WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Дрозд Наталья Николаевна

ВЫЯВЛЕНИЕ НОВЫХ АНТИКОАГУЛЯНТОВ ПРЯМОГО 

ДЕЙСТВИЯ В РЯДУ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ

14.03.06. – фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Гематологический научный центр РАМН (ГНЦ РАМН, г. Москва)

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор

  Макаров Владимир Александрович

  доктор химических наук, профессор

  Варламов Валерий Петрович 

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лобанова Елена Георгиевна

доктор биологических наук Минеева Майя Федоровна

доктор медицинских наук, профессор Сейфулла Рошен Джафарович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Защита состоится “____” ________2010 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 г. Москва, ул. Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 г. Москва, ул. Балтийская, д.8

Автореферат разослан “______” ____________20…. г.

Ученый секретарь

диссертационного совета 

доктор медицинских наук Е.А.Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

  Тромбозы развиваются в результате дисбаланса прокоагулянтных, антикоагу­лянтных и фибринолитических процессов в системе свертывания крови, отражающего сложное взаимодействие между генетическими или приобретенными факторами риска [Segal G.V. и др. 2009; Shakoor H. и др., 2009; Colman R.W. и др., 2006]. Тромбоэмболические осложнения – распространенная медицинская проблема, связанная со значительной заболеваемостью и смертностью [Thakor A.S. и др., 2009; Cohen A.T., 2007; Frutos P.G. и др. 2007].

  Для профилактики и лечения тромбозов наряду с антиагрегантами, прямыми фибринолитиками и антагонистами витамина К используют прямые антикоагулянты (АК) [De Caterina R., 2009]. К непосредственно ингибирующим активность тромбина (Т) относят такие полипептиды для парентерального введения как лепирудин, аргатробан, бивалирудин; для перорального введения – дабигатран [Roberts LN 2009; Steffel J, Lscher TF. 2009; Alban S/ 2008]. Ингибиторы активности активированного фактора десять (Ха) - ривароксабан, апиксабан и эдоксабан - используют per os [Fonseca R.J. и др. 2008; Hoppensteadt D.A. 2008]. Препараты для парентерального введения на основе гликозаминогликанов ингибируют активность тромбина и фактора Ха активируя антитромбин (АТ) или другие серпины [Castaon M.M. и др, 2007; Hernndez-Espinosa D. И др., 2007; Qiu X и др., 2006; Richard B. И др., 2006; Gomez K. И др., 2005; Raman R. И др., 2005; Petitou M. И др., 2004]. К ним относят нативные нефракционированные гепарины (НФГ) со средней молекулярной массой (ММ) 15 кДа (получают из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней), сулодексид (выделяют из слизистой оболочки кишечника свиней; содержит 80% НФГ и 20%  сульфата дерматана), полусинтетические низкомолекулярные гепарины (НМГ) с ММ 4-7 кДа и отношением активностей против фактора Ха и тромбина (aХa/аIIа) от 1,5 до 4,5 [Atkinson HM и др, 2009; Raju NC и др., 2009; Heerspink HL и др, 2008; Henry M.L. и др. 2008; Eikelboom J.W. и др. 2002], а также синтетические пентасахариды ингибирующие активность только фактора Ха с помощью АТ - фондапаринукс (арикстра) и идрапаринукс - [De Caterina R. 2009; Steffel J и др., 2009].

  Актуальность выбранной темы связанна с тем, что:

1. Используемые в настоящее время АК прямого действия  не удовлетворяют полностью потребности практической медицины; при несомненной эффективности у НФГ, НМГ, синтетических олигосахаридов есть недостатки (зависимость от АТ , невозможность ингибировать активность Т связанного со сгустком и пр.) [Segal G.V. и др. 2009; Shakoor H. и др., 2009; Sakamoto S. и др., 2008]; прямые ингибиторы тромбина и фактора Ха действуют непродолжительно и не имеют антидотов [De Caterina R., 2009; McCullough P.A. и др., 2004].

2. В Российской Федерации  отсутствует собственное производство для наработки субстанций нефракционированных гепаринов.

3. В Российской Федерации  есть существенная сырьвая база полисахаридов растительного и животного присхождения для получения новых соединений с антикоагулянтной активностью. 

Цель и задачи работы

  Цель исследования. Анализ структуры и антикоагулянтной (АК) активности натуральных и химически модифицированных  полисахаридов растительного/животного происхождения и синтетических фукозилированных олигосахаридов, выявление потенциальных антикоагулянтов прямого действия.

  Для достижения этой цели последовательно решали следующие задачи:

  • Выявление связи между антикоагулянтной активностью и молекулярной массой, степенью сульфатирования, степенью замещения, моносахаридного состава 290 нативных и полусинтетических сульфатов полисахаридов и 5 синтетических  фукозилированных олигосахаридов.
  • Определение механизма антикоагулянтного действия сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 65 – 123 кДа и количеством серы 11,1-15,4 %.
  • Сравнение способов определений антитромбиновой активности  сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 20 – 123 кДа (количество серы 8,8 – 16,9%) в системах in vitro и ex vivo.
  • Выбор в результате анализа связи между АК активностью и молекулярной массой  оптимальных способов деполимеризации НФГ или сульфатов хитозана для получения образцов с отношением активностей аХа /aIIa в диапазоне 1,5 – 3,0.
  • Сравнение специфических антикоагулянтных активностей (aIIa и аХа) натуральных и химически модифицированных сульфатированных полисахаридов (СП) растительного происхождения (фукоиданы, сульфаты галактоманнана, целлюлозы, пектина, крахмала).
  • Определение фармакодинамических параметров наиболее перспективных образцов НМГ, сульфатов хитозана, фукоиданов, сульфата галактоманнана при введениях экспериментальным животным.
  • Сравнение антитромботической и геморрагической активностей наиболее перспективных образцов НМГ, фукоиданов, сульфатов хитозана и галактоманнана, с используемыми в клинической практике нефракционированными и низкомолекулярными гепаринами.
  • Разработка метода выбора поликатионов для нейтрализации антикоагулянтной активности и количественного определения сульфатированных полисахаридов в биологических жидкостях.
  • Выявление наиболее активного прямого ингибитора тромбина среди синтетических производных пептидов (Z-Аla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA).
  • Оценка возможности применения комбинации экспериментального концентрата антитромбина человека с нефракционированным гепарином и пара-аминобензойной кислоты в качестве антитромботических средств на модели венозного стаза у крыс.

