WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

КУДРЯВЦЕВА 

Юлия Александровна

ВЛИЯНИЕ  РАЗЛИЧНЫХ КОНСЕРВАНТОВ И

АНТИКОАГУЛЯНТОВ НА ГЕМОСОВМЕСТИМОСТЬ

КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ БИОПРОТЕЗОВ

(экспериментальное исследование)

14.01.24. –Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации  на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2011

Работа выполнена  в Научно-исследовательском институте  комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний  Сибирского отделения  РАМН, г. Кемерово

Научный консультант

Доктор медицинских наук,

профессор       Журавлева Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты:

1. Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Белов Юрий Владимирович

2. Доктор медицинских наук, профессор  Дан Василий Нуцович

3. Доктор биологических наук, профессор   Новикова Светлана Петровна

Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им.академика Е.Н.Мешалкина Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится «____»____________ 2011 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.055.01. при ФГУ «ФНЦ  трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д.1, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФНЦ  трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан «___» ____________2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208.055.01

доктор медицинских наук, профессор Ольга Павловна  Шевченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из важнейших направлений современной сердечно-сосудистой хирургии является создание новых моделей протезов для замещения пораженных клапанов сердца и сосудов, обладающих био- и гемосовместимостью. Ежегодно в России проводится более 6 000  операций при окклюзии периферических артерий, более 17 000 операций по коррекции  врожденных и приобретенных пороков сердцах (Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г., 2008; Покровский А.В., 2007), что обуславливает достаточно высокую потребность в кардиоваскулярных протезах.

Биологические протезы обладают рядом преимуществ, определяющих их широкое применение в реконструктивных операциях на сердце и периферических сосудах (Чернявский А.М.с соавт., 2002; Иванов С.В., 2005; Караськов А.М. с соавт., 2008; Барбараш Л.С. с соавт., 2009). Значительное влияние на отдаленные результаты операций оказывают качественные характеристики биопротезов, которые зависят от базовой консервации и последующей модификации консервированного биоматериала (Севастьянов В.И. с соавт., 1995; Барбараш Л.С.  с соавт., 2002; Wang E.Y. et al., 1993; Dardik H.A. et al., 2002; Jee K.S. et al., 2003). 

Мономерное эпоксисоединение – диглицидиловый эфир этиленгликоля - весьма широко применяется в нашей стране для консервации кардиоваскулярных биопротезов. Консервация диэпоксидом позволяет придать биоматериалу резистентность к кальцификации, удовлетворительные физико-механические свойства и гемосовместимость (Барбараш Л.С.c соавт., 1995; Журавлева И.Ю., 1995; Иванов С.В., 2005).

Как показывает анализ использования артериальных биопротезов, в структуре отдаленных послеоперационных осложнений преобладают тромбозы в зоне реконструкции (Ивченко О.А. с соавт., 1999;  Генс А.П. с соавт., 2001; Иванов С.В. 2005). При использовании биопротезов клапанов сердца риск тромбозов и тромбоэмболий не столь  значителен, но, тем не менее,  требует оптимизации гемосовместимых свойств биоматериала (Аминов В.В., 2004; Чернявский А.М. с соавт., 2007; Барбараш Л.С. с соавт., 2009).

Для повышения гемосовместимости биопротезов перспективным направлением является использование в качестве базового консерванта биоматериала полиэпоксисоединений. Данная группа препаратов имеет в составе разветвленной полимерной цепи свободные эпоксигруппы, которые могут быть использованы для дополнительной модификации ткани биологически активными веществами.

Для антитромботической модификации кардиоваскулярных биопротезов в настоящее время применяется нефракционированный гепарин. В последние годы в медицинской практике широкое применение находят низкомолекулярные гепарины, обладающие целым рядом преимуществ перед нефракционированным гепарином: высокой антитромботической активностью, сниженным риском развития тромбоцитопении и преимущественным ингибированием фактора Xa (Баркаган З.С, 2000; Зубаиров Д.М., 2000; Алиев М.А. с соавт., 2004; Hirsh J., 2001).

Кроме характеристик биологических протезов, на отдаленные результаты реконструктивных операций значительное влияние оказывает шовный материал. Хроническое воспаление в зоне сосудистого анастомоза, спровоцированное шовным материалом, может явиться причиной развития гиперплазии неоинтимы (Белоярцев Д.Ф., 2003; Pae W.E. et al.,1981). Развитию гиперплазии неоинтимы на поврежденной швом поверхности предшествует адгезия тромбоцитов в зоне анастомоза и сорбция белков крови (Курьянов П.С.c соавт., 2008; Connolly R. et al., 1988). 

Нарушение функции клапанов в магистральных венах нижних конечностей является основным фактором развития хронической венозной недостаточности (Стеммер Р., 1997, Богачев В.Ю., 2001). Различными формами хронической венозной недостаточности, в том числе посттромботическим синдромом, страдает около 35 миллионов населения России (Яблоков Е.Г. c соавт., 1999; Савельев В.С., 2000). Использование в восстановительных реконструктивных операциях клапансодержащих аутотрансплантатов ограничено наличием подходящих участков необходимого диаметра с компетентными клапанами, а также спазмированием  пересаженного аутотранстплантата, что в итоге приводит к тромбообразованию в зоне операции (Суковатых Б.С., 1991, Игнатьев И.М., 2002).

Следует заметить, что адекватной модели протеза венозного клапана в настоящее время не существует. Весьма перспективным решением этой проблемы является разработка протеза венозного клапана с использованием ксеногенного материала, консервированного эпоксисоединенями.

Таким образом, проблема тромборезистентности и гемосовместимости биологических протезов в настоящее время достаточно актуальна. Необходимы исследования новых перспективных полиэпоксидных соединений, а также оценка эффективности применения новых препаратов класса низкомолекулярных гепаринов с целью повышения био- и гемосовместимости кардиоваскулярных биопротезов. Разработка биопротеза венозного клапана позволит решить проблему коррекции венозной недостаточности.

Цель настоящего исследования разработка способов повышения гемосовместимости кардиоваскулярных биопротезов путем использования полиэпоксидных соединений и иммобилизованных гепаринов различной молекулярной массы.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние консервации эпоксидными смесями оригинальной композиции на аминокислотный состав и физико-механические свойства ксеногенного биоматериала различной видовой и тканевой принадлежности. 

2. Изучить влияние эпоксидных консервантов и гепаринов различной молекулярной массы на структуру поверхности ксеногенного биоматериала различной видовой и тканевой принадлежности.

3. Оценить в сравнительном аспекте количественные параметры иммобилизации нефракционированного и низкомолекулярного гепарина на биопротезы сосудов. 

4.  Изучить процессы контактной активации тромбоцитов и сорбции протеинов крови  при взаимодействии с ксеногенными артериями, обработанными эпоксисоединениями и модифицированными нефракционированным гепарином и низкомолекулярным гепарином Эноксапарином натрия.

5. Обосновать подход к созданию  гемосовместимых ксеногенных клапаносодержащих венозных биопротезов.

6. Изучить in vitro процессы трансформации зоны сосудистых анастомозов после контакта с кровью при использовании различного шовного материала – нитей из полипропилена, полидиоксанона и  никелида титана.

Научная новизна. 

Для консервации биопротезов использованы новые смеси эпоксидных соединений оригинальной композиции.

Для повышения тромборезистентности кардиоваскулярных биопротезов впервые предложено использовать низкомолекулярный гепарин – Эноксапарин натрия.

Впервые показаны различия контактно-активационных свойств поверхности биоматериала в зависимости от способа консервации и модификации.

- впервые показаны различия  изменение морфологии поверхности  биоматериала  в зависимости от видовой и тканевой принадлежности при применении консервантов  с различной структурой углеводородной цепи и гепаринов различной молекулярной массы;

- впервые качественно и количественно охарактеризован процесс  сорбции белков крови при контакте с поверхностью эпоксиобработанного биоматериала до и после модификации антикоагулянтами;

-  впервые рассмотрена возможность разработки протеза венозного клапана с использованием ксеногенного материала, консервированного эпоксисоединениями;

-  впервые использована технология послойной антитромботической модификации венозных сегментов крупного рогатого скота с целью  максимального сглаживания поверхности биоматериала и повышения ее гемосовместимости;

- впервые проведен сравнительный анализ взаимодействия различного шовного материала с компонентами крови и влияние модификации гепарином на сорбционные и контактно-активационные процессы в зоне сосудистого анастомоза.

Практическая значимость. Результаты работы могут быть использованы при создании новых моделей биологических протезов клапанов сердца, артериальных и клапансодержащих венозных заменителей. 

Обосновано использование композиций эпоксисоединений с различной длиной и структурой углеводородной цепи для обеспечения заданных свойств биоматериала.

Предложен способ повышения тромборезистентных свойств кардиоваскуляных биопротезов путем модификации биоматериала низкомолекулярным гепарином (Эноксапарином натрия).

Технология послойной модификации поверхности клапансодержащих венозных сегментов, обработанных эпоксидными консервантами, может быть использована при создании биопротеза венозного клапана.

Установлены особенности влияния различных видов шовного материала на взаимодействие зоны сосудистого анастомоза с компонентами крови.  Показана необходимость  повышения гемо- и биосовместимости шовного материала, используемого в сердечно-сосудистой хирургии.

Предложена модель in vitro для оценки гемосовместимости сосудистых протезов и шовного материала  при контакте с кровью.

Положения, выносимые на защиту. 1. Состав консервирующего раствора и химическая структура  эпоксисоединений, используемых для консервации, в значительной мере определяют качество поперечной сшивки фибриллярных белков, физико-механические свойства  и структуру поверхности биоматериала различной видовой и тканевой принадлежности.

2. Модификация кардиоваскулярных биопротезов с применением низкомолекулярных гепаринов обеспечивает снижение активации тромбоцитарного звена гемостаза,  уменьшение количественных параметров сорбции протеинов крови и определяет преимущественную сорбцию альбумина.

3. На результаты реконструктивных операций на артериях малого диаметра значительное влияние оказывает шовный материал, способный провоцировать массивную сорбцию протеинов и компонентов крови в зоне сосудистого анастомоза.

Область применения и внедрение результатов исследования: Основные результаты работы внедрены в ЗАО «НеоКор» и применяются при серийном производстве биопротезов клапанов сердца и сосудов. Предложенная модель для оценки гемосовместимости сосудистых протезов in vitro и полученное по результатам исследования рационализаторское предложение по модификации способа антитромботической обработки сосудистых протезов используются в отделе экспериментальной и клинической кардиологии  НИИ Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН.

