1991; В.И. Слободяник, 1994; Г.Н. Кузьмин, 1995; В.В. Подберезный, 1995; Л.К. Попов, 1998; Н.Г. Гасанов, 1999; Л.Д. Демидова, 2002; В.П. Родин, 2002).

По данным Национального Совета по маститу США общий ущерб, наносимый этой болезнью, складывается из снижения молочной продуктивности – 70%, преждевременной выбраковки коров – 14%, ухудшения качества молока – 8%, увеличения расходов на лечение – 8%.

Наибольшую хозяйственно-экономическую проблему представляет субклинический мастит, встречающийся в 2-7 раз чаще, чем клинически выраженный. Он может регистрироваться у 20-80% лактирующих коров (В.А. Париков с соавт., 2000; В.К. Копытин с соавт., 2002).

Отечественной наукой и практикой достигнуты определенные успехи в решении проблемы мастита у животных. Разработаны и внедряются в производство методы ранней диагностики, профилактики и лечения данного заболевания путем применения различных антимикробных препаратов и физиотерапевтических средств (В.А. Париков, 1990; В.И. Слободяник,  1994; В.П. Иноземцев  1997).

Вместе с тем, несмотря на имеющиеся достижения, проблема мастита продолжает оставаться одной из актуальных для ветеринарной науки и практики. Длительное и повсеместное, а порой бессистемное применение химиотерапевтических средств, привело к снижению эффективности лечения данного заболевания из-за образования лекарственно устойчивых штаммов микроорганизмов, вызывающих развитие воспалительного процесса (В.М. Ивченко, 1988; В.И. Слободяник с соавт., 1994; Г.Н. Кузьмин, 1995; А.И. Ивашура с соавт., 1998; В.Л. Юрков с соавт., 2001; В.Ю. Коптев с соавт., 2002 и др.).

В то же время, в борьбе с маститом практически нельзя обойтись без применения антимикробных средств, поскольку основными возбудителями заболевания являются различные патогенные микроорганизмы, к тому же часто обладающие полирезистентностью к большинству антибиотиков. Поэтому в решении проблемы профилактики и лечения этого заболевания в современных условиях разведения молочного скота необходимы дальнейшие исследования по изучению этиологической структуры мастита, выявлению связей между степенью микробной обсемененности молочной железы и выраженностью воспалительного процесса, разработке новых более эффективных антибактериальных препаратов и их фармако - токсикологической оценке в соответствии с современными требованиями. Крайне необходимо формирование новых подходов к использованию антимикробных средств в зависимости от степени пораженности молочных стад маститом и новых принципов антибактериальной терапии, включая выбор оптимальных доз, продолжительности курса лечения. 

1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение и разработка новых средств и  способов фармакотерапии и фармакопрофилактики мастита у коров. Для её достижения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение, формы проявления и этиологическую структуру мастита у коров в хозяйствах различных регионов России.

2. Установить показатели бактерицидности и микробной обсемененности кожи вымени у клинически здоровых коров и при заболевании субклиническим маститом.

3. Выявить эффективность использования средств неспецифической патогенетической терапии при субклиническом мастите у коров.

4. Обосновать состав и разработать препараты для лечения мастита у коров в период лактации на основе диоксидина, изучить их фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность.

5. Разработать препараты на основе доксициклина для профилактики мастита у коров и дать им фармако-токсикологическую оценку.

6. Разработать новые принципы оздоровления молочных стад от мастита в зависимости от уровня заболеваемости коров.

1.3. Научная новизна. Выявлено значение технологических факторов и патогенной микрофлоры в развитии воспалительного процесса в молочной железе при разной степени пораженности коров маститом. Показано, что преобладающим возбудителем заболевания является агалактийный стрептококк и золотистый стафилококк (в монокультуре и в ассоциациях), а также энтерококки. Впервые определена взаимосвязь микробной обсемененности молочной железы и заболеваемости коров маститом с бактерицидными свойствами кожи вымени. Созданы комплексные антибактериальные препараты на основе  диоксидина – диофур,  диеномаст и линдомаст для лечения коров, больных маститом, в период лактации и комплексные препарты пролонгированного действия на основе доксициклина – доксимаст и неодоксимаст для профилактики данного заболевания. Показано синергидное антибактериальное действие компонентов разработанных препаратов, дана их фармако-токсикологическая и клиническая оценка. Определена перспективность использования созданных препаратов в ветеринарной практике.

Определена эффективность терапии коров, больных субклиническим маститом, общестимулирующими патогенетическими средствами.

Научная новизна подтверждена тремя патентами на изобретения: (№ 2048805, №2350332 и №2367433).

1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследований. На основании результатов исследований разработаны и предложены производству эффективные антибактериальные препараты (диофур, диеномаст, линдомаст) и способ лечения мастита у коров в период лактации, обеспечивающие выздоровление соответственно 93,6 и 83,7% животных, а также для его профилактики (доксимаст, неодоксимаст), позволяющие предупредить развитие мастита у 92,4 - 97,0 % коров.

Материалы исследований вошли в «Комплексную экологически безопасную систему ветеринарной защиты здоровья животных», - М., 2000; «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров», одобренные бюро Отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 июня 2005г (протокол №3), а также в нормативную документацию и наставление по применению диофура в ветеринарии, утвержденного 1 июня 1999г (регистрационный номер ПВР -2-1.9/00081) и Инструкцию по применению диеномаста для лечения мастита у коров, утвержденную 18 июня 2007г (регистрационный номер ПВР-2-0.2/01043).

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и одобрены на: VIII Всероссийском симпозиуме по машинному доению сельскохозяйственных животных (Оренбург, 1995); Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию организации ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005); Международной научно-производственной конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения проф. А.А. Авророва «Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных» (Воронеж, 2006); Республиканской научно-производственной конференции посвященной 90-летию со дня рождения И.Ф. Заянчковского «Актуальные проблемы физиологии и патологии размножения животных» (Уфа, 2007); 1-ом съезде ветеринарных фармакологов России «Достижения ветеринарной науки – на вооружение практическому животноводству» (Воронеж, 2007); научно-практической конференции «Проблемы повышения продуктивного долголетия животных» (Курган, 2007); XIV международном симпозиуме по машинному доению сельскохозяйственных животных (Углич, 2008); Международной научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения проф. В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных» (Воронеж, 2009); Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию образования факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета «Достижения современной ветеринарной науки и практики в области охраны здоровья животных» (Краснодар, 2009).

1.6. Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 35 печатных работах, в том числе в 10 статьях ведущих научных журналов, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 2 монографиях и в 3 патентах.

1.7. Основные положения, выносимые на защиту:

- этиологическая структура мастита у коров в зависимости от уровня их заболеваемости;

- бактерицидность и микробная обсемененность кожи вымени клинически здоровых лактирующих коров и при заболевании их маститом;

- фармако-токсикологическая и клиническая характеристика комплексных антимикробных препаратов на основе диоксидина для терапии мастита у коров в период лактации;

- фармако-токсикологическая оценка и клиническая характеристика антибактериальных препаратов на основе доксициклина для профилактики мастита у коров;

- этапная фармакотерапия и фармакопрофилактика в комплексной системе оздоровления молочных стад от мастита.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 271 страницах текста в компьютерном исполнении, включает обзор литературы, материал и методы исследований, результаты собственных исследований и их анализ, выводы, практические предложения, список литературы, содержащий 531 источник, в том числе 169 зарубежных авторов, и приложения. Диссертация содержит 69 таблиц и 18 рисунков.

  1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научные исследования выполнены в 1990-2008 гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии по заданиям: 04.03 (номер гос. регистрации 01.9.40.00.75.89), 04.03 Д (номер гос. регистрации 01.9.90001257), 04.01.03 (номер гос. регистрации 01.200.117018), 08.04. (номер гос. регистрации 15070.36660226906).

Для изучения степени распространения и форм проявления мастита у коров проведено клиническое обследование 7355 коров 15 хозяйств Белгородской, Воронежской, Липецкой и Орловской областей. Диагноз на заболевание устанавливали в соответствии с «Наставлением по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров» (М., 2000).

Этиологическая структура мастита у коров изучалась путём бактериологического исследования секрета из 112 пораженных маститом долей вымени в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» (М., 1983).

Изучение бактерицидности и микробной обсеменённости кожи вымени у здоровых и больных маститом коров во взаимосвязи с показателями титра лизоцима М и количества соматических клеток в молоке и секрете выполнено на 30 коровах. Бактерицидные свойства кожи вымени определяли по методике Н.Н. Клемпарской и О.Г. Алексеевой (1959) в модификации А.А. Гинзбург (1976), титр лизоцима М по В.И. Мутовину (1974), подсчёт соматических клеток  на приборе «Фоссоматик».

Разработка рационального метода патогенетической терапии у коров с использованием ПДЭ, АСД-2Ф и витаминных препаратов проведена на 244 животных. Использовали клинические, бактериологические и иммунологические методы. Определение суммарных иммуноглобулинов осуществляли цинк-сульфатным методом (М.А. Воловенко, 1975).

Разработка новых антибактериальных препаратов на основе диоксидина и доксициклина осуществлялась на основе определения антимикробной активности отдельных компонентов и различных сочетаний, определения их фармакодинамики и фармакокинетики.

Антимикробную активность изучали методом серийных разведений (В.И. Антонов, 1981) и дисков в отношении референтных и полевых штаммов микроорганизмов – основных возбудителей мастита.

Изучение острой и хронической токсичности препаратов проведено общепринятыми методами (М.П. Беленький, 1963; И.В. Саноцкий, 1970; О.Н. Елизарова, 1971) на половозрелых нелинейных разнополых белых мышах с массой тела 20-22 г (n=660), белых крысах с массой тела 110-220 г (n=800).

Общетоксическое действие препаратов оценивали по динамике массы тела животных при взвешивании 1 раз в неделю, гематологическим показателям и состоянию системы гомеостаза – по окончании курса инъекций и через неделю восстановительного периода.

Гематологические исследования проведены по общепринятым методам, биохимические – в соответствии с «Методическими указаниями по применению унифицированных биохимических методов исследований крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях» (М., 1981).

Раздражающее действие препаратов на кожу изучали на кроликах методом кожных и конъюнктивальных проб, а их аллергенные свойства определяли с помощью кожно-провокационной пробы (О.Л. Алексеева, Л.А. Дуева, 1978).

Влияние препаратов, разработанных на основе диоксидина,  на молочную железу лактирующих коров изучено на 9 клинически здоровых коровах на 3-5 месяце лактации.

Исследования по установлению времени нахождения компонентов препаратов в секрете молочной железы, крови и моче проведены на 18 лактирующих коровах. В секрете молочной железы, крови и моче определеляли содержание диоксидина, фурациллина, гентамицина сульфата и линкомицина гидрохлорида, входящих в состав препаратов, через 12; 24; 36; 48; 60; 72 и 96, 120 часов после их введения. Определение содержания  гентамицина сульфата и линкомицина гидрохлорида проводили микробиологическими методами диффузии в агар, а концентрацию диоксидина и фурацилина – хроматографически. При проведении исследований руководствовались «Методическими указаниями по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» № 3049-84 от 29.06.84.

Клинико-фармакологическая оценка разработанных препаратов и их компонентов проведена на 138 коровах, больных субклиническим маститом, и 117 коровах, больных клинически выраженным катаральным маститом на базе ЗАО «Манино Воронежской, ЗАО «Должанское» и ОАО «Роговатовская Нива» Белгородской, СПК «Здоровецкий» и АОНП «Успенское» Орловской областей.

Препараты вводили внутрицистернально по 10 мл один раз в сутки в течение 3-4 дней. Оценка эффективности лечения осуществлялась путем клинического обследования молочной железы, количественного определения соматических клеток в молоке методом Прескотта-Брида, а также с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы ДеЛаваль и постановки пробы отстаивания.