Основные положения, выносимые на защиту

  • Исследованные СП растительного, животного и синтетического происхождения ингибируют фибриногенсвертывающую и амидолитическую активности тромбина и фактора Ха при участии плазменного ингибитора сериновых протеаз – антитромбина.
  • АК активность исследованных СП растительного, животного и синтетического происхождения зависит от молекулярной массы, степени сульфатирования, введения монофосфатных, ацетатных, карбоксиметильных, амидоэтильных групп.
  • Сульфат протамина нейтрализует амидолитическую и фибриногенсвертывающую антитромбиновую (aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активности НМГ  с молекулярной массой (ММ) 4,7 и 7,0 кДа, СХ с ММ 9,0 кДа, фукоиданов из F. evanescens и L. cichorioides в гравиметрических отношениях антидот/антикоагулянт  от 0,5 до 1,5.  Хитозаны с ММ 16 кДа (степень дезацетилирования - СД 91%) и 21 кДа (СД 61%) нейтрализуют антитромбиновую активность НФГ 15 кДа, НМГ с ММ 4,7 кДа и сульфата хитозана (СХ) с ММ 9,0 кДа.
  • Фармакодинамические (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 6,8 кДа при подкожном введении кроликам сопоставимы с ФД параметрами фраксипарина. Внутривенное введение крысам и кроликам смеси СХ (ММ 75 кДа, степень сульфатирования - СС 1,25) и НФГ в весовом соотношении 1:1, фукоиданов из водорослей F. evanescens и L. cichorioides, сульфатированного галактоманнана (СГМ, ММ 127 кДа, СС – 1,46) приводит к возрастанию АК активности плазмы и длительности действия с увеличением дозы.
  • НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 6,8 кДа в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс; геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова. Антитромботическое действие СХ с ММ 75 кДа (СС 1,25) и фукоидана из F. evanescens сопоставимо с действием НФГ при в/в введении крысам, но геморрагиче­ский эффект ниже. 100% противотромботический эффект сульфатированного галактоманнана (ММ 127 кДа) достигается в 2 раза меньшей дозой, чем фукоиданом из водоросли F. evanescens.
  • Экспериментальный концентрат АТ человека (56 – 100 ЕД/кг) в сочетании с НФГ (30-50 ЕД/кг) и пара-аминобензойная кислота (0,5; 1,5 и 3,0 мг/кг) предотваращает развитие тромбоза на модели венозного стаза у крыс при внутривенном введении.
  • Синтетические пептиды Z-Аla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA ингибируют активность тромбина; при внутривенном введении Fta-Gly-Arg-Pip* TFA крысам антикоагулянтная активность плазмы возрастает с увеличением дозы.
  • С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы можно фиксировать комплексы между СП растительного, животного, синтетического происхождения и поликатионами (сульфат протамина и хитозаны с ММ 6-21 кДа и СД – 61-93%).); размеры пиков преципитации зависят от ММ, степени сульфатирования и АК активности сульфатов полисахаридов.

Научная новизна и теоретическое значение

  Проведены широкомасштабные сравнительные исследования специфической антикоагуляной активности 290 нативных и модифицированных сульфатов полисахаридов, выделенных из растительного материала или тканей млекопитающих и членистоногих. Получены новые сведения о зависимости структура – антикоагулянтное действие для низкомолекулярных гепаринов, фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов хитозана, целлюлозы, галактоманнанов, крахмала и пектинов.

Осуществлен комплексный анализ по выявлению низкомолекулярных гепаринов с антитромботической активностью, полученных посредством целенаправленных изменений макромолекул нефракционированных гепаринов хитинолитическим, целлюлолитическим, протеолитическим ферментными комплексами, а также  лизоцимом, папаином и химотрипсином, никогда ранее для этой цели не использовавшимися.

  Установлены особенности как механизма реализации ингибирования активности тромбина и фактора Ха, так и образования комплексов между поликатионами и сульфатированными полисахаридами, с последующим выбором антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности.

  Разработаны и апробированы методологические аспекты детализации молекулярных механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов целлюлозы и галактоманнанов из травянистых и древовидных растений, сульфатов картофельного крахмала, сульфатов пектинов из травянистых растений, синтетических олигосахаридов фукоиданового типа и синтетических производных пептидов, с выявлением наиболее активных соединений и анализом фармакодинамических параметров, антитромботической и геморрагической активностей, в сравнении с используемыми в клинической практике антикоагулянтами прямого действия. Экспериментально обоснована возможность конструирования  новых лекарственных препаратов для профилактики и лечения тромбозов на основе исследованных соединений.

Разработан алгоритм адекватной оценки специфической антитромбиновой активности сульфатированных хитозанов. В результате анализа связи между молекулярной массой и антикоагулянтной активностью, с помощью направленных модификаций получены низкомолекулярные сульфаты хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (Х).

  Создана композиция, состоящая из нефракционированного гепарина и экспериментального концентрата антитромбина человека. Эта композиция и пара-аминобензойная кислота демонстрируют антитромботическую активность на модели венозного стаза у крыс.

  Практическое значение работы

Разработаны методические указания по изучению антикоагулянтной активности фармакологических веществ и включены в Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Москва, 2000).

Разработан метод выбора антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов на основе фиксирования комплексов между антикоагулянтами и поликатионами (патент на изобретение РФ “Способ обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами" № 2370271).

Ресурсная обеспеченность и патентная защищенность (6 патентов, 4 положительных решения по заявкам) являются предпосылками для получения антитромботических  лекарственных средств на основе нативных и полусинтетических сульфатированных полисахаридов растительного и животного происхождения, синтетических фукозилированных олигосахаридов и производных пептидов, а также композиции экспериментального концентрата антитромбина человека и нефракционированного гепарина и пара-аминобензойной кислоты.

       Рекомендованы для дальнейшей разработки активные соединения – для парентерального введения: низкомолекулярный гепарин с ММ 6,8 кДа ;  низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа;СС 1,26) и  нефракционированного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46); для введения per os: пара-аминобензойная кислота.

  Практическое внедрение результатов исследований

На основе патента на изобретение “Способ определения активности антитромбина” № 2195673 фирмой “Технология-Стандарт” производится набор для определения активности антитромбина в плазме.

На основе патента на изобретение “Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови” № 2221578 в лаборатории стандартизации методов контроля препаратов плазмы ГНЦ РАМН созданы (производятся НПО “Ренам”) наборы для определения способности гепаринов ингибировать фибриногенсвертывающую и амидолитическую активности фактора Ха.

  Публикации результатов исследования. Основные положения и результаты отражены в 48 публикациях; из 40 статей 2 опубликованы в зарубежных журналах, 4 представлены главами в книгах, 16 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов докторских диссертаций. По теме диссертации получено 6 патентов.

  Связь работы с научной тематикой организации.  Работа выполнена в рамках НИР ГНЦ РАМН (номера государственной регистрации НИР: 01200501366, 2005-2009 г.г. “Разработка новых средств для профилактики тромбозов и остановки кровотечений” и 01200001744, 2004-2005 г.г. “Разработка новых средств диагностики и лечения тромбозов и ДВС-синдрома”).

  Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно определяла направление исследований, осуществляла поиск перспективных, с точки зрения антикоагулянтной активности, органических соединений разной структуры и осуществляла контакты с предполагаемыми соавторами – химиками. А также, планировала ход экспериментов, самостоятельно получала результаты ко всем главам диссертации, анализировала результаты и формулировала выводы.

Апробация работы Основные результаты и положения предлагаемой работы за период с 1995 по 2004 г.г.  были представлены на  20 Всесоюзных/Всероссийских и 12 Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях; за последние 5 лет : 30, 33 Конгрессы Федерации Европейских биохимических обществ: Будапешт (2005), Афины (2008); Вторая Европейская школа по биореологии, Варна (Болгария), 2006; 14 Конференция Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции, Дрезден, 2007; II Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, 2005, Москва; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам» 2005, Москва; Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины, 2005, Киров; Международная конференция "Гемореология в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; II Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова, Ярославль 2005; Вторая Международная научно – практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская область), 2005; Третья Международная Научно-практическая Конференция МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине», Москва 2006; III съезд фармакологов России Фармакология –практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология  и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2007, Москва; III съезд фармакологов России Фармакология –практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа 2008; "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" Новосибирск 2008;  Всероссийская конференция  с международным участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению" Москва 2008;  IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009; XII научно-практическая конференция “Химия – XXI век: новые технологии, новые продукты”, Кемерово, 2009; VII Всероссийская научная конференция “Химия и медицина” Орхимед-2009, Уфа; Конференция “Химическая биология – фундаментальные проблемы бионанотехнологии”, Новосибирск, 2009.

  Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, а также 7 глав собственных результатов, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения (450 страниц); число рисунков 123, таблиц 114. Список цитированной литературы включает 788 наименований, в том числе 62 работы на русском и 726 – на иностранных языках. 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

  Выделение, анализ химического состава и структуры соединений для исследования антикоагулянтной активности проводили в следующих организациях: нефракционированные сульфаты хитозана (СХ) с ММ 20-123 кДа и степенью сульфатирования (СС) 0,62-1,86 исследовали на кафедре технологии химических волокон Московского государст­венного текстильного университета им. А.Н. Косыгина [Вихорева Г.А. и др., 1990]; низкомолекулярные  СХ с ММ 1,6 – 40 кДа и содержанием серы 6,1 -16,8% исследовали на кафедре технологии химических волокон Московского государст­венного текстильного университета им. А.Н. Косыгина и в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН [Vichoreva G.A. и др. 2004; Банникова Г.Е и др. 2002]: химически модифицированные хитозаны, низкомолекулярные гепарины с  ММ 1,6 – 9,0 кДа и хитозаны с ММ 4-21 кДа и степенью дезацетилирования 61-93 % - в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН [Ильина А.А. и др. 2007; Банникова Г.Е и др. 2002]. Выделение, изучение химического состава и структуры фукоиданов из бурых морских водорослей  Охотского моря Fucus  evanescens, Laminaria cichorioides, Laminaria japonica, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae,  Costaria Costata, а также деполимеризацию фукоиданазой, десульфатирование, освобождение от белков и полифенолов проводили в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток) [Kusaykin M. и др., 2008; Шевченко Н.М. и др., 2007; Zvyagintseva T.N. и др, 2005]. Ферментативное расщепление экстрактом из гепатопанкреаса камчатского краба фукоидана из водоросли Laminaria saccharina с целью получения фрагментов полисахарида с меньшей ММ, сульфатирование альгиновой кислоты из бурой водоросли Macrocystis purifera и создание наноструктур на основе сульфата альгиноовой кислоты осуществляли в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН [Ильина А.В. и др., 2009]; фракционирование фукоидана из водоросли Laminaria saccharina методом ионообменной хроматографии с целью получения фракций, обогащенных фукозой и сульфатными группами проводили в лаборатории химии гликоньюгатов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН [Cumashi A. и др., 2007]. Сульфатированные низкомолекулярные галактоманнаны (СГМ) из семян  Cyamopsis Tetragonoloba (L.) Taub. с ММ 12,6 – 245,6 кДа, гуаровую камедь из Cyampsis tetragonlobus (L.) Taub. , галеговую камедь Galega orientalis Lam, софоровую камедь  из семян софоры японской (Styphnolobium japonicum), камедь Локуст бин (Locust Bean), полисахаридные ионные комплексы, компонентами которых служили галактозилированный хитозан, N-сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан в разных весовых пропорциях (табл. 6.4.1. в приложении), карбоксиметилированные галактоманнаны с ММ 141 кДа и содержанием групп SO4-2  - 48,8 – 62,8 % и наноструктуры на основе ГМ из семян Cyamopsis Tetragonoloba (L.) Taub. полу­чали в лаборатории инженерии ферментов Центра “Биоинженерия” РАН и в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН [Ильина А.В. и др., 2005,2006,2007; Местечкина Н.М. и др., 2008]. Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование целлюлозы и крахмала осуществляли в Институте химии Коми научного центра УрО РАН (Сыктывкар) [Торлопов М.А. и др., 2006,2007,2008]. Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование сульфатов пектина из травянистых растений осуществляли в отделе молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар) [Оводов Ю.С. и др. 2008]. Сульфатированную целлюлозу из древесины пихты, осины, соломы пшеницы и цианидины из коры березы, ели, сосны, лиственницы, кедра получали в лаборатории каталитической химии угля и биомассы института химии и химической технологии СО РАН (Красноярск) и на кафедре органической химии Сибирского федерального университета (Красноярск) [Кузнецова С.А. и др. 2006, 2007, 2008,2009]. Фукозилированные олигосахариды синтезировали в лаборатории гликоконьюгатов Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН [Устюжанина Н. и др, 2007; Крылов В. и др. 2008,2009]. Производные пептидов: Z-Аla-Ala-Arg-Рip*ТFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip*ТФА; (Ac-Trp-Arg-Pip*ТФА синтезировали в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика. Выделение, изучение химического состава и структуры экспериментального концентрата антитромбина человека осуществляли в  лаборатории фракционирования белков плазмы ГНЦ РАМН [Ажигирова М.А. и др. 2006].

  Выделение кофактора гепарина II (ГК) из плазмы крови человека осуществляли по [Sheehan J.P. и др., 1994]. Электрофоретический анализ ГК проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по [Tollefsen D.M., 1997].

Для получения плазмы человека, лишенной антитромбина (АТ) использовали метод [Hoogendoorn H. и др., 1980]. Нефракционированный гепарин (153 aIIa ЕД/мг) связывали с  CNBr-активированной сефароза 4В (Pharmacia Fine Chemicals) по [Miller-Andresson M. и др. 1974].

  Комплексы бычьего АТ с сульфатом хитозана (СХ, aIIa активность - 20 ЕД/мг) получали инкубацией растворов АТ ( Sigma, 5 мг/мл)  и СХ (7,6 мг/мл) в молярном соотношении 1:1 в 0,01М трис-НCl буфере pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, в течение 15 мин при 20 С [Башков Г.В., 1987]. Содержание белка в комплексах определяли спектрофотометрически, принимая А1%280 (1 см) для АТ быка = 6,0 [Chuang Y.J. и др., 2001]. Концентрацию СХ определяли спектрофотометрически при длине волны  220 нм [Bernkop-Schnurch A., 2000] и по окрашиванию азуром [Mori T. и др., 1998].

  Ракетный биоспецифичный электрофорез [Drozd N.N. и др., 2001] комплексов АК с поликатионами (сульфат протамина и хитозаны с ММ 4-21 кДа)  проводили в слое 1% агарозы в 0,1М натрий фосфатном буфере рН 6,8. Пластины с высохшим гелем сканировали, переводили изображение в формат JPG и оценивали высоту и площадь пиков преципитации с помощью программы PhotoM 1,31.

  Турбидиметрическое титрование [Мазов М.Ю. и др., 1983] антикоагулянтов (0,25 мг/мл) проводили сульфатом протамина (“Spark” или “Sigma”) и хитозанами с ММ 4-21 кДа (0,25 мг/мл).

  Ингибирование фибриногенсвертывающей и амидолитической активности тромбина посредством антитромбина, кофактора гепарина II и образцов СХ: влияние СХ на каталитическую активность тромбина (Т) по отношению к фибриногену определяли по [Kiphuth I.C. и др., 2008]. Влияние АК на ингибирующую активность АТ по отношению к Т оценивали по [Machovich R. И др., 1986 и определяли константы псевдо-первого порядка ингибирования тромбина посредством АТ и ГК  в присутствии АК. АТ выделяли по [Башков Г.В. и др. , 1989]. Константы ингибирования второго порядка взаимодействия АТ-Т рассчитывали (согласно модели [Griffith M.J., 1982]) по скорости ингибирования 1 нМ Т (Sigma) 10-тью нМ АТ (Sigma) в 0,1 М триэтаноламин-HCl буфере рН 7,8 содержащем 0,1 М NaCl и 0,1 % полиэтиленгликоль 6000 при 37 С в присутствии 0,2 мкМ хромогенного субстрата S 2238 [Scully M.F. и др., 1989]. 

Определение антикоагулянтной активности соединений in vitro: влияние АК на внутренний, внешний и общий пути свертывания крови оценивали используя общепринятые тесты - время свертывания крови (ВСК) [Lee R.I., 1913], время рекальцификации (ВР) [Kennedy C.C. и др., 1973], активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) [Stuart R.K. и др., 1971], протромбиновое время (ПВ) [Rosenberg R.D., 1977], тромбиновое время (ТВ) [Teien A.N., 1975], тромбин-Ca время (Т-Са) [Колмен Р.У., 1988]. Для определений применяли наборы отечественных (Ренам, Технология стандарт) и зарубежных (Sigma, Biopool, Roche) фирм. Специфическую АК активность образцов in vitro определяли по ингибированию фибриногенсвертывающей и амидолитической активностям тромбина (антитромбиновая, анти- фактор IIa, aIIa активность) [Coyne E., 1981; Teien A.N. и др. 1977] и фактора Ха (активность против фактора Ха, анти-фактор Ха, аХа активность) [Teien A.N. и др., 1976; Yin E.T. и др., 1973] в плазме человека или экспериментальных животных c использованием Международных стандартов НФГ или НМГ. Определение aIIa активности с использованием теста АЧТВ проводили по [Coyne E. И др., 1981], с использованием ингибирования амидолитической активности тромбина – по [Teien A.N. и др., 1977; Yin E.T. и др., 1973]. Определение аХа активности по ингибированию фибриногенсвертывающей активности фактора Ха проводили по [Yin E.T., 1973], по ингибированию амидолитической активности фактора Ха - по [Rezaie A.R. , 2006; Teien A.N. и др., 1976]. IC50 рассчитывали по [Motulsky H.J., 2003].

  Нейтрализацию антикоагулянтной активности in vitro исследуемых СП поликатионами проводили в тестах по ингибированию фибриногенсвертывающей или амидолитической активностей тромбина и фактора Ха [Racanelli A. И др., 1989; Torjemanea L. И др., 2008].

Анализ ингибирования генерации тромбина (ГТ) проводили по [Sollier C.B. и др., 2004]. Под кривой ГТ находили площадь (AUC [Motulsky H.J., 2003]) и рассчитывали процент ингибирования: [AUC(ГТ) контроль – AUC(ГТ) с НМГ]/AUC(ГТ) контроль [Lormeau J.C.,1993].

  Агрегацию тромбоцитов исследовали по [Born G.V., 1962]. Число тромбоцитов определяли по поглощению 0,4 мл богатой тромбоцитами плазмы кроликов или человека при λ= 800 нм [Walkowiak B. И др., 1989] и на счетчике форменных элементов фирмы “Coultronix” (Франция).

Антикоагулянтная активность образцов in vivo. Экспериментальные исследования выполнены на 327 кроликах Шиншилла обоего пола массой 2,5-4,5 кг и на 720 крысах-самцах Wistar массой 250-400 г, полученных из  питомника РАМН "Столбовая", находившихся на стандартной диете в  боксированных  помещениях  с  соблюдением  всех  правил  и  международных  рекомендаций  Европейской  конвенции  по  защите  позвоночных животных,  используемых в  экспериментальных  работах (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental  and Other  Scientific Purposes. Ctrasbourg, 1986). Разброс животных в группе по массе тела не превышал ± 10%.  Животные  контрольных  и  опытных  групп  одного  пола,  возраста, получены  из  питомника  одновременно. Фармакологическую активность исследуемых образцов определяли при в/в или п/к введениях кроликам или крысам. Внутривенное введение АК кроликам осуществляли в краевую вену уха, крысам - в левую яремную вену; подкожное введение кроликам проводили в складку со стороны спины. В качестве отрицательного контроля использовали введение физиологического раствора. В качестве положительного контроля применяли растворы НФГ или фраксипарина. Кровь у кроликов отбирали методом капель из краевой вены противоположного уха, кровь у крыс забирали из противоположной яремной вены в пластиковую пробирку с 0,11 М раствором C6H5O7Na  в соотношении 9:1. Для получения бедной тромбоцитами плазмы пробирки откручивали при 1400g 20 мин. Анти-IIa [Teien A.N., 1975] и aXa [Yin E.T. и др., 1973] активности плазмы крыс оценивали в разные интервалы времени после введения. Кровь для исследования отбирали до введения и через 5-300 мин после в/в введения или через 60, 120, 180, 240, 300 мин и 24, 48 час после п/к введения. Для расчета фармакокинетических параметров данные представляли в виде полулогарифмических графиков выведения исследуемого вещества с использованием затем электронного ресурса SummitPK.com. 

  Антитромбиновую активность образцов СХ в системе ex vivo рассчитывали на базе кривых выведения АК после в/в введения кроли­кам. В основу методики положено математическое описание действия НФГ, предложенное ранее [De Swart C. И др., 1982].

Активность плазминогена [Markwardt F., Klocking H.P., 1977] в плазме кроликов и крыс после введения антикоагулянтов определяли с использованием набора  НПО “Ренам” Реахром-Плазминоген. Активность протеина С [Yang L. и др., 2002] в плазме кроликов и крыс после введения антикоагулянтов определяли с использованием набора НПО “Ренам” Реахром-Протеин-С.

  Исследование антитромботической активности проводили на модели венозного стаза у крыс по [Wessler S. и др.,1959]. Эфективность антитромботической активности оценивали: 1. по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены (в баллах); пересчет системы баллов на процент предотвращения тромбоза проводили по [Holmer E. и др., 1986]; 2. по весу влажного тромба на аналитических весах. 3. по концентрации белка в гомогенате тромба [Кочетков Г.А., 1980]. Геморрагическую активность АК определяли на крысах самцах Wistar весом 200-250 г [Hobbelen P.M. и др., 1987]. 

  Оценка значимости различий двух средних арифметических рядов экспериментальных данных проводили по t критерию Стьюдента. Для определения связи между двумя признаками в рядах экспериментальных данных использовали корреляционный анализ, для определения достоверности вывода о влиянии фактора на результативный признак F использовали дисперсионный анализ [Дюк В., 1997]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Biostat, SSPS, StagraphicsPlus.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Влияние аминополисахаридов - низкомолекулярных гепаринов (НМГ) и сульфатированных хитозанов (СХ) на свертывание крови человека и экспериментальных животных in vitro и in vivo.. 

  1. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью ферментативного гидролиза нефракционированных гепаринов.

  Для выбора перспективносго НМГ анализировали АК активность гепаринов, полученных деполимеризацией НФГ разных фирм производителей, из тканей крупного рогатого скота (КРС) или свиней, с использованием хитинолитического, протеолитического, целлюлолитического ферментных комплексов (ФК) или протеолитических ферментов. Критериями отбора перспективных образцов НМГ служили: аХа активность не менее 70 ЕД/мг и отношение активностей аХа/aIIa более 1. На рис.1. приведена АК активность некоторых (получены деполимеризацией НФГ впервые использованным с этой целью хитинолитическим ФК продуцируемым штаммом Streptomyces kurssanovii) НМГ. Антитромбиновая активность НМГ с ММ 1,6- 7,4 кДа уменьшается в 3-25 раз (в сравнении с НФГ) со снижением ММ (r = 0,75-0,97; p<0,05). Активность против активированного фактора Х достигает  170-190 ЕД/мг, отношение активностей аХа/aIIa - более 4. Величина аХа активности полученных НМГ возрастает с увеличением ММ при гидролизе НФГ из слизистой оболочки кишечника  свиней (r=0,88); в значительно меньшей степени подобная связь прослеживается для НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (r=0,35). Максимальное отношение активностей аХа/aIIa у НМГ, полученных деполимеризацией НФГ их легких КРС в 1,5 раза больше, чем у гепаринов, полученных деполимеризацией НФГ из слизистой оболочки кишечника  свиней. Однако в диапазоне ММ 1,6-2,7 кДа аХа активность НМГ из слизистой кишечника свиней больше, чем у НФГ; то есть, на АК активность НМГ (в указаннных пределах ММ) влияет тип ткани НФГ. Количество и состояние (иммобилизованный или в растворе) ФК, а также время действия и температурный режим играют роль при получении антикоагулянтов с высокой активностью.

 

Рис. 1 Антикоагулянтная активность некоторых низкомолекулярных гепаринов (НМГ), полученных гидролизом нефракционированных гепаринов (НФГ) хитинолитическим ферментным комплексом (ФК) Streptomyces kurssanovii (содержит четыре хитиназы, хитозаназу, N-ацетил-D-глюкозоаминидазу и протеазу; иммобилизован на силохроме); по оси Х – молекулярная масса, кДа; * - (p<0,05- 0,001) достоверность различий с антикоагулянтной активностью НФГ.

 

 

Рис. 2 Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (ОАО "Синтез”) ФК протеаза С (на основе штамма Acremonium chrysogenum;  в состав входят сериновая протеаза I, сериновая протеаза II, нейтральная протеаза, карбоксипептидаза, аминопептидаза ) иммобилизованным на поливиниловом спирте; * - (p<0,05- 0,001) достоверность различий с АК активностью НФГ.

При снижении ММ НМГ до 3,4-5,8 кДа, полученных гидролизом НФГ из легких крупного рогатого скота протеолитическим ФК протеаза С, достоверно снижается аIIa активность, аХа активность возрастает и максимум составляет 208±9 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa достигает 1,5-2,5 раза (рис. 2).

  Анти Ха активность НМГ, полученных гидролизом НФГ папаином составляет  – 140-220 ЕД/мг (рис.3). Отношение активностей при гидролизе иммобилизованными ферментами достигает 1,3. Однако при гидролизе ферментами в растворе отношение активностей аХа/aIIa возрастает до 1,7-2,5 за счет снижения аIIa активности.

  Отношение активностей аХа/aIIa НМГ полученных гидролизом  НФГ из легких КРС химотрипсином и целловиридином [ФК карбогидраз целлюлолитического действия штамма Trichoderma reesei (viride)] составляет 1,3, хотя максимальная аХа достигает 160-180 ЕД/мг. НМГ с ММ 6,8 и 9,3 кДа, полученные гидролизом НФГ лизоцимом, продемонстрировали отношения активностей 1,3. Некоторые авторы в работах последних лет рассматривают преимущества НМГ с оптимальными ММ в диапазоне 9 - 12 кДа, так называемые гепарины со средней ММ (СМГ). Геморрагическая активность СМГ несколько выше, чем у НМГ, но их АК активность успешнее нейтрализуется, что увеличивает безопасность таких лекарственных средств [Alban S. и др., 2002].

Рис. 3 Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких крупного рогатого скота (ОАО "Белмедпрепарат”) папаином; по оси Х – молекулярная масса, кДа; * - (p<0,05- 0,001) достоверность различий с АК активностью НФГ.

 

  Таким образом, для получения НМГ с отношением активностей аХа/aIIa больше 1 (в основном, за счет снижения антитромбиновой активности) можно использовать для гидролиза НФГ (из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней) неспецифические ферментные комплексы и ферменты. Способность ингибировать активированный фактор Х, у некотрых фракций НМГ, в сравнении с исходными НФГ достоверно увеличивается на  8 – 13 %. Это может свидетельствовать о том, что при гидролизе НФГ использованными неспецифическими ФК и ферментами не затрагиваются последовательности сахаридов, ответственные за связь с плазменным ингибитором сериновых протеаз – антитромбином [Bisio A. и др., 2009]. Снижение антитромбиновой активности НМГ с уменьшением ММ закономерно [Atkinson H.M. и др. 2009].

  Для определения возможности комплексообразования между полученными НМГ (гидролиза НФГ ФК Streptomyces kurssanovii или протеаза С) и поликатионами [хитозан (СД 61-85% и ММ 4-21 кДа) и сульфат протамина (ПСТ)] использовали биоспецифичный электрофорез и турбидиметрическое титрование. Добавляя факции НМГ в лунки геля агарозы с поликатионами наблюдаем пики преципитации комплексов полианион-поликатион, появляющиеся в результате электрофореза [Weeke B., 1973]. На рис. 4 и 5 показаны сканированные изображения пиков преципитации после электрофореза. Размеры пиков преципитации  (высота и площадь) тесно коррелируют с ММ и специфическими АК активностями НМГ (rмм= 0,6-0,93; raIIa=0,55-0,92; rаХа= 0,73- 0,93), что предполагает применение этого метода для выбора наиболее активных НМГ, при анализе большого количества образцов. Структурные характеристики поликатионов-хитозанов влияют на размеры пиков преципитации. Так, с увеличением ММ при СД 85% и с увеличением СД при ММ 21 кДа увеличивается высота пиков преципитации. При анализе результатов турбидиметрического титрования показано, что с увеличение степени дезацетилирования хитозанов увеличивается сила положительной связи с ММ исследуемых НМГ. Для появления комплексов на 1 мг НМГ требуется  0,8 – 1,4 мг ПСТ и хитозанов. Определение связи между ММ, антикоагулянтной активностью НМГ, структурными характеристиками хитозанов и размерами пиков преципитации позволило выбрать наиболее оптимальные поликатионы. 

  Известно, что ПСТ частично нейтрализует АК активность НМГ, используемых в клинической практике [Crowther M.A. и др., 2002]. Однако ПСТ полностью нейтрализует аХа и aIIa активности НМГ с ММ 4,7; 5,1 и 7,4 кДа (получены гидролизом НФГ ФК S. kurssanovii) в исследованиях с применением амидолитических тестов; гравиметрическое отношение антидот : антикоагулянт= (0,7 -1):1.

  Но при нейтрализации ингибирования НМГ с ММ 7,0 кДа [гидролиз НФГ лизоцимом) фибриногенсвертывающей активности тромбина (гравиметрическое отношение антидот:антикоагулянт= (0,5 -1):1] остаточная aIIa активность составила 20%, по отношению к контролю, что совпало с данными по нейтрализации антитромбиновой активности НФГ.

Хитозан  с ММ 21 кДа и СД 61% нейтрализует ингибирование НМГ с ММ 7,0 кДа (гидролиз НФГ лизоцимом) фибриногенсвертывающей активности тромбина. Антитромбиновая активнотсь НМГ-7,0 снижается более, чем в 1,5 раза, при весовом отношении поликатион: полианион = 0,3. Хитозаны с ММ 16 и 21 кДа (степень дезацетилирования 91 и 61%) нейтрализуют на 25-100% ингибирование НМГ с ММ 2,7 – 7,4 кДа и НФГ амидолитической активности тромбина. Таким образом, aIIa и аХа активности некоторых полученных НМГ можно нейтрализовать ПСТ и хитозанами с ММ 16 и 21 кДа в амидолитических и коагулологических тестах. Нейтрализация осуществляется за счет появления комплексов поликатион – полианион.

 

A

Б

1а 1б 1в 2а 2б 2в 3а3б3в 4а 4б 4в 5а 5б 5в

Рис. 4. Электрофорез гепаринов в агарозном геле с сульфатом протамина (А) и хитозаном (В, ММ 16 кДа, СД=-91%); количество АК в лунках: a-1,25 мкг, b-2,5 мкг; номер лунки: 1- НФГ 15 кДа; 2- НМГ 5,1 кДа; 3- НМГ 7,4 кДа; 4- 4,7 кДа; 5- 4,0 кДа; 6-2,7 кДа.

Рис. 5. Электрофорез гепаринов с хитозанами в геле агарозы (А - хитозан-HCl, СД 85%, ММ 10 кДа; Б - хитозан-HCl,СД 93%, ММ 7,4 кДа); номер лунки: 1- НФГ 14 кДа; 2- НМГ 7,4 кДа; 3- 5,1 кДа; 4- 4,7 кДа; 5 – 4,0 кДа; концентрация АК в лунках: а - 0,25; б - 0,5; в – 1 мг/мл.

 

На основе патента (№ 2221578 от 24.10.2002 г. “Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови”), полученного нами в соавторстве с сотрудниками лаборатории стандартизации методов контроля препаратов плазмы ГНЦ РАМН разработан набор “РеаХром-гепарин” (НПО “Ренам”) позволяющий определять аХа активность плазмы при введениях НМГ экспериментальным животным и человеку, а также оценивать  удельную аХа активность разрабатываемых НМГ и других соединений. Достоверность определений аХа активности с помощью набора “РеаХром-гепарин” НПО Ренам, в сравнении с определениями набором Berichrom heparin (Dade Behring), подтверждается статистическими параметрами, обычно используемыми в исследованиях такого рода.

  Фармакодинамические (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7 кДа и 5,4 кДа (НМГ-4,7; НМГ-5,4 при в/в введении кроликам в дозах 0,3 – 3,0 мг/кг и при п/к введении в дозах 3 – 30 мг/кг ) и НМГ-6,8 (при п/к введении в дозах 70 – 300 аХа ЕД/мг) по аIIa, аХа активностям и времени свертывания плазмы в тестах ВСК и АЧТВ соответствуют ФД параметрам коммерческого НМГ эноксапарина [Alban S. и др., 2002] и совпадают с ФД параметрами фраксипарина, который использовали для сравнения. Сравнение отношений аХа/aIIa активностей плазмы кроликов после п/к введения исследуемых НМГ с отношением специфических активностей показало увеличение первых до 0,87-1,74 (для НМГ-4,7), 0,98-10,46 (для НМГ-5,4) и 1,25-3,44 (для НМГ-7,0). Подобное может свидетельствовать о возможном влиянии этих АК на выброс из эндотелия сосудов ингибитора внешнего пути свертывания [Harenberg J. И др., 2002]; известно, что уровень этого ингибитора в плазме повышается в 2-4 раза при п/к или в/в введении НМГ [Demirkan A. и др., 2002].

Рис. 6. Антитромботическая активность низкомолекулярных гепаринов

НМГ-4,7 (aIIa - 68±8 ЕД/мг; аХа - 155±23 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa – 2,3), НМГ- 5,4 (aIIa - 110±11 ЕД/мг; аХа - 168±19 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa – 1,53) и НМГ-6,8 (aIIa - 115±13 ЕД/мг; аХа - 152±10 ЕД/мг; отношение активностей аХа/aIIa – 1,32)  в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс (рис. 6). Такие показатели как: форма тромба в баллах, вес влажного тромба, содержание белка при дозах 39 - 390 ЕД/кг у НМГ-4,7 и НМГ- 5,4, сопоставимы с такими же показателями для фраксипарина. По всей вероятности, НМГ-4,7 и НМГ-5,4 обладают сравнимой противотромботической активностью в силу того, что НМГ-4,7 имеет меньшую величину специфических активностей, но большее соотношение активностей аХа/aIIa, а НМГ-5,4 – несмотря на меньшее отношение активностей аХа/aIIa демонстрирует большую величину специфических активностей.  Геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова.

  Таким образом, деполимеризация НФГ из легких КРС или слизистой оболочки тонкого кишечника свиней посредством неспецифических гидролаз, приводит к получению образцов НМГ с высокими аХа активностями до 150 -200 ЕД/мг,  что  сравнимо с аХа активностью коммерческих НМГ. За снижением ММ НМГ следует снижение aIIa активности и увеличение отношения активностей аХа/ аIIa до 4. Использование биоспецифичного электрофореза, способа фиксирования комплексов между гепаринами и сульфатом протамина/хитозанами (СД 61-85% и ММ 6-21 кДа), облегчает выбор эффективного антидота.  Специфическую АК активность полученных НМГ можно успешно нейтрализовать с помощью сульфата протамина. Обнаружен образец хитозана, который частично (на 42%) нейтрализует аIIa активность НМГ (в весовом соотношении 3:1). С увеличением дозы НМГ-4,7 (гидролиз S. kurss.), НМГ-5,4 (гидролиз протеазой С) и НМГ-6,8 (гидролиз лизоцимом) увеличиваются аIIa и аХа активности плазмы кроликов при в/в и п/к введениях. При п/к введении полученных НМГ кроликам период полувыведения сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина в одинаковых дозах.  Антитромботическая и геморрагическая активности НМГ-4,7 (гидролиз НФГ S. kurss.) и НМГ-5,4 (гидролиз НФГ протеазой С) сравнимы с таковыми у фраксипарина. В 2008 г. осуществили первый этап  токсикологических испытаний НМГ-6,8 по программе Фармкомитета в лаборатории лекарственной токсикологии НИИЭК ФГУ «РКНПК» Росздрава. Социально-экономическая значимость результатов бесспорна, так как НМГ-6,8 может быть в 3-8 раз дешевле существующих на рынке Российской Федерации импортируемых НМГ. 

  2. Влияние сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 20-123 кДа на свертывающую систему крови в экспериментах in vitro и  in vivo.

В связи с тем, что сырьевая база НМГ снижается, так как мировые производители переходят на источник НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней, а также отсутствие отечественных производителей НФГ, повысился интерес к АК средствам на основе сульфатированных хитозанов. Хитозан - производное природного биополимера - хитина, второго (после целлюлозы) по распространенности в природе органического вещества, запасы которого возобновляются и практически неисчерпаемы. Мы  исследовали АК активность образцов сульфатов хитозана с ММ 20-123 кДа и степенью сульфатирования 0,62-1,86.  Наибольшие aIIa активности (35-40 ЕД/мг), определенные по Фармакопейной статье с плазмой овец in vitro, показали образцы с ММ 55 до 82 кДа и количеством серы 15-17%. Активности против фактора Ха не обнаружено. Не обнаружено и какой-либо связи между АК активностью и ММ в представленном диапазоне (r = - 0,3; p< 0,05). В тоже время, отмечено снижение aIIa активности с уменьшением содержания серы (r = 0,6; p<0,05).

  Расчет аIIa активности сульфатов хитозана in vivo проводили по графикам кривых выведения. При этом, допускали, что кинетика элиминации образцов при в/в введении  нелинейна, а также линейное приближение зависимости антикоагулянтного эффекта от дозы СХ. Антитромбиновую активность выражали по отношению к рабочему стандарту, прокалиброванному в единицах ак­тивности Международного стандарта НФГ. Максимальные aIIa активности СХ составили 42-52 ЕДмг. При сравнении aIIa активностей, рассчитанных по Фармакопейной статье, и при в/в введении кроликам отмечали несовпадение величин спе­цифических активностей (рис. 7). Подобное может найти объяснение в разной чувствительности плазмы овец и кроликов для некотрых образцов, что может быть связано с различиями в структурной формуле исследуемых веществ. 

Рис.7. Сопоставление антитромбиновой активности образцов СХ, измеренной по Фармакопейной статье (in vitro), и при внутривенном введении кроликам (in vivo)

С целью подтверждения адекватности определения аIIa активно­сти в системе in vivo проводили сравнительный анализ фармакокинетических (ФК) па­раметров, полученных на основании математической модели и измеренных с помощью определения количества СХ при проведении биоспецифичного электрофореза с хлоридом цетилпиридиния [Drozd N. и др., 2002]. Коэффициенты корреляции для периодов полувыведения соответствовали в среднем 0,98, а для констант элиминации (- 0,97). Подобное свидетельствует о высокой достоверности результатов, полученных с помощью линейной ФК модели, а, следовательно, достоверно и сниже­ние антитромбиновой активности для некотрых образцов в системе in vivo.

  Образцы СХ с ММ 20-123 кДа и СС 0,62-1,86 обнаружили аIIa активность 0,5-40,0 ЕД/мг (in vitro) и 0,5—52 ЕД/мг (in vivo). Анти-IIa актив­ность образцов СХ зависит от ММ и СС. Наиболее активные и длительно действующие продукты имеют СС не ниже 1,6 и ММ 61 – 75 кДа. Эти параметры следует принять за оптимум, к которому необходимо стремиться при отработке технологии получения аналогов НФГ на основе СХ.

  НФГ образует с антитромбином (АТ) эквимолярный стехиометрический комплекс [Sugahara K. И до., 2003]. Нами показано, что СХ с ММ 75 кДа (содержание серы 13,7%) и АТ  объединяются в эквимолярном комплексе. На этом же образце СХ исследовали механизм АК действия. Исходя из определенного сходства структурной организации и специфического действия, оказываемого НФГ и СХ на ина­ктивацию свертывания крови по внутреннему и внешнему путям, исследовали влияние последнего на аIIa активность плазмы в условиях реакций псевдо-первого порядка. Показано, что СХ  в конечной концентрации 0,2 ЕД/мл катализирует инактивацию свертывающей актив­ности плазмы плазменными ингибиторами с константой ингибирования псевдо­-первого порядка 0,24 мин-1. Для достижения одинаковой скорости инактивации свертывающей активности плазмы плазменными ингибиторами в присут­ствии НФГ и СХ, последнего требуется в 2,5 раза больше.

  СХ ускоряет инактивацию тромбина АТ и кофактора гепарина II (ГК II) в реакциях с фибриногеном. Константы ