WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ЖУКОВ Владимир Александрович МЕТОДОЛОГИЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВОСПРИИМЧИВОСТИ ХОЗЯИНА К ВИРУСНЫМ ИНФЕКЦИЯМ И ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ВЫБОРА ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.01.06 – биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово - 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович доктор биологических наук, доцент Лихошвай Виталий Александрович Ведущая организация Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, г. Москва

Защита диссертации состоится «22» апреля 2011 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.(8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « ___ »____________ 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Г.П. Трошкова Посвящается памяти моих родителей Жуковой Т.В. и Жукова А.С.

и академика Воробьева А.А., внесшего неоценимый вклад в развитие и выполнение данной работы.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Важным аспектом предотвращения неблагоприятных последствий эпизоотий и эпидемий инфекционных заболеваний, появления новых (вновь возникающих) инфекций является своевременный прогноз восприимчивости животных или человека к патогенам, а также подбор и создание наиболее эффективных противовирусных средств.

Решение данных задач основано на использовании модельных биологических систем – культур клеток и модельных животных с последующим испытанием безвредности и оценки эффективности на животных и человеке. Однако, широкое использование биологических моделей и биотехнологий не сопровождалось столь же интенсивной разработкой методов или моделей экстраполяции (масштабирования) количественных параметров, характеризующих свойства вирусов, с одной модельной системы на другую и в конечном итоге на организм хозяина (животного и/или человека), как, например, в радиобиологии, фармакологии и токсикологии - дисциплинах, где также используются живые модельные системы. Использование для микробов методов экстраполяции, разработанных для химических и физических факторов, невозможно, т.к. в отличие от последних микробы являются размножающимися (инфекционными) объектами. Разные виды животных, вообще говоря, не являются равно чувствительными к одному и тому же виду микробов, поэтому прямой перенос результатов экспериментов по определению показателей инфекционности патогенов или защитного уровня противовирусных препаратов (ПВП) на модельных животных на другие виды животных и человека неправомочен. Наиболее важным показателем вирусов является 50% инфицирующая доза ( ), характеризующая главное свойство микробов – способность инфицировать и образовывать инфекционный процесс.

Важность этого показателя определяется и тем, что вероятность инфицирования организма хозяина является дозо-зависимой, при этом величина является характеристическим параметром функциональной зависимости вероятности инфицирования от дозы заражения. Это означает, что определяет долю заболевших в группе инфицированных объектов, т.е.

заболеваемость в коллективе. Определение экспериментальным путем требует заражение групп макроорганизмов известными дозами патогена.

Очевидно, что для вирусов, вызывающих инфекции с летальным исходом, в применении к человеку такая возможность отсутствует. Что касается оценок, сделанных на основании моделирования аварийных случаев, то согласно многим исследователям эти данные являются приблизительными, требуют уточнения и дополнительного обоснования.

Более пятидесяти лет в вирусологических исследованиях используются первичные культуры клеток, выделенные из органов-мишеней хозяина. В многочисленных исследованиях с первичными культурами макрофагов показано наличие корреляции способности макрофагов продуцировать вирус в экспериментах in vitro с восприимчивостью организма хозяина к различным макрофаготропным вирусам. Эти данные свидетельствуют о потенциальной пригодности первичных культур клеток органов-мишеней для оценки восприимчивости их хозяина к микроорганизмам.

В свете вышеизложенного работы по изучению межвидовой взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на клеточном и организменном уровнях хозяина, в том числе при изучении свойств вируса с использованием первичных культур клеток органов-мишеней являются актуальными. Следует признать актуальным проведение таких исследований для социально-значимых и особоопасных инфекций. Представителем первой группы является вирус гриппа (ВГ), второй - вирус Марбург (ВМ).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка метода экстраполяции (прогнозирования) 50% инфицирующей дозы вируса ( ) с модельного (лабораторного) животного на хозяина (в том числе человека), а также разработка на базе предложенного метода новых подходов к выбору кандидатных препаратов и модельных животных для оценки эффективности потенциальных противовирусных препаратов в отношении защиты хозяина (в том числе человека).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Построение математической модели взаимосвязи вируса для хозяина и параметров взаимодействия вируса с восприимчивыми клетками хозяина на фоне действия факторов врожденного иммунитета (далее – уравнение инфекционности).

2. Построение алгоритма экстраполяции с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток.

3. Построение алгоритмов оценки параметров модели прогнозирования в экспериментах in vitro.

4. Разработка методов получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток легких и трахеи лабораторных животных.

5. Экспериментальное определение вируса гриппа при аэрогенном инфицировании экспериментальных животных.

6. Экспериментальное изучение особенностей взаимодействия вируса гриппа с восприимчивыми клетками (альвеолоцитами I и II типа, реснитчатыми клетками), макрофагами и нейтрофилами в суспензионной первичной культуре клеток легких и трахеи экспериментальных животных.

7. Оценка вклада внеклеточных защитных (барьерных) факторов выстилки респираторных органов экспериментальных животных в формирование их восприимчивости к вирусу гриппа.

8. Проверка работоспособности алгоритма прогнозирования на примере прогноза вируса Марбург для обезьян и вируса гриппа для крыс и мышей.

9. Применение метода для прогнозирования вируса Марбург для человека. Разработка новых подходов к выбору кандидатных препаратов и экспериментальных животных, моделирующих заданную инфекцию и пригодных для оценки противовирусной активности кандидатных препаратов, перспективных в отношении защиты человека от данной инфекции.

Научная новизна и практическая значимость. В данной работе впервые проведено комплексное теоретико-экспериментальное исследование взаимосвязи параметров инфекционности вирусов на организменном и клеточном уровнях хозяина с использованием методов математического и экспериментального моделирования. В ходе исследования получены следующие новые результаты.

1. На основании обобщенной схемы развития инфекционного процесса для патогенов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания, разработано уравнение инфекционности. Данное уравнение связывает параметры вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) с вероятностью инфицирования хозяина одним вирионом, которая связана с обратной зависимостью.

2. На основании анализа уравнения инфекционности разработаны два варианта алгоритма экстраполяции с модельного животного на хозяина с использованием уравнения инфекционности и данных по оценке параметров вирус-клеточного взаимодействия в опытах с первичными культурами клеток:

частный вариант предназначен для случая, когда отличия в активности факторов врожденного иммунитета у хозяина и модельного животного не существенны и модифицированный вариант – когда отличия существенны.

3. Разработаны алгоритмы оценки параметров модели прогнозирования в экспериментах in vitro с использованием суспензионных и монослойных первичных культур клеток, в том числе алгоритмы оценки вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета без прямого подсчета количества инфицированных клеток и алгоритмы оценки средней урожайности вируса в клетке.

4. Адекватность уравнения инфекционности, алгоритма оценки параметров модели прогнозирования, частного и модифицированного алгоритмов прогнозирования показана на примерах прогнозирования вируса Марбург для обезьяны (зеленая африканская мартышка) и вируса гриппа для мыши ICR и крысы Wistar.

5. Показано, что для прогнозирования восприимчивости обезьяны к вирусу Марбург, используя морскую свинку в качестве модельного животного, достаточно учитывать только отличие в восприимчивости макрофагов.

6. Проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток мыши CD-1 и крысы Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro. Показано, что восприимчивость и вируспродуцирующая способность альвеолоцитов I и II типов при их инфицировании вирусом гриппа in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток.

7. Показано, что для прогнозирования восприимчивости трахеи и легких мыши ICR и трахеи крысы Wistar к вирусу гриппа при использовании мыши CD-1 в качестве модельного животного достаточно использовать только первичные культуры клеток соответствующего органа, а для легких крысы Wistar необходимо также использовать данные по вируснейтрализующему действию секреторных факторов бронхоальвеолярной эпителиальной выстилки крысы. Это свидетельствует, что первичные культуры клеток адекватно моделируют свойства клеток (при взаимодействии с вирусом) in vivo и позволяют адекватно оценивать «базовую» (клеточно-опосредованную и без учета факторов врожденного иммунитета) восприимчивость хозяина к вирусу гриппа. При незначимом проявлении иммунных факторов «базовая» соответствует реальной восприимчивости.

8. На основании анализа уравнения инфекционности обоснованы количественные критерии восприимчивости и резистентности хозяина к инфекции в зависимости от величин параметров вирус-клеточного взаимодействия (вероятности инфицирования клетки одним вирионом и средней урожайности вируса в клетке), критерий оптимального выбора ПВП, определяющий критическую степень снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия, при достижении которой вероятность образования инфекционного процесса при любой дозе инфицирования становится равной нулю, т.е. когда макроорганизм становится резистентным к инфекции.

Показано, что для обеспечения невосприимчивости хозяина нет необходимости достигать полной невосприимчивости клеток, когда вероятность инфицирования клеток и/или урожайность клеток равна нулю, необходимо, чтобы величина произведения параметров вирус-клеточного произведения была меньше либо равна 1. Данный критерий можно использовать для выбора кандидатных ПВП при их испытании в клеточных системах.

9. Математическими методами показано, чтобы перевести макроорганизм с помощью противовирусных средств в невосприимчивое к вирусу состояние, достаточно с одной и той же (критической) кратностью уменьшить один из следующих параметров – вероятность инфицирования клетки (интегрально характеризующую стадии прикрепления и проникновения вируса в клетку) или среднюю урожайность вируса в клетке (интегрально характеризующую стадии репродукции, сборки и выхода вируса).

10. Математическими методами обосновано условие, выполнение которого необходимо для проявления эффекта синергизма при сочетанном применении двух ПВП, т.е. когда два неоптимальных ПВП, примененные совместно, переводят макроорганизм в невосприимчивое состояние. Для проверки выполнения условия достаточно оценить уровни снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия для каждого из тестируемых ПВП в отдельности. Условие может быть использовано для выбора кандидатных пар ПВП, когда индивидуальное применение средств не обеспечивает перевода хозяина в состояние полной резистентности.

11. Выведен критерий выбора модельного животного для тестирования ПВП. Выполнение критерия обеспечивает, что ПВП, являющийся оптимальным для модельного животного, будет оптимальным и для моделируемого хозяина.

12. С применением разработанного метода оценено, что вероятность (аэрогенного) инфицирования человека одним вирионом вируса Марбург равняется 0,014 (-0,004;+0,005). Полученное значение может быть использовано для оценивания риска заражения человека при моделировании различных ситуаций чрезвычайного характера. В частности, данная оценка была использована в исследовании, выполненном с участием автора в Center for Security Studies and Research, East Carolina University, Greenville, North Carolina, USA и посвященном оценке эффективности современных средств обнаружения микроорганизмов в воздушной среде (основанных на методах ИФА, ПЦР, массспектрометрии) в сравнении с вероятностью инфицирования человека, находящегося в контаминированной зоне.

13. С использованием разработанных алгоритмов оценена восприимчивость к вирусу Марбург и вируспродуцирующая способность клеток макрофагов морских свинок, обезьян и человека in vitro. На основании этих данных оценены величины критического уровня критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к животным и человеку.

Прогнозируется, что оптимальный для человека ПВП должен снижать вероятность инфицирования клетки или урожайность вируса или их произведение не менее чем в 187 раз. На основании анализа критических уровней критерия эффективности ПВП для вируса Марбург в применении к человеку, морской свинке и обезьяне (зеленой африканской мартышке) показано, что для выбора эффективного ПВП против вируса Марбург морская свинка являются более подходящей моделью человека, чем обезьяна. Оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия могут быть использованы в математических моделях развития инфекции Марбург указанных хозяев, а критические уровни - при подборе ПВП для борьбы с указанной инфекцией.

14. Разработана лабораторная технология получения и культивирования первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи, сохраняющих жизнеспособность и способных продуцировать вирус гриппа в течение 54 часов.

15. Для вируса гриппа разработаны методики оценки параметров модели прогнозирования (а именно вероятности инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средней урожайности вируса в клетке) в экспериментах in vitro с суспензионными первичными культурами клеток легкого и трахеи лабораторных животных.

16. Построена и проверена на литературных данных формула для оценки коэффициента эпидемиологической эффективности противовирусных средств через дозы этиологического вируса, измеренные для интактного и обработанного препаратом макроорганизма. В совокупности с моделью прогнозирования формула позволяет прогнозировать возможную эпидемиологическую эффективность кандидатных препаратов, основываясь на данных лабораторных экспериментов.

17. По результатам исследования изданы методические рекомендации по проблеме прогнозирования 50% инфицирующей дозы вируса для хозяина и оценке параметров моделей прогнозирования.

Полученные данные существенно углубляют и дополняют представления о методических подходах, которые следует использовать при изучении и характеризации вирусов, разработке и оценке потенциальной эффективности противовирусных средств. Разработанные модели, уравнения, методы, алгоритмы и критерии могут быть использованы для количественной оценки потенциальной опасности существующих и вновь возникающих вирусов для человека, оценивания значимости участия различных типов клеток и факторов врожденного иммунитета в формирование восприимчивости хозяина к инфекции, что позволит более надежно и обоснованно выбирать кандидатные противовирусные средства на стадиях лабораторных исследований.

Положения, выносимые на защиту. Предметом защиты диссертации является комплекс математических моделей и алгоритмов, позволяющих прогнозировать вируса для хозяина (в том числе человека) на основе параметров вирус-клеточных взаимодействий, полученных в экспериментах in vitro, обеспечивать оптимальный выбор противовирусных препаратов, обладающих заданными свойствами, и оценивать их эпидемиологическую эффективность, подбирать адекватных модельных животных, а также оценивать степень подобия восприимчивости клеток к вирусам in vitro относительно in vivo. Используя технологию математического и экспериментального моделирования, в работе получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.

1. Уравнение инфекционности адекватно связывает параметр восприимчивости организма хозяина к вирусу (вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) с параметрами вирус-клеточного взаимодействия (вероятность инфицирования клетки на фоне факторов врожденного иммунитета и средняя урожайность вируса в клетке) для вирусов, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции приводит к развитию полноценного инфекционного заболевания.

2. Частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней позволяют адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам, вызывающим инфекцию во входных воротах, в условиях соответственно незначительных и выраженных отличий факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина.

3. Разработанные алгоритмы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия позволяют адекватно оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия.

4. Первичные культуры клеток макрофагов адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусу Марбург. Первичные культуры клеток трахеи и легкого адекватно отражают свойства клеток in vivo и позволяют прогнозировать восприимчивость соответствующего органа хозяина к вирусу гриппа in vivo.

5. Величина произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия может быть использована в качестве критерия восприимчивости/резистентности хозяина к инфекции, а также критерия выбора оптимального ПВП и выбора модельного животного для выбора ПВП оптимального для хозяина.

6. Величина коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП может быть оценена сверху величиной 1-, где и - 50% эффективная доза патогенна ( или ), определенная для хозяина, получившего и не получившего препарат.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 33 всесоюзных, всероссийских и международных научных конференциях:

Всесоюз. конф. «Математическое моделирование иммунитета и инфекционного процесса», Кольцово, Новосибирская обл., 1989; Всесоюз. конф. «Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ», Москва, 1990; Intern. Conf. on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, USSR, 1991; Всерос.

конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии», Томск, 1991; Fourth Intern. Aerosol Conf., Los Angeles, California, 1994; Всерос. конф. "Экология и здоровье", Новосибирск, 1996; 3rd Intern. Conf. on Medical B-Protection, Munchen, 1996; Russian-German colloq. on Filoviruses: The modern state of problem, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997; Всерос. конф. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера», Новосибирск, 1998; Всерос. вторая научн. конф. "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1998; Intern. SB Medical Treatment Symp.

Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without chemical and biological weapons, Zagreb-Dubrovnik, Croatia, 1998; 18th Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Tacoma, Washington, USA, 1999; Intern.

Congress on Circumpolar Health, Harstad, Norway, 2000; Intern. Conf. on Bacterial and Viral Virulence Factors, Smolenice, Slovakia, 2000; 19th Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), St. Louis, Missouri, 2000; 3-rd Intern. Conf. on Emerging Zoonoses 2001, Noordwijkerhout, Holland, 2001; Intern. Conf. On Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, 2002; Х междун. конф.

«Новые информационные технологии в медицине экологии», Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2002; Intern. Biological Medical Conf. 2003, Prophylaxis and treatment of BW health disorders, Munich, Germany, 2003; 22nd Conf. of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Anaheim, California, USA, 2003;

Intern. Conf. On Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, 2004;

Междун. конф. «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» - Сосновка, Новосибирская обл., 2004; 23rd Conference of the American Ass. for Aerosol Research (AAAR), Atlanta, Georgia, 2004; Intern. Biological Medical Defense Conf. 2004, Munich, Germany, 2004;

Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные процессы:

фундаментальные, экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 2004;

European Aerosol Conference, Budapest, Hungary, 2004; 2-й Междун. конф.

«Наука – Бизнес – Образование Биотехнология – биомедицина - Окружающая среда», Пущино, Московская обл., 2005; XIII Intern. Cong. of Virology, San Francisco, California, USA, 2005; Intern. Biological Medical Defense Conf. 2005, Munich, Germany, 2005; III Рос. Научн. конф. с междун. участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2006, Новосибирск; 9th World Conf. on Biosensors, Toronto, Canada, 2006; Междун. конф.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, IT+M&E07», Гурзуф, Украина, 2007; 11th Intern. Biological Medical Defense Conf. 2007, Munich, Germany, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ, в т.ч. 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертационной работы, списка цитируемой литературы (511 ссылок), раздела с благодарностями и приложения. Работа изложена на 324 страницах, включая 14 рисунков и 29 таблиц.

Личный вклад соискателя. Благодарности. Выполнены лично: разделы 1–6, 7.2-7.4, 8.8, 9, 10, под руководством автора в соавторстве с к.б.н.

Шишкиной Л.Н. (разделы 8.1-8.7), к.м.н. Сергеевым А.А. (разделы 8.1, 8.2, 8.48.7); Петрищенко В.А. (разделы 8.1, 8.2, 8.4-8.6); к.б.н. Плясуновым И.В.

(раздел 8.6); Фанкиным И.В. (разделы 8.1, 8.5); д.м.н. Сергеевым А.Н. (разделы 8.1-8.7); к.ф.-м.н. Сафатовым А.С. (разделы 8.3, 8.4, 8.7); к.б.н. Пьянковым О.В.

(разделы 8.3, 8.4, 8.6); д.м.н. Несвижским Ю.В. (раздел 8.6); к.т.н. Топорковым В.С. (разделы 8.3, 8.4); к.т.н. Яшиным В.А. (разделы 8.3, 8.4); Беляевым Н.М.

(разделы 8.3, 8.4), Киселевым С.А. (раздел 8.6); под руководством автора: д.б.н.

Рябчиковой Е.И. (изучение тканей трахей и легких инфицированных животных методом электронной микроскопии в разделе 8.1); д.м.н. Малковой Е.И.

(изучение клеточного состава экспериментальных суспензий методом световой микроскопии в разделах 8.1, 8.5); к.ф.-м.н. Зайцевым Б.Н. (определение физического титра вируса гриппа методом атомной силовой микроскопии в разделе 8.8). Результаты, полученные совместно с: д.м.н. Сергеевым А.Н., Пьянковой О.Г., к.б.н. Булычевым Л.Е., Петрищенко В.А., к.б.н. Пьянковым О.В., к.б.н. Рыжиковым А.Б., к.б.н. Шишкиной Л.Н., к.ф.-м.н. Сафатовым А.С.

(данные по восприимчивости мышей ICR при инфицировании вирусом, гомологичным использованному в исследовании; метод прямого определения наличия инфекционного процесса гриппа у мышей и крыс - в раделе 8.4). Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность всем коллегам за плодотворное сотрудничество, а также к.ф.-м.н. Сафатову А.С., д.м.н. Сергееву А.Н., к.б.н. Пьянкову О.В., к.т.н. Субханкулову Г.Ф., д.б.н. Рябчиковой Е.И., Ярославцевой О.А. за предоставленные данные.

Автор сохранил признательность и память о своем научном консультанте академике А.А. Воробьеве и первом руководителе профессоре В.М.

Чермашенцеве, бывшем генеральном директоре ГНЦ ВБ «Вектор» академике Л.С. Сандахчиеве, бывшем заместителе генерального директора профессоре А.П. Садовском, бывшем директоре института аэробиологии ГНЦ ВБ «Вектор» к.т.н. В.С. Топоркове, оказывавшим поддержку в проведении исследований.

Автор искренне благодарит за сотрудничество, помощь в организации и проведении работ Генералову Т.И., Копылову Е.О., Окулову Л.М., Кириченко Т.Б., Прудникову Н.В., Соловей И.М., к.х.н. Котлярова Л.А., Грехову Г.П., Евтина Н.К., Колесникову Н.Г., к.вет.н. Бондаренко В.Н., д.м.н. Ставского Е.А., к.б.н. Мартынюк Р.А., Фомичеву И.В., к.б.н. Прыткову О.В., Лобанову Т.П., Николаеву А.И. и Речкину О.Л.; за доставку животных из питомника г. Пущино - Юркина А. и Оробея Д.; за полезные и продуктивные обсуждения при проведении работ и помощь при оформлении работы - к.ф.-м.н. Марьясова А.Г., к.х.н. Зайцева С.А., Красникову О.М., Наумочкина А.Н., д.б.н. Офицерова В.И., д.б.н. Сабельникова А.Г., к.б.н. Скрипченко А.А., к.м.н. Сучкова С.И., Терещенко А.Ю., к.б.н. Фролова В.Г., Хлопцеву Н.П., к.т.н. Шабанова А.В., Юрченко В.В.; за участие в планировании и обсуждение результатов исследования в рамках проекта ISTC/DARPA №450р, результаты которого вошли в данную диссертацию - Morse S. (Columbia University, New York, NY, USA, со-директор (1996-2000) программы Pathogen Countermeasures, DARPA, USA), Anderson G.W. (MRI, Frederick, MD, USA, представитель (1999-2002) DARPA, USA), Finke E.J. (Bundeswehr Institute of Microbiology, Munich, Germany, коллаборатор проекта).

Автор выражает отдельную благодарность за дружескую поддержку, обсуждения, полезные советы при проведении работ и помощь при написании рукописи, понимание важности для автора выполнения данного исследования к.х.н. Гусеву Ю.М., Хусаинову М.Д., а также за помощь, поддержку, терпение жене Луговской Л.Я и всей семье.





МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали штамм вируса гриппа (ВГ) А/Aichi/2/68 (Н3N2), свободных от патогенной флоры мышей CD-1 и крыс Wistar, а также конвенциональных мышей ICR.

Для определения ВГ для легких и трахеи животных инфицировали (5-10 голов на дозу, 4-5 доз инфицирования) аэрозолем с аэродинамическим диаметром 3,5 мкм (2 = 0,78). Наличие инфекционного процесса в органе определяли прямым методом по наличию вируса в органе через 48 ч после заражения. вируса гриппа для трахеи или легких вычисляли по формуле, где - 50% инфицирующая доза, рассчитанная исходя из значений концентрации ВГ в аэрозоле, – коэффициент осаждения аэрозоля 3,5 мкм (величины для животных определены в разделе 8.3). Дозы и их дисперсии вычисляли по методу Ван дер Вардена. Зависимости доза-эффект определяли однократно для трахеи мыши ICR и дважды во всех остальных случаях. В случае повторов дозы усредняли. Сравнение доз проводили по Z-критерию. В качестве дисперсии для трахеи мышей ICR использовали среднюю величину дисперсий всех определенных - =0,044, в остальных случаях в качестве дисперсии средних (по двум повторам) использовали величину равную =0,023.

Первичные культуры клеток получали методом дезагрегации легочной и трахеальной ткани с помощью трипсина. Для изменения соотношений реснитчатых клеток, альвеолоцитов I и II типов, а также макрофагов и нейтрофилов использовали метод адгезии клеток в пластиковых флаконах в присутствии 10% эмбриональной сыворотки, а также метод фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/cм3. Инфицировали исходные культуры клеток легкого и трахеи, суспензии неадгезированных клеток и клеток, собранных в верхней и нижней фракциях. Для каждого типа культуры в 3 повторах определяли урожайность а также процентное содержание вышеприведенных типов клеток. Дозы нормировали на 1 млн. клеток по формуле из раздела 5.2.

Урожайность вычисляли по формулам, выведенным в разделе 5.3.

Инкубацию вируса во всех случаях проводили при 370С.

Цитологическое исследование проводили при увеличении 1000 в световом микроскопе Axiovert-40 (Цейс, Германия) в препаратах, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову. Идентификацию клеток осуществляли на основе характерных для них морфологических признаков. Репродукцию вируса гриппа в суспензионных первичных клеточных культурах легких и трахеи подтверждали методом ультратонких срезов. Срезы изучали в электронном микроскопе Н-600 (Хитачи, Япония) при увеличениях 5000-30000.

Жидкость, содержащую внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки (ИФСЭВ) крыс получали из бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), которую диализировали с целью максимального освобождения полученной жидкости от хлорида натрия и лиофилизировали, с последующим разведением продукта лиофилизации в изотоническом растворе NaCl. Изучение вирус-нейтрализующего действия жидкости, содержащей ИФСЭВ, проводили в контактных опытах in vitro с последующим определением инфекционности вируса гриппа при заражении РКЭ.

Величины констант скорости нейтрализации вируса гриппа ИФСЭВ крыс, термоинактивации вируса и скорости инфицирования клеток, определяли по формулам, выведенным в разделе 5.1.

Для прогнозирования использовали частный и модифицированный алгоритмы, вывод которых приводится в разделах 3 и 4. Для решения уравнения инфекционности при прогнозировании дозы частным алгоритмом использовали метод перебора, а при прогнозировании модифицированным алгоритмом использовали программу поиска решения уравнения из MS Excel 2007.

Проверка адекватности алгоритмов прогнозирования проведена на примере экстраполяции вируса Марбург с морской свинки на обезьяну (зеленая африканская мартышка) и вируса гриппа для легких и трахеи с мыши CD-1 на мышь ICR и крысу Wistar, а также с мыши ICR на крысу Wistar с последующим сравнением прогнозируемых c экспериментально измеренными величинами.

Сравнение прогнозируемых с экспериментально определенными проводили по двустороннему Z-критерию, где индекс «pred» или «exp» относит параметр к прогнозируемой или экспериментально определенной дозе, а - оценка дисперсии соответствующей величины. Дисперсию прогнозируемой величины полагали равной дисперсии экспериментально определенной величины, соответствующей тому животному, которое использовалось как модельное. В случае прогнозирования вируса Марбург для обезьяны дисперсию прогноза полагали равной дисперсии для морской свинки, определенной по экспериментальным данным. Дозу вируса гриппа для трахеи мышей ICR определяли в одном эксперименте, в то время как во всех остальных случаях (легкие мышей ICR, трахеи и легкие мышей CD-1 и крыс Wistar) - в двух независимых повторах. Поэтому в качестве дисперсии для трахеи мышей ICR использовали среднюю величину дисперсий всех (для вируса гриппа) экспериментально определенных - =0,044, в остальных случаях в качестве дисперсии средних (по двум повторам) использовали величину равную =0,023. Дисперсию прогноза для трахеи крысы при экстраполяции с мышей ICR полагали равной Sa2 =0,044, во всех остальных случаях прогноза – равной 0,5Sa2=0,023.

В работе также использовали однофакторный дисперсионный анализ и t- критерий. Достоверным принимался уровень значимости <0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение среднего ( ), количество повторов (n). Параметр n не приводится для доз и концентраций ВМ, выраженных в БОЕ.

При выводе уравнения инфекционности рассматривали вероятностную модель формирования инфекционного процесса, а также использовали формулу полной вероятности и аппарат производящих функций. При выводе модифицированного алгоритма прогнозирования вируса для хозяина с учетом факторов врожденного иммунитета анализировали простейшую кинетическую модель инфекционного процесса, согласно которой полагали, что на начальных стадиях инфекционного процесса скорости снижения концентрации свободного вируса, обусловленные процессами инфицирования клеток и нейтрализации фактором иммунитета, следуют кинетике реакции псевдовторого порядка с константами скоростей (характеризует восприимчивость клеток к вирусу) и (характеризует восприимчивость вируса к фактору иммунитета), соответственно, а скорость спонтанной инактивации (термоинактивации) следует реакции псевдопервого порядка с константой скорости и (характеризует общую устойчивость вируса), т.е.

описываются соответственно уравнениями, (1), (2) и, (3) где - концентрация активного свободного вируса, - концентрация неинфицированных клеток, - концентрация фактора иммунитета, 0 - время инфицирования организма или культуры клеток или внесения вируса в среду культивирования с или без фактора иммунитета.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Основные предположения Сформулируем основные предположения, в рамках которых решается задача разработки метода прогнозирования вируса для хозяина.

Гипотеза независимого действия, согласно которой каждый вирион, попавший в организм хозяина, независимо от других может с некоторой вероятностью, р, вызвать инфекционный процесс (условие 1).

Популяция хозяина. Рассматривается гомогенная популяция хозяина по восприимчивости к вирусу (условие 2).

Модель инфекционного процесса. Рассматривается обобщенная модель образования инфекционного процесса заболеваний, у которых место первичной репликации одновременно является органом-мишенью, или, когда место первичной репликации не является органом-мишенью, но наработка вируса в месте первичной репликации непременно приводит к поражению органамишени, т.е. ассоциируется с полноценным инфекционным заболеванием, а также выход вируса из первично-инфицированных клеток происходит до значимого изменения активности неспецифических факторов и иммунного ответа (условие 3). Для упрощения изложения орган, являющийся воротами инфекции, будем называть органом-мишенью. Уточним условие 3. На первом этапе считаем, что только один тип клеток является восприимчивым к вирусу.

В соответствии с гипотезой независимого действия поведение вириона в органе-мишени является вероятностным процессом. Обозначим вероятность инфицирования одной из восприимчивых клеток, соответственно с вероятностью вирион может подвергнуться спонтанной инактивации (термоинактивации) и инактивации или нейтрализации факторами неспецифической защиты (в интактном организме). Считаем, что количество вируса, произведенного инфицированной клеткой, может варьировать от клетки к клетке и является случайной величиной распределенной по закону Пуассона относительно среднего количества (средней урожайности вируса в клетке) равного. Параметры (вероятность инфицирования клетки) и (средняя урожайность вируса в клетке) будем называть параметрами вирусклеточного взаимодействия.

50% инфицирующая доза. Считаем, что инфекционный процесс не образовался, если процесс наработки вируса в клетках и последующего инфицирования клеток прекращается до того, как произойдет значимое изменение эффективной восприимчивости клеток вследствие активации факторов защиты и иммунного ответа.

Подобие условий in vitro и in vivo. Считаем, что урожайности вируса в клетке in vitro и in vivo равны, а удельная восприимчивость клеток в условиях in vitro изменяется относительно условий in vivo; при этом степень изменения не зависит от вида клеток и хозяина; удельная противовирусная активность неклеточных факторов врожденного иммунитета (неспецифических ингибиторов) в условиях in vitro не изменяется по отношению к условиям in vivo; скорость термоинактивации вируса при равных температурах in vivo и in vitro одинакова (условие 4).

2. Уравнение инфекционности Как показано в работе (Peto S.A. Dose-response Equation for the Invasion of Microorganism // Biometrics. 1953. 9(9). P. 320-335), из гипотезы независимого действия для гомогенной популяции справедлива экспоненциальная зависимость доза-эффект (4) где – вероятность инфицирования организма при попадании в него некоторого количества вирионов со средним значением равным, p – вероятность инфицирования хозяина одним вирионом. Там же показано, что (5) где выражается в физическом количестве вирионов. Отсюда следует, что задача прогнозирования равносильна прогнозированию вероятности р.

Способность вириона, попавшего в организм, вызвать инфекционный процесс, обусловлена способностью «дочерних» вирионов, появившихся в результате первого цикла репродукции вируса в инфицированной клетке, поддерживать многораундную репликацию. Использование формулы полной вероятности и аппарата производящих функций позволило связать вероятность р с параметрами вирус-клеточного взаимодействия уравнением (6) называемому далее уравнением инфекционности. Уравнение относительно неизвестного относится к классу трансцендентных уравнений, что означает невозможность выражения через параметры вирус-клеточного взаимодействия. Решение таких уравнений может быть найдено только численными методами. Тем не менее, некоторые свойства уравнения можно проиллюстрировать, основываясь на общих свойствах функций, входящих в уравнение инфекционности.

Для восприимчивого хозяина доза является конечной величиной, которой в соответствии с (5) будет соответствовать некоторое значение вероятности, верна и обратная связь. Поэтому при решении уравнения инфекционности следует определять значение неизвестного из интервала и только в случае отсутствия такого решения, следует принять решение, которое формально всегда существует и которому соответствует бесконечное значение дозы, означающее полную резистентность хозяина к инфекции.

Рассмотрим графическую интерпретацию уравнения инфекционности (рис. 1). Представим левую и правую части уравнения как функции от переменной : и. Графиком функции является прямая линия, исходящая из начала координат под углом 45о к оси абсцисс, а графиком функции – экспонента, обращенная выпуклостью вверх, исходящая также из начала координат и асимптотически приближающаяся снизу к прямой, идущей параллельно оси абсцисс на уровне. Решению уравнения будет соответствовать абсцисса точки пересечения графиков и, значение которой всегда меньше. При уменьшении или N кривая становится соответственно целиком ниже или положе исходной кривой, при этом точка пересечения графиков приближается к началу координат, т.е. значение вероятности р становится ближе к 0. Легко убедиться, что при урожайности вируса в клетке всего лишь в 7 раз больше дозы, 7, величина выражения из правой части уравнения инфекционности становится меньше 0,01. Это означает, что р становится практически равной.

Рис. 1. Графическая интерпретация вероятностного уравнения инфекционности А. Случай существования решения, соответствующего конечной дозе.

В. При 1 касательная к графику при р>0 проходит под.

Условие отсутствия положительного решения уравнения инфекционности (т.е. когда следует из свойств строго вогнутых функций, к которым относится функция. При (7) график строго вогнутой функции целиком, за исключением точки касания, находится под касательной, исходящей из начала координат под углом что и означает существование только нулевого решения уравнения. В противном случае, когда (8) уравнение инфекционности будет иметь положительное решение, когда доза конечна. Отсюда, условие (7) является критерием невосприимчивости или резистентности хозяина, а условие (8) – критерием восприимчивости хозяина к инфекции.

Согласно условию 4 урожайности вируса в клетке in vivo ( ) и in vitro (, индекс « » у параметра означает соответствие его условиям in vitro) равны, а восприимчивость клеток может изменяться. Поэтому при использовании параметров вирус-клеточного взаимодействия, измеренных в экспериментах с первичными культурами клеток, в уравнение инфекционности следует ввести дополнительный параметр – масштабный коэффициент, = учитывающий отличия восприимчивости клеток in vitro и in vivo, что приводит к уравнению (9) Вероятность является аналогом вероятности инфицирования вирусом всего организма или органа-мишени - р, отличаясь от последней тем, что определяется для культуры восприимчивых клеток, при этом культура считается инфицированной если произошло заражение хотя бы одной клеткимишени с образованием в ней инфекционного вирусного потомства. В этом случае по аналогии с (5) справедливо, что. (10) Подстановка в (9) вместо вероятностей р и выражений (5) и (10) позволяет получить уравнение, связывающее вируса для хозяина с параметрами вирус-клеточного взаимодействия ( ). (11) Уравнения (9) и (11) наряду с (6) будем также называть уравнением инфекционности, при этом уравнения, в которые входят вероятности, будем называть вероятностными уравнениями инфекционности. Следует отметить, что в вероятностном уравнении урожайность должна быть выражена в количестве вирионов, а в (не вероятностном) уравнении инфекционности урожайность и дозы и можно выражать в биологических единицах.

Если у хозяина восприимчивыми к вирусу являются клетки R типов, то уравнение инфекционности принимает вид (12) где и – параметры вирус-клеточного взаимодействия для клеток r-го ( ) типа. Для отсутствия положительного решения этого уравнения необходимо и достаточно, чтобы 3. Частный алгоритм прогнозирования вируса для хозяина Считаем, что существует модельное животное, при инфицировании у которого развивается инфекционный процесс подобный процессу в организме хозяина. Рассмотрим случай, когда отличия в активности факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина несущественны.

Для модельного животного возможно определение не только параметров вирус-клеточного взаимодействия, но и инфицирующей дозы, что позволяет по уравнению инфекционности вычислить величину коэффициента . Согласно условию 4 восприимчивость клеток к вирусу ( или ) in vitro относительно восприимчивости этих клеток in vivo изменяется одинаково для хозяина и модельного животного. Если при этом отличия в активности факторов врожденного иммунитета несущественны и в экспериментах in vitro концентрации клеток, полученных от различных хозяев, соответствует в одинаковой степени концентрациям in vivo, то величины масштабного коэффициента для различных хозяев должны быть одинаковыми. Это следствие позволяет сформулировать приводимый ниже алгоритм экстраполяции с модельного животного на хозяина. Нижний индекс « » при параметре будет означать, что параметр измерен для модельного животного или его клеток.

1. Определяется для модельного животного.

2. В экспериментах in vitro определяются и для клеток модельного животного и хозяина.

3. Вычисляется величина коэффициента при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для модельного животного 4. Вычисляется величина вероятности при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для хозяина и вычисленной величины , после чего для хозяина определяется доза Подстановка в уравнение п.4 алгоритма выражения вероятности через и выражения для коэффициента п. 3 алгоритма, логарифмирование обеих частей уравнения позволяет получить интегральное уравнение для прогнозирования ( ) ( ) (13) Подстановка в равнение выражения через приводит к другой форме интегрального уравнения ( ) ( ) (14) Как будет показано ниже, вероятность может быть оценена через количество инфицированных клеток и инфицирующую дозу, в этом случае возможно выражение дозы и следовательно вероятности в условных единицах.

Т.к. при 7 величина <0,01, то можно в уравнении (13) или (14) опустить члены с экспонентами и полученное упрощенное уравнение, например, (15) использовать для приближенного вычисления величины.

4. Модифицированный алгоритм прогнозирования вируса для хозяина с учетом нейтрализующих факторов врожденного иммунитета Модифицированный алгоритм прогнозирования с учетом факторов врожденного иммунитета получен на основе рассмотрения кинетической модели инфекционного процесса, представленной тремя уравнениями (1) - (3), которые описывают убыль концентрации активного вируса при инфицировании восприимчивых клеток, нейтрализации фактором иммунитета и в процессе спонтанной (термо) инактивации. Так как нас интересует вероятность образования инфекционного процесса, то естественно предположить, что на начальных стадиях формирования инфекционного процесса, когда концентрация свободного вируса (in vivo) не достигает своих максимальных значений, справедливо, что концентрации неинфицированных клеток,, и фактора иммунитета,, в результате взаимодействия с вирусом меняются незначительно, т.е. В этом случае.

уравнения (1) и (2) могут рассматриваться как уравнения псевдопервого порядка с константами и Так как в организме все процессы снижения концентрации свободного вируса протекают параллельно, то общее снижение концентрации вируса вследствие инфицирования клеток, нейтрализации факторами иммунитета и термоинактивации будет описываться интегральным уравнением (16) Используя формулы для выражения количества продукта параллельных реакций первого порядка на момент времени t через начальное количество субстрата и константы скоростей соответствующих (параллельных) процессов были получены выражения для определения вероятности того, что к моменту времени t вирусная частица либо инфицирует клетку, либо окажется нейтрализованной фактором иммунитета,, либо подвергнется термоинактивации,, [ ] *» (17) а также для определения абсолютной вероятности того, что вирион инфицирует клетку. (18) Согласно условию 4 величины коэффициентов нейтрализации и термоинактивации, измеренные in vivo и in vitro не отличаются и, а восприимчивость клеток in vitro относительно in vivo изменяется.

Введем коэффициент который характеризует степень изменения восприимчивости клеток в культуре клеток по отношению к их восприимчивости в живом макроорганизме. Отсюда и согласно (18) (19) где - масштабный коэффициент, учитывающий отличие и концентраций, и восприимчивости клеток in vivo и in vitro; и – соответственно константы скоростей инфицирования клеток с концентрацией равной и нейтрализации вируса фактором иммунитета с концентрацией равной ; коэффициент учитывает отличие концентраций фактора иммунитета in vivo и in vitro.

Подстановка в (7) выражения (19) вместо приводит к кинетической форме уравнения инфекционности. (20) Данное уравнение является линейным относительно коэффициента, откуда следует формула для вычисления . (21) [( ) ] [ ] [ ] Согласно условию 4 степень изменения восприимчивости клеток, полученных от различных хозяев, одинаковая, поэтому величина масштабного коэффициента для модельного животного и хозяина будет одинаковая, если при проведении экспериментов in vitro соотношение концентраций клеток модельного животного относительно хозяина будет как в условиях in vivo.

Отсюда следует модифицированный алгоритм прогнозирования вируса c учетом нейтрализующего фактора врожденного иммунитета.

1. Определяется для модельного животного.

2. В экспериментах in vitro определяются и для клеток хозяина и модельного животного, и для фактора иммунитета хозяина и модельного животного и при культивировании вируса при температуре равной температуре тела хозяина и модельного животного.

3. Вычисляется величина коэффициента по формуле (21) при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для модельного животного.

4. Вычисляется величина вероятности инфицирования хозяина одним вирионом p при подстановке в уравнение инфекционности параметров, измеренных для хозяина и полученного значения , после чего определяется доза Интегральное уравнение, связывающее вероятность p c другими параметрами, ввиду громоздкости не приводится.

Важной особенностью модифицированного алгоритма является необходимость использования в вычислениях величин, и, выраженных в количестве вирионов в отличие от частного алгоритма прогнозирования, в котором возможно использования параметров, выраженных в условных единицах.

5. Теоретическое обоснование способов оценки in vitro параметров моделей прогнозирования 5.1. Определение вероятности инфицирования клеток, констант скоростей термоинактивации, нейтрализации вируса и инфицирования клеток Рассмотрены три типа экспериментов по культивированию вируса in vitro: в первом случае вирус инкубируется в бесклеточной среде и без фактора иммунитета, во втором - вирус инкубируется в бесклеточной среде с (нейтрализующим) фактором иммунитета и в третьем - вирус инкубируется в присутствии чувствительных клеток и в отсутствие фактора иммунитета.

Убыль вируса обусловлена: в первом эксперименте - термоинактивацией, во втором – нейтрализацией фактором и термоинактивацией, в третьем – инфицированием клеток и термоинактивацией. Пусть – концентрация вируса в каждом из трех экспериментов с одинаковой начальной концентрацией при изучении термоинактивации и нейтрализующих факторов, т.е. Если во всех случаях убыль концентрации вируса соответствует кинетике псевдопервого порядка, то справедливы следующие формулы для определения in vitro констант скоростей: для константы скорости спонтанной инактивации вируса (22) для константы нейтрализации вируса фактором нейтрализации, (23) для константы скорости инфицирования клеток. (24) Если скорость взаимодействия вируса с клетками много меньше скорости инактивации, то из-за экспериментальной погрешности определения величины и могут оказаться статистически неразличимы, из-за чего величина по формуле (24) будет оценена 0. Для этого случая выведены формулы для оценки и через дозу вируса для культуры первичных клеток-мишеней и количество инфицированных клеток. В первом случае величина может быть вычислена путем численного решения уравнения [ ] (25) где – длительность времени инкубации вируса с клетками при определении дозы. Во втором случае, (26) где - концентрация инфицированных клеток (может быть определена методом инфекционных центров) в среде сокультивирования клеток и вируса, – концентрация вируса в инфицирующей дозе. В этом случае величина может быть вычислена путем численного решения уравнения [ ] (27) 5.2. Нормирование вероятности инфицирования клеток и дозы на количество клеток Для корректного сопоставления вероятностей инфицирования клеток или доз для клеток от различных видов хозяина и использования их в алгоритме прогнозирования необходимо, чтобы эти параметры были измерены для определенного количества клеток, что бывает трудно выполнить в эксперименте. Так как в экспериментах in vitro используются концентрации клеток много меньше, чем в условиях in vivo, то величина константы скорости инфицирования культуры клеток может стать меньше константы скорости термоинактивации. В этом случае возможно нормирование вероятности и дозы, измеренных для концентрации клеток на концентрацию, клеток по формулам:

, (28) (29) 5.3. Определение урожайности вируса в клетке ( ) Формула оценки урожайности вируса в клетке выведена исходя из предположений, что термоинактивация вируса, вышедшего из клетки в среду культивирования, соответствует кинетике псевдопервого порядка и, что кинетика продукции вируса в клеточной культуре состоит из 3-х фаз: эклипса и созревания вируса; стационарной фазы продукции вируса и фазы инактивации вируса. ; – максимальная стабильная концентрация вируса для всей стационарной фазы продукции вируса. Показано, что может быть оценена по формуле, (30) где – количество вирионов, произведенных одной клеткой и неинактивировавшихся к моменту времени из интервала, в котором наблюдается стационарная фаза продукции вируса. В свою очередь (31) где – концентрация внесенного вируса в среде культивирования при инфицировании клеток; - концентрация не инактивированных вирусных частиц во время стационарной фазы продукции вируса. Если вероятность определяется через согласно (10), то (32) 6. Вывод упрощенной модели прогнозирования с учетом нейтрализующего фактора и частного алгоритма прогнозирования из модифицированного алгоритма прогнозирования Если величины константы скорости инфицирования клеток меньше константы скорости термоинактивации, тогда и Подстановка этих выражений в выражения для вероятности инфицирования клетки in vitro и in vivo и в уравнение инфекционности приводит к упрощенному интегральному уравнению прогнозирования ( ) ( ) (33) Полученное интегральное уравнение в отличие от уравнений, входящих в исходный модифицированный алгоритм, позволяет использовать дозы, и, выраженные в условных (биологических) единицах. При равенстве противовирусной активности факторов иммунитета у обоих видов хозяина будет выполняться равенство из чего следует уравнение прогнозирования (14) частного алгоритма.

Математически показано, что если константа скорости инфицирования клетки in vivo не превышает величину константы скорости термоинактивации, т.е. и если в экспериментах in vitro происходит разбавлении концентрации клеток, то величина прогноза по упрощенному уравнению будет отличаться от прогноза по полному уравнению не более, чем на величину 0,3, которая сопоставима со статистической погрешностью изменения при экспериментальном определении. Так как уже при величина ( ) становится меньше 0,007, то в качестве приближенного решения уравнения (33) можно использовать выражение, стоящее в его правой части за исключением последних двух слагаемых с экспонентами, что приводит к уравнению (34) 7. Проверка адекватности частного алгоритма прогнозирования на примере вируса Марбург В разделе приводятся результаты проверки адекватности частного алгоритма прогнозирования на примере экстраполяции ВМ с морской свинки на обезьяну (зеленая африканская мартышка), а также прогноза восприимчивости человека к ВМ. Из литературных данных следует, что при аэрогенном заражении ВМ первично инфицируемыми клетками являются макрофаги, а также что ВМ способен подавлять антигенпрезентирующую функцию дендритных клеток. В литературе не отмечается подверженности этого вируса воздействию каких-либо факторов врожденного иммунитета.

Отсюда следует, что для данного вируса будет достаточно учесть при прогнозировании только клетки макрофагов. Параметры вирус-клеточного взаимодействия оценивали, используя литературные данные по эффективности инфицирования и кинетикам репродукции вируса в первичных культурах макрофагов животных и человека. По формуле (26) с последующей нормировкой на 1 млн. клеток были определены величины вероятности инфицирования макрофагов, : 0,45±0,30 (n=3), 0,18±0,09 (n=2) и 0,020±0,007 (n=2) 10-3/(БОЕ/мл) для морской свинки, обезьяны и человека соответственно. Урожайность N оценивали количеством вирусных частиц, произведенных одной клеткой и не инактивированных к моменту времени достижения максимальных концентраций вируса по формуле (31): 53±22, 117±33 и 440±118 БОЕ/клетка для макрофагов морской свинки, обезьяны и человека соответственно.

При экстраполяции с морской свинки на обезьяну использовали уравнение (13), значения параметров, определенные выше, а также величину дозы для морской свинки = -0,67 Дозу для морской свинки и пробные значения для обезьяны выражали в количестве вирионов исходя из соотношения 1 у.е. = 10 вирионов. Урожайность выражали в количестве вирионов в двух вариантах: исходя из очевидного соотношения 1 БОЕ 1 вирион и исходя из оценки 1 БОЕ = 30 вирионов, приведенной в литературе. В обоих случаях прогнозная величина равняется -0,26, которая незначимо (=0,05) отличается от нижней и верхней оценок для обезьяны, -0,57±0,38 -0,16±0,Это свидетельствует об адекватности частного алгоритма прогнозирования, а также свидетельствует об адекватности уравнения инфекционности и возможности использования первичных культур макрофагов для адекватного прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусу Марбург. Прогноз вируса Марбург для человека произведен путем экстраполяции с морской свинки аналогично тому, как это делалось для обезьяны. Для обоих вариантов выражения БОЕ в количестве вирионов прогнозируемая величина для человека равняется 0,69±0,14 или 49±2 вириона. Отсюда можно оценить вероятность инфицирования человека одним вирионом 0,014 (-0,004;+0,005). Т.о., при аэрогенном инфицировании человек восприимчив к ВМ примерно в 20 раз меньше, чем морская свинка, и в 7-17 раз меньше, чем обезьяна.

8. Проверка адекватности частного и модифицированного алгоритмов прогнозирования на примере вируса гриппа 8.1. Оптимизация условий культивирования первичной суспензионной культуры клеток, выделенной из легочной ткани мышей В качестве клеточной системы для изучения параметров взаимодействия вируса гриппа с клетками широко используют первичные культуры клеток, полученные из органов дыхания, в виде монослоя, сформированного на специальных подложках, например, на коллагене. Однако клеточный состав таких первичных клеточных культур не соответствует естественному соотношению клеток в органе, поскольку там присутствуют клетки, которые обладают слабой адгезивной способностью и, соответственно, не «приживаются» в монослое. На первом этапе работы были разработаны методы получения первичной суспензионной культуры легочных клеток и оценки ее восприимчивости к вирусу гриппа. Показано, что полученная с помощью ферментативной дезагрегации первичная суспензионная культура легочных клеток мышей, содержит все основные клеточные типы: реснитчатые клетки - 0,70,5 %; бокаловидные клетки - 0,50,4 %; альвеолоциты I типа - 0,90,4 %;

альвеолоциты II типа - 3,81,2 %; недифференцированные эпителиальные клетки - 5,21,5 %; макрофаги - 12,82,6 %; нейтрофилы - 10,32,0 %;

эозинофилы - 1,10,6 %; лимфоциты - 51,46,8 % ; прочие – 13,31,4 % (во всех случаях n=3). С помощью электронной микроскопии было показано, что клетки в суспензионных первичных культурах продуцируют вирус гриппа при культивировании в течение 30 ч после инфицирования in vitro.

Для культивирования инфицированных вирусом гриппа первичных культур клеток в суспензии по результатам серии экспериментов была выбрана cреда DMEM/F12 c добавлением 0,5 % эмбриональной сыворотки Gold (ICN Biomedicals Inc).

8.2. Оптимизация условий определения вируса гриппа для суспензионных культур клеток Для определения необходимо определить момент времени для измерения концентрации вируса, при котором несвязавшийся вирус инактивируется, а вероятность наличия в суспензии неинактивированного вновь наработанного вируса максимальная. Для этого были изучены кинетики наработки ВГ в суспензиях первичных культур клеток ткани легкого мышей и крыс при разной множественности заражения и кинетики инактивации вируса в суспензиях дебриса клеток. Использовали три различные дозы вируса, при этом концентрации ВГ в суспензии клеток и дебрисе клеток на 0 часов инкубации сопоставимы. Вирус начинает выходить из клеток через 6-12 ч после их инфицирования. Концентрация ВГ достигает максимальных значений к 18-часам после инфицирования, после чего остается на стационарном или близком к нему уровне до 42-48 часов для клеток мышей и 36-42 часов для клеток крыс.

При этом, после 24 часов инкубации ВГ в дебрисе клеток не обнаруживается.

Средняя продолжительность стационарной фазы продукции вируса для легочных клеток мышей равняется 26,0±2,0 ч (n=3) и для легочных клеток крыс - 18,0±3,5 ч (n=3). Исходя из полученных данных, мы выбрали 30 ч как время отбора биопроб для определения наличия наработки вируса в первичных суспензионных культурах легочных клеток экспериментальных животных, т.е.

установления факта продуктивной адсорбции ВГ на первичных клетках и определения урожайности вируса в клетках.

Величины потери инфекционной вирусной активности, за первые и последующие 3 ч инкубации в дебрисе легочных клеток мышей (0,6±0,3 (n=3) и 0,6±0,2 (n=2) соответственно) и крыс (0,5±0,3 (n=3) и 0,3±0,3 (n=2), соответственно) не отличаются (>0,05) друг от друга, что подтверждает возможность использования экспоненциальной зависимости для описания инактивации вируса в среде культивирования. Среднее значение константы термоинактивации kTV равняется 0,4±0,1 час-1 (n=10). Это значение и величины средней длительности стационарной фазы продукции вируса в дальнейшем были использованы для определения урожайности ВГ в первичных клетках.

8.3. Определение коэффициентов осаждения экспериментального аэрозоля в респираторных органах мышей и крыс Четыре мыши CD-1 и 4 крысы были экспонированы жидким аэрозолем (3,5 мкм), содержащим латексные частицы диаметром 3 мкм. Из трахеи и легких готовили гомогенаты с последующим приготовлением мазков на покровных стеклах и подсчетом в них количества частиц латекса в люминесцентном микроскопе Olympus CK-40, Япония при 280 кратном увеличении. На основании оценок количества латексных частиц, попавших в трахею и легкие, и находящегося во вдыхаемом объеме воздуха были определены величины экспериментального аэрозоля для трахеи и легких у мышей - 1,20,1 и 2,60,2 %, у крыс - 3,20,2 и 11,80,9 % соответственно (во всех случаях n=4).

8.4. Определение вируса гриппа для респираторных органовмишеней у экспериментальных животных при аэрогенном заражении вируса гриппа определяли отдельно для легких и трахеи, т.к. в этих органах восприимчивые клетки представлены различными типами: в трахее – реснитчатыми клетками, а в легком реснитчатыми и альвеолоцитами I и II типов. Определено (таблица 1), что у мышей CD-1 и ICR отличия между восприимчивостью к ВГ легких и трахеи незначимы, а у крыс трахея более восприимчива, чем легкие (<0,05).

Таблица Дозы ВГ для органов дыхания экспериментальных животных при аэрогенном заражении Вид животных Средние значения для органов дыхания, Трахея Легкие Крыса Wistar -0,1±0,2** 1,3±0,2* Мышь СD-1 -0,4±0,2** -0,5±0,2** Мышь ICR -1,1±0,2 -1,2±0,Примечание: * - показатель достоверно отличается (>0,05) от показателя для легких у мышей и от показателей для трахеи у мышей и крыс; ** - показатель достоверно отличается (>0,05) от аналогичного показателя у мышей ICR Отличия по восприимчивости трахеи к вирусу гриппа у крыс Wistar и мышей CD-1 незначимы (>0,05), но обе эти характеристики достоверно ниже, чем восприимчивость к вирусу гриппа трахеи у мышей ICR. Восприимчивость к ВГ легких у крыс Wistar значительно ниже, чем у мышей CD-1 и ICR (<0,05).

Восприимчивость легких у мышей СD-1 достоверно ниже, чем у мышей ICR (<0,05).

8.5. Определение параметров вирус-клеточного взаимодействия для клеток легких и трахеи экспериментальных животных в первичной суспензионной клеточной культуре Был оценен вклад различных клеток эпителия респираторных органов в развитие инфекции. В экспериментах использовали первичные суспензионные культуры клеток, полученных из ткани легкого и трахеи животных, а также суспензии неадгезированных клеток после инкубации в пластиковых пробирках и клеток, собранных в верхней и нижней фракциях после центрифугирования.

Для смесей определяли процентное содержание клеток - реснитчатых, альвеолоцитов I и II типов, макрофагов, нейтрофилов, и других - (таблица 2), а также величины и (таблица 3).

Таблица Процентное содержание различных типов клеток в первичных культурах респираторных органов мышей и крыс после их разделения разными способами Вид Вид культуры клеток Процентное содержание (%) различных типов клеток животных РК А I А II Мф Нф Все другие клетки Суспензия 1,3±0,3 1,2±0,5 0,9±0,4 9,8±1,1 15,0±1,3 72,8±2,дезагрегированных в ни в н,в,ни,т клеток легких Неадгезированные 2,3±0,2 0,1±0,1 0,0±0,0 8,1±1,7 3,3±0,7 85,2±1,клетки легких в ни л,в Клетки легких, Мышь 3,3±1,6 10,6±1,5 1,6±0,8 2,3±2,3 0,0±0,0 82,2±4,собранные в верхней CD- л,н,ни,т л,ни л,н,ни фракции Клетки легких, 3,2±0,6 3,9±1,6 3,8±0,9 11,9±1,6 6,2±2,0 70,9±3,собранные в нижней в л,н,т в л,в фракции Суспензия клеток 1,2±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0 8,0±2,0 2,3±1,0 88,5±1,трахеи в ни л Суспензия 0,9±0,3 11,0±0,5 4,2±1,дезагрегированных 2,4±0,6 0,3±0,2 81,2±1,в,ни,т в в клеток легких Неадгезированные 1,0±0,3 7,5±1,4 2,6±0,2,1±0,5 1,0±0,6 85,8±2,клетки легких в,ни,т в в Клетки легких, Крыса 19,9±2,6 0,8±0,8 0,0±0,собранные в верхней 0,7±0,7 0,4±0,4 80,5±4,Wistar л,н,ни,т л,н,ни л,н,ни,т фракции Клетки легких, 2,7±0,1 3,6±1,2 10,6±1,8 2,8±0,собранные в нижней 1,7±0,1 78,5±2,л,н,в,т т в в,т фракции Суспензия клеток 0,0±0,0 0,0±0,0 6,2±1,8 1,4±0,1,9±0,4 90,5±1,трахеи л,в,н,ни ни в,ни Суспензия 10,3±2,дезагрегированных 0,7±0,5 0,9±0,4 3,8±1,2 12,8±2,т т 71,5 3,Мышь клеток легких ICR Суспензия 0,0±0,0 2,8±1,дезагрегированных 1,1±0,2 0,0±0,0 9,3±2,3 86,8±2,л л клеток трахеи Примечание: РК – реснитчатые клетки, А I (II) – альвеолоциты I (II) типа, Мф – макрофаги, Нф – нейтрофилы; - клетки, полученные методом фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/cм3; т - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток трахеи (0,05);

ни - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток, собранных в нижней фракции (0,05); в - содержание клеток достоверно отличается от содержания в суспензии клеток, собранных в верхней фракции (0,05); н - содержание клеток достоверно отличается от их содержания в суспензии неадгезированных клеток легких (0,05); л - содержание клеток достоверно отличается от содержания в исходной суспензии клеток легких (0,05); во всех случаях n=3.

Таблица Значения 50% клеточных инфицирующих доз вируса гриппа (КИД50) и урожайности вируса гриппа (N) в суспензиях первичных культур клеток легких и трахеи мышей и крыс Вид животных Виды полученных Параметры вируспервичных суспензионных клеточного взаимодействия клеточных культур легких и в суспензионных трахеи первичных культурах, N, Суспензия дезагрегированных клеток 4,0±0,5 3,1±0,3 # легких Неадгезированные клетки 4,0±0,6 2,7±0,легких Клетки легких, собранные в Мышь CD-1 4,3±0,3 2,5±0,верхней фракции Клетки легких, собранные в 4,0±0,4 2,3±0,нижней фракции Суспензия дезагрегированных клеток 3,8±0,2 * 3,2±0,2 $ трахеи Суспензия дезагрегированных клеток 4,0±0,4 2,0±0,легких Неадгезированные клетки 3,9±0,2 2,0±0,легких Клетки легких, собранные в Крыса Wistar 4,0±0,6 1,8±0,верхней фракции Клетки легких, собранные в 3,7±0,3 1,1±0,нижней фракции Суспензия дезагрегированных клеток 3,7±0,3 * 2,1±0,трахеи Суспензия дезагрегированных клеток 3,1±0,1 3,2±0,3 # легких Мышь ICR Суспензия дезагрегированных клеток 2,8±0,2 3,3±0,трахеи Примечание: - 50% клеточная инфицирующая доза вируса гриппа, нормированная на 1 млн. клеток; N – урожайность вируса гриппа для 1 клетки, через часов культивирования в смеси клеток; - клетки, полученные методом фракционирования при центрифугировании клеточной суспензии на растворе фиколла с плотностью 1,041 г/cм3;

* - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток трахеи мышей ICR (<0,05);

$ - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток трахеи крыс Wistar (<0,05);

# - значение больше, чем у суспензии дезагрегированных клеток легких крыс Wistar (<0,05);

во всех случаях n=3.

Значимость варьирования и, а также содержания каждого типа клеток в клеточных суспензиях в зависимости от способа их получения для мышей CD-1 и крыс проверялась методом однофакторного дисперсионного анализа. Согласно результатам, для обоих видов животных концентрация реснитчатых клеток во всех первичных клеточных суспензиях менялась несущественно, а остальных типов клеток значимо (<0,035). В таблице приводятся также результаты попарного сравнения по критерию Стьюдента концентраций различных типов клеток в изучаемых смесях. При этом изменение и вируса было незначимым (=0,05).

Из полученных данных следует, что восприимчивость к вирусу гриппа клеток легких и трахеи одинакова у мышей CD-1 и крыс Wistar и меньше чем у мышей ICR, при этом восприимчивость и вирус-продуцирующая способность реснитчатых клеток существенно выше, чем альвеолоцитов I и II типов. Отсюда следует возможность использования математической модели (2) для «одноклеточного» случая. Кроме того, значимое изменение численности фагоцитов (макрофагов и нейтрофилов) в исследованных интервалах незначимо влияет на восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа в суспензионных первичных культурах легочных клеток у мышей и крыс. Тем не менее, как показано выше, восприимчивость легких к ВГ у крыс оказалась достоверно ниже, чем восприимчивость трахеи крыс, а также легких и трахеи мышей CD-1.

Согласно литературным данным, внеклеточные факторы, входящие в состав секреторной эпителиальной выстилки легких у крыс в отличие от мышей, способны в значительной степени нейтрализовать вирус гриппа. В связи с этим, на следующем этапе работы была оценена противовирусная активность указанных факторов крыс.

8.6. Изучение вируснейтрализующей активности внеклеточных ингибирующих факторов, входящих в состав секреторной эпителиальной выстилки, в легких у крыс Использованный в работе метод получения внеклеточных факторов, входящих в состав секреторной эпителиальной выстилки, не позволяет получать внеклеточные факторы отдельно от компонентов сурфактанта, находящихся совместно в секреторной выстилке, покрывающей поверхность воздухоносных путей и альвеол. Поэтому была оценена вируснейтрализующая активность, как компонентов сурфактанта, так и сопутствующих факторов неспецифического иммунитета, обозначаемых далее как «внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки» (ИФСЭВ) легких. Естественно ожидать, что все собственные компоненты сурфактанта, а также факторы иммунитета и альвеолярные макрофаги, находящиеся в слое сурфактанта, в одинаковой степени вымываются с лаважной жидкостью.

Степень разведения компонентов сурфактанта в экспериментах in vitro относительно их концентраций в легких, которые приняты за 100%, охарактеризовали одним коэффициентом. Коэффициент оценили величиной 9,1±0,7% для легких и 101,1±7,8% для трахеи, исходя из оценки по литературным данным объема, занимаемого сурфактантом в легких, степени вымывания альвеолярных макрофагов с лаважной жидкостью (оцененной по результатам подсчета макрофагов в БАЛЖ и литературными данными по исходному количеству макрофагов в легких крыс), а также степени разведения лиофилизата при подготовке культуральной среды для экспериментального изучения нейтрализующей активности факторов. Обнаружено (таблица 4), что инфекционность ВГ после его соинкубации с ИФСЭВ достоверно (<0,05) снижалась по сравнению с контролем. По формулам (22) и (23) были оценены величины соответственно константы скорости термоинактивации при 37 С,.= 0,6±0,2 (n=3) 1/час и константы скорости нейтрализации вируса ИФСЭВ 1,8±0,3 (n=3) 1/час. Полученная здесь оценка константы скорости термоинактивации соответствует приводимой в разделе 8.2 величине константы скорости термоинактивации вируса в дебрисе клеток легкого мышей и крыс равной 0,4±0,1 1/час. На основании полученных данных константа скорости нейтрализации вируса в легком оценивается величиной 19,8±3,7 1/час - в раза больше (<0,05) константы скорости термоинактивации, а в трахее – величиной 1,8±0,3 1/час.

Таблица Биологическая активность вируса гриппа до и после инкубации вируса с ИФСЭВ крыс и в 0,9% растворе NaCl Условия инкубации Концентрация вируса гриппа, вируса гриппа до 1 2 внесения в РКЭ До инкубации 8,2 8,0 8,3 8,2±0,7,2±0,Вирус гриппа+ИФСЭВ 7,3 6,8 7,*# Вирус гриппа+0,9% раствор NaCl 7,8 7,8 8,3 8,0±0,(контроль) Примечание: 1, 2, 3 – повторы эксперимента; * - количество вируса гриппа достоверно отличается от контроля (р=0,04); # - количество вируса гриппа достоверно отличается от количества вируса в ВАЖ до инкубации (р=0,01); – среднее значение ± стандартное отклонение среднего.

8.7. Прогнозирование восприимчивости животных к вирусу гриппа c помощью частного и модифицированного алгоритмов экстраполяции Проверка адекватности методов прогнозирования восприимчивости организма-хозяина к вирусу гриппа проведена на примере экстраполяции определенных выше данных по восприимчивости легких и трахеи с мышей CD1 и ICR на легкие и трахею крысы Wistar. Также проведена экстраполяция аналогичных данных с мыши CD-1 на мышь ICR (таблица 5). Прогнозирование по частному алгоритму осуществлялось по уравнению (14), по модифицированному алгоритму - по полной модели (уравнение (20)) и упрощенной модели (уравнение (33)). При прогнозе по полной модели для перевода доз и урожайности вируса в количество вирионов использовали соотношение 1 ЭИД50 = 22,8±2,6 (определенное методом атомной силовой микроскопии, n=3).

Во всех вариантах прогнозирования по частному алгоритму восприимчивости трахеи прогнозные величины с высокой точностью и достоверностью (=0,05) соответствуют экспериментально определенным величинам Также наблюдается соответствие прогнозируемой и экспериментальной величин для легких мыши ICR. Как и ожидалось, для легких крысы в обоих случаях при использовании в качестве модельных животных мышей CD-1 или ICR прогнозируется существенно более высокий уровень восприимчивости к вирусу гриппа, чем наблюдается в действительности при аэрогенном заражении крыс Wistar вирусом гриппа (<0,001).

Таблица Прогнозы ВГ по частному алгоритму без учета ИФСЭВ, полному и упрощенному уравнению прогнозирования по модифицированному алгоритму с учетом ИФСЭВ Модельное Хозяин, животное Прогноз Эксперимент Модифицированный Частный алгоритм с учетом ИФСЭВ алгоритм без учета Полное Упрощенное уравнение уравнение ИФСЭВ Прогноз для трахеи Мышь CD-1 Крыса Wistar 0,2 0,2 -0,5 -0,Мышь CD-1 Мышь ICR -1,2 -1,4 -1,4 -1,Мышь ICR Крыса Wistar 0,3 0,5* -0,2 -0,Прогноз для легких Мышь CD-1 Крыса Wistar 1,1 1,1 -0,5** 1,Мышь CD-1 Мышь ICR -1,2 -1,4 -1,2 -1,Мышь ICR Крыса Wistar 1,0 1.3 -0,3** 1,Примечание: * - прогнозная величина отличается от экспериментально измеренной при =0,037; ** - прогнозная величина отличается от экспериментально измеренной при <0,001; в остальных случаях - прогнозная величина не отличается от экспериментально измеренной при >0,05;

Во всех случаях прогнозирования по полному уравнению модифицированного алгоритма, в том числе для легких крысы, прогнозные величины соответствуют (=0,05) значениям экспериментально определенным. Это свидетельствует о значимости влияния ИФСЭВ легких крыс и об адекватности модифицированного метода прогнозирования, позволяющего учитывать нейтрализующие факторы иммунитета.

При использовании упрощенной модели модифицированного алгоритма во всех случаях кроме прогнозирования восприимчивости трахеи крыс при экстраполяции с мышей ICR результаты прогнозирования не отличаются достоверно (=0,05) от экспериментально измеренных доз. При этом достоверность отличий (=0,037) в отмеченном выше случае не является высоко достоверной. Это подтверждается и величиной разности между прогнозируемой и измеренной дозами равной 0,6. Некоторое ухудшение прогностических свойств компенсируются упрощением вычисления величины прогноза дозы. Стоит отметить, что величины прогнозов по полной модели и упрощенной друг от друга отличаются незначимо. Как было оценено в разделе 6 при теоретическом анализе упрощенной модели, отклонения прогноза по упрощенной формуле должны отличаться от прогноза по полной модели не более, чем на 0,3, что и наблюдается во всех случаях прогнозирования. Основываясь на вышеприведенных результатах упрощенный способ оценки можно рекомендовать для экспресс-прогнозирования восприимчивости хозяина.

Проведенное исследование также позволяет заключить, что данные о восприимчивости к вирусу гриппа только легочных клеток животного, для которого осуществляется прогноз, позволяют прогнозировать потенциальную или базовую (клеточную) его восприимчивость к вирусу, которая совпадает с реальной восприимчивостью в случае несущественных отличий влияния факторов врожденного иммунитета у модельных животных и хозяина. При наличии отличий для прогнозирования реальной восприимчивости хозяина необходимо учитывать активность барьерных факторов неспецифического иммунитета.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об адекватности частного алгоритма прогнозирования, когда не требуется учитывать нейтрализующие факторы врожденного иммунитета, и об адекватности модифицированного алгоритма прогнозирования, когда требуется учитывать нейтрализующие факторы врожденного иммунитета. Также показана возможность использования упрощенного варианта модифицированного алгоритма для экспресс-прогнозирования.

9. Следствия из уравнения инфекционности Положительные результаты, полученные в предыдущих разделах, свидетельствуют как об адекватности разработанных алгоритмов, так и уравнения инфекционности, которое является основой алгоритмов. В данном разделе на основании анализа уравнения инфекционности дается формализованное описание и решение задач, связанных с изучением выбором оптимальных средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

9.1. Прогноз потенциальной эффективности противовирусных препаратов для хозяина. Теоретическое обоснование критерия оптимальности противовирусных средств Все ПВП можно условно разделить на 2 класса: препараты, снижающие вероятность инфицирования клетки и снижающие урожайность вируса в клетке, - не исключая возможности принадлежности средства обоим классам.

Отсюда очевидным образом следует возможность использования разработанных методов для прогнозирования потенциальной степени защиты человека различными ПВП. Для этого необходимо оценить исходный уровень параметров вирус-клеточного взаимодействия для интактных клеток-мишеней, а затем для клеток, обработанных ПВП. Для иммуноглобулинов схема оценки может быть аналогична схеме, использованной в настоящей работе для ИСФЭВ крыс. Естественно понимать под оптимальным противовирусным препаратом такой, после применения которого вероятность инфицирования хозяина станет равной 0 при любой дозе инфицирования (для терапевтических препаратов под дозой инфицирования можно понимать количество вируса, которое содержит хозяин на момент применения средства). Такое возможно только когда вероятность инфицирования хозяина одним вирионом,, равняется 0. Как было доказано выше, уравнение инфекционности имеет нулевое решение ( ) тогда и только тогда, если, т.е. реализуется критерий невосприимчивости хозяина. Таким образом, если чувствительность клеток интактного организма характеризуется параметрами и, то для перевода организма в невосприимчивое состояние необходимо, чтобы под действием ПВП средняя урожайность вируса в клетке или вероятность инфицирования клетки или их произведение уменьшилось, по крайней мере, в раз (критерий оптимальности ПВП, – критический уровень критерия оптимальности ПВП). Важно отметить, что величина одна и та же для средств разной направленности действия: ингибиторов свободного вируса и репродукции, сборки и высвобождения вируса. Выведенный критерий справедлив и для профилактических, и для терапевтических препаратов.

9.2. Критерий выбора модельных животных для хозяина Задача решается в предположении, что степень снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия под действием ПВП не зависит от вида хозяина. Определим также, что оптимальность ПВП для хозяина означает, что после применения ПВП вероятность инфицирования хозяина одним вирионом,, становится равным 0. Будем считать животное модельным для хозяина, если ПВП, являющийся оптимальным для животного, будет оптимальным и для хозяина. Пусть для хозяина определена величина критического уровня критерия, при этом существует два вида животных с критическими уровнями и. Тогда в качестве модельного животного для хозяина (для предварительного выбора ПВП) следует выбрать животное с критическим уровнем, так как средство, будучи оптимальным для этого животного будет снижать произведение параметров вирус-клеточного взаимодействия в, т.е. будет оптимальным и для хозяина. В противном случае - при тестировании ПВП на втором виде модельного животного - может оказаться, что реальная степень снижения,, больше, но меньше. В этом случае средство переведет животное в невосприимчивое состояние, и будет признано эффективным и для хозяина, не являясь таковым на самом деле.

9.3. Влияние параметров вирус-клеточного взаимодействия на вероятность инфицирования хозяина Математически доказывается, что при одной и той же степени снижения параметров вирус-клеточного взаимодействия меньше критической - снижение вероятности инфицирования эффективнее снижает восприимчивость хозяина, чем снижение урожайности. Это происходит, потому что в первом случае в уравнении инфекционности изменяется параметр, стоящий перед экспонентой, а во втором – параметр, стоящий в показателе степени экспоненты. Соответствующие графики, построенные на примере ВМ приводятся ниже (рис.2).

9.4. Резистентность хозяина при восприимчивых клетках Действительно, при и, а также при выполнении выше сформулированного критерия резистентности заражение отдельных клеток не приведет к образованию инфекционного процесса. В этом случае возможно инфицирование клеток, но инфекционный процесс будет самозатухающим, т.е. через некоторое время c вероятностью 1 ни один из вирионов потомства не инфицирует новые клетки, т.е. процесс прервется.

9.5. Объяснение эффекта синергизма Будем называть ПВП слабо-эффективным, если он снижает вероятность инфицирования и/или урожайность, но не переводит организм в состояние невосприимчивости, когда. Допустим, существует два таких средства.

Пусть первое средство при индивидуальном применении приводит к уменьшению вероятности в раз, а второе средство приводит к уменьшению уровня репродукции вируса в клетке в раз. Если выполняется условие, то при сочетанном применении таких средств будет достигнут критический уровень уменьшения произведения параметров вирус-клеточного взаимодействия и соответственно перевод организма в невосприимчивое состояние.

9.6. Схема оптимального выбора кандидатных ПВП в клеточных культурах Считаем, что степени снижения вероятности адсорбции вируса на клетке и урожайности in vitro и in vivo равняются. Пусть определен критический уровень для хозяина. Можно сформулировать следующую схему выбора ПВП. Для каждого ПВП в экспериментах с клетками определяется отдельно степень снижения вероятности инфицирования,, и степень ингибирования урожайности,, – номер ПВП. Согласно критерию оптимального выбора ПВП в кандидатные следует отобрать препараты, для которых выполняется условие. Если таковых не существует, то определяются пары ПВП, для которых ( и – номера препаратов). Такая схема требует экспериментов. При полном переборе пар потребуется экспериментов.

9.7. Оценка критического уровня для ПВП против вируса Марбург и выбор модельного животного для человека Использовали полученные в разделе 7. оценки дозы вирионов, урожайности 13200 вирионов и соответствующую им величину 0,014, которые были приняты за начальные значения данных параметров (, ). На основании этого величина критерия 187. Это означает, что оптимальный для человека ПВП должен в конечном итоге снижать вероятность инфицирования клетки и/или урожайность вируса не менее чем в 187 раз.

На рис. 2 приводятся графики изменения восприимчивости человека при изменении степени снижения вероятности инфицирования клетки или урожайности вируса в клетке в интервале от 1 до 187 раз. В случае использования ингибиторов различных стадий репродукции, сборки и почкования вируса при степени снижения до 10 раз восприимчивость хозяина останется практически на исходном уровне и только при больших степенях восприимчивость начинает быстро снижаться, после чего медленно выходит на нулевой уровень при достижении критического уровня равного 187. Напротив, при использовании препаратов, снижающих вероятность адсорбции быстрое снижение восприимчивости хозяина происходит на начальной стадии уменьшения вероятности инфицирования клетки.

Величины критических уровней для морской свинки - 1138 и для обезьяны - 414 (159) для нижней (верхней) границы дозы. Отсюда следует, что из рассмотренных животных на роль модельного животного для человека подходит морская свинка ( = 1138). Обезьяна менее подходящее животное, т.к. величина критического уровня для верхней границы инфицирующей дозы для обезьяны равняется 159, что меньше требуемой величины (187).

0,00,00,00,00,0Ряд0,0Ряд0,00,00,01 2 5 10 25 125 1Степень снижения, I Рис. 2. Изменение восприимчивости человека к вирусу Марбург при снижении вероятности инфицирования клетки (Ряд 1) и урожайности вируса в клетке (Ряд 2).

9.8. Критерий подобия восприимчивости клеток in vitro и in vivo Константы скорости инфицирования клеток вирусом in vivo, и характеризуют интегральную и удельную восприимчивость клеток in vivo.

Соответственно и характеризуют интегральную и удельную восприимчивость культуры клеток in vitro. В разделе 4 был введен коэффициент, характеризующий степень изменения интегральной восприимчивости клеток in vitro относительно in vivo Коэффициент характеризует степень изменения удельной восприимчивости клеток in vitro относительно in vivo. Пусть имеется два вида хозяина. Если соотношение концентраций клеток in vivo и in vitro для обоих видов одинаково, то равенство значений коэффициента возможно при равенстве величин коэффициента для клеток обоих видов хозяина, т.е. когда клетки, полученные от разных хозяев, изменяют свои свойства in vitro в одинаковой степени. Это означает, что коэффициент может характеризовать стандартность проведения операций по получению первичных культур клеток и созданию условий культивирования клеток, подобных таковым in vivo, т.е. быть критерием подобия восприимчивости клеток от разных видов хозяина in vitro относительно in vivo. Величина критерия может быть вычислена с помощью выражения (21).

Для случая, когда не требуется учитывать факторы врожденного иммунитета, критерием подобия является другой безразмерный коэффициент - который может быть выражен через и по формуле хозяина, р Вероятность инфицирования Равенство критериев подобия – коэффициента или – ( ) для нескольких видов хозяина можно установить двумя способами: путем вычисления величины критерия для клеток одного вида хозяина и прогнозирования с его помощью восприимчивости другого вида хозяина (как это было продемонстрировано выше для ВМ и ВГ), а также традиционным сравнением величин критерия, вычисленных для клеток нескольких видов хозяина.

Для иллюстрации второго способа можно воспользоваться результатами вычисления величин коэффициентов и (таблица 6), которые были использованы при прогнозировании восприимчивости к ВГ трахеи и легких мышей ICR и крыс Wistar при экстраполяции с мышей CD-1.

Таблица Величины критериев подобия восприимчивости клеток in vitro и in vivo в экспериментах с вирусом гриппа Вид животного Орган Критерий Критерий подобия подобия Мышь CD-1 Легкие 12940 32734 2,Мышь ICR Легкие 15010 20893 1,Крыса Wistar Легкие 8499 -* -* Среднее для всех Легкие 12150±1921 26814±5921 2,0±0,животных Мышь CD-1 Трахея 6584 16982 2,Мышь ICR Трахея 4780 8128 1,Крыса Wistar Трахея 12662 6761 0,Среднее для всех Трахея 8008±2384 10623±3204 1,6±0,животных Среднее для всех Легкие, 10079±1653 17100±4723 1,7±0,животных трахея Примечание: * - данные не приводятся, т.к. для легких крыс необходимо учитывать факторы врожденного иммунитета.

Средние величины коэффициента 12150±1921 и 8009±2384, соответствующие клеткам легких и трахеи, отличаются друг от друга незначимо (=0,05). Также незначимо (=0,05) отличаются и средние величины коэффициента - 26814±5921 для клеток легких и 10623±3204 для клеток трахеи. Следует добавить, что степень отличия двух критериев – – для клеток трахеи и легких одинакова и в среднем равняется 1,7±0,4. Совокупность этих данных показывают, что коэффициенты и могут быть использованы в качестве критериев подобия восприимчивости клеток in vitro и in vivo, а также (наравне с результатами экстраполяции) свидетельствует о стандартности использованных методик по получению первичных культур клеток ткани трахеи и легких и об одинаковой степени изменения данных клеток легкого и трахей экспериментальных животных к вирусу гриппа in vitro относительно in vivo.

10. Прогнозирование эффективности эпидемиологической защиты хозяина противовирусными средствами В разделе теоретически обосновывается оценка максимально-возможной ожидаемой величины коэффициента эпидемиологической эффективности препарата для произвольной вспышки. Считаем, что выполнены следующие положения.

1) Эпидемиологическая эффективность препарата оценивается критерием (коэффициентом эпидемиологической эффективности) , (35) где и - заболеваемость (смертность) в экспериментальной и контрольной группах (т.е. получавших и не получавших препарат) соответственно, а и - количество индивидуумов (особей) в каждой из групп.

2) Справедлива гипотеза независимого действия вирионов против хозяина, согласно которой каждый активный вирион независимо от других, попавших в организм хозяина, может с некоторой вероятностью - - вызвать инфекционный процесс, заканчивающийся заболеванием (летальным исходом).

3) В каждой группе подобраны индивидуумы однородные по чувствительности к патогену. Это предположение отражает требования к организации полевого эксперимента.

4) Доза патогена, попавшая в организм, является случайной величиной. Вид распределения – произвольный. Считаем, что данное распределение справедливо для всех людей, попавших в очаг вспышки. Это предположение также отражает требования к организации полевого эксперимента.

Используя аппарат производящих функций математически доказывается, что справедлива оценка сверху для величины коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП (36) где - это или. Справедливость данной оценки подтверждена результатами статистического анализа некоторых литературных данных по смертности мышей различных возрастов при инфицировании последовательными десятикратными разведениями вирусов возбудителей некоторых нейротропных инфекций: лихорадки Бвамбы, простого герпеса, восточного энцефаломиелита лошадей. Вследствие различной чувствительности мышей различных возрастов к некоторым из вирусов эти данные позволили смоделировать ситуацию эпидемиологического эксперимента, рассматривая группу менее чувствительных животных как группу, обработанных препаратом, а более чувствительных - как контрольную группу.

ВЫВОДЫ Впервые проведено теоретико-экспериментальное исследование взаимодействия «вирус-хозяин» для установления взаимосвязи параметров инфекционности вирусов для хозяина на уровнях: клетка, организм и популяция с целью разработки методов экстраполяции результатов изучения инфекционности вирусов с модельных животных на хозяина. Теоретическое исследование проведено с использованием системного подхода и математических моделей, описывающих процессы инфицирования клеток и целого организма хозяина, размножения и нейтрализации вируса для инфекций, для которых развитие инфекционного процесса в воротах инфекции ассоциируется с полноценным инфекционным заболеванием. Для оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия, используемых в разработанных моделях проведен теоретический анализ инфекционных свойств вирусов в культурах клеток и в бесклеточной среде культивирования. На основании полученных результатов сделаны следующие выводы.

1) Получено уравнение инфекционности, которое адекватно связывает восприимчивость организма хозяина к вирусу (вероятность инфицирования макроорганизма одним вирионом) и параметры вирус-клеточного взаимодействия (вероятности инфицирования клетки на фоне нейтрализующих факторов врожденного иммунитета и средней урожайности вируса в клетке).

2) Построены частный и модифицированный алгоритмы прогнозирования.

Частный алгоритм позволяет адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам с использованием данных по восприимчивости первичных культур клеток органов-мишеней при условии, когда нейтрализующие факторы врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина отличаются незначительно. Модифицированный алгоритм позволяет адекватно прогнозировать восприимчивость хозяина к вирусам при выраженных отличиях нейтрализующих факторов врожденного иммунитета у модельного животного и хозяина. Для экспресс-прогноза восприимчивости хозяина к вирусной инфекции можно использовать упрощенную модель модифицированного алгоритма прогнозирования, которая также позволяет учесть факторы иммунитета.

3) Разработаны алгоритмы оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro, которые позволяют адекватно оценивать вероятность инфицирования клетки и урожайность вируса в клетке в первичных культурах клеток.

4) Разработаны критерии: (а) восприимчивости/резистентности хозяина к инфекции, (б) выбора оптимального ПВП и (в) выбора модельного животного, которое можно использовать для идентификации ПВП, оптимального для хозяина). Показано, что основой этих критериев является величина произведения вероятности инфицирования клетки одним вирионом и средней урожайности вируса в клетке.

5) Математически обоснована и проверена на литературных данных формула, позволяющая оценивать максимально возможную величину коэффициента эпидемиологической эффективности ПВП, используя только величину отношения 50% эффективных доз ( или ) этиологического патогена, определенных для получавших и неполучавших препарат индивидуумов.

6) Показано, что данные по размножению вируса Марбург в первичных культурах макрофагов, полученные in vitro, могут быть использованы для прогнозирования с помощью частного и модифицированного алгоритмов восприимчивости хозяина к вирусу Марбург in vivo. Это свидетельствует об адекватности разработанных методов оценки параметров вирус-клеточного взаимодействия in vitro и алгоритмов прогнозирования. Рассчитанная доза вируса Марбург для человека при аэрогенном инфицировании составила 0,7±0,7) Показано, что данные по размножению вируса гриппа в первичных культурах трахеи и легких, полученные in vitro, могут быть использованы для прогнозирования с помощью частного и модифицированного алгоритмов восприимчивости in vivo трахеи и легких хозяина к вирусам гриппа.

8) Разработанные методики получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток трахеи и легких позволяют получать культуры клеток, содержащие основные типичные для этих органов клетки, в том числе - восприимчивые к вирусу гриппа и способные продуцировать вирус гриппа при культивировании не менее 54 часов и позволяющие оценивать параметры вирус-клеточного взаимодействия вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи животных.

9) Показано, что восприимчивость и вируспродуцирующая способность альвеолоцитов I и II типов при их инфицировании вирусом гриппа in vitro статистически менее значима по сравнению с восприимчивостью и вируспродуцирующей способностью реснитчатых клеток у мышей CD-1 и ICR, а также крыс Wistar. Определено, что секреторные факторы бронхоальвеолярной выстилки у крыс Wistar могут существенно снижать восприимчивость легких к ВГ при аэрогенном заражении и инфекционность ВГ для восприимчивых клеток in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Жуков В.А. Экстраполяция ID50 вируса с модельного животного на хозяина. Методическое пособие. ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск. 2010.

22 с.

2. Жуков В.А. Уравнение инфекционности и его использование для прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусным инфекциям и в других задачах. В: Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты (сборник научных трудов). Выпуск 17. М.: РАЕН;

2007. C. 159-167.

3. Чермашенцев В.М., Жуков В.А., Марьясов А.Г., Сафатов А.С. Некоторые теоретические подходы к оценке эффективности противовирусных препаратов // Вестник РАМН. 1993. № 9. С. 4-7.

4. Жуков В.А., Чермашенцев В.М., Воробьев А.А. Теоретическое обоснование критериев оптимального конструирования противовирусных препаратов // Вестник РАМН. 1993. № 9. С. 7-9.

5. Zhukov V.A., Chermashentsev V.M. Theoretical Foundation of Optimal Design Criteria of Antiviral Preparations // Antiviral Research. 1994. 23(S1). P. 144.

6. Жуков В.А., Пьянкова О.Г., Рыжиков А.Б., Воробьев А.А.

Прогнозирование коэффициента эпидемиологической эффективности профилактических препаратов по данным лабораторных исследований // Вестник РАМН. 1996. № 10. C. 36-40.

7. Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Пьянков О.В., Жуков В.А., Рыжиков А.Б., Колесникова Н.Г., Евтин Н.К., Шишкина Л.Н. Изучение некоторых патогенетических характеристик гриппозной инфекции у белых мышей. Вопросы вирусологии. 1997. № 5. C. 216-218.

8. Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Пьянков О.В., Жуков В.А., Рыжиков А.Б., Шишкина Л.Н., Котляров Л.А., Порываев В.Д. Изучение Чувствительности белых мышей к вирусу гриппа (А/АИЧИ/2/68) при аэрогенном заражении с учетом осаждения аэрозоля в их дыхательном тракте // Вопросы вирусологии. 1999. № 2. C. 69-71.

9. Sergeyev A.N., Pyankova O.G., Bulichev L.E., Petrischenko V.A., Pyankov O.V., Zhukov V.A., Ryzhikov A.B., Shishkina L.N., Yevtin N.K., Safatov A.S.

Study of mice susceptibility to influenza virus (A/Aichi/2/68) under aerosol challenge considering the aerosol deposition in respiratory tract // J. Aerosol.

Science. 1999. 30(1). P. 721-722.

10. Zhukov V.A., Shishkina L.N., Sergeev A.N., Safatov A.S., Piankova O.G., Petrishenko V.A., Piankov O.V., Chermashentsev V.M. The method of extrapolation of virus ID50 from one mammalian species to another // The Infectious Disease Review. 2001. S3. P. 124-126.

11. Sergeev A.N., Safatov A.S., Zhukov V.A., P’yankov O.V., Shishkina L.N., Petrishchenko V.A., P’yankova O.G., Buryak G.A., Sergeev A.A. The study of infectious activity of influenza virus aerosol taking into account its deposition in laboratory animal’s organism // J. Aerosol Sci. 2001. 33(S1). P. S793-S794.

12. Сергеев А.Н., Жуков В.А., Порываев В.Д., Пьянков О.В., Шишкина Л.Н., Петрищенко В.А., Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е., Сафатов А.С. Разработка простого метода прямой оценки наличия инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа // Вопросы вирусологии. 2002. № 4. C. 44-46.

13. Сергеев А.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Малкова Е.М., Смоленцев М.Н. Получение и культивирование первичных культур клеток легкого экспериментальных животных для изучения продуктивных свойств вируса гриппа // Успехи современного естествознания. 2004. Т 1. № 6. С.137-138.

14. Жуков В.А., Сафатов А.С., Пьянков О.В., Топорков В.С., Сергеев А.А., Киселев С.А., Яшин В.А., Беляев Н.М., Рябчикова Е.И., Жуков А.В., Шишкина Л.Н., Медведев А.А., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев А.А. Новый комплекс для получения и изучения монодисперсных микробиологических аэрозолей в медико-биологических исследованиях // Вестник РАМН. 2004. № 3. C. 11-15.

15. Сергеев А.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Рябчикова Е.И., Малкова Е.М., Воробьев А.А. Изучение восприимчивости клеток легких у мышей и крыс к вирусу гриппа при инфицировании in vivo и in vitro // Вестник РАМН. 2004. № 8.

C. 15-18.

16. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Фанкин И.В., Сметанникова М.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев А.А.

Проверка возможности прогнозирования восприимчивости хозяина к инфекции гриппа используя данные экспериментов с первичными клетками // Medline.ru: сетевой журн. 2006. № 7. С. 195-204. URL:

http://www.medline.ru/public/last/ (дата обращения: 03.01.2010).

17. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Малкова Е.М., Рябчикова Е.И., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Устюжанина Н.В., Воробьев А.А.

Изучение восприимчивости и продуктивности реснитчатых клеток и альвеолоцитов 1-го и 2-го типов мышей при заражении вирусом гриппа in vitro // Medline.ru: сетевой журн. 2006. № 7. С. 205-213. URL:

http://www.medline.ru/public/last/ (дата обращения: 03.01.2010).

18. Сметанникова М.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Фанкин И.В., Булычев Л.Г., Колесникова Л.В., Омигов В.В., Малкова Е.М., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Жуков В.А. Влияние глюкокортикоидной иммуносупрессии на течение экспериментальной гриппозной инфекции // Вестник РАМН.

2006. № 6. C. 22-27.

19. Сметанникова М.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Фанкин И.В., Сергеев А.А., Скарнович М.О., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Бондаренко В.Н., Сергеев А.Н., Восприимчивость клеток-мишеней и активность фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии // Вестник РАМН. 2007. № 1. C. 3-8.

20. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Фанкин И.В., Сметанникова М.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Воробьев А.А.

Изучение возможности прогнозирования чувствительности к гриппу различных отделов респираторного тракта хозяина // Вестник РАМН. 2007.

№ 5. C. 32-7.

21. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Малкова Е.М., Рябчикова Е.И., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Устюжанина Н.В., Воробьев А.А.

Сравнительный анализ восприимчивости клеток-мишеней респираторного тракта мышей и крыс при заражении вирусом гриппа in vitro // Вестник РАМН. 2008. № 2. С.12-16.

22. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Плясунов И.В., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н., Зайцев Б.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А. Количественная оценка in vitro вирус-гриппа нейтрализующей активности секреторных факторов легких крыс // Вестник РАМН. 2009. № 11. C. 46-49.

23. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сафатов А.С., Сергеев А.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Зайцев Б.Н., Топорков В.С., Сергеев А.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А. Валидация модифицированного алгоритма прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусам с учетом параметров восприимчивости первичных культур клеток-мишеней и факторов врожденного иммунитета // Вестник РАМН. 2010. № 5. C. 24-29.

24. Zhukov V.A., Safatov A.S., Subkhankulov G.F., Chermashentsev V.M. A mathematically based model for the development of vaccine requirements:

рroceedings of the Int. Conf. on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. Leningrad, 1991. P.4-6.

25. Жуков В.А., Чермашенцев В.М., Сафатов А.С. Системный подход к проблеме конструирования биопрепаратов: материалы Всерос. конф.

«Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. C. 78.

26. Жуков В.А., Чермашенцев В.М., Сафатов А.С., Субханкулов Г.Ф. Подход к прогнозированию воздействия на человека различных неблагоприятных факторов: матер. Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии». Томск, 1991. C. 79.

27. Жуков В.А., Чермашенцев В.М. Подход к оценке противовирусных препаратов (ПВП) с использованием животных и экспериментов ин витро:

матер. Всерос. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии».

Томск, 1991. C. 80.

28. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г. Теоретические основания системы прогнозирования влияния неблагоприятных факторов внешней среды на здоровье человека: матер. Всерос. конф. "Экология и здоровье". Новосибирск, 1996. C. 72-73.

29. Zhukov V.A., Shishkina L.N., Ryzhikov A.B., Safatov A.S., Sandakhchiev L.S.

Shift of virus infectivity for human: proceedings of the International SB Medical Treatment Symposium Industry I. Eco-terrorism chemical and biological warfare without chemical and biological weapons. Zagreb-Dubrovnik, Croatia, 1998. P.

350-352.

30. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Сафатов А.С., Пьянкова О.Г., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Рябчикова Е.И., Малкова Е.М., Морзе С., Воробьев А.А. Метод экстраполяции ID50 с одного вида млекопитающих на другой. Перспективы применения в медицине: тр. Х Юбил. междун. конф.

и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине экологии». Ялта-Гурзуф, Украина, 2002. C. 237-239.

31. Сергеев А.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Смоленцев М.Н., Малкова Е.М.

Разработка клеточной системы для изучения способов и средств коррекции инфекционного воспаления: матер. Всерос. конф. «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск, 2004. C. 70 - 71.

32. Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Фанкин И.В., Пьянков О.В., Сергеев А.А., Сергеев А.Н., Петрищенко В.А., Омигов В.В., Колесникова Л.В., Малкова Е.М. Изучение влияния глюкокортикоидного гормона кеналога на резистентность мышей к вирусу гриппа: матер. Всерос. конф.

«Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». Новосибирск, 2004. C. 181 - 182.

33. Жуков В.А. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации:

теоретическое обоснование алгоритма прогнозирования: тр. междун. конф.

«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, IT+M&E07». Гурзуф, Украина, 2007. C. 190192.

34. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Плясунов И.В., Сергеев А.Н., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации: определение вирус нейтрализующей активности сурфактанта крысиных легких: тр. междун.

конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, IT+M&E07». Гурзуф, Украина, 2007. C. 192194.

35. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.А., Пьянков О.В., Петрищенко В.А., Зайцев Б.Н., Сергеев А.Н., Воробьев А.А. Ex vivo in vitro диагностика восприимчивости хозяина к вирусам с учетом факторов иммунитета и термоинактивации: проверка адекватности алгоритма прогнозирования для вируса гриппа и крыс: тр. междун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, IT+M&E07».

Гурзуф, Украина, 2007. C. 194-196.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВГ - вирус гриппа ВМ - вирус Марбург ИФCЭВ - ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки респираторных органов ПВП - противовирусный препарат






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.