Терапевтическая эффективность диофура определена на 72 коровах, больных субклиническим (n=36) и клинически выраженным катаральным маститом (n=36) в сравнении с мастисаном А и 1% диоксидином.

Определение эффективности применения диеномаста и его компонентов для терапии субклинического и клинически выраженного катарального мастита проведено на 81 больных коровах.

Изучение терапевтической эффективности линдомаста и его компонентов проведено на 102 больных субклиническим и клинически выраженным катаральным маститом.

Производственная оценка эффективности диофура, диеномаста и линдомаста проведена на 642 больных маститом коровах (199 - субклиническим, 171- клиническим выраженным катаральным, 143 - гнойно-катаральным и 129 - серозным).

Изучение эффективности применения доксимаста для профилактики мастита в послеродовый период проведено в сравнении с препаратом септогель на 370 коровах переводимых в сухостой. Препараты вводили внутрицистернально однократно после последнего доения.

Изучение эффективности применения неодоксимаста для профилактики мастита у коров после отела проведено на 80 коровах, разделенных по принципу аналогов на 4 группы. Животным первой группы (n=20) после последнего доения однократно внутрицистернально вводили неодоксимаст в дозе 10 мл, второй (n=20) – септогель, третьей (n=20) – орбенин ДС согласно наставлений по их применению, коровы четвертой группы (n=20) – служили в качестве отрицательного контроля и им препарат не вводили.

Профилактическую эффективность доксимаста и неодоксимаста определяли в первый день после отела по результатам исследования секрета молочной железы с 2% раствором мастидина и пробой отстаивания.

Гематологические, биохимические, иммунобиологические, бактериологические, фармакологические и токсикологические исследования проведены совместно с сотрудниками других подразделений института, за что автор выражает им свою признательность и благодарность.

Полученный цифровой материал подвергали математической обработке с помощью программы ExStat на ЭВМ РС АМD K7-800 Athlon.

Экономическую эффективность лечебно-профилактических мероприятий оценивали по «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (М., МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 1997).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Распространение и формы проявления мастита у коров в хозяйствах с различной технологией их содержания и использования

Установлено, что заболеваемость коров маститом в хозяйствах различная и колеблется от 7,1 до 60,3%. В целом из 7355 обследованных коров мастит диагностирован у 2598 животных, что составляет 34,9%. На долю субклинического мастита приходится 79,1% и на долю клинически выраженного – 20,9%.

При этом следует отметить, что в хозяйствах с уровнем молочной продуктивности свыше 6500 кг заболеваемость маститом наименьшая и составляет в среднем 15,26%, менее 4500 кг наибольшая - 46,78%, от 4500 кг до 6500 кг молока - 35,93%. То есть, чем ниже заболеваемость коров маститом, тем выше их молочная продуктивность.

Заболеваемость маститом коров чёрно-пестрой породы составила 32,51%, а симментальской – 41,23%. При этом заболеваемость коров черно-пёстрой породы с уровнем продуктивности 6000 кг и выше составила 20,3%, а 4600 кг и менее – 53,05%, а коров симментальской породы с продуктивностью более 5000 кг 35,80%, 4300 кг и менее 43,0%.

Нами также установлено, что при привязном содержании и доении коров на линейной доильной установке заболеваемость маститом составляет 37,3%, при беспривязном содержании и доении в доильных залах, оснащенных в основном импортной доильной техникой, – 30,3%. При грубых нарушениях в технологии машинного доения заболеваемость животных маститом возрастает до 52,5%, а при соблюдении технологии доения составляет менее 10,0%.

По уровню заболеваемости коров сельхозпредприятия (молочные фермы) можно разделить на три группы: первая заболеваемость превышает 30%, вторая – составляет 10-30% и третья менее 10%.

Наибольшая заболеваемость коров маститом (более 30%) отмечена в период лактации и при запуске. Особенно это выражено в тех хозяйствах, где недостаточно внимания уделяется диагностике и профилактике этого заболевания, а также соблюдению технологии доения независимо от использованных доильных систем (запоздалое или преждевременное подключение доильного аппарата, несвоевременное снятие доильных стаканов с вымени, использование изношенной сосковой резины). В то же время при полном соблюдении технологии машинного доения и отсутствии погрешностей в работе доильной техники уровень заболеваемости маститом составляет менее 10%, при времени доения одной коровы не более 5 минут.

Проведенными исследованиями установлено, что при отсутствии антисептической обработки сосков вымени коров после доения заболеваемость маститом в среднем составила 35,2%, а при её наличии - 22,6%. Это свидетельствует как о необходимости проведения данной процедуры, так существенной роли микрофлоры в возникновении и развитии воспалительного процесса в молочной железе.

Также следует отметить, что даже при соблюдении технологии доения коров на самом современном доильном оборудовании, заболеваемость маститом при ежемесячном обследовании составляет 7,1-9,3%, что также указывает на ведущую роль микрофлоры окружающей среды в этиологии мастита.

3.2. Этиологическая структура мастита у коров

Бактериологическими исследованиями 112 проб секрета пораженных маститом долей вымени выделено 121 культура микроорганизмов 15 видов и один вид микроскопических грибов. Из числа выделенных культур 54,9% представлены грамположительными кокками, а остальные 45,1% –представителями семейства Enterobacteriaceae и Ps. aeruginosa. Доминирующими были стафилококки – 28,6%, стрептококки – 22,6% и энтерококки – 19,2%. Монокультуры выделены в 59,3%, в том числе Str. аgalactiae – 19,1%, Staph. аureus – 16,5%, Ent. faecium 15,7%, Str. dysgalactiae – 3,5%, Staph. haemolyticus – 2,6% и Staph. epidermidis – 1,7%.

Такие микроорганизмы как Ps. aeruginosa, Staph. saprophyticus, Ent. aerogenes, C. diversus выделены в ассоциациях со стафило- и стрептококками, реже друг с другом в 40,9%.

При анализе данных бактериологических исследований от больных маститом коров установлено (табл. 1), что этиологическая структура несколько различается.

Таблица 1

Контаминация секрета вымени в зависимости от уровня

заболеваемости коров маститом

Возбудитель

Заболеваемость, %

до 10

10-30

свыше 30

проб

%

проб

%

проб

%

Staph. aureus

2

13,3

13

30,9

4

7,3

Staph. haemolyticus

2

13,3

1

2,4

-

Staph. epidermidis

-

-

-

-

2

3,6

Str. agalactiae

7

46,7

15

35,7

-

Str. dysgalactiae

-

-

4

9,5

-

Ent. faecalis

-

-

1

2,4

9

16,3

Staph. aureus + Str. agalactiae

4

26,7

2

4,8

-

Staph. aureus + Ps. aerug.

-

-

-

-

8

14,5

Staph. sapr. + Ps. aerug.

-

-

-

-

4

7,3

Ent. faecalis + Klebsiella

-

-

-

-

1

1,8

Ent. faecium + C. diversus

-

-

-

-

1

1,8

Ent. faecium +Ent. aerogenes

-

-

-

-

3

5,5

Ent. aerogenes + C. diversus

-

-

-

-

1

1,8

E. сoli

-

-

-

-

4

7,3

E. сoli + C. diversus

-

-

-

-

2

3,6

Micrococcus

-

-

2

4,8

-

Citrobacter diversus

-

-

-

3

5,5

Сandida

-

-

-

3

5,5

Микрофлора не выделена

-

-

4

9,5

10

18,2

Всего

15

42

55

Так, при заболеваемости маститом коров менее 10%, патогенная микрофлора выделена в 100% случаев: Staph. aureus 13,3%, Staph. haemolyticus 13,3%, Str. agalactiae 46,7%, смешанная микрофлора (Staph. aureus + Str. agalactiae) 26,7%.

В сельхозпредприятиях, где заболеваемость коров маститом составляет 10-30%, установлен рост микрофлоры в 90,5 % случаев (38 проб), которая была представлена патогенными стрепто - и стафилококками (Str. agalactiae – 35,7%, Staph. aureus – 30,9%, Staph. haemolyticus 2,4%, и их ассоциациями в 4,8%), а также Micrococcus – 4,8%, Str. dysgalactiae – 9,5%, Ent. faecalis 2,4%, не являющиеся основными патогенами молочной железы. Таким образом, в хозяйствах, где уровень заболеваемости маститом составляет 10-30%, патогенная микрофлора выделена в 73,8% проб секрета вымени и  условно-патогенная – 16,7%.

При заболеваемости коров маститом свыше 30% микрофлора выделена из 81,8% случаев. Из выделенных культур на долю патогенных приходилось 32,7%  (Staph. aureus в монокультуре –7,3 % и в ассоциации с Ps. aeruginosa – 14,5%; E. сoli в монокультуре – 7,3%; E. сoli + C. diversus – 3,6%), условно-патогенных – 23,6% (Ent. faecalis – 16,3%; Ent. faecalis+ Klebsiella – 1,8; Citrobacter 5,5%), сапрофитных -20,0% (Staph. saprophyticus + Ps. aeruginosa – 7,3%; Staph. epidermidis – 3,6% Ent. Аerogenes + C. diversus – 1,8%, Ent. faecium + C. diversus 1,8%; Ent. faecium + Ent. aerogenes – 5,5%;) и грибы (Сandida) - 5,5%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при уровне заболеваемости коров маститом        до 10%, из всех проб секрета вымени выделена патогенная кокковая микрофлора, как в монокультуре (Str. agalactiae 46,7%, Staph. aureus 13,3%, Staph. haemolyticus 13,3%), так и ассоциации (Staph. aureus + Str. agalactiae 26,7%).

При уровне заболеваемости от 10% до 30% кроме патогенной микрофлоры (73,8%), выделена и условно-патогенная 16,7%, в 9,5% проб микрофлора отсутствовала.

При уровне заболеваемости коров маститом свыше 30% патогенная микрофлора (Staph. aureus, E. сoli) выделена в 32,7% случаев, условно-патогенная (C. diversus, Ent. faecalis,) – 23,6%, в 20,0% сапрофитная (Staph. saprophyticus, Staph. epidermidis, Ent. аerogenes, Ps. aeruginosa), грибы (Саndida) 5,5%, и в 18,2% проб микрофлора отсутствовала.

Следовательно, в сельхозпредприятиях с уровнем заболеваемости коров маститом до 30% основным фактором вызывающим развитие мастита (100-90,5%) является воздействие на молочную железу патогенной и условно-патогенной микрофлоры с преобладанием стафило - и стрептококков (73,8%-100%), среди которых доминировали Str. agalactiae и Staph. aureus как в монокультуре, так и в ассоциациях.

В сельхозпредприятиях с более высоким уровнем заболеваемости маститом основными факторами, способствующими его возникновению, являются грубые нарушения в технологии машинного доения коров с последующим инфицированием молочной железы не только патогенной и условно-патогенной, но даже сапрофитной микрофлорой. Кроме того, отсутствие микрофлоры в 17,2% случаев свидетельствует о том, что вначале мастит начинает развиваться как асептический, а затем при инфицировании микрофлорой как инфекционный процесс различной степени тяжести.

Выявленная нами роль технологических факторов и патогенной микрофлоры в степени проявления патологических реакций со стороны молочной железы свидетельствует о необходимости выработки более рациональных подходов к решению проблемы терапии и профилактики воспалительных заболеваний данного органа. Разрабатываемые программы по снижению заболеваемости коров маститом должны учитывать особенности каждого сельхозпредприятия и степень заболеваемости маститом.

3.3. Бактерицидность и микробная обсемененность кожи вымени

здоровых и больных маститом коров

Изучение бактерицидности кожи молочной железы у коров проведено нами при разном её функциональном состоянии.

Установлено, что бактерицидность кожи вымени у клинически здоровых животных в различные функциональные периоды молочной железы снижается от начала лактации к запуску. Так, наибольшая величина индекса бактерицидности кожи отмечена нами в первую неделю после родов 91,8±2,0%. С началом лактации индекс бактерицидности снижается до 87,8±2,4% и остается практически неизменным до середины лактации. В конце лактации бактерицидность кожи уменьшается до 79,7±2,3 % (Р<0,05), что на 12,1 % ниже уровня этого показателя в первую неделю после родов. У запускаемых коров отмечается тенденция дальнейшего снижения этого показателя по сравнению с лактирующими коровами, что связано вероятно, с ослаблением активности всей системы неспецифической резистентности.

При изучении показателей естественной резистентности молочной железы и микробной обсемененности её кожи у клинически здоровых и больных маститом лактирующих коров  установлено, что у коров, больных субклиническим маститом, из секрета пораженных долей выделены патогенные микроорганизмы, количество соматических клеток достигало 6585,0± 133,5 тыс./мл, индекс бактерицидности кожи вымени данных долей оказался ниже в 1,5 раза, а обсемененность её микрофлорой выше в 2,9 раза, чем у клинически здоровых животных (табл. 2).

Установлено также, что индекс бактерицидности и микробная обсемененность кожи вымени оказались значительно измененными и в непораженных смежных с больными долях. Так, индекс бактерицидности этих долей оказался ниже на 20,0% (74,5±6,5%), а бактериальная обсемененность – на 66% больше (560,8±128,5 тыс. КОЕ), в сравнении со здоровыми животными.

Следовательно, развитие воспалительного процесса происходит на фоне понижения бактерицидной активности кожи и повышения её бактериальной обсемененности, как пораженных долей, так и всей молочной железы. При этом показатели бактерицидности кожи и её бактериальной обсемененности находятся в тесной взаимосвязи с количеством соматических клеток и титром лизоцима М (табл. 2).

Таблица 2

Показатели естественной резистентности и микробной обсемененности кожи вымени здоровых и больных субклиническим маститом коров

Показатели

Клинически здоровые,

Больные субклиническим маститом

непораженные

доли

пораженные

доли

Титр лизоцима М, мм

22,5±0,3

21,8±0,7

16,1±1,9*

Количество соматич. клеток, тыс/мл

124,3±12,4

384,0±10,6*

6585,0±133,5

Индекс бактерицидности, %

84,2±1,9

74,5±6,5

54,5±5,3*

Обсемененность, тыс, КОЕ

337,6±19,1

560,8±128,0

985,0±150,0*

* Р < 0,001 по сравнению с клинически здоровыми

При изучении роли показателей бактерицидности и микробной обсемененности кожи вымени в возникновении скрыто протекающего воспалительного процесса, проведенные в течение двух месяцев лактации, установлено, что индекс бактерицидности кожи вымени в области пораженных долей уже за неделю до заболевания снизился в 1,35 раза (Р<0,001) по сравнению с исходным уровнем, а интактных долей этих коров 17,5% (табл. 3).

Таблица 3

Бактерицидность кожи вымени коров до и при заболевании маститом

Время исследования

Бактерицидность кожи вымени, %

Клинически здоровые коровы

заболевшие субклиническим маститом

непораженные доли

пораженные доли

За 3 недели до заболевания

85,5±2,1

88,5±3,7

90,2±3,4

За 2 недели до заболевания

85,2±3,3

89,1±3,2

88,5±4,3

За 1 неделю до заболевания

88,1±2,5

75,3±5,5

66,4±6,9*

В день заболевания

85,1±4,0

74,5±6,5

55,4±5,3*

       *-Р <0,05-0,001 по сравнению с клинически здоровыми

Аналогичная закономерность выявлена и в количестве микробной обсемененности кожи (табл. 4). Так, за неделю до заболевания обсемененность кожи вымени микрофлорой возросла с 301,7±60,9 до 670,0±150,0 тыс. КОЕ или в 2,2 раза (Р<0,05), а в день заболевания до 985,0±150,0 тыс. КОЕ или в 3,3 раза. В непораженных долях заболевших маститом коров этот показатель возрос на 20%.

Одновременно установлено, что уже за неделю до заболевания коров маститом в секрете молочной железы отмечается увеличение соматических клеток с 152,6±57,5 тыс/мл до 358,3±95,8 или в 2,2 раза и в день заболевания в пораженных долях до 9253±1934 тыс/мл или в 5,8 раза (Р<0,001), а в непораженных долях до 446,2±92,9 тыс/мл или 2,9 раза. Титр лизоцима М снизился с 22,7±0,2 мм до 16,2±1,9 или в 1,4 раза (Р<0,05). Только в день заболевания и только в пораженных долях.

Таблица 4

Обсемененность кожи вымени микрофлорой до и при заболевании маститом

Время исследования

Обсемененность кожи вымени микрофлорой, тыс. КОЕ/мл

клинически здоровые

заболевшие субклиническим маститом

непораженные доли

пораженные доли

За 3 недели до заболевания

406,2±56,4

347,5±264,5

301,7±60,9

За 2 недели до заболевания

325,4±55,5

550,0±159,6

200,0±47,4

За 1 неделю до заболевания

338,3±39,6

578,3±168,1

670,0±150,0*

В день заболевания

300,0±58,7

560,0±128,3

985,0±150,0*

*-Р <0,05  по сравнению с клинически здоровыми

Полученные нами данные свидетельствуют, что показатель бактерицидности кожи вымени обладает большей реактивностью по сравнению с титром лизоцима М и количеством соматических клеток.

Анализ литературных данных и собственных исследований позволяет сделать вывод, что в возникновении воспаления в молочной железе коров главную роль играет изменение взаимодействия двух факторов - неспецифической резистентности молочной железы и патогенной микрофлоры окружающей среды. В частности, снижение бактерицидной активности кожи (в 1,5 раза) или увеличение патогенности микроорганизмов способствует увеличению обсемененности молочной железы (в 2,9 раза) и проникновению в неё возбудителей мастита главным образом через сосковый канал. Поэтому показатели бактерицидности и микробной обсемененности кожи, отражающие состояние локальной естественной резистентности, может служить тестом для выявления патологического состояния организма и молочной железы, а разработка профилактических мероприятий, должна базироваться на применении средств, повышающих общую и локальную резистентность и снижающих микробную обсемененность вымени, подавляющих патогенное действие микроорганизмов.

3.4. Эффективность использования средств неспецифической

патогенетической терапии субклинического мастита у коров

В качестве средств, стимулирующих общую неспецифическую резистентность организма, факторы локальной защиты молочной железы коров и позволяющих тем самым ликвидировать воспалительный процесс использовали препарат плаценту эмульгированную денатурированную (ПДЭ) и антисептик стимулятор Дорогова фракция-2 (АСД-2Ф).

В экспериментальных исследованиях, выполненных на 45 животных, одной группе пятикратно подкожно с интервалом 48 часов вводили ПДЭ в дозе 20 мл, второй – внутримышечно трижды с интервалом 48 час 15% АСД-2Ф на тетрагидровите в дозе 10 мл и третьей группы в первый, третий и пятый дни лечения подкожно вводили ПДЭ по 20 мл, а на второй, четвертый и шестой дни - внутримышечно 15% АСД-2Ф в дозе 10 мл.

Выявлено, что эффективность применения ПДЭ и АСД-2Ф оказалась недостаточной и составила соответственно 60,0 и 53,3%.

Наилучший эффект при субклиническом мастите -87,6% достигнут при комплексном применении данных препаратов. У клинически выздоровевших животных отмечено увеличение индекса бактерицидности кожи вымени с 53,7 ±1,7% до 86,2±2,4 или в 1,4 раза (Р<0,001), снижением количества соматических клеток в молоке с 4178,0±1035,8 тыс/мл до 296,8±90,6 тыс/мл или в 6,3 раза (Р<0,01). Через сутки после выздоровления микрофлора отсутствовала в 60% проб молока, а через неделю у всех животных.

Комплексное применение ПДЭ и АСД-2Ф при лечении субклинического мастита сопровождалось достоверным увеличением в крови содержания общего белка на 9,48%, -глобулинов - на 16,28%, лимфоцитов -на 9,6%, при снижении уровня альбуминов - на 9,56% и эозинофилов - на 39,13%.

Производственные испытания эффективности комплексного метода лечения с использованием ПДЭ и АСД-2Ф проведены на 199 коровах, больных субклиническим маститом, подтвердили результаты экспериментальных исследований (табл. 5)

Таблица 5

Терапевтическая эффективность ПДЭ, 15% АСД-2Ф на тетрагидровите и  ПДЭ + 15% АСД-2Ф на тетрагидровите при субклиническом мастите

у лактирующих коров

Препарат

Подвергнуто лечению

Выздоровело

Осталось больных

коров

долей

коров

%

долей

%

коров

%

долей

%

ПДЭ

35

39

24

68,5

26

66,7

11

31,4

13

33,3

15% АСД-2Ф

35

38

20

57,1

21

55,3

15

42,9

17

44,7

ПДЭ+15% АСД-2Ф

129

144

108

83,7

117

81,3

21

16,3

27

18,7

Терапевтическая эффективность применения отдельно ПДЭ или 15%-ного АСД-2Ф при субклиническом мастите составила соответственно 68,5 и 57,1%, а при их комплексном использовании 83,7%.

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что разработанный нами комплексный метод лечения субклинического мастита у коров с использованием ПДЭ и АСД-2Ф в виде 15% раствора на тетрагидровите является достаточно эффективным и экологически безопасным.

Однако он требует продолжительного времени лечения (не менее 6 инъекций препаратов), дает эффект только при субклиническом мастите и не может быть использован при клинических формах воспаления вымени.

3.5. Разработка новых антимикробных лекарственных препаратов для лечения больных маститом коров и их фармако-токсикологическая и клиническая оценка

На основе химиотерапевтического средства диоксидин, проявляющего антимикробную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, нами подобрано три комбинации антимикробных средств, обладающих синергидным действием: диоксидин и фурацилин в соотношении 1:0,2; диоксидин и гентамицина сульфата 1:2, диоксидин и линкомицина гидрохлорид 1:4. На их основе были разработаны препараты для лечения мастита у коров в период лактации.

Диофур, включающий в себя следующие компоненты, масс.% диоксидин 1,0; фурациллин 0,2; вода дистиллированная до 100,0

Диеномаст, комплексный препарат, содержащий следующие компоненты, масс.%: диоксидин 1,0; гентамицина сульфат 2,0; воск – 5,0; масло вазелиновое до 100,0.

Линдомаст, комплексный препарат, содержащий следующие компоненты, масс.%: диоксидин 1,0; линкомицина гидрохлорид 3,0; моноглицерид мягкий 3,0; моноглицерид дистиллированный 3,0; масло вазелиновое до 100,0.

3.5.1. Антимикробная активность диофура, диеномаста и линдомаста

Определение анимикробной активности препаратов диофур, диеномаст и линдомаст проведено совместно с сотрудниками отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии и лаборатории диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний института.

Результаты исследований, приведенных в таблицах 6, 7, 8, свидетельствуют, что диофур обладает широким спектром  и высоким антимикробным действием в отношении основных возбудителей мастита в концентрации 0,98-7,8 мкг/мл, что превышает антимикробную активность диоксидина и фурациллина в 2-8 раз. Данная комбинация подавляет рост кокковой микрофлоры в концентрации 3,9-7,8 мкг/мл, а грамотрицательной – 0,98 мкг/мл (табл. 6).