Работа выполнена в рамках плановой тематики  НИР  Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН «Механизмы адаптации организма реципиента к имплантируемым биоматериала» (номер государственной регистрации 01.200316097).

Апробация материалов диссертации.  Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Первой ежегодной научной сессии Кемеровского кардиологического центра СО РАМН (Кемерово, 1997), 11th Annual Meeting of the EACTS (Copenhagen, 1997), Юбилейной конференции «Прогресс и проблемы в лечении заболеваний сердца и сосудов» (С.-Петербург, 1997), VII, XI, XIII, XIV Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2001, 2005, 2007, 2010);  Всероссийской конференции с международным участием «Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии» (Кемерово, 2001),  Четвертых научных чтениях, посвященные памяти академика Е.Н.Мешалкина с международным участием (Новосибирск, 2004), Региональной  научно-практической конференции «Актуальные проблемы  сердечно-сосудистой  хирургии» (Кемерово, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Стандартизация медицинских технологий, реабилитация в ангиологии и сосудистой хирургии» (Новокузнецк, 2006); ESAO Congress (Geneva-Switzerland 2008 and  Compienue-France 2009);  Объединенном Съезде кардиологов и кардиохирургов Сибирского федерального округа с международным участием (Томск, 2009), Всероссийской  научно-практической конференции «Облитерирующие заболевания сосудов: проблемы и перспективы» (Кемерово, 2009), 1st Russian – Hellenic Symposium with International participation «Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues» (Heraklion, Crete–Greece, 2010), на Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2010), на Международном конгрессе «Современная кардиология: Эра инноваций» (Томск, 2010).

Фрагмент диссертации, посвященный влиянию шовного материала на гемосовместимость зоны сосудистого анастомоза, занял  III место во Всероссийском конкурсе «Будущее шовных материалов» (Москва, 2008 г.).

Апробация работы состоялась 30.09.2009 г. (протокол №1) на совместном заседании сотрудников кафедр кардиологии и сердечно-сосудистой хирургии, анестезиологии и реанимации ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава», Ученого Совета Учреждения РАМН «Научно-исследовательский институт  комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН и МУЗ «Кемеровский кардиологический диспансер». 

Публикации. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ в форме научных статей и тезисов в журналах, трудах научных  съездов и конференций (из них 19 в журналах, рекомендованных ВАК), включая монографию «Биологические протезы артерий» и 2  патента на изобретение.

Вклад автора: Планирование и проведение всех экспериментов. Обработка и анализ полученных данных, подготовка публикаций.

Структура работы. Диссертация изложена на 259 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, трех глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 383 источника, в т.ч. 233 зарубежных. Работа иллюстрирована 13  таблицами и  66 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящем исследовании были изучены четыре вида биоматериала: створки аортальных клапанов свиньи, перикард, клапансодержащие сегменты v. saphena medialis и сегменты внутренней грудной артерии крупного рогатого скота. Для консервации биоматериала применяли различные сшивающие агенты: глутаровый альдегид (ГА), диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭЭ) и новые консерванты СМ1, СМ2 и СМ3, представляющие собой смеси ДЭЭ и олигоэпоксидных препаратов. Препараты В2 и В4, входящие в состав смесей СМ1, СМ2 и СМ3,  синтезированы в Иркутском институте органической химии им. А.Е.Фаворского СО РАМ (г.Иркутск). Структуры  использованных эпоксидных соединений  представлены на рис.1.

а.  б. 

       в.

Рис. 1. Структуры  эпоксидных препаратов: а - Диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭЭ), б - препарат В2 (Ди-1-[2-(глицидилокси)этокси] этиловый эфир диэтиленгликоля), в - препарат В4 (1,2,3,4,6-Пента-О-{1-[(глицидилокси)этокси]этил}--D-глюкопираноза).

Для антитромботической модификации биоматериала использовали нефракционированные гепарины: «Биохеми» (Biochemie, Австрия) и «Белмедпрепарат» (РУП «Белмедпрепараты», Беларусь), а также низкомолекулярный гепарин - Эноксапарин натрия («Клексан», Aventis, Франция). Модификацию образцов (артерии, аортальные створки и перикард) выполняли растворами антикоагулянтов с концентрацией 100 Ед/мл в течение 16 ч. Венозные сегменты с клапанным аппаратом модифицировали в 3 этапа: сначала венозные образцы инкубировали в растворе соответствующего антикоагулянта при рН 7,4 и 370С в течение 4 ч, затем в растворе соответствующего консерванта, далее после отмывки физиологическим раствором NaCl, образцы помещали в раствор донорского альбумина с концентрацией 3 г/л при рН 4,5 и 37оС на 4 ч, и снова в консервирующий раствор. Далее после отмывки в физиологическом растворе сегменты подвергали повторной модификации в растворе соответствующего антикоагулянта.

До начала проведения экспериментов все образцы хранили в консервирующем растворе.

Для оценки структурной стабильности консервированного биоматериала использовали комплекс методов. Аминокислотный состав биоматериала (n=100) проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе «Hitachi-835» (Япония). Данный раздел выполнен в отделе хроматографического анализа НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, г.Москва (зав. отделом, д.х.м, профессор Л.А.Баратова).

Исследование физико-механических свойств биоматериала (n=300) выполнено в лаборатории полимерных и композиционных материалов Института физики прочности  и материаловедения СО РАН г.Томска (руководитель лаборатории - д.т.н. С.В. Панин). . Испытания проведены в условиях продольного растяжения однотипно приготовленных образцов, в соответствии с ГОСТ 270-75. Эксперименты выполнены на разрывной машине «Instron-5582» (Великобритания).

Структуру биоматериала (n=100) исследовали методом световой микроскопии с окраской препаратов различными способами: гематоксилин-эозином - для анализа клеточных структур, пикрофуксином по Ван-Гизон – для оценки структуры коллагеновых волокон, для идентификации отложений кальция - специфичную окраску азотно-кислым серебром по Коссу. Гистологические препараты исследовали с помощью микроскопа МИКМЕД-2 («ЛОМО», Санкт-Петербург).

Цитотоксичность биоматериала оценивали по величине гемолиза, индуцированного биоматериалом. Исследуемые образцы инкубировали в растворе 0,9%NaCl при 370С в течение 120 мин, после добавления 200 мкл свежей цитратной крови повторно инкубировали 60 мин. После инкубации полученный раствор центрифугировали и измеряли оптическую плотность раствора  на  спектрофотометре. 

       Количество иммобилизованного гепарина определяли тремя различными методами: 1) в реакции с толуидиновым синим (по методике проф. С.П.Новиковой (НЦССХ им. А.Н.Бакулева, Москва, 1988) (n=1620), 2) радиоактивным методом с использованием H3 (n=240),  и 3) методом определения по  количеству серы (n=150).

Влияние консервантов и антикоагулянтов на структуру поверхности биоматериала оценивали при помощи сканирующей электронной микроскопии (n=165). Исследования проведены совместно с с.н.с.  Института геологии, геофизики и минералогии СО РАН к.х.н. А.Т.Титовым (г.Новосибирск) на растровом электронном микроскопе LЕО 1430 VP (Carl Zeiss, Germany) при 20 кВт. Толщина напыления золотосодержащих пленок составила приблизительно 500 нм. 

Для изучения влияния шовного материала в зоне сосудистого анастомоза были использованы сегменты ксеноартерий, консервированные ДЭЭ. В качестве шовного материала применяли «Prolene» 6/0 (Еthicon), рассасывающуюся нить полидиоксанон (PDS) (Еthicon) 6/0 и нить из никелида титана (TiNi), сопоставимую по диаметру с Prolene (НИИ  медицинских материалов и имплантатов с памятью формы, г. Томск).

Для изучения взаимодействия биоматериала с кровью была разработана модель in vitro для оценки гемосовместимости сосудистых протезов. Для проведения исследований образцы всех групп (L=6 см, d=4,5-5 мм) закрепляли на штуцерах магистралей многоканального перистальтического насоса Watson-Marlow 2054U/CA24 (Англия). Каждую магистраль с фиксированным образцом заполняли свежей цитратной донорской кровью. Скорость циркуляции крови составила 0,04 литра в минуту при температуре 370С. После проведения испытаний кровь от каждого образца собирают в отдельную пробирку. Особенность данной модели состоит в том, что испытания каждого образца и анализ параметров гемосовместимости проводят индивидуально.

Для оценки параметров агрегации тромбоцитов продолжительность контакта образцов с кровью составила 3 мин. Исследования проводили с помощью анализатора агрегации тромбоцитов АР 2110 (Solar, Беларусь). Агрегацию тромбоцитов индуцировали раствором АДФ с концентрацией 1,25 мкг/мл. Измеряли скорость агрегации тромбоцитов V (%/min), максимум агрегации MAX (%) и время агрегации Т (сек).

Для оценки количества и изучения качественного состава белков, сорбировавшихся после контакта с кровью, выполняли их десорбцию с внутренней поверхности сосудистых сегментов. Время контакта с кровью составляло 5, 30, 60, 90 и 120 мин. Десорбцию протеинов крови проводили на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин в растворе 2 М NaCl, затем в течение 30 мин в растворе 6 М мочевины. Полученные растворы подвергали диализу против 0,9 % раствора NaCl в течение 24 ч с 3-кратной сменой раствора. Затем растворы концентрировали при комнатной температуре до объема 0,3 мл.  Оценку суммарного количества адсорбировавшихся белков крови осуществляли  по методу Бредфорда с Coomassie G-250 (Sigma, Germany).

Идентификацию белков выполняли методом двумерного иммуноэлектрофореза в 1% геле агарозы с моно - и полиспецифическими антисыворотками против сывороточных белков крови человека (Нижегородское госпредприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио» г.Нижний Новгород). Для идентификации преципитатов проводили окраску геля  в растворе Coomassie R-250 (Sigma, Germany) в течение 30 мин при комнатной температуре, затем отмывали в дифференцирующем растворе (10% раствор уксусной кислоты). Пластины высушивали и по линиям преципитации определяли качественный спектр белков.

Определение количества каждого белка проводили при помощи вертикального электрофореза диализата в акриламидном геле. Для этого использовали градиентный гель (5-15%) с толщиной слоя 1 мм, полученный с помощью устройства Gradient-Forming devices (Sigma). Электрофореграмму высушивали при помощи GelAir Cellophan Support (Bio-Rad). Количественную оценку белков крови проводили при помощи сканирующего денситометра ДМ 2120 (Solar, Беларусь).

Количество иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA определяли методом иммуноферментного анализа при помощи набора реагентов «Иммуноскрин-G,M,A- ИФА-БЕСТ» (Новосибирск, Россия). 

Кальций-связывающую активность исследовали in vivo, путем подкожной имплантации образцов биоматериала крысам линии Wistar весом 55-60 г. Использовали створки аортального клапана свиньи, консервированные ГА, ДЭЭ, СМ1, СМ2 и СМ3 (n=100). Удаление образов производили через 60 суток. Удаленные образцы отмывали от окружающих тканей в 0,9% растворе NaCl, после чего высушивали до постоянной массы. Гидролиз образцов проводили на песочной бане (t=150 C0) в 0,5 мл раствора 50% хлорной кислоты. Количество кальция определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Perkin Elmer, 5100», USA). Содержание кальция в образце рассчитывали по формуле:

С = Спр х Vпр.: m,  где С – содержание кальция (мкг) в 1 мг сухой массы образца,

Спр  - концентрация кальция (мкг\мл) в 1 мл пробы, полученная по калибровочной кривой; Vпр – объем пробы (мл), m – масса исследуемого образца (мг).

Изучение влияния шовного материала на кальций-связывающую активность биоткани (образцы ксеностворок, консервированные ДЭЭ, прошитые Prolene, TiNi, PDS), проводили путем подкожной имплантации крысам. По истечении 60 суток образцы были извлечены, отмыты в 0,9% растворе NaCl и подвергнуты визуальному осмотру. Затем биоматериал помещали в 1,0 % раствор ГА, с последующим морфологическим изучением при помощи световой микроскопии (n=25). В оставшихся 15 образцах каждой группы оценивали количество кальция методом атомно-абсорбционной спектроскопии (n=75).

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета Statistica 6.0. Рассчитывали значение средней арифметической величины (М) и стандартной ошибки (+m); достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t).

ИССЛЕДОВАНИЕ  БИОСОВМЕСТИМОСТИ КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ  БИОПРОТЕЗОВ

Влияние различных  эпоксидных препаратов на качество консервации

биоматериала

Известно, что -NH2 группы лизина и гидроксилизина являются химической основой образования интра- и интермолекулярных поперечных связей при фиксации нативного биоматериала такими консервантами, как ГА и ДЭЭ (Woodrof E.A., 1979; Tu R. et al., 1994). Результаты проведенного аминокислотного анализа показали общие закономерности взаимодействия консервантов и биоматериала. ГА взаимодействует только с лизином и гидроксилизином коллагеновой матрицы. В отличие от ГА, ДЭЭ и эпоксисмеси СМ1, СМ2 и СМ3, помимо лизина и гидроксилизина, активно вступают в реакцию с метионином, гистидином и тирозином. Данная закономерность установлена для всех видов изучаемого биоматериала.

Установлено, что при консервации образцов ксеностворок ГА в процесс сшивки вовлекается 86,6% лизина и гидроксилизина. Использование диэпоксида и эпоксидных смесей (рис.2а) обеспечивает более значительную плотность сшивки. По сшивающей активности в отношении лизина и гидроксилизина (суммарно) консерванты можно расположить в следующем порядке: ДЭЭ (95,1%) > СМ2 > (94,9%) > СМ1 (93,9%) > СМ3 (93,2%) > ГА (86,6%).

Рис. 2а.  Относительное содержание некоторых аминокислот в ткани ксеностворок, консервированной различными способами.

Максимальное вовлечение в сшивку гистидина обеспечивали ДЭЭ и СМ3 – 92,8% этой аминокислоты вступило в реакцию с консервантом. Оценивая убывание свободных остатков всех пяти аминокислот, следует признать, что наибольшая суммарная плотность связей в ткани ксеностворок достигается при использовании консерванта СМ1 (84,4%), затем  ДЭЭ (83,7%), СМ2 (82,2%) и  СМ3 (81,2%).

При изучении аминокислотного состава образцов ксеноперикарда наблюдали иную картину (рис. 2б). По степени убывания свободных остатков лизина и оксилизина все полиэпоксидные смеси несколько уступают ДЭЭ -эффективность сшивки уменьшается в ряду ДЭЭ>СМ1>CМ2>СМ3. Вместе с тем, эпоксидные смеси весьма эффективно вовлекают в сшивку тирозин - использование СМ1 обеспечивает связывание 100% этой аминокислоты, СМ2 и СМ3 - около 97%.

Рис. 2б.  Относительное содержание некоторых аминокислот в ткани ксеноперикарда, консервированного различными способами.

Анализируя суммарное количество вовлеченных в сшивку аминокислот, можно отметить, что для ксеноперикарда наилучший сшивающий эффект оказывает ДЭЭ, превосходя  эпоксидные смеси в 2,5 раза. Столь выраженные различия в сшивающей активности ДЭЭ и  эпоксисмесей обусловлены различиями сшивки по метионину. По видимому, особенности структуры углеводородной цепи препаратов, входящих в состав эпоксисмесей, оказывают эффект «структурной некомплементарности», когда затруднено взаимодействие реакционной эпоксигруппы с определенной аминокислотой.

Для образцов ксеноартерий максимальный сшивающий эффект по лизину и гидроксилизину был отмечен при использовании СМ3: 94% данных аминокислот было вовлечено в сшивку фибриллярных белков (рис. 2в). Сопоставляя исследуемые консерванты по эффективности вовлечения свободных аминогрупп лизина и гидроксилизина в процесс сшивки, их можно расположить в ряду: СМ3(94%)>СМ1(93,3%)>ДЭЭ(93%)>СМ2(92%)>ГА(87,7%). Сшивающая способность ГА во всех исследуемых образцах достоверно (p<0,05) уступает эпоксидным консервантам. Суммарно по Lys, OHLys, Tyr, His и Met максимальный сшивающий эффект был отмечен при обработке ДЭЭ - 89,5%. Изучаемые эпоксидные смеси практически не уступают ДЭЭ:  СМ1 и СМ3 - 88,5%, СМ2 - 87,5%. Несколько более высокая сшивающая активность ДЭЭ обусловлена более эффективным вовлечением в сшивку метионина.

Рис. 2в.  Относительное содержание некоторых аминокислот в ткани ксеноартерий, консервированных различными способами.

В венозных образцах, консервированных как ДЭЭ, так и эпоксисмесями СМ1, СМ2 и СМ3, отмечено практически полное отсутствие свободных остатков лизина и гидроксилизина (рис. 2г). По эффективности вовлечения в сшивку данных аминокислот консерванты можно расположить в ряду: СМ1(95,6%)>СМ2(95%)=СМ3(95%)>ДЭЭ (94,3%)>ГА(84,2%).

Рис. 2г.  Относительное содержание некоторых аминокислот в ткани ксеновен, консервированной различными способами.

Если рассматривать суммарное уменьшение свободных остатков лизина, гидроксилизина, метионина, гистидина и тирозина в венозных сегментах, то максимальная сшивка была отмечена в образцах, консервированных СМ3: суммарное содержание свободных остатков всех пяти аминокислот снизилось на 90,2% (р<0,05), несколько меньше - на 88,4% - при использовании ДЭЭ. Эпоксисмеси СМ1 и СМ2 оказывали сшивающее воздействие практически одинаково – на 85,3% и 86,5%, соответственно (р>0,05).В целом можно утверждать, что воздействие на биоматериал всех эпоксисоединений однотипно и заключается в образовании специфических для данного класса консервантов связей со свободными остатками лизина, гидроксилизина, метионина, гистидина и тирозина коллагеновой матрицы. Максимальную суммарную плотность поперечной сшивки ткани артерий и перикарда обеспечивает ДЭЭ, вен – СМ3 и створок аортального клапана – СМ1.

При гистологическом исследовании эпоксиобработанных ксеностворок было установлено, что все образцы имели однотипное строение – деление на слои сохранено, коллагеновые волокна расположены компактно в фиброзном слое и более рыхло в спонгиозном, сохранена их характерная извитость (рис. 3). Максимально компактное расположение коллагеновых волокон в ткани обеспечила обработка эпоксисмесью СМ3, содержащей в своем составе препарат В4 с разветвленной структурой углеводородной цепи, за счет которой, по-видимому, и происходит более плотная интерфибриллярная сшивка.

Для образцов ксеноперикарда, ксеновен и ксеноартерий отмечена аналогичная зависимость. Таким образом, результаты гистологического исследования свидетельствуют, что использование эпоксидных препаратов СМ1, СМ2 и СМ3 обеспечивает высокую сшивающую активность, что в итоге определяет удовлетворительную структуру коллагена.

Рис. 3 Гистологические препараты  ксеностворок, консервированных: а) ДЭЭ; б) СМ1; в) СМ2; г)СМ3. Окраска гематоксилин-эозином, ув.х200.

Установлено, что все изучаемые консерванты придают биоматериалу удовлетворительные физико-механические свойства. Показатели прочности образцов створок, консервированных ГА, ДЭЭ, СМ1 и СМ2, не имели достоверных различий (р>0,05) (рис. 4а). Наибольшие показатели  прочности были отмечены в образцах, консервированных с  использованием СМ3, что обусловлено структурой консервированного биоматериала: высокой плотностью упаковки сшитых коллагеновых волокон, обеспечивающих устойчивость биоматериала к нагрузкам на разрыв.

Рис. 4а.  Показатели прочности образцов створок, перикарда, артерий и вен, обработанных различными консервантами.

По прочности ГА-обработанный ксеноперикард значительно превосходил все группы эпоксиобработанного (р<0,01), кроме обработанных СМ3 (p>0,05). Прочность образцов, консервированных ДЭЭ, СМ1 и СМ2, практически не различалась (р>0,05).

Среди ксеноартерий наибольшей прочностью обладали обработанные ГА и СМ3 (р>0,05), несколько уступали им образцы, консервированные СМ2  (р>0,05). Для венозных образцов, консервированных эпоксисоединениями, характерна тенденция к увеличению прочности в ряду: СМ1<ДЭЭ(p<0,05)<СМ2(р>0,05)<СМ3(р>0,05)<ГА (р>0,05).

Полученные данные согласуются с результатами гистологического исследования биоматериала, обработанного эпоксидными консервантами - максимально компактное расположение коллагеновых волокон, отмеченное в биоматериале, обработанном СМ3, обеспечивает его более высокую прочность. При использовании СМ3 показатели прочности максимальны для всех видов изучаемых биотканей, а у образцов ксеностворок даже превосходят ГА-обработанный биоматериал.

Оценивая эластичность образцов ксеноартерий, можно отметить незначительное увеличение относительного удлинения  биоматериала, консервированного ДЭЭ и СМ3 (рис. 4б), хотя в целом различия между группами были недостоверны (р>0,05). Среди образцов ксеновен наибольшей эластичностью обладали образцы, консервированные СМ2 и СМ3.

Рис. 4б.  Относительное удлинение образцов створок, перикарда, артерий и вен, обработанных различными консервантами.

Эластичность образцов ксеностворок, обработанных ГА, достоверно ниже (р<0,05), чем биоматериала, консервированного ДЭЭ, СМ1 и СМ3. Среди групп образцов, консервированных эпоксисоединениями, достоверных различий по эластичности не установлено. Среди образцов ксеноперикарда наибольшую эластичность биоматериалу придавали эпоксидные смеси СМ1 и СМ3 (р<0,05);  СМ2-обработанные образцы занимали промежуточное положение (p>0,05).

При сравнении толщины исследуемого биоматериала было установлено, что независимо от тканевой принадлежности толщина образцов, обработанных ГА, меньше, чем эпоксиобработанных. Достоверных различий по толщине биоматериала при использовании различных эпоксисоединений не обнаружено.

Оценка цитотоксичности свидетельствует о высокой биосовместимости биоматериала, консервированного всеми изучаемыми консервантами. Модификация гепарином позволяет существенно уменьшить гемолиз эритроцитов.

Использование эпоксидных препаратов СМ1, СМ2 и СМ3 в качестве консервантов биоматериала обеспечивает высокую сшивающую активность и  определяет удовлетворительную структуру коллагена. Все эпоксиобработанные образцы обладают удовлетворительными физико-механические свойствами. Применение сшивающих агентов с разветвленной структурой углеводородной цепи позволяет повысить прочность ксеногеных тканей за счет более компактного расположения коллагеновых волокон.

Оценка кальций-связывающей активности биоматериала

Было установлено, что содержание кальция в створках, консервированных эпоксидными препаратами и имплантированных крысам на 60 суток, лишь на 1 мг превышает уровень кальция в контрольных (неимплантированных) образцах (табл. 1). В то же время в образцах, обработанных ГА, количество кальция через 60 суток после  имплантации возрастает в  240 раз (р<0,001).        Полученные результаты доказывают, что эпоксидные смеси СМ1, СМ2, СМ3 и ДЭЭ, в отличие от ГА, придают биоматериалу достаточно высокую резистентность к кальцификации.

Таблица 1

Содержание  кальция  в биоматериале, обработанного различными консервантами

Количество кальция мкг/г сухой ткани

Консервант

ДЭЭ

1

СМ1

2

СМ2

3

СМ3

4

ГА

5

До имплантации

0,57+0,09

0,54+0,12

0,59+0,08

0,55+0,10

0,48+0,11

После имплан-тации (60 сут)

1,40+0,18

р1-5<0,01

1,53+0,32

р1-2>0,05

1,48+0,22

р1-3>0,05

1,54+0,30

р1-4>0,05

121,85+15,7

Изучение иммобилизации различных гепаринов на эпоксиобработанный

биоматериал

Для определения количества иммобилизованных гепаринов были использованы образцы ксеноартерий и ксеновен, консервированные ДЭЭ. При оценке количества гепарина, сорбированного артериальными образцами, по реакции с 0-толуидиновым синим, была отмечена максимальная сорбция гепарина «Белмедпрепарат» - 6,6+0,9 мкг/мг сухой ткани (рис.5а). Количество иммобилизованного Эноксапарина и нефракционированного «Биохеми»  было значительно меньше, по сравнению с гепарином «Белмедпрепарат», и составило  3,6+0,5 мкг/мг и 3,1+0,5 мкг/мг (р<0,05), соответственно.

Рис. 5а. Количество различных антикоагулянтов (мкг/мг сухой ткани), иммобилизованных на ксеноартериях, определенное  различными методами: Т.С. – реакция с толуидиновым синим, S – по содержанию серы, Н3 – при  помощи радиоактивной метки.

Количество иммобилизованного гепарина, определенного при помощи радиоактивной метки 3Н, совпадает с данными, полученными толуидиновым методом: «Белмедпрепарат» сорбировался в количестве 6,7+0,4 мкг/мг, гепарин «Биохеми» - 3,6+0,3 мкг/мг. В тоже время, количество Эноксапарина, определенного радиоактивным методом составило 5,3+0,5 мкг/мг, что на 52% больше количества, полученного с использованием толуидинового метода (р<0,05). Результаты определения количества иммобилизованного гепарина по содержанию серы подтвердили полученную ранее зависимость - наибольшие показатели были отмечены при иммобилизации гепарина «Белмедпрепарат» - 6,5+0,6 мкг/мг; количество сорбированного гепарина «Биохеми» было на 50% (р<0,05), а Эноксапарина - на 35% (р<0,05) меньше, чем количество гепарина «Белмедпрепарат».

При изучении количественных параметров модификации антикоагулянтами образцов ксеновен была получена аналогичная зависимость (рис. 5б). При оценке количества иммобилизованного гепарина методом связывания с толуидиновым синим наиболее высокие значения были отмечены при использовании «Белмедпрепарата» - 4,1 мкг/мг сухой ткани. Количество иммобилизованного Эноксапарина (2,2 мкг/мг) было в 2 раза, а нефракционированного гепарина «Биохеми» (1,5 мкг/мг) - в 2,7 раза меньше (р<0,01). Методики определения  при помощи радиоактивной метки и по количеству серы, продемонстрировали аналогичную закономерность.

Рис. 5б. Количество различных антикоагулянтов (мкг/мг сухой ткани), иммобилизованных на ксеновенах,  определенных  различными методами: Т.С. – реакция с толуидиновым синим, S – по содержанию серы, Н3 – при  помощи радиоактивной метки.

Далее был выполнен сравнительный анализ эффективности связывания гепарина образцами ксеностворок и ксеноперикарда, консервированных индивидуальным ДЭЭ и смесями эпоксидных соединений СМ1, СМ2 и СМ3, и дополнительно модифицированных нефракционированным гепарином  «Белмедпрепарат».

Результаты проведенных исследований показали, что количество иммобилизованного гепарина зависит не только от используемого консерванта, но и от вида биоматериала. Так, образцы аортальных ксеностворок связывали гепарин в 1,6-1,8 раза более активно (р<0,01), чем образцы ксеноперикарда ( рис. 6). 

Рис.6  Количество иммобилизованного гепарина в образцах ксеностворок и ксеноперикарда, обработанных различными консервантами (мкг/г сухой ткани). Время  сорбции 16 ч.

Достоверных различий между образцами, консервированными различными эпоксисоединениями, не установлено.

Для модификации биоматериала наиболее целесообразно использовать нефракционированный гепарин «Белмедпрепарат» и низкомолекулярный Эноксапарин. Наиболее точным и воспроизводимым методом оценки количества иммобилизованного гепарина является метод с использованием радиоактивной метки 3Н. Методы, основанные на связывании антикоагулянта с толуидиновым синим и расчетах по содержанию серы, могут применяться для  скрининговых исследований.

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПАРАМЕТРОВ ГЕМОСОВМЕСТИМОСТИ  ЭПОКСИОБРАБОТАННЫХ БИОПРОТЕЗОВ

Изучение структуры поверхности биоматериала методом сканирующей

электронной микроскопии

Была проведена оценка in vitro гемосовместимых свойств биоматериала, консервированного изучаемыми эпоксидными консервантами и модифицированного гепаринами различной молекулярной массы. Значительное влияние на тромборезистентность биоматериала оказывает структура поверхности – чем ее рельеф ровнее, тем более высокими гемосовместимыми свойствами она обладает.

Индивидуальные эпоксидные соединения и их смеси, состав которых потенциально весьма разнообразен, могут оказывать различное влияние на рельеф и сорбционные свойства поверхности биоматериала. Изучение образцов изучаемых биотканей методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) позволило выявить некоторые особенности структуры поверхности.

Все ксеностворки имели характерное гофрированное строение: «макрогофры» выражены слабо, «микрогофры» в большинстве случаев рельефны, рельеф представляет собой правильно упакованные «жгуты» или ячеистые образования (рис. 7). Однако, в зависимости от использованного эпоксиконсерванта, рельеф поверхности образцов различался. Поверхность ДЭЭ-обработанных ксеностворок более рельефна по сравнению с образцами, консервированными эпоксисмесями (рис. 7а). Поверхность, близкая по структуре к ДЭЭ-консервированной, отмечена у образцов, обработанных СМ3 (рис. 7г). Наиболее ровный рельеф придает аортальным ксеностворкам консервация эпоксисмесью СМ1.

Рис. 7.  Сканирующая электронная микроскопия  поверхности ксеностворок, обработанных 5% раствором: а) ДЭЭ, б) СМ1, в) СМ2 г) СМ3. Ув. х 3000.

Полученные различия вполне объяснимы, учитывая структуру препаратов, входящих в состав эпоксисмесей, и их соотношения. Преобладание в составе смеси СМ3 высокомолекулярного препарата В4 с разветвленной структурой обеспечивает высокую плотность сшивки коллагеновых волокон, что оказывает выраженное влияние и на структуру поверхности. Длина углеводородной цепи препарата В1 в 2 раза превышает длину ДЭЭ, что снижает плотность сшивки коллагеновых волокон в образцах, обработанных СМ1, и как следствие, формирует более сглаженный рельеф поверхности.

При изучении ксеноперикарда было отмечено, что образцы, обработанные ДЭЭ и СМ3, также имели схожую структуру поверхности – «микрогофры» рельефны, вытянуты. В образцах, консервированных СМ1, «микрогофры» образуют ячеистые структуры с относительно ровными ячейками. Наиболее ровная поверхность была отмечена у образцов, консервированных СМ1 и СМ2.

Дополнительная модификация антикоагулянтами обеспечивает сглаживание рельефа образцов, консервированных всеми изучаемыми эпоксисоединениями. Низкомолекулярный Эноксапарин, в отличие от НФГ, образует более равномерное покрытие, сквозь которое проступают лишь контуры «микрогофр». Наиболее ровный рельеф после модификации Эноксапарином отмечен в  образцах ксеноперикарда, обработанных СМ1.

Особенно важен ровный рельеф поверхности для сосудистых протезов, имеющих большую площадь контакта с кровью. Структура поверхности образцов ксеноартерий, консервированных различными эпоксисоединениями, имеет свои характерные особенности. В биоматериале, обработанном ДЭЭ, поверхность более рыхлая по сравнению с образцами, консервированными эпоксисмесями (рис. 8а). «Макро- и микрогофры» упорядочены. Рельеф поверхности образцов, консервированных СМ1, по структуре был наиболее близок к образцам, обработанным ДЭЭ (рис. 8б). 

Рис. 8. Сканирующая электронная микроскопия поверхности ксеноартерий, обработанных 5% раствором: а) ДЭЭ, б) СМ1, в) СМ2 г) СМ3. Ув. х 1000.

Характерная особенность структуры поверхности, выявленная при изучении створок и перикарда, присутствует и у образцов ксеноартерий, обработанных СМ3 - поверхность имеет волнообразный рельеф и наиболее плотную упаковку «микрогофр». Наиболее ровную поверхность приобрел биоматериал, консервированный СМ2 -  в данных образцах микрорельеф более однороден и упорядочен, «макрогофры» отсутствуют, «микрогофры» сглажены (рис.8в).

Обработка НФГ привела к сглаживанию «микро- и макрогофр» у всех  эпоксиобработанных образцов. Наиболее ровный рельеф отмечен для образцов, консервированных СМ2. В сравнении с НФГ, Эноксапарин оказал более выраженный эффект сглаживания – поверхность биоматериала ровная, однородная (рис.9). Наиболее гладкий рельеф отмечен у сегментов ксеноартерий, обработанных СМ2 и модифицированных низкомолекулярным Эноксапарином (рис. 9г).

Рис.9. Сканирующая электронная микроскопия поверхности ксеноартерий, обработанных по схеме: а) ДЭЭ+НФГ;

б) ДЭЭ+НМГ

в) СМ2+НФГ;

г) СМ2+НМГ. .

Ув. х 1000.

Более ровный рельеф поверхности биоматериала, модифицированного Эноксапарином, вероятно обусловлен различиями химической структуры изучаемых антикоагулянтов. Для низкомолекулярных гепаринов характерны короткие полисахаридные цепи – 16-18 моносахаридных единиц. В структуре НФГ минимальная длина полисахаридной цепи составляет не менее 25- 32 моносахаридных единиц. Таким образом, Эноксапарин, благодаря меньшему размеру молекул, образует более компактное, ровное  покрытие на поверхности биоматериала.

Изучение ксеновен при помощи СЭМ показало, что поверхность образцов, консервированных различными эпоксисоединениями, имеет продольные складки, образуя тем самым рельеф, близкий по структуре к рельефу артерий. Поверхность образцов, консервированных ДЭЭ, наиболее подвержена изменениям – складчатость выражена, образует  своеобразные «гребни» по всей поверхности биоматериала. Образцы, консервированные эпоксидными смесями, имеют более ровный рельеф поверхности. Ксеновены, обработанные СМ1 и СМ2, обладают волнообразным рельефом, а консервация СМ3 придает поверхности складчатый  характер, но менее выраженный, чем при использовании ДЭЭ .

Иммобилизация гепарина, как НФГ, так и Эноксапарина, позволяет изменить рельеф поверхности венозных образцов. Рельеф поверхности вены сглаживается, становится более упорядоченным, гепарин как бы  заполняет углубления на поверхности биоматериала, тем самым выравнивая рельеф.

Однако, в отличие от артерий, где скорость кровотока достаточно высока и время контакта клеток и белков крови с поверхностью протеза минимально, в венозных сосудах скорость кровотока во много раз ниже, поток крови нередко принимает турбулентный характер. Помимо этого, венозной крови свойственно состояние гиперкоагуляции. Эти особенности венозного кровотока влекут за собой увеличение времени контакта крови с поверхностью протеза и, соответственно, большую активацию компонентов крови, поэтому клапансодержащим венозным протезам необходимо обеспечить максимально гладкую, тромборезистентную поверхность.

Для модификации ксеновен был предложен метод стадийной модификации «Гепарин-Альбумин-Гепарин». Преимущество данного метода состоит в том, что, во-первых, слои альбумина и гепарина позволяют дополнительно сгладить рельеф поверхности, во-вторых, комплекс «альбумин-гепарин» может усиливать антитромбогенный эффект антикоагулянта.

Данные СЭМ показали, что послойная модификация «НФГ-Альбумин-НФГ» позволяет дополнительно сгладить рельеф поверхности. Поверхность образцов, модифицированная по схеме «Эноксапарин+Альбумин+Эноксапарин», имеет наиболее гладкий рельеф. Для образцов, консервированных ДЭЭ и СМ1, обработка как «НФГ+Альбумин+НФГ», так и «НМГ+Альбумин+НМГ» позволила существенно сгладить рельеф поверхности. В большей степени данный эффект коснулся образцов с базовой консервацией СМ3 (рис.10). Альбумин и Эноксапарин равномерно заполнили углубления рельефа, создав на поверхности ксеновен ровное покрытие.

Рис. 10. Сканирующая электронная микроскопия поверхности ксеновен, с базовой консервацией СМ3 и дополнительно модифицированных: а) НФГ; б) по схеме «НФГ-Альбумин-НФГ»; в) НМГ г) по схеме «НМГ-Альбумин-НМГ». Ув. х 3000.

Таким образом, изучение поверхности биоматериала с использованием СЭМ показало, что эпоксиконсерванты оказывают индивидуальное воздействие на рельеф биоткани. Значительное влияние оказывает состав смесей и структура эпоксидных препаратов, входящих в состав консервирующего раствора. Оптимальный рельеф поверхности достигается при использовании СМ1 - для консервации створок аортального клапана и СМ2 - для обработки ксеноперикарда и ксеноартерий. Для консервации ксеновен оптимально использовать СМ3.

Дополнительная модификация  гепарином позволяет сгладить рельеф, сформированный в процессе базовой консервации. Наибольший сглаживающий эффект оказывает иммобилизация низкомолекулярного гепарина - Эноксапарина.  Максимально гладкий рельеф поверхности ксеновен обеспечивает  послойная модификация «Эноксапарин-Альбумин-Эноксапарин».

Взаимодействие  поверхности ксеноартерий с компонентами крови

При имплантации ксенопротеза в сосудистое русло большое значение имеют первые минуты его контакта с кровью: в этот период происходит адсорбция белков плазмы и адгезия тромбоцитов на луминальной поверхности протеза. От состава и количества сорбированных белков зависит дальнейшая «судьба» протеза.

Результаты исследований показали, что через 5 минут контакта с кровью на поверхности образцов, обработанных эпоксисмесями, количество сорбировавшегося белка достоверно меньше (р<0,05), чем на образцах, консервированных ДЭЭ (рис. 11а). Оптимальными параметрами отличаются сегменты ксеноартерий, консервированных СМ2 - в образцах этой группы отмечено минимальное количество белковых депозитов. После модификации ксеноартерий гепаринами количество сорбированных белков значительно снижается. На ДЭЭ-консервированных образцах после модификации НФГ количество белковых отложений уменьшается 1,7 раза (р<0,01), а при использовании Эноксапарина – в 3,8 раза (р<0,001) по сравнению с немодифицированными образцами. Для  ксеноартерий, обработанных СМ1, дополнительная модификация антикоагулянтами позволила в 2,2 раза (р<0,01) снизить количество сорбированных белков.

Для образцов, консервированных СМ2 и СМ3, эффект гепаринизации не столь выражен – снижение количества сорбированного белка не имеет статистической достоверности (р>0,05), при этом различий в использовании НФГ или Эноксапарина не выявлено. С другой стороны, на образцах, консервированных СМ2 и СМ3, исходно  сорбировалось минимальное количество белков. В то же время, к 90 мин контакта с кровью на образцах, обработанных эпоксисмесями, количество сорбированных белков увеличилось всего в 3 раза, в то время как на образцах, консервированных ДЭЭ,  данный показатель возрос в 9 раз (рис.11б).

Рис.11 а  Количество сорбировавшихся белков крови на образцах ксеноартерий, обработанных различными способами. Длительность контакта с кровью  5 мин.

Рис.11 б  Количество сорбировавшихся белков крови  на поверхности ксеноартерий, обработанных различными способами. Длительность контакта с кровью  90 мин.

Исследование сорбции протеинов позволило утверждать, что дополнительная обработка биоматериала гепаринами достоверно (р<0,05) снижает количество сорбированных белков в 1,2-1,4 раза. Различия при использовании НФГ и Эноксапарина недостоверны (р>0,05). Наименьшее количество белков сорбировано на ксеноартериях, консервированных СМ2 и дополнительно модифицированных  Эноксапарином.

Модификация антикоагулянтом позволила не только уменьшить количество сорбированных белков, но и повлияла на их состав, сдвинув процесс сорбции в сторону альбумина и «легких» иммуноглобулинов. На образцах, консервированных СМ2 и модифицированных Эноксапарином, сорбировалось до 80% альбумина. Среди сорбировавшихся иммуноглобулинов около 95% представлены IgG.

Преимущественная сорбция альбумина и IgG препятствует адгезии и контактной активации тромбоцитов, что подтвердили результаты проведенных исследований. При взаимодействии с поверхностями, дополнительно модифицированными как нефракционированным гепарином, так и Эноксапарином, активация тромбоцитов значительно снижается (рис. 12). Минимальная контактная активация тромбоцитов отмечена для образцов, консервированных СМ2 и модифицированных Эноксапарином.

Контактная активация тромбоцитов также зависит от способа обработки биоматериала. Поверхность ГА-обработанного биоматериала более интенсивно провоцирует активацию тромбоцитов, чем эпоксиобработанного. Модификация эпоксиобработанных ксеноартерий как НФГ, так и  Эноксапарином препятствует адгезии тромбоцитов на поверхности биоматериала.

Скорость агрегации

Максимум агрегации

Рис. 12 Показатели скорости и  максимума  агрегации тромбоцитов в зависимости от базовой модификации и дополнительной обработки гепарином (НФГ-нефракционированный гепарин, НМГ- низкомолекулярный гепарин Эноксапарин)..

Полученные результаты позволяют утверждать, что на гемосовместимость биоматериала значительное влияние оказывают такие факторы, как рельеф поверхности, полученный в процессе консервации, и свойства антикоагулянта, используемого для модификации биоткани. В свою очередь, рельеф и свойства поверхности, приобретенные в процессе обработки, определяют количество и состав протеинов, сорбирующихся на биоматериале при контакте с кровью. Обоснованный подбор консерванта и антикоагулянта позволяет оптимизировать свойства поверхности биоматериала.

Для ксеноартерий базовая консервация эпоксисмесью СМ2 с последующей иммобилизацией низкомолекулярного Эноксапарина позволяет создать поверхность с  гладким и упорядоченным рельефом, обладающую наименьшей контактно-активационной способностью в отношении тромбоцитов, низкой сорбционной активностью по отношению к белкам плазмы крови.

ВЛИЯНИЕ ШОВНОГО МАТЕРИАЛА НА БИОСОВМЕСТИМОСТЬ

КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ  БИОПРОТЕЗОВ

Исследовано влияние шовного материала на гемосовместимость зоны анастомозов, выполненных нитями Prolene, PDS  и TiNi. Данные СЭМ показали, что через 5 мин контакта с кровью в зоне анастомоза белковые депозиты визуализируются во всех исследуемых образцах (рис. 13).

Рис. 13  Сканирующая  электронная микроскопия  зоны анастомозов после 5 мин контакта с кровью, выполненных:  a - нитью Prolene; б -нитью PDS;  в - - нитью TiNi. Ув. х 150.

При использовании нити TiNi белковый слой более компактен, покрывает зону анастомоза в виде пленки. В зоне анастомозов из PDS отмечены более массивные, рыхлые отложения белков. Еще более массивные белковые депозиты, простирающиеся за пределы анастомоза отмечены при исследовании нити Prolene. При большем увеличении видно, что среди белковых отложений находится большое количество форменных элементов крови, свидетельствующее о формировании красного тромба (рис. 14).

Рис. 14  Сканирующая  электронная микроскопия зоны анастомоза, выполненного  нитью Prolene, после 5 минут контакта с кровь. Образование красного тромба,  ув. х 10 000. 

Помимо этого, при использовании нитей Prolene и PDS около 80% эритроцитов, вовлеченных в формирование красного тромба, трансформированы в эхиноциты (рис.15). Появление эхиноцитов свидетельствует о неблагоприятном воздействии, в частности, о реакции эритроцитов на инородное тело. В отличие от Prolene и PDS, в зоне анастомоза, выполненного нитью из TiNi, отмечены лишь единичные эхиноциты.

Рис. 15 Сканирующая электронная микроскопия  эритроцитов и эхиноцитов в зоне анастомоза после 5 мин контакта с кровью,  выполненных: а -  нитью Prolene;  б - нитью PDS; в - нитью TiNi. Ув. х 3000. 

Модификация зоны анастомозов НФГ позволила нормализовать реакцию эритроцитов. Помимо благоприятного влияния на эритроциты, модификация гепарином зоны анастомозов  способствовала снижению количества белковых отложений, что морфологически проявилось в более компактном расположении слоя протеинов.

К 120 минуте контакта с кровью зона анастомоза, выполненного TiNi, равномерно покрыта слоем белка. Более рыхлый, по сравнению с нитью TiNi, слой протеинов отмечен в зоне анастомоза, прошитого PDS. Наиболее массивные, рыхлые белковые отложения с грубой структурой характерны для анастомозов, выполненных Prolene.

Изучение поверхности самого шовного материала показало, что нить Prolene на протяжении всего контакта с кровью оставалась гладкой, интактной к белкам крови: шовный материал как бы провоцировал массивную сорбцию белка, но сам не участвовал в процессе (рис.16). Нить TiNi обладала шероховатой поверхностью, в процессе контакта с кровью покрывалась протеинами и, сливаясь с адсорбированными белками, образовала  равномерное покрытие зоны анастомоза.

Поверхность нити PDS к 120 минуте контакта с кровью, помимо протеинов, была  покрыта и адгезированными форменными элементами крови.

Как показали полученные результаты, реакция компонентов крови на шовный материал различается и зависит от вида используемых нитей. Модификация гепарином оказывает положительное влияние на процессы, протекающие в зоне анастомоза в первые часы контакта с кровью. Так как при имплантации кардиоваскулярных протезов рассасывающийся шовный материал не используется, дальнейшие сравнительные исследования проводили с нитями Prolene и TiNi.

Рис. 16 Сканирующая  электронная микроскопия поверхности шовного материала после 120 минут контакт с кровью: a - нить Prolenе; б - нить PDS; в - нить  TiNi.. Ув. х 1500.

Изучение динамики сорбции белков крови в зоне анастомоза позволило установить, что нить TiNi обладает гемосовместимыми свойствами в большей мере, чем Prolene - через 120 минут контакта с кровью на анастомозах, выполненных TiNi, сорбировалось меньше белков (р<0,01) (рис.17). Предварительная модификация анастомозов  нефракционированным гепарином позволила снизить сорбцию протеинов, причем на анастомозах, выполненных нитью Рrolene, количество сорбировавшихся белков было почти в 2 раза меньше, чем на немодифицированных.

Рис. 17  Количество сорбированных белков в зоне  анастомозов после контакта с кровью (мкг/см2). Влияние шовного материала и  дополнительной модификации  гепарином.

Обработка гепарином зоны анастомоза, прошитого TiNi, практически не повлияла на количество сорбированных белков. Возможно, это обусловлено тем, что во время контакта с кровью сама нить покрывается слоем протеинов, что в итоге увеличивает суммарное количество сорбированного белка. Полученный результат едва ли следует рассматривать как отрицательный, поскольку на риск тромбообразования в зоне анастомоза в большей степени оказывает влияние характер сорбции протеинов (их видовая специфичность и последовательность), а также адгезия и агрегация тромбоцитов.

Как показал качественный анализ протеинов, сорбированных в зоне анастомозов, выполненных Prolene, после 30 минут контакта с кровью белковый слой состоит на 55-60% из альбумина, на 10% - из трансферина, остальная часть протеинов приходится на иммуноглобулины IgG , IgА и IgM, и до 90 минуты контакта с кровью состав белков не изменяется. При использовании TiNi к 30 минутам контакта белковый слой представлен: альбумин - 60%,  трансферин - 18% и иммуноглобулины - 20%. К 90 минутам контакта с кровью соотношение белков несколько изменилось – альбумин составил 66-70%, трансферин – не более 7%, а иммуноглобулины - около 6%, причем основная доля  представлена  IgG.  Модификация нефракционированным гепарином зоны анастомозов, выполненных как Prolene, так и TiNi, позволила оптимизировать состав сорбированных белков - сорбция протеинов сместилась в сторону альбумина и иммуноглобулинов. На анастомозах, выполненных TiNi и модифицированных гепарином, на всем протяжении эксперимента доля сорбированного  альбумина составляла 75-85 %, трансферина - не более 4-6%  и IgG - 6-9%.

Таким образом, дополнительная модификация нефракционированным гепарином зоны анастомозов, выполненных как TiNi, так и Prolene, изменила избирательность сорбции протеинов крови в пользу альбумина и иммуноглобулинов малой молекулярной массы, что в свою очередь, позволяет надеяться на снижение риска тромбообразования. Помимо этого, значительно снизились показатели агрегации тромбоцитов; максимальное снижение скорости агрегации тромбоцитов отмечено при контакте крови с анастомозами, выполненными нитью TiNi и модифицированными нефракционированным гепарином (рис.18).

Скорость агрегации

Максимум агрегации

Рис. 18  Показатели скорости и  максимума  агрегации тромбоцитов, в зависимости от шовного материала и  дополнительной обработки гепарином.

Изучение кальций-связывающей активности биоматериала, прошитого Prolene и TiNi, показало, что шовный материал способен провоцировать образование кальциевых депозитов. Установлено, что характер накопления  кальция зависит от качественных характеристик шовного материала. В образцах, прошитых TiNi, отложения кальция располагались вокруг шовного материала и имели мелкозернистую форму. За пределами кальцинатов коллагеновые волокна сохраняли извитость и компактное расположение (рис. 19). Напротив, использование нити Prolene провоцировало образование крупных кальциевых депозитов, причем не только в перилигатурной зоне, но и в других отделах аортальной створки, при этом коллагеновые волокна приобретали рыхлое расположение.

Рис. 19. Отложения  кальция вокруг шовного материал: а-  нить Prolenе;  б –  нить TiNi. Окраска по Коссу, ув. х 200.

Оценка количества кальция в биоматериале после подкожной имплантации лабораторным животным показала, что применение нити Prolene достоверно провоцирует кальцификацию консервированных аортальных створок - через два месяца после имплантации количество кальция в биоматериале возрастает в 63 раза (р<0,001), при использовании TiNi  данный показатель увеличился в 17,5 раз (р<0,001), а нити PDS – в 15 раз (р<0,001).

Модификация опытных образцов нефракционированным гепарином позволила значительно снизить интенсивность отложения кальция в биоматериале. В образцах, прошитых нитью Prolene, уровень кальция снизился почти в 3 раза (до 58,6+4,53 мг/г) (р<0,01), прошитых PDS  -в 3,4 раза (до 10,6+ 1,7 мг/г)(р<0,01), а при использовании TiNi - в 10 раз (до 4,3+0,6  мг/г)(р<0,001), что незначительно превысило метаболический уровень кальция в биоматериале.

В целом проведенные исследования показали, что шовный материал оказывает значительное влияние на реакцию плазменных белков и форменных элементов крови в зоне сосудистого анастомоза и, кроме того, способен провоцировать кальцификацию биоткани протезов клапанов сердца. Доказано, что удовлетворительными параметрами био- и гемосовместимости обладает нить TiNi. Дополнительная модификация гепарином позволяет минимизировать негативное влияние шовного материала в зоне анастомоза.

ВЫВОДЫ:

1. Качественные показатели сшивки эпоксисоединениями фибриллярных белков биоматериалов различной видовой и тканевой принадлежности однотипны и заключаются в образовании связей со свободными остатками лизина, гидроксилизина, метионина, гистидина и тирозина. Максимальную суммарную плотность поперечной сшивки ткани артерий и перикарда крупного рогатого скота обеспечивает консервация диглицидиловым эфиром этиленгликоля (ДЭЭ), вен – эпоксидной смесью СМ3 и  створок аортального клапана свиньи – эпоксидной смесью СМ1.

       2. Все исследованные эпоксидные консерванты придают биоматериалу удовлетворительные физико-механические свойства. Наличие в составе консервирующей смеси эпоксисоединений с разветвленной структурой углеводородной цепи определяет повышение прочности биоматериала: максимальные показатели прочности обеспечивает эпоксисмесь СМ3 с наибольшим содержанием 1,2,3,4,6-Пента-О-{1-[(глицидилокси)этокси]этил}--D-глюкопиранозы.

3. Значительное влияние на рельеф поверхности ксеногенного биоматериала оказывает структура эпоксидных соединений и состав их смесей. Эпоксидная смесь СМ1 положительно влияет на рельеф поверхности створок аортального ксеноклапана и ксеноперикарда, СМ2 – на поверхность ксеноартерий. Модификация биоматериала низкомолекулярным Эноксапарином натрия позволяет максимально сгладить рельеф поверхности биоматериала.

4. Основанные на разных подходах методы определения иммобилизованного гепарина (реакция с толуидиновым синим, использование радиоактивной метки и оценка количества серы), позволяют  получить сопоставимые результаты. Наиболее высокие количественные параметры иммобилизации демонстрирует нефракционированный гепарин «Белмедпрепарат». 

5. Консервация ксеноартерий эпоксисоединениями обеспечивает сведение к минимуму адгезии и значительное снижение агрегации тромбоцитов. Модификация антикоагулянтами повышает антиагрегационный эффект консервации эпоксисоединениями. Наиболее эффективно снижает показатели агрегации тромбоцитов консервация эпоксидной смесью СМ2 с последующей модификацией низкомолекулярным Эноксапарином.

6. Состав и динамика формирования белковых слоев на поверхности биоматериала в первые часы контакта с кровью в значительной мере зависят от способа базовой консервации и дополнительной модификации. На поверхности ксеноартерий, консервированных СМ2 и модифицированных низкомолекулярным Эноксапарином, сорбируется преимущественно альбумин, что определяет высокую гемосовместимость биоматериала.

7. Для создания протеза венозного клапана перспективно использовать эпоксиобработанные клапаносодержащие венозные сегменты крупного рогатого скота. Консервация эпоксисмесью СМ3 с дополнительной модификацией по схеме «Эноксапарин-Альбумин-Эноксапарин» обеспечивает удовлетворительные физико-механические свойства биоматериала и максимально гладкий рельеф поверхности.

8.  Шовный материал способен оказывать значительное негативное влияние на гемосовместимость зоны анастомозов: провоцировать сорбцию высокомолекулярных белков крови, вызывать трансформацию эритроцитов и потенцировать агрегацию тромбоцитов. Модификация зоны анастомоза гепарином позволяет значительно снизить уровень негативного воздействия шовного материала на компоненты крови: уменьшается контактная активация тромбоцитов, сорбция белков крови смещается в пользу альбумина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения прочности биоматериала целесообразно включать в состав консервирующего раствора препарат 1,2,3,4,6-Пента-О-{1-[(глицидилокси)этокси]этил}--D-глюкопиранозу. Для повышения эластичности - добавлять препарат Ди-1-[2-(глицидилокси)этокси] этиловый эфир диэтиленгликоля.

2. При создании тромборезистентных биопротезов артерий возможно использование эпоксисмеси СМ2, биопротезов клапанов сердца и изделий из ксеноперикарда  - эпоксисмеси  СМ1,  биопротезов  венозного клапана – СМ3.

3. Для эффективной антитромботической модификации кардиоваскулярных биопротезов перспективно применение низкомолекулярного гепарина - Эноксапарина натрия (Клексан). Для придания тромборезистентных свойств поверхности протеза венозного клапана целесообразно использовать послойную модификацию «Эноксапарин-Альбумин- Эноксапарин».

4. Метод, основанный на использовании радиоактивной метки 3Н, при оценке количества иммобилизованного гепарина является наиболее точным. Однако для рутинных исследований или сравнительной оценки  образцов может быть использован метод определения с толуидиновым синим - менее трудоемкий, легко воспроизводимый и безопасный.

5. В комплекс методов оценки гемосовместимых свойств биоматериала целесообразно  включать  разработанную модель in vitro, позволяющую оценивать морфологические изменения в зоне анастомоза после контакта с кровью, трансформацию  компонентов крови, показатели активации тромбоцитов, а также количество и качественный состав адсорбировавшихся белков.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Влияние факторов реципиента  на кальцификацию ксеноимплантатов, консервированных глутаровым альдегидом / Барбараш Л.С., Журавлева И.Л., Гантимурова И.Л., Кудрявцева Ю.А. // Трансплантология и искусственные органы. – 1995. -№3. – С.48-52.

2. Разработка новых моделей биопротезов на основе консервации эпоксидными препаратами / И.Ю. Журавлева, Ю.А. Кудрявцева, И.А. Климов // Биологические протезы артерий (ред. Барбараш Л. С.,  Криковцов А. С., Журавлева И. Ю.). - Кемерово, 1996.- С. 171-188.

3. Новые методы консервации биопротезов для сердечно-сосудистой системы / Ю.А.Кудрявцева  //Биопротезы в сердечно сосудистой хирургии. - Материалы Симпозиума с международным участием. Кемерово, 1996 г. - С. 146-151.

4. Влияние рельефа поверхности биоматериала на тромборезистентные свойства ксенососудов, консервированных различными эпоксисоединениями /И.Ю.Журавлева, Ю.А.Кудрявцева, В.В.Борисов// Прогресс и проблемы в лечении заболеваний сердца и сосудов: Материалы юбилейной конференции. Декабрь 1997г.,С.-Петербург.–С.120-121.

5. New heart valve bioprostheses  with high thromboresistance and antibacterial activity / I. Zhuravleva, Yu. Kudriavtseva,  V. Borisov // 11th Annual Meeting of the EACTS: Abstracts.- Copenhagen, 1997. - P.78.

6. Антитромбогенная модификация эпоксиобработанного биоматериал / Л. С. Барбараш, И.А. Климов, Ю.А. Кудрявцева, И.Ю. Журавлева // Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии: Всероссийская конференция с международным участием (21-23 июня 2001 г., Кемерово, Россия).- Новосибирск: ЦЕРИС, 2001. - С. 18-19.

7. Новое поколение биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии / И.Ю.Журавлева, В.В.Борисов, И.А.Климов, Ю.А.Кудрявцева, Л.С. Барбараш // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». - Москва, 2001. - № 3.  – С.248.

8. Влияние иммобилизованного гепарина и структуры поверхности биоматериала на тромборезистентные свойства биологических протезов / И.Ю. Журавлева, П.М. Ларионов, Ю.А. Кудрявцева, Л.С. Барбараш // Четвертые научные чтения, посвященные памяти академика Е.Н.Мешалкина с международным участием: Тезисы докладов.- Новосибирск: Сибмедиздат, 2004. - С.169.

9. Влияние различных эпоксисоединений и антикоагулянтов на структуру ксеногенного митрального клапана / Т.В. Глушкова, И.Ю. Журавлева, Ю.А. Кудрявцева,  Б.А. Трофимов // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН  «Сердечно-сосудистые заболевания». – Москва,  2005 г. - Т.6. - №3 - С. 250.

10. Влияние шовного материала на биосовместимость кардиоваскулярных биопротезов / Ю.А.Кудрявцева, С.С.Зинченко, А.Ю.Бураго, Т.В.Глушкова // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН  «Сердечно-сосудистые заболевания». – Москва,  2005 г.- Т.6.-№5. - С.303.

11. Пути и перспективы совершенствования инфраингвинальных артериальных биопротезов / И.Ю. Журавлева, Ю.А. Кудрявцева, С.В. Иванов, И.А. Климов, Л.С. Барбараш  // Патология кровообращения и кардиохирургия.- 2005.-№ 1.- С. 78-83.

12. Влияние различных консервантов на гемо- и биосовместимость ксеногенного митрального клапана / Ю.А. Кудрявцева, Т.В. Глушкова, А.Т. Титов, Л.А.Опарина  // Материалы Региональной  научно-практической конференции «Актуальные проблемы  сердечно-сосудистой  хирургии», 23-25 сентября, 2006. – Кемерово. - С.215

13. 12-ти летний опыт использования биопротезов для замещения инфраингвинальных  артерий / Л.С.Барбараш, С.В.Иванов, И.Ю.Журавлева, А.И.Ануфриев, Я.В.Казачек, Ю.А.Кудрявцева, М.Г.Зинец // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2006. - Т.12. - № 3. - С. 91-97.

14. Перспектива создания биологического протеза венозного клапана / Ю.А.Кудрявцева, А.Т.Титов, И.Ю.Журавлева // Материалы Х Всероссийской научно-практической конференции «Стандартизация медицинских технологий,  реабилитация в ангиологии и сосудистой хирургии», 12-13 октября 2006г., г.Новокузнецк. - С.133-134.

15. Влияние различных консервантов и иммобилизованного  гепарина на тромборезистентные свойства артериальных биопротезов / И.Ю. Журавлева, Ю.А. Кудрявцева, Б.А. Трофимов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Стандартизация медицинских технологий,  реабилитация в ангиологии и сосудистой хирургии», 12-13 октября 2006г., г.Новокузнецк. - С.58.

16 Влияние шовного материала на биосовместимость кардиоваскулярных биопротезов / Ю.А.Кудрявцева, С.С.Зинченко, А.Ю.Бураго, Т.В.Глушкова// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Стандартизация медицинских технологий, реабилитация в ангиологии и сосудистой хирургии», 12-13 октября 2006 г., г.Новокузнецк. -  С.73-74.

17. Сравнительная оценка  сшивающей активности новых консервантов из класса эпоксисоединений / И.Ю.Журавлева, Ю.А. Кудрявцева, И.А.Климов, Л.С.Барбараш // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2007. – № 2(34). - С.44-48.

18. Новые технологии повышения биосовместимости биологических протезов клапанов сердца / И.Ю.Журавлева, Ю.А.Кудрявцева, А.Т.Титов,  Л.С.Барбараш // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН  «Сердечно-сосудистые заболевания». – Москва,  2007 г. - Т.8. - № 6. - С.305.

19. Новая технология антикальциевой обработки биопротезов клапанов сердца / Ю.А.Кудрявцева, Т.В. Глушкова, А.В. Веремеев,  С.В. Лосева,  И.Ю. Журавлева // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН  «Сердечно-сосудистые заболевания». – Москва, 2007 г. - Т.8. - № 6. - С.305.

20. Трансформация зоны анастомоза «Биопротез-артерия» при контакте с кровью: влияние шовного материала / И.Ю.Журавлева, Ю.А.Кудрявцева, С.С.Зинченко, А.Т.Титов, Л.С.Барбараш // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2007. - Т.13. - № 4. - С.132-136.

21. Effect of epoxide fixation to degradation of porcine  endogenous retrovirus DNA in porcine valves / A. Niemiec-Cyganek, L. Pawlus-Lachecka, J. Wszolek, B. Strzalka-Mrozik, J. Adamaska, J.A. Kudrjavtseva, I. Jouravleva, U. Mazurek // The International Journal of  artificial organs.- 2008. -Vol.31.- N.7.–P.627.

22. Трансформация зоны анастомоза «биопротез-артерия» при контакте с кровью: влияние шовного материала (сообщение II) / Ю.А.Кудрявцева, С.С.Зинченко, И.Ю.Журавлева, С.В.Иванов, Л.С.Барбараш // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - Т.14. - № 1. - С. 113-117.

23. Применение  смесей моно- и олигоэпоксидных соединений для консервации биологических протезов клапанов сердца / Ю.А.Кудрявцева, И.Ю.Журавлева, Л.А.Опарина, М.Я.Хилько, Б.А.Трофимов, Л.С.Барбараш // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2008. - №1. – С. 79-84.

24. Разработка биологического протеза  венозного клапана для лечения  клапанной недостаточности / Ю.А.Кудрявцева, И.Ю.Журавлева, А.Т.Титов, Л.С.Барбараш // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - Т.14. - № 3. - С. 64-70.

25. Влияние  различных гепаринов на динамику адсорбции белков крови  на поверхности биоматериала / Ю.А.Кудрявцева, А.В.Веремеев, О.Н.Хрячкова, Л.С.Барбараш // Сибирский медицинский журнал. – 2009. –Том 24. – №1. - С.83-84.

26. Диагностика и выявление факторов риска развития стенозов биопротезов  в бедренно-проксимально-подколенной позиции / Ю.А.Кудрявцева, Н.Н.Бурков, И.Н.Сизова, И.Ю.Журавлева, Л.С.Барбараш // Сибирский медицинский журнал. – 2009. –Том 24. – №1. - С.84.

27. Способ консервации и стерилизации биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии, Патент РФ № 2350075 / Л.С.Барбараш, И.Ю.Журавлева, Ю.А.Кудрявцева, И.Л.Гантимурова, Р.Х.Леванова // Опубликовано 27.03.2009г. бюл.№ 9.

28.  Способ стерилизации и предимплантационного хранения  биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии, Патент РФ №2357766 / Л.С.Барбараш, И.Ю.Журавлева, Ю.А.Кудрявцева, И.Л.Гантимурова, Р.Х.Леванова // Опубликовано 10.06.2009 г. бюл. № 16.

29. Комплексный лечебно-диагностический подход у пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий  нижних конечностей. Выявление факторов  риска и диагностика стенозов анастомозов биопротезов в отдаленном периоде после бедренно-проксимально-подколенного протезирования / Ю.А.Кудрявцева, Н.Н.Бурков, И.Н.Сизова, Л.С.Барбараш // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Облитерирующие заболевания сосудов: проблемы и перспективы». Кемерово, 19-20 июня 2009. – С.91-92.

30. Пути повышения тромборезистентности сосудистых биопротезов / Ю.А.Кудрявцева, А.В.Веремеев, О.Н.Хрячкова, И.Ю.Журавлева // Материалы Всероссийской  научно-практической конференции «Облитерирующие заболевания сосудов: проблемы и перспективы». Кемерово, 19-20 июня 2009.  – С.117-118.

31. Разработка  технологий повышения биосовместимости ксеноперикардиальных заплат для ангиопластики / Ю.А.Кудрявцева, Т.В. Глушкова, И.Ю.Журавлева // Материалы Всероссийской  научно-практической конференции «Облитерирующие заболевания сосудов: проблемы и перспективы». Кемерово, 19-20 июня 2009.  – С.119-120.

32. Использование новых консервантов класса эпоксисоединений для создания биопротеза венозного клапана / Ю.А. Кудрявцева, И.Ю. Журавлева, Б.А. Трофимов // Материалы 21 (ХХV)  Международной  конференции Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов, Самара, 29 июня – 1 июля 2009.  – С.217.

33. Chemical fixed acellular porcine tissue as biomaterials for tissue engeneering / A. Niemiec-Cyganek, А.Baranska, J.Nozynski, L.Pawlus-Lachecka P.Wilozek, J.Wszolek, J.A. Kudrjavtseva, L.S.Barbarash //The International Journal of  artificial organs.- 2009. -Vol.32.- N.7.–P.459.

34. The biochemical properties of l acellular porcine valve scaffold  fixed  with different crosslink agent/ А.Baranska, A.Niemiec-Cyganek, P.Wilozek, L.Pawlus-Lachecka, J.Wszolek, J.A. Kudrjavtseva, L.S.Barbarash // The International Journal of  artificial organs.- 2009. -Vol.32.- N.7.–P.461.

35. Разработка технологии антитромботической модификации биопротеза венозного клапана / Кудрявцева Ю.А., Тогулева А.Г., Журавлева И.Ю. // Бюллетень НЦССХ им.А.Н. Бакулева,  Москва,  2010 г.  – С.187.

36. Роль шовного материала в кальцификации биопротезов / Ю.А.Кудрявцева, М.В.Насонова, Т.Н.Акентьева, И.Ю.Журавлева // Бюллетень НЦССХ им.А.Н. Бакулева,  Москва,  2010 г. – С.189.

37.Technology of antithrombotic modification of the venous valve bioprosthesis / Ju.A.Kudryavtseva, A.G.Toguleva, M.V.Nasonova, I.Ju.Zhuravleva // 1st Russian – Hellenic Symposium with International participation «Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues»: Abstracts, 3-9 May, 2010, Heraklion, Crete–Greece. – P.51.

38. Effect of the epoxy preservatives and immobilized heparin on hemocompatibility of arterial bioprostheses /Ju.A.Kudryavtseva,I.Ju.Zhuravlyova,B.A.Trofimov //1st Russian – Hellenic Symposium with International participation «Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues»: Abstracts, 3-9 May, 2010, Heraklion, Crete–Greece. – P.50-51.

39. Пути повышения биосовместимости ксеноперикардиальных заплат для интракардиальной и ангиопластики / Ю.А.Кудрявцева, Т.В.Глушкова, И.Ю Журавлева.// Тезисы докладов Международного Конгресса «Кардиология на перекрестке наук», Тюмень, 2010. – С. 153-154

40. Сравнительный анализ применения различных гепаринов для антитромботической модификации биоматериала / И.Ю.Журавлева, Ю.А.Кудрявцева, В.В.Борисов, Л.С.Барбараш // Медицина в Кузбассе. -2010. - № 3. – С.17-22.

41. Пути предупреждения тромбозов сосудистых биопротезов / Ю.А.Кудрявцева, М.В.Насонова, А.Г.Тогулева, Т.Н.Акентьева, И.Ю.Журавлева // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Новые возможности в диагностике, лечении и снижении смертности от ССЗ», Москва, 2010. – С.35.

42. Профилактика тромбозов биопротезов в инфраингвинальной позиции / Н.Н.Бурков, Ю.А.Кудрявцева, И.Ю.Журавлева, Л.С.Барбараш // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Новые возможности в диагностике, лечении и снижении смертности от ССЗ», Москва, 2010. – С.36-37.

43. Применение различных гепаринов для повышения тромборезистентности биоматериала / Кудрявцева Ю.А.,  Журавлева И.Ю., Борисов В.В. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Новые возможности в диагностике, лечении и снижении смертности от ССЗ», Москва, 2010. – С.38-39.

44.  Использование нефракционированного гепарина с целью предупреждения кальцификации биоматериала / Кудрявцева Ю.А., Насонова М.В., Бураго А.Ю., Акентьева Т.Н., Журавлева И.Ю. // Сибирский медицинский журнал. - 2010. – Т.25. - №2. –С.181-182.

45. Предупреждение кальцификации эпоксиобработанного  биоматериала с использованием аминодифосфоната / Глушкова Т.В., Кудрявцева Ю.А., Лосева С.В.,  Журавлева И.Ю. //Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010. – С. 50-51.

46. Перспективы применения смесей моно-и олигоэпоксисоединений для консервации биоматериала / Кудрявцева Ю.А., Глушкова Т.В., Опарина Л.А., Трофимов Б.А.,  Журавлева И.Ю. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010. – С. 115-116.

47. Состояние гуморального иммунитета у пациентов после бедренно-проксимально-подколенного  протезирования биологическим протезом «Кемангиопротез» Материалы Всероссийской научно-практической  конференции «Актуальное проблемы сердечно-сосудистой патологии», Бурков Н.Н., Веремеев А.В., Кудрявцева Ю.А., Журавлева И.Ю. -  Кемерово, 2010. – С. 45-46

       48. Оценка антикальциевой эффективности  аминодифосфоната для обработки биологических протезов клапанов сердца/ Журавлева И.Ю., Глушкова Т.В., Кудрявцева Ю.А. //Материалы Всероссийской научно-практической  конференции «Актуальное проблемы сердечно-сосудистой патологии» - Кемерово, 2010. – С.102-103. 

       49. Использование смесей моно- и олигоэпоксисоединений для консервации биоматериала / Кудрявцева Ю.А., Глушкова Т.В., Насонова М.В., Опарина  Л.А., Журавлева И.Ю.// Материалы Всероссийской научно-практической  конференции «Актуальное проблемы сердечно-сосудистой патологии», Кемерово, 2010. – С. 154-155.

       50. Выбор технологии антитромботической модификации биопротеза венозного клапана / Кудрявцева Ю.А., Тогулева А.Г., Акентьева Т.Н, Насонова М.В, Журавлева И.Ю.// Материалы Всероссийской научно-практической  конференции «Актуальное проблемы сердечно-сосудистой патологии», Кемерово, 2010. – С.155-156.

Соискатель:                                                                        Ю.А.Кудрявцева




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.