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) диеномаста составляет 0,39-3,1 мкг/мл, что превышает антимикробную активность диоксидина и гентамицина сульфата в 2-32 раза, диеномаст ингибирует рост кокковой микрофлоры в концентрации 0,39-0,98 мкг/мл, а грамотрицательной – 0,39-3,1 мкг/мл (табл. 7).

Линдомаст подавляет рост исследованной микрофлоры в концентрации 3,1-25,0 мкг/мл (табл. 8), что превышает антимикробную активность диоксидина и линкомицина в отдельности в 2-16 раз.

Таблица 6

Антимикробная активность диоксидина, фурациллина и диофура

в отношении  основных возбудителей мастита

Штаммы

микроорганизмов

МИК, мкг/мл

Диоксидин

Фурацилин

Диофур

Staph. aureus  ВМ-57

15,6

31,25

7,8

Staph. aureus-589

7,8

31,25

3,9

Str. agalactiae-2646

15,6

31,25

7,8

Str. agalactiae-587

15,6

31,25

7,8

Ent. faecalis-2890

15,6

62,5

7,8

Ent. faecalis-2894

15,6

31,25

7,8

E. сoli-1640

7,8

15,63

0,98

E. сoli-1649

7,8

7,8

0,98

Таблица 7

Антимикробная активность диоксидина, гентамицина и диеномаста

в отношении основных возбудителей мастита

Штаммы

микроорганизмов

МИК, мкг/мл

Диоксидин

Гентамицина

Диеномаст

Staph. aureus-209 Р

25,0

1,56

0,39

Staph. aureus-589

25,0

3,1

0,78

Str. agalactiae-2646

12,5

3,1

0,78

Str. agalactiae-587

25,0

1,56

0,39

Ent. faecalis-2890

25,0

3,1

0,78

Ent. faecalis-2894

12,5

6,25

0,78

Ent. faесium-2899 

50.0

3,1

0,39

E. сoli-0138

50,0

0,78

0,39

E. сoli-866

12,5

6,25

3,1

E. сoli-643

50,0

0,78

0,39

Таблица 8

Антимикробная активность диоксидина, линкомицина и линдомаста

в отношении основных возбудителей мастита

Штаммы микроорганизмов

МИК, мкг/мл

Диоксидин

Линкомицин

Линдомаст

Staph. aureus-209 Р

25,0

12,5

6,3

Staph. aureus-589

25,0

6,3

3,1

Str. agalactiae-586

12,5

12,5

6,3

Str. agalactiae-587

25,0

25,0

3,1

Ent. faecalis-640

50,0

100,0

25,0

Ent. faecalis-2894

25,0

50,0

6,3

Ent. faесium-2899

50,0

50,0

32,5

E. сoli-644

50,0

100,0

25,0

E. сoli-643

50,0

100,0

25,0

Таким образом, разработанные новые антимикробные препараты для лечения мастита у коров диофур, диеномаст и линдомаст обладают высокой антимикробной активностью в отношении грамположительной и грамотрицательной микрофлоры, изолируемой из секрета молочной железы больных маститом коров.

3.5.2. Изучение параметров токсичности препаратов диофур, диеномаст и линдомаст

Определение параметров токсичности препаратов диофур, диеномаст и линдомаст в остром опыте выполнено совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной фармакологии института.

3.5.2.1. Острая токсичность препаратов

Пероральный способ введения. Препараты вводили однократно внутрь в дозах от 3500 до 30000 мг/кг веса в объеме для белых мышей - 0,6 мл, для белых крыс - 6 мл (диофур – 6000,0-30000,0 мг/кг, диеномаст – 5000,0-20000,0 мг/кг, линдомаст –  4500,0-22500,0 мг/кг массы тела). Дозы являются предельно допустимыми по объему для перорального введения.

При внутрижелудочном введении препаратов диофур, диеномаст и линдомаст в изученных дозах за весь период наблюдения (14 дней) гибели животных не отмечено.

Подкожный способ введения. При подкожном введении данные препараты вводили однократно в дозах от 10 до 50 г/кг массы тела в объеме 1,0 мл на мышь и 5,0 мл на крысу.

Полученные данные позволили определить параметры острой токсичности диофура, диеномаста и линдомаста при подкожном введении (табл. 9).

Таблица 9

Параметры острой токсичности диофура, диеномаста и линдомаста для

лабораторных животных  при однократном подкожном введении (мг/кг)

Вид

животных

Параметры токсичности

SLD50

МПД

LD16

LD50

LD84

LD100

Диофур

Белые мыши

20000,0

46645,6

61462,2

(54900 68100)

77517,0

85234,8

±3280,4

Белые крысы

21000,0

38848,9

61330,6

(5360069100)

85459,4

97112,0

±3866,0

Диеномаст

Белые мыши

4500

6166,7

11108,3

(901013200)

16227,2

18742,4

±1034,5

Белые крысы

5500

8048,4

12015,1 (1150013500)

16069,7

18075,0

±757,1

Линдомаст

Белые мыши

10500,0

11877,0

15170,1

(1340017000)

18326,2

19938,5

±878,0

Белые крысы

10000,0

11118,8

14017,5

(1260015500)

16755,0

19000,0

±702,7

Результаты проведенных исследований показывают, что диофур, диеномаст и линдомаст по степени токсичности относятся к IV классу опасности – вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76).

3.5.2.2. Хроническая токсичность

Установлено, что многократное подкожное введение диофура в дозе 1227 мг/кг, диеномаста - 240 мг/кг и линдомаста - 280,0 мг/кг (1/50 LD50), а также введение диофура в дозе - 6133 мг/кг, диеномаста - 1202 мг/кг и линдомаста - 1400,0 мг/кг массы тела (1/10 LD50 в остром опыте) не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии животных. Поведение, аппетит, частота дыхания у всех животных опытных групп, как в период применения препарата, так и в течение 10 дней после окончания применения оставались в пределах нормы. За период наблюдения у животных опытных групп не было отмечено нарушений функций пищеварения и мочеотделения.

Диофур. Скорость роста крыс опытных групп существенно не отличалась от скорости роста крыс контрольной группы. Среднесуточный прирост массы тела за весь период наблюдения (31 день) составил 103,8% при применении препарата в дозе 1227,0 мг/кг и 105,9% при применении препарата в дозе 6133 мг/кг массы тела по сравнению с контролем (рис. 1).

Рис. 1. Динамика изменения массы тела белых крыс при многократном подкожном введении диофура (% к исходной массе тела)

Диеномаст. Скорость роста крыс опытных групп существенно не отличалась от скорости роста крыс контрольной группы. Среднесуточный прирост массы тела за весь период наблюдения (31 день) составил 100,7% при применении диеномаста в дозе 240,0 мг/кг и 98,7% при применении препарата в дозе 1202,0 мг/кг массы тела по сравнению с контролем (рис. 2).

Рис. 2. Динамика изменения массы тела белых крыс при многократном подкожном введении диеномаст (% к исходной массе тела)

Линдомаст. Скорость роста крыс опытных групп существенно не отличалась от скорости роста крыс контрольной группы. Среднесуточный прирост массы тела за весь период наблюдения (31 день) составил 104,0% при применении препарата в дозе 280,0 мг/кг и 100,5% при применении препарата в дозе 1400 мг/кг массы тела по сравнению с контролем (рис. 3).

Рис. 3. Динамика изменения массы тела белых крыс при многократном подкожном введении линдомаста (% к исходной массе тела)

Таким образом, в течение курса применения диофура, диеномаста и линдомаста подопытные животные не отличались от контрольных животных по приросту массы тела. По окончании эксперимента статистически достоверных различий по массе тела животных контрольных и опытных групп также не обнаружено.

Коэффициенты массы внутренних органов крыс, которым применяли диофур и диеномаст, не отличались существенно от контроля. На 21 день применения линдомаста была отмечена тенденция увеличения коэффициента массы почек на 5,7% (доза 280,0 мг/кг) и на – 7,1% (доза 1400,0 мг/кг). Однако среднее значение этих показателей у крыс опытной группы не выходило за верхние границы нормы для данного вида и возраста животных.

При исследовании крови животных, получавших диофур в дозе 1227,0 и 6133 мг/кг массы тела, диеномаст – в дозе 240,0 и 1202 мг/кг и линдомаст – в дозе 280,0 и 1400,0 мг/кг, не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе крови, биохимических показателях по сравнению с показателями в крови животных контрольной группы.

3.5.3. Местно-раздражающее действие лекарственных препаратов

Установлено, что при однократной аппликации на кожные покровы кролика при плотности нанесения от 0,020 до 0,10 г/см2  диофур, диеномаст и линдомаст не вызывают повреждение кожи в виде эритемы или её отёков.

После инстилляции каждого препарата в отдельности не выявлено изменений в клиническом состоянии организма кроликов (температуры тела, частоты пульса и количества дыхательных движений), а также изменения кровенаполнения конъюнктивы, состояния роговицы и век, не отмечено лакримации и выделений.

При визуальной оценке состояния конъюнктивы, роговицы и век опытных животных установлено, что препараты вызывают слабое раздражение конъюнктивы спустя два часа после инстилляции, которое исчезало уже к 3 часу.

Длительное воздействие. Установлено, что длительное накожное применение основы и препаратов не приводит к изменению поведения и аппетита животных. Не отмечено различий температуры тела и живой массы во всех группах кроликов. Толщина складки выстриженной и выбритой кожи животных контрольной и опытной групп на протяжении 20-ти дневного срока наблюдения не отличалась. Накожное нанесение препарата и основы приводило к незначительному увеличению толщины кожной складки в пределах 0,5-1,9% по отношению к контролю и исходному состоянию.

Таким образом, разработанные нами препараты не оказывают раздражающего действия на кожу.

3.5.4. Аллергенные свойства диеномаста и линдомаста

В результате проведенных исследований аллергенных свойств диофура, диеномаста и линдомаста при наружном, конъюнктивальном и парентеральном способе применения установлено, что 20-кратная аппликация диофура, диеномаста и линдомаста не вызывает контактного дерматита, отсутствует реакция конъюнктивы сенсибилизированных и интактных морских свинок на инстилляцию препаратов, следовательно реакция гиперчувствительности к препаратам отсутствует.

3.5.5. Влияние препаратов на организм и молочную железу

лактирующих коров.

Проведенными исследованиями установлено, что интрацистернальное введение препаратов диофур, диеномаст и линдомаст в дозе 10 мл вызывает незначительное, проходящее в течение 48 часов раздражение тканей молочной железы у лактирующих коров, а в дозах 10 и 20 мл не оказывает существенного влияния на биохимические и морфологические показатели крови.

3.5.6. Фармакинетические параметры препаратов

диофур, диеномаст и линдомаст

Опыты проведены на 18 лактирующих коровах симментальской породы в условиях опытной станции ВГАУ. Коровам опытных групп интрацистернально вводили один из препаратов (диофур, диеномаст, линдомаст) по 10 мл пятикратно каждые 24 часа, животным контрольных групп препараты не вводили, они служили контролем.

Диофур. Остаточные количества препарата диофур в молоке определяли на спектрофотометре (СФ-46) при длине волны 475 нм.

Установлено, что активнодействующие компоненты диофура (диоксидин и фурациллин) не накапливаются в секрете молочной железы и выводятся из организма в течение 24 часов.

Диеномаст. Определение содержания диоксидина в молоке, крови и моче проводили спектрофотометрически с использованием калибровочных кривых, а гентамицина сульфата бактериологическим методом с использованием тест-культуры Bacillus pumilus NСТС-8241.

Установлено, что через 7 суток после пятикратного интрацистернального введения диеномаста в исследуемых биологических жидкостях (молоке, крови и моче) активнодействующие компоненты препарата диоксидин и гентамицина сульфат не обнаруживаются (рис. 4).

Таким образом, молоко в пищевых целях можно использовать на 7 сутки после последнего применения

Рис. 4. Содержание диоксидина и гентамицина в молоке коров

диеномаста при условии полного исчезновения признаков мастита, подтвержденного диагностическими тестами.

Линдомаст. У коров опытной и контрольной групп брали молоко, кровь и мочу для определения остаточных количеств диоксидина и линкомицина гидрохлорида через 1, 3, 5, 7 суток после последнего введения линдомаста.

Определение содержания диоксидина в молоке, крови и моче проводили спектрофотометрическим методом с использованием калибровочных кривых, содержание линкомицина гидрохлорида бактериологическим методом с использованием тест-культуры Bacillus subtillis ATCC 6633, после пятикратного введения линдомаста.

Установлено, что через 5 суток

Рис. 5. Содержание диоксидина и линкомицина в молоке коров

после пятикратного интрацистернального введения линдомаста в исследуемых биологических жидкостях (молоке, крови и моче) активнодействующие вещества диоксидин и линкомицина гидрохлорид не обнаруживаются.

Таким образом, молоко в пищевых целях можно использовать на 5 сутки после последнего применения линдомаста при условии полного исчезновения признаков мастита, подтвержденного диагностическими тестами.

3.5.7. Результаты клинических данных по применению препаратов для терапии больных маститом коров

Диофур. Опыт проведен на коровах 36 коровах с субклиническим и 36 с клинически выраженным катаральным маститом, которых в каждом случае разделили по принципу аналогов на три группы. Животным первой группы вводили мастисан А, второй - 1% раствор диоксидина, согласно наставления по применению и третьей группы – диофур интрацистернально один раз в сутки, в течение 3-4 дней в дозе 10 мл. Эффективность определяли после курса лечения по количеству выздоровевших животных (табл. 10).

Таблица 10

Терапевтическая эффективность диофура при мастите у лактирующих коров

Препараты

Подвергнуто

лечению

Выздоровело

Осталось больных

коров

долей

коров

%

долей

%

коров

%

долей

%

Субклинический мастит

Мастисан А

12

14

7

58,3

7

50,0

5

41,7

7

50,0

1% раствор диоксидина

12

15

8

66,7

10

66,7

4

33,3

5

33,3

Диофур

12

15

10

83,3

13

86,7

2

16,7

2

13,3

Катаральный мастит

Мастисан А

12

15

5

41,7

6

40,0

7

58,3

9

60,0

1% раствор диоксидина

12

15

7

58,3

9

60,0

5

41,7

6

40,0

Диофур

12

16

9

75,0

15

93,8

3

25,0

1

6,2

Эффективность применения мастисана А при субклиническом мастите составила 58,3%, а при катаральном 41,7%, при этом остались не излеченными 50,0 и 60,0% долей вымени.

При использовании 1% диоксидина выздоровление наступило у 66,7% коров, больных субклиническим и у 58,3% коров катаральным маститом, с излечением соответственно 66,7% и 60,0% пораженных долей вымени.

Терапия диофуром способствовала выздоровлению 83,3% коров, больных субклиническим маститом, что на 25,0 и 16,6% выше, чем при использовании мастисана А и 1% раствора диоксидина. При терапии катарального мастита лечебный эффект диофура был выше мастисана А и 1% диоксидина на 33,3 и 16,7% соответственно.

Диеномаст. Опыт проведен на 45 коровах с субклиническим и 36 с клинически выраженным катаральным маститом, которых в каждом случае разделили по принципу аналогов на три группы. Животным первой группы вводили 1% суспензию диоксидина, второй - 4% суспензию гентамицина сульфата и третьей – диеномаст.

Установлено (табл. 11), что использование суспензии 1% диоксидина коровам, больным субклиническим маститом, способствовало выздоровлению 60,0% коров, а при катаральном мастите - 58,3%.

Таблица 11

Терапевтическая эффективность диеномаста при мастите

у лактирующих коров

Препараты

Подвергнуто

лечению

Выздоровело

Осталось больных

коров

долей

коров

%

долей

%

коров

%

долей

%

Субклинический мастит

Суспензия диоксидина, 1%

15

19

9

60,0

12

63,2

6

40,0

7

36,8

Суспензия гентамицина сульфата, 4%

15

20

12

80,0

15

75,0

4

20,0

5

25,0

Диеномаст

15

20

14

93,3

19

95,0

1

6,7

1

5,0

Катаральный мастит

Суспензия диоксидина, 1%

12

16

7

58,3

9

56,3

5

41,7

7

43,7

Суспензия гентамицина сульфата, 4%

12

16

9

75,0

11

68,7

3

25,0

5

31,3

Диеномаст

12

18

10

83,3

15

83,3

2

16,7

3

16,7

Применение 4% суспензии гентамицина сульфата привело к выздоровлению 80,0% коров с субклиническим и 75,0 с катаральным маститом, при этом излечено 75,0% и 68,7% долей вымени соответственно.

Лучший терапевтический эффект достигнут при лечении мастита у коров диеномастом. Эффективность диеномаста при субклиническом мастите составила 93,3%, что выше, чем при использовании 1% суспензии диоксидина на 30,3% и 4% суспензии гентамицина сульфата на 13,3%, а при лечении катарального мастита – 83,3%, что превысило эффективность применения суспензии диоксидина и гентамицина сульфата на 25,0% и 8,3% соответственно.

Линдомаст. Опыты проведены на 57 больных субклиническим маститом и 45 клинически выраженным катаральным маститом животных, которых в каждом случае разделили по принципу аналогов на 3 группы, коровам первой группы вводили суспензию диоксидина, второй - суспензию линкомицина, третьей - препарат линдомаст.

Выявлено, что терапевтическая эффективность 1% суспензии диоксидина оказалась самой низкой и составила при субклиническом мастите 70,0 %, а при катаральном - 60,0% (табл. 12).

Применение 3% суспензии линкомицина гидрохлорида привело к выздоровлению 84,2% коров больных субклиническим и 86,7% катаральным маститом, при этом излечено 98,7% и 89,5% четвертей вымени.

Наиболее высокая терапевтическая эффективность достигнута при использовании линдомаста. При субклиническом мастите она составила 94,4%, что выше соответственно на 10,2 и 23,8%, чем при использовании  отдельных его компонентов, а при катаральном мастите – 93,3%, что выше соответственно на 33,3% и 6,6%.

Таблица 12

Терапевтическая эффективность линдомаста при субклиническом и

катаральном мастите у лактирующих коров

Препараты

Подвергнуто

лечению

Выздоровело

Осталось больных

коров

долей

коров

%

долей

%

коров

%

долей

%

Субклинический мастит

Суспензия диоксидина, 1%

20

26

14

70,0

22

84,6

6

30,0

4

15,4

Суспензия линкомицина,3%

19

24

16

84,2

22

91,7

3

15,0

2

8,3

Линдомаст

18

25

17

94,4

24

96,0

1

5,6

1

4,0

Катаральный мастит

Суспензия диоксидина, 1%

15

18

9

60,0

10

55,6

6

40,0

8

44,4

Суспензия линкомицина,3%

15

19

13

86,7

15

78,9

2

13,3

4

21,1

Линдомаст

15

19

14

93,3

17

89,5

1

6,7

2

10,5

Таким образом, применение диофура, диеномаста и линдомаста для терапии мастита у коров способствовало выздоровлению соответственно 83,3%, 93,3% и 94,4% коров больных субклиническим и 75,0%, 83,3% и 93,3% катаральным маститом.

3.5.8. Результаты производственных испытаний использования диофура, диеномаста и линдомаста для лечения больных маститом коров

Производственные испытания проведены на 199 животных, больных субклиническим маститом, 171 – клинически выраженным катаральным, 143 – гнойно-катаральным и 129 - с серозной формой мастита. Животные были разделены по принципу аналогов на три группы. Коровы первой группы вводили диофур, второй – диеномаст и третьей – линдомаст.

Результаты исследований представлены в таблице 13, из которых следует, что терапевтическая эффективность диофура составляет: при субклиническом мастите 88,6%, катаральном - 82,1%, гнойно-катаральном - 75,0% и серозном - 76,5% .

При лечении диеномастом выздоровление наступило у 90,8% коров, больных субклиническим маститом, 81,8% - катаральным, 73,1% - гнойно-катаральным, и 76,6% серозным маститом.

Эффективность применения линдомаста при субклиническом мастите  составила 93,7%, катаральном – 92,4%, гнойно-катаральном – 85,5%, серозном – 83,3%. 

Таким образом, все препараты показали достаточно высокую эффективность при лечении больных маститом коров. При этом наивысший терапевтический эффект достигается при использовании линдомаста.

Таблица 13

Результаты производственных испытаний терапевтической эффективности диофура, диеномаста и линдомаста

Препарат

Подвергнуто лечению

Кратность введения препарата

Выздоровело

Излечено

коров

долей

коров

%

долей

%

Субклинический мастит

Диофур

44

52

3,2±0,09

39

88,6

47

90,3

Диеномаст

76

92

2,8±,010

69

90,8

81

88,0

Линдомаст

79

90

2,5±0,10

74

93,7

85

94,4

Катаральный мастит

Диофур

39

49

3,5±0,10

32

82,1

41

83,6

Диеномаст

66

79

3,9±0,09

54

81,8

65

82,2

Линдомаст

66

76

3,5±0,08

61

92,4

69

90,8

Гнойно-катаральный мастит

Диофур

36

41

4,3±0,19

27

75,0

31

75,6

Диеномаст

52

62

4,6±0,11

38

73,1

45

72,6

Линдомаст

55

63

3,7±0,11

47

85,5

53

84,1

Серозный мастит

Диофур

34

45

4,0±0,10

26

76,5

35

77,8

Диеномаст

47

67

3,8±0,11

36

76,6

51

76,1

Линдомаст

48

69

3,6±0,10

40

83,3

57

82,6

3.6. Разработка новых антимикробных препаратов для профилактики мастита у коров, их фармако-токсикологическая и клиническая оценка

На основе антибиотика доксициклина из группы тетрациклинов совместно с аспирантами отдела патологии воспроизводства и молочной железы А.Ю. Алиевым и А.Н. Модиным разработаны два препарата для лечения и профилактики мастита у коров в сухостойный период.

Доксимаст, комплексный препарат, содержащий следующие компоненты, масс.%: доксициклин 4,0; воск эмульсионный – 5,0; алюминия стеарат -3,0; масло вазелиновое до 100,0.

Неодоксимаст, комплексный препарат, содержащий следующие компоненты, масс.%: доксициклин 3,0; неомицина сульфат 1,0;  воск эмульсионный – 5,0; алюминия стеарат -3,0 масло вазелиновое до 100,0.

3.6.1. Изучение параметров токсичности доксимаста и неодоксимаста

Острая токсичность. При однократном введении внутрь доксимаста и неодоксимаста дозах  от 5000,0 до 30000,0 мг/кг массы тела в объеме 0,6 мл на мышь и 6,0 мл на крысу, за весь период наблюдения за животными  не отмечено развития клинических признаков интоксикации и гибели животных.

При подкожном однократном введении препаратов в дозах: от 4000,0 до 21500,0 мг/кг массы (доксимаст), от 5000,0 до 16000,0 мг/кг (неодоксимаст) для мышей, от 4500,0 до 22000,0 мг/кг (доксимаст), от 5000,0 до 16500 мг/кг массы тела (неодоксимаст) для крыс, были получены следующие данные (табл. 14), которые позволили определить параметры острой токсичности доксимаста и неодоксимаста.

Таблица 14

Параметры острой токсичности доксимаста и неодоксимаста

для лабораторных животных при однократном подкожном введении (мг/кг)

Вид животных

Параметры токсичности

SLD50

МПД

SLD16

LD50

LD84

LD100

Доксимаст

Белые мыши

4000,0

6177,3

12706,1

(10600 14800)

19278,8

21500,0

±1038,0

Белые крысы

4500,0

8118,7

13841,9

(11900 15800)

19701,5

22000,0

±968,0

Неодоксимаст

Белые мыши

13000,0

13525,4

14437,9

(14100 14800)

15332,1

15783,8

±190,8

Белые крысы

14500,0

1433,72

15497,8

(1500016000)

16662,8

17244,2

±243,4

Результаты приведенных исследований показывают, что доксимаст и неодоксимаст по степени токсичности относится к IV классу опасности – вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76).

Хроническая токсичность. Проведенными исследованиями установлено, что многократное подкожное применение доксимаста в дозе 276,8 мг/кг и 1384,2 мг/кг массы тела (1/50 и 1/10 от LD50 полученной при изучении острой токсичности), и неодоксимаста в дозе 310,0 и 1550,0 мг/кг (1/50 и 1/10 от LD50 в остром опыте) не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии, не отмечено случаев гибели животных.

В течение курса применения доксимаста и неодоксимаста подопытные животные не отличались от контрольных животных по приросту массы тела. По окончании эксперимента статистически достоверных различий по массе тела между контрольными и опытными группами по каждому препарату не установлено.

Не установлены статистически достоверные различия в коэффициентах массы внутренних органов крыс опытной и контрольной групп.

Доксимаст в дозе 276,8 мг/кг массы тела (1/50 от LD50) не оказывает существенного влияния на биохимические показатели крови животных.

При  исследовании крови животных, получавших препарат в дозе 1384,0 мг/кг массы тела (1/10 от LD50), у крыс достоверно возросло содержание в сыворотке крови мочевины на 30,0%, активность АлАТ – на 27,1%, креатинина – на 15,5%, В тоже время, среднее значение этих показателей у крыс опытной группы находилось в пределах нормы для данного вида животных.

Многократное подкожное введение неодоксимаста в дозах 310,0 и 1550,0 мг/мл не вызывает достоверных изменений в морфологическом составе крови, биохимических показателях по сравнению с показателями крови животных контрольной группы.

Таким образом, изучение хронической токсичности доксимаста и неодоксимаста, при подкожном введении препаратов, проведенное в опыте на белых крысах показало, что оба препарата в применяемых дозах 276,8-1384,2 мг/кг (доксимаст) и 310,0-1550,0 мг/кг (неодоксимаст) не вызывают существенных отклонений в жизнедеятельности животных, не оказывают отрицательного влияния на систему кроветворения и гомеостаз, не влияют на функциональное состояние печени и почек, не вызывают нарушений основных обменных процессов в организме.

3.6.2. Местно-раздражающее действие препаратов

Однократное воздействие. Установлено, что при однократной аппликации на кожные покровы кролика при плотности нанесения от 0,020 до 0,10 г/см2 препараты доксимаст и неодоксимаст не вызывают повреждение кожи в виде эритемы или её отёков.

Не выявлено изменений температуры тела, частоты пульса и количества дыхательных движений.

При визуальной оценке состояния конъюнктивы, роговицы и век опытных животных установлено, что препарат вызывает слабое раздражение конъюнктивы спустя два часа после инстилляции препарата, которое исчезало уже к 4 часу.

Многократное воздействие. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что длительное накожное применение основы и препаратов не  вызывают повреждение кожи в виде эритемы или её отёков.

Не установлено изменений поведения и аппетита животных. Не отмечено различий температуры тела и живой массы в обеих группах кроликов. Толщина складки выстриженной и выбритой кожи животных контрольных и опытных групп на протяжении всего срока наблюдения не отличалась.

Накожное нанесение препаратов и основов приводит к незначительному увеличению толщины кожной складки в пределах 0,5-1,9 % по отношению к контролю и исходному состоянию. Таким образом, установлено, что доксимаст и неодоксимаст не оказывают раздражающего действия на кожу.

3.6.3. Аллергенные свойства доксимаста и неодоксимаста

Установлено что 20-ти кратная аппликация препаратов доксимаст и неодоксимаст не вызывает явлений сенсибилизации.

3.6.4. Фармакокинетические параметры и остаточные количества

доксимаста и неодоксимаста в биоматериале

Доксимаст. Однократное интрацистернальное введение препарата на основе доксициклина в дозе 10 мл обеспечивает сохранение препарата в бактериостатической концентрации в секрете молочной железы и соответственно в доле вымени в течение 6 недель (рис. 4). Через 8 недель после введения доксициклин не детектируется в секрете молочной железы.

Неодоксимаст. Однокра-тное интрацистернальное введение неодоксимаста в дозе 10 мл в каждую четверть вымени обеспечивает сохранение активнодействующих компонен-тов в секрете молочной железы и соответственно в доле вымени до 7 недель (рис. 5). Максимальная концентрация (60,0 мкг/мл) доксициклина в секрете молочной железы обнаруживается через трое суток, затем она на-

чинает достаточно быстро снижаться в среднем до 12,5-6,3 мкг/мл и оставаться на этом уровне до 6 недель. В то же время в крови опытных коров доксициклин не обнаруживается на протяжении всего опыта. Основываясь на полученных результатах и данных литературы можно предположить, что доксициклин, обладая свойством хорошо растворяться в липидах, в период сухостоя быстро распределяется по паренхиме молочной железы и присутствует в количествах, превышающих минимальную подавляющую концентрацию.

Несколько иная картина обстоит с неомицином. Данный антибиотик мало растворим в липидах, и поэтому он присутствует в секрете молочной железы в достаточно высоких концентрациях (рис. 5). Максимальная его концентрация (17,8 мкг/мл) установлена через четверо суток, затем она достаточно плавно начинает снижаться и на протяжении

всего опыта превышает минимальную подавляющую концентрацию в 120-30 раз.

Неомицина сульфат в крови у коров обнаруживается через 1, 2, 3 и 4 недели соответственно в концентрациях 4,6; 3,8; 2,5 и 0,12 мкг/мл (рис. 6). Через 8 недель после введения препарата и в день отела доксициклин и неомицин не детектируются как в секрете молочной железы, так и в крови.

Следовательно, в пищевых целях молоко может использоваться без ограничения, при условии отсутствия признаков мастита, подтвержденных диагностическими тестами, и приобретения нормальных свойств молока.

3.6.5. Эффективность применения доксимаста и неодоксимаста для профилактики мастита у коров

Эффективность применения доксимаста для профилактики мастита определена на 370 коровах, разделенных по принципу аналогов на три группы. После последнего доения при переводе коров в сухостой животным первой группы (n=125) во все доли вымени вводили внутрицистернально однократно доксимаст, второй (n=124) - септогель, согласно наставлению по его применению, животным третьей группы (n=125) препараты не вводили, они служили отрицательным контролем. Профилактическая эффективность применения препаратов определялась в первый день после отела по результатам исследований секрета молочной железы с 2% раствором мастидина и пробой отстаивания (табл. 15).

Установлено, что в группе отрицательного контроля из 120 коров, использованных в опыте, маститом заболело 30 животных (25,%), при этом было поражено 73 четверти вымени (15,4%).

Применение септогеля  обеспечило снижение заболеваемости коров до 12,9% или в 1,9 раза.

Введение доксимаста профилактировало развитие мастита у 94,4% коров. При этом пораженность долей молочной железы субклиническим маститом снизилось в сравнении с септогелем в 2,7 раза, а с контролем – в 4,9 раза.

Таблица 15

Результаты производственных испытаний применения доксимаста

для профилактики мастита у коров в сухостойный период

Группа животных

Всего в опыте

Не заболело маститом

Заболело маститом

коров

долей

коров

%

долей

%

коров

%

долей

%

Доксимаст (опытная)

126

496

119

94,4

481

97,0

7

5,6

15

3,0

Септогель (контроль)

124

487

108

87,1

447

91,8

16

12,9

40

8,2

Отрицательный контроль

120

474

90

75,0

401

84,6

30

25,0

73

15,4

Профилактическая эффективность неодоксимаста определена на 80 коровах, разделенных по принципу аналогов на 4 группы. Коровы первой группы (n=20) однократно внутрицистернально после последнего доения вводили препарат неодоксимаст, второй (n=20) – септогель, третьей (n=20) –орбенин ДС согласно наставлению по применению; четвертой (n=20) – препараты не применяли, они служили контролем.

Результаты исследований (табл. 16) свидетельствуют о том, что в группе отрицательного контроля из 20 коров, использованных в опыте, маститом заболело 5 животных (25,0%), при этом было поражено 12 четвертей вымени (21,1%).

Введение септогеля  обеспечило снижение заболеваемости коров до 20,0% или в 1,3 раза.

Применение неодоксимаста коровам в конце запуска, как и орбенин ДС  обеспечивает профилактический эффект у 90% животных, что на 10% выше септогеля. При этом пораженность долей молочной железы маститом снижается в сравнении с контролем в 2,9 раза.

Таблица 16

Эффективность применения неодоксимаста для профилактики мастита

у коров в сухостойный период

Группа животных

Всего в опыте

Не заболело маститом

Заболело маститом

коров

долей

коров

%

долей

%

коров

%

долей

%

Первая, неодоксимаст

20

57

18

90,0

53

92,9

2

10,0

4

7,1

Вторая, септогель

20

60

16

80,0

51

85,0

4

20,0

9

15,0

Третья, орбенин ДС

20

59

18

90,0

56

94,9

2

10,0

3

5,1

Четвертая, отрицательный контроль

20

57

15

75,0

45

78,9

5

25,0

12

21,1

Таким образом, внутрицистернальное ведение коровам в период запуска доксимаста или неодоксимаста снижает заболеваемость коров маститом после родов в 2,5 и 4,46 раза.

3.7. Этапная фармакотерапия и фармакопрофилактика

в комплексной системе оздоровления молочных стад от мастита

Выполненные нами исследования показали, что в разрабатываемых и реализуемых программах по снижению воспалительных заболеваний молочной железы у коров должны учитываться особенности всех технологических процессов эксплуатации животных и степень заболеваемости коров маститом.

По степени заболеваемости коров маститом мы предлагаем разделить сельхозпредприятия (молочные фермы) на три группы: первая – заболеваемость превышает 30%, вторая – заболеваемость составляет 10-30%, третья – заболеваемость не превышает 10%.

Наиболее сложно решается проблема в хозяйствах первой группы, так как основной причиной высокой заболеваемости коров маститом в них являются, как правило, грубые погрешности в технологии ведения молочного скотоводства. Поэтому в данных хозяйствах оздоровление поголовья от мастита необходимо проводить в три этапа.

На первом этапе устанавливается основная причина высокой заболеваемости маститом. Как правило, это использование неисправной доильной техники (отсутствие вакуумрегуляторов, неисправные манометры, недостаточная производительность вакуумного насоса, при этом величина вакуума может составлять от 0,42 до 0,9 кгс/см2); нарушения технологии доения (преждевременное или запоздалое подключение доильного аппарата, передержка его на вымени, нерегулярная замена сосковой резины); низкий уровень гигиены содержания (высокая влажность воздуха в коровнике, отсутствие или загрязнённая подстилка) и санитарии при доении (подмывание вымени всех коров группы из одного ведра, использование одной салфетки для обсушивания вымени, отсутствие дезинфицирующих средств). При этом данные погрешности имеют место в каждом хозяйстве, но степень их выраженности различна. Как правило, в хозяйствах с таким уровнем заболевания маститом коров время доения превышает в 2-2,5 раза физиологические нормы (5-6 минут) и составляет 9 - 12 минут, что обусловлено как вызовом неполноценного рефлекса молокоотдачи (нарушение технологии доения) так и нефизиологичным доением (неисправная доильная техника).

Устранение выявленных причин позволяет снизить количество коров, заболевших маститом до 20% и перевести сельхозпредприятие (молочную ферму) во вторую группу. Только после выполнения первого этапа следует приступать ко второму этапу реализации программы по снижению заболеваемости коров маститом.

На втором этапе мероприятия по оздоровлению коров от мастита аналогичны мероприятиям для молочных стад второй группы (заболеваемость 10-30%) которая является самой многочисленной. Они должны включать:

- выполнение операторами требований к машинному доению коров - соблюдение очередности доения - сначала первотелки, затем здоровые коровы, затем животные, больные маститом; санитарную подготовку вымени  и высушивание сосков вымени; сдаивание перед доением первых струек молока из каждого соска, сбор и утилизацию молока с видимыми изменениями; подключение доильных стаканов через 40-60 секунд от начала подготовки вымени с исключением подсоса воздуха; контроль выполнения процесса молокоотдачи, проверку на полноту выдаивания до снятия доильных стаканов; на линейных доильных установках проведение машинного додоя и одновременное снятие всех доильных стаканов только после отключения вакуума; после окончания доения обработку сосков вымени антисептическим средством;

- обеспечение исправности доильного оборудования: параметров величины вакуума, его запаса, параметров работы пульсаторов, учёт продолжительности эксплуатации сосковой резины и регулярной её замены, мытье и дезинфекция доильного оборудования;

- обеспечение полноценного кормления и соблюдения требований гигиены содержания;

- проведение специальных ветеринарных мероприятий: ежемесячное исследование молока коров с экспресс-диагностикумом (масттест, мастидин, альфа-тест и др.), клиническое обследование молочной железы всех животных, давших положительную реакцию с диагностикумумом, и регистрацию данных каждого исследования в журнале; ежеквартальный отбор проб секрета из пораженных долей вымени для лабораторного исследования (наличие, вид и чувствительность микрофлоры к антимикробным средствам); изолирование и немедленное лечение коров с клиническим маститом путем интрацистернального введения антимикробных препаратов с учетом чувствительности микрофлоры и их последующей ротации; выделение коров с хроническим и субклиническим маститом в отдельную группу (или внедряют промежуточную дезинфекцию доильных стаканов), лечение таких животных проводят в основном во время запуска препаратами для лечения мастита в период лактации; при переводе коров в сухостой после последнего доения всем животным интрацистернально вводят противомаститные препараты с длительным сроком сохранения в молочной железе; постепенно выбраковывают коров, лечение которых не даёт положительного результата.

Полное внедрение вышеперечисленных мероприятий позволяет в течение года снизить заболеваемость коров маститом до 7-8% и перевести данное сельхозпредприятие в третью группу и получать молоко высокого санитарного качества.

Основной задачей для хозяйств третьей группы является сохранение или улучшение достигнутого уровня по заболеваемости коров маститом. Кроме полного обеспечения всех технологических параметров разведения и доения животных в этих хозяйствах проводятся следующие мероприятия:

- ежедневное выявление и лечение коров с клинически выраженным маститом (диофур, диеномаст и линдомаст);

- ежедекадная проверка коров на субклинический мастит (масттест, мастидин) и лечение больных маститом (диофур, диеномаст, линдомаст);

- лечение коров с хроническим маститом в период запуска (диофур, диеномаст, линдомаст, из зарубежных препаратов мастиет-форте, синулокс LC, и др.) и выбраковка не поддающихся лечению животных, как источника инфекции;

- решение о широком использовании препаратов с длительным сроком нахождения в вымени (доксимаст, неодоксимаст, орбенин ДС, нафпензал ДС и др.) принимать в зависимости от уровня заболеваемости коров маститом в послеродовый период (выше 10-15%) и молочной продуктивности (более 4500 кг);

- ввод в основное стадо клинически здоровых коров - первотелок проводить после двукратного обследования молочной железы и проведения курса лечения, больных маститом коров.

Внедрение данной системы оздоровления молочных стад от мастита в ООО «Жито», ЗАО «Манино» Воронежской области, ОАО «Роговатовская Нива», Белгородской области, АОНП «Успенское» и ОАО «ПЗ «Сергиевский» Орловской области позволило в течение года снизить заболеваемость коров маститом с 55,0-25,7% до 12,6-5,8 %.

  1. ВЫВОДЫ

1. Заболеваемость коров маститом в различных хозяйствах Центрального Региона Российской Федерации колеблется от 7,1% до 60,3%. В сельхозпредприятиях с уровнем молочной продуктивности свыше 6500 кг заболеваемость составляет 15,26%, а с  уровнем продуктивности менее 4500 кг 46,78%. У коров черно-пестрой породы мастит регистрируется в 32,51% случаев, симментальской – 41,23%. На долю субклинического мастита приходится 79,1 %, на долю клинически выраженного 20,9%.

2. В сельхозпредприятиях с уровнем заболеваемости коров маститом менее 10% из секрета пораженных долей вымени в 100% случаев выделена патогенная микрофлора, которая представлена в монокультурах Str. agalactiae -46,7%, Staph. aureus -13,3%, Staph. haemolyticus -13,3% и в ассоциациях Staph. aureus + Str. agalactiae в 26,7%.

В стадах с заболеваемостью коров от 10 до 30% выделенная из 90,5% проб секрета микрофлора в 73,8% случаев представлена патогенными культурами (Str. agalactiae -35,7%, Staph. aureus-30,9%, Staph. haemolyticus -2,4%, в ассоциациях-4,8%) и в 16,7% – условно-патогенными (Str. dysgalactiae -9,5%, Micrococcus -4,8%, Enterococcus faecalis -2,4%).

При уровне заболеваемости коров маститом свыше 30% патогенная микрофлора (Staph. аureus, E. сoli) выделена в 32,7% случаев, условно-патогенная (Citrobacter, Enterococcus faecium,– в 23,6%, и сапрофитная (Staph. saprophyticus, Staph. epidermidis, Enterococcus aerogenes, Pseudomonas aeruginosa) в 20,0% случаев. В 5,5% случаев выделены грибы (Сandida).

3. В  развитии воспалительного процесса в молочной железе независимо от действия технологических факторов основную роль играют изменения во взаимосвязи систем неспецифической резистентности данного органа и патогенной микрофлоры окружающей среды. У клинически здоровых лактирующих коров индекс бактерицидности кожи составляет 87,8±2,4 – 91,8±2,0%, а её микробная обсемененность 337,6±19,1 тыс. КОЕ.

У больных субклиническим маститом индекс бактерицидности кожи снижен в 1,5 раза (54,5±15,3%), а микробная обсемененность возрастает до 985,0±150,0 тыс. КОЕ или в 2,9 раза. Явление снижения бактерицидности кожи вымени и увеличения её бактериальной обсемененности регистрируется уже за семь дней до проявления заболевания.

4. При комплексном применении больным субклиническим маститом коровам общестимулирующих патогенетических средств (ПДЭ, АСД-2Ф на тетрагидровите) отмечается увеличение в сыворотке крови общего белка на 9,5%, -глобулинов на 16,3%, снижение эозинофилов на 39,1%, и увеличение индекса бактерицидности кожи вымени до 86,2±2,4 или в 1,4 раза. Терапевтический эффект составляет 83,7%.

5. Созданные сочетания антимикробных средств: диоксидин-фурациллин, диоксидин-гентамицина сульфат, диоксидин-линкомицина гидрохорид обладают синергидным действием в отношении грамположительной и грамотрицательной микрофлоры, а разработанные на их основе антимикробные препараты диофур, диеномаст и линдомаст обладают высокой активностью в отношении основных возбудителей мастита у коров. Минимальная ингибирующая их концентрация составляет  0,98-7,8; 0,39-3,1 и 3,1-25,0 мкг/мл.

6. Препараты диофур, диеномаст и линдомаст относятся к IV классу опасности (малоопасные вещества по ГОСТу 12. 1.007-76).  ЛД50 при внутрижелудочном их введении превышает 30000 мг/кг массы тела. При однократном подкожном введении ЛД50 для белых мышей составляет соответственно 61462,2; 11108,3 и 15170,1 мг/кг, для белых крыс – 61330,6; 12015,1 и 14017,5 мг/кг массы тела.

7. Препараты не оказывают аллергенного и кожно-резорбтивного действия. Не вызывают раздражения при нанесении на кожу. Проявляют слабое раздражающее действие при нанесении на слизистую оболочку глаз. Длительное применение комплексных препаратов на основе диоксидина (диофур, диеномаст и линдомаст) не оказывает отрицательного влияния на морфологические и биохимические показатели крови лабораторных животных. Относительные массы внутренних органов крыс не выходят за границы физиологической нормы. Коэффициенты кумуляции составляют 5,0 и более. Данные препараты в терапевтических дозах не оказывают отрицательного влияния на физиологические и биохимические показатели крови коров.

8. При пятикратном интрацистернальном введении коровам диофура его компоненты (диоксидин и фурацилин) выводятся из молочной железы и организма животных через 24 часа, диеномаста (диоксидин и гентамицина сульфат) – через 7 суток и линдомаста (диоксидин и линкомицина гидрохлорид) – через 5 суток.

9. Терапевтическая эффективность диофура при субклиническом мастите у лактирующих коров составляет 88,6%, при клинически выраженном катаральном мастите 82,1%, гнойно-катаральном 75,0% и серозном 76,5%, диеномаста соответственно 90,8%; 81,8%; 73,1%; 76,6% и линдомаста 93,7; 92,4,%; 85,5% и 83,3%.

10. Разработанные на основе доксициклина антибактериальные препараты длительного действия доксимаст и неодоксимаст для профилактики мастита у коров относятся к IV классу опасности – вещества малоопасные  по ГОСТу 12.1.007-76. ЛД50 при внутрижелудочном введении превышает 30000 мг/кг массы тела.

ЛД50 при однократном подкожном введении доксимаста для белых мышей составляет 12706,1 мг/кг, для белых крыс – 13841,9 мг/кг массы тела. ЛД50 неодоксимаста для белых мышей -14437,9 и для белых крыс  15497,8 мг/кг массы тела соответственно.

11. Препараты доксимаст и неодоксимаст не обладают раздражающим и кожно-резорбтивным действием, у препаратов отсутствуют аллергенные свойства. Длительное применение комплексных препаратов на основе доксициклина (доксимаст и неодоксимаст) не оказывает отрицательного влияния на морфологические и биохимические показатели крови лабораторных животных. Относительные массы внутренних органов крыс не выходят за границы физиологической нормы. Коэффициенты кумуляции составляют 5,0 и более. Данные препараты в терапевтических дозах не оказывают отрицательного влияния на физиологические и биохимические показатели крови коров.

12. Однократное интрацистернальное введение коровам, переводимым в сухостой,  доксимаста и неодоксимаста обеспечивает сохранение препарата в молочной железе в бактериостатической концентрации до 6 недель. Антимикробные компоненты препаратов (доксициклин) и (доксициклин + неомицина сульфат) в секрете молочной железы перед и после отела не обнаруживаются.

13. Внутрицистернальное введение коровам в период запуска доксимаста или неодоксимаста снижает заболеваемость коров маститом после родов 2,5-4,5 раза. По своей профилактической эффективности, разработанные отечественные препараты приближаются к уровню зарубежных аналогов (орбенин ДС).

14. Экономический эффект при лечении мастита у коров препаратами диеномаст и линдомаст составляет на 1 животное 2604,2-4026,3 руб. и 6,9-9,9 руб. на один рубль затрат. Экономический эффект при профилактике мастита препаратом доксимаст составляет 609,48 руб и 81,2 руб. на один рубль затрат.

15. Разработанная и предложенная производству схема поэтапной фармакопрофилактики и фармакотерапии мастита у коров в комплексной системе оздоровления молочных стад от мастита позволяет в течение года снизить заболеваемость коров воспалением вымени до 7-8% и поддерживать её на этом уровне.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для оценки уровня естественной резистентности молочной железы и выявления риска развития воспалительного процесса использовать показатели бактерицидности и микробной обсемененности кожи вымени. У клинически здоровых лактирующих коров индекс бактерицидности кожи сосков вымени  составляет  87,8±2,4 – 91,8±2,0%, и микробная обсемененность –  337,6±19,1 тыс. КОЕ.

Критериями риска развития мастита является снижение индекса бактерицидности кожи до 66,4±6,9% и увеличения обсемененности до 670,0±150,0 тыс. КОЕ.

2. Для терапии субклинического мастита у коров в период лактации использовать способ лечения, включающий подкожное введение тканевого препарата ПДЭ в дозе 20 мл трехкратно на 1-й, 3-й и 5-й дни лечения и АСД-2Ф в 15% концентрации на тетрагидровите в дозе 10 мл на 2-й,  4-й и  6-й дни лечения.

3. Для терапии коров, больных субклиническим и клинически выраженным маститом, в период лактации применять диофур, диеномаст и линдомаст согласно наставлениям по их применению.

4. Для профилактики мастита у коров после отела путем введения в конце запуска в каждую долю вымени антибактериальных препаратов использовать доксимаст и неодоксимаст в дозе 10 мл.

5. При оздоровлении молочных стад крупного рогатого скота от мастита использовать разработанную схему проведения поэтапных технологических, фармакопрофилактических и фармакотерапевтических мероприятий.

6. Научные результаты работы использовать в учебном процессе студентов и специалистов зооветеринарного профиля по акушерству, гинекологии и биотехнологии репродукции животных, по фармакологии и токсикологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Перспективные пути решения проблемы мастита у коров / В.А. Париков, В.И. Слободяник, А.Н. Савостин, Н.Т. Климов // Вопросы ветеринарной фармации и фармакотерапии» / Тезисы докл. Всес. н.- практ. конф. - Сигулда, Упр. н.-тех. информации, 1990.- С. 21-22.

2. Экономическая эффективность мероприятий при борьбе с маститом коров / В.А. Париков, А.Н. Савостин, Н.Т. Климов, А.И. Романенко, В.В. Перегудов, Н.Н. Калуцкий // Научные основы профилактики и лечения незаразных болезней с.-х. жив. / Сб. научн. тр. ВНИВИПФиТ, Воронеж, 1991.- С. 98-100.

3. Климов Н.Т. Бактерицидность и обсемененность кожи вымени при заболевании маститом / Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Слободяник // Важнейшие итоги исследований по изучению заболеваний с.-х. жив. незаразной этиологии, их профилактика и лечение / Сб. науч. тр. ВНИВИПФиТ, Воронеж, 1992. - С. 67-68.

4. Перспективы экологически безопасной системы профилактики мастита у коров при машинном доении / В.А. Париков, В.И. Слободяник, А.Н. Савостин, Н.Т. Климов, Л.В. Смирнова, Н.А. Сапожникова, Е.М. Князева // Тез. докладов VIII (1 Всероссийский симпозиум по машинному доению сельскохозяйственных животных). – Оренбург, 1995. - С. 8 -9.

5. Патент № 2048805 С1, 6 А 61 К 31/00 Препарат для лечения мастита у коров / В.А. Париков, В.И. Слободяник, А.И. Романенко, Н.Т Климов, В.А. Антипов, Ю.А. Козырев, В.И. Моргунов; –5045934/15; Заявл.30.06.1992; Опубл. 27.11. 1995; Бюл.№ 33 // ИСМ. –1995.

*6. Мастит у коров (профилактика и терапия) / В.А. Париков, Н.Т. Климов, А.И. Романенко, О.Г. Новиков, Д.М. Пониткин, И.В. Игнатов // Ветеринария. - 2000. - №11. - С. 34-38.

7. Этиологические и патогенетические аспекты мастита у коров, методы и средства его профилактики и терапии / В.А. Париков, В.И. Слободяник, Н.Т. Климов, О.Г. Новиков // Эколого-адаптационная стратегия здоровья и продуктивности животных в современных условиях: Монография – Воронеж. 2001.- С. 105-113.

8. Париков В.А. Проблема мастита у коров в свете современных достижений ветеринарной науки и практики / В.А. Париков, В.И. Слободяник, Н.Т. Климов // Матер. Международной научно-практ. конф., «Проблемы акушерско-гинекологической патологии и воспроизводства сельскохозяйственных животных» посвященной 100-летию А.П. Студенцова, Казань, 2003. - (часть 2)  – С. 79-85.

9. Мастит коров (диагностика, профилактика и терапия) / В.А. Париков, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, В.М. Грязнов, А.Я. Петров, Д.М. Пониткин // Матер. Международной научно-практ. конф., посвящ. 35-летию организации ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных». Воронеж, 2005. – С. 367-371.

10. Эффективные отечественные препараты для профилактики и терапии мастита у коров / В.А. Париков, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, Д.М. Пониткин // Матер. Международной научно-практ. конф., посвящ. 35-летию организации ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных», Воронеж, 2005. – С. 375-378.

11. Климов Н.Т. Мастит и современное доильное оборудование / Н.Т. Климов, Н.Ф. Курило // Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Авророва А.А., Воронеж, 2006. - С. 901-905.

12. Мастит коров – основная проблема молочного скотоводства / В.А. Париков, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, Д.М. Пониткин // Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Авророва А.А., Воронеж, 2006. - С. 963-966.

13. Антимикробная активность и раздражающее действие нового препарата для лечения и профилактики мастита у коров в сухостойный период / В.А. Париков, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, Г.А. Востроилова, Л.И. Ефанова, А.Ю. Алиев // Материалы республиканской научно-производственной конф., посвященной 90-летию со дня рождению профессора И.Ф. Заянчковского «Актуальные проблемы физиологии и патологии размножения животных». – Уфа, 2007. – С. 38-42.

*14. О нозологии скрыто протекающих патологий в молочной железе коров / В.А. Париков, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, Д.М. Пониткин, А.Ю. Алиев, В.И. Зимников, А.М. Модин, А.В. Чурсин // Российский ветеринарный журнал.- 2007 .- Специальный выпуск. - С. 29.

*15. Предупреждение мастита у коров – основа повышения продуктивности и качества молока / Д.М. Пониткин, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, А.Ю. Алиев, В.И. Зимников, А.М. Модин, А.В. Чурсин // Зоотехния. - 2007.-№7. С. 21-23.

16. Антимикробная активность и раздражающее действие нового препарата для терапии мастита у коров в период лактации / С.В. Шабунин, Н.Т. Климов, В.А. Париков, Н.В. Притыкин, А.В. Чурсин, Г.А Востроилова, Л.И. Ефанова, А.М. Модин, В.И. Зимников // Материалы первого съезда ветеринарных фармакологов России. Воронеж, 2007. - С. 651-655.

17. Климов Н.Т. Система ранней диагностики, комплексной терапии и групповой профилактики акушерско-гинекологических болезней коров. / Н.Т. Климов, В.И. Михалев, Н.В. Притыкин // Проблемы повышения продуктивного долголетия животных / Материалы научно-практической конференции. - Курган, 2007. - С. 43-52.

18. Климов Н.Т. Эффективность применения антисептических препаратов для профилактики мастита у коров / Н.Т. Климов // Материалы Международной научно-практ. конф., посвящ. 125-летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» - Курск, 2008. - С. 177-179.

*19. Малозатратная и эффективная методика дифференциации кокковой микрофлоры при мастите у коров / Н.Т. Климов, Д.М. Пониткин, В.А. Париков, В.И. Слободяник, Е.Е. Шевелева // Ветеринарная патология, 2008. - №1 (24) - С. 45-47.

*20. Климов Н.Т. Мониторинг мастита у коров и его этиологическая структура в разные периоды репродукции / Н.Т. Климов // Ветеринарная патология, 2008. - №1 (24) - С. 42-45.

*21. Климов Н.Т. Бактерицидность и обсемененность кожи вымени у здоровых и больных маститом коров / Н.Т. Климов // Международный вестник ветеринарии, 2008. - №3 - С. 48.

*22. Климов Н.Т. Этиология мастита у коров в разные периоды их физиологического состояния / Н.Т. Климов // Международный вестник ветеринарии. – 2008. - №3. - С. 49-50.

*23. Климов Н.Т. Бактерицидность кожи вымени – показатель резистентности молочной железы коров / Н.Т. Климов // Международный вестник ветеринарии, 2008. - №3 - С. 51.

24. Роль нарушения технологии доения в возникновении мастита у коров в современных доильных залах / Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Михалев, А.Н. Модин, В.И. Зимников, А.В. Чурсин, Д.М. Пониткин // Матер. международ. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса». – Курск, 2008. -Ч.3. - С. 219-221.

25. Рациональные подходы борьбы с маститом коров. / Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Михалев, А.Н. Модин, В.И. Зимников, А.В. Чурсин, Д.М. Пониткин // Матер. международ. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса». – Курск, 2008. - Ч.3. - С. 221-224.

*26. Роль микробного фактора в возникновении и развитии мастита у коров / Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Слободяник, Е.Е. Шевелева, В.И. Зимников А.Н. Модин, А.В. Чурсин, Д.М. Пониткин // Ветеринария, 2008. - №12. - С. 33-36.

27. Микрофлора молока и половых путей коров, больных маститом и эндометритом / Л.И. Ефанова, Н.Т. Климов, В.В. Давыдова, Ю.А. Рубцова, Ю.Ю. Крутских // Матер. Международной научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных».  Воронеж, 2009. – С. 168-172.

28. Климов Н.Т. Доксимаст - препарат для профилактики мастита у сухостойных коров / Н.Т. Климов // Матер. Международной научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных». Воронеж, 2009. – С. 207-210.

29. Климов Н.Т. Линдомаст и диеномаст – эффективные препараты для терапии мастита у коров в период лактации / Н.Т. Климов, И.Т. Шапошников // Матер. Международной научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных». Воронеж, 2009. – С. 210-212.

30. Климов Н.Т. Эффективный комплекс мероприятий в борьбе с маститом коров / Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Зимников // Матер. Международной научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных». Воронеж, 2009. – С. 212-215.

31. Першин С.С. Требования технического регламента на молоко и значение профилактики болезней молочной железы у коров в его выполнении / С.С. Першин, Н.И. Шумский, Н.Т. Климов // Матер. Международной научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного и продуктивного здоровья животных». Воронеж, 2009. – С. 212-215.

*32. Климов Н.Т. Рациональные пути оздоровления молочных стад от мастита / Н.Т. Климов // Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: ветеринарные науки, 2009. - №1. - Ч. 2.- С. 183-185.

33. Слободяник В.И. Иммунологические аспекты физиологии и патологии молочной железы / В.И. Слободяник, Н.Т. Климов, В.В. Подберезный // под ред. д-ра вет. наук, проф. В.И. Слободяника. - Таганрог: Изд. центр Таганрог. гос. пед. ин-та, 2009. -276 с.

34. Патент № 2350332 С1. А61К 31/65 Препарат для лечения и профилактики мастита у коров в период сухостоя / Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, С.В. Шабунин - 2007135675/15; Заявл. 26.09.2007; Опубл. 27.03.2009; Бюл. №9.

35. Патент № 2367433 МПК А61К 31/4025, 31/498, 15/00, 15/14, 31/04 Препарат для лечения мастита у коров в период лактации / С.В.Шабунин, Н.Т. Климов, В.А Париков, Н.В. Притыкин и др. - 2008109150/15; Заявл. 07.03.2008; Опубл. 20.09.2009; Бюл. №26. – 9 с.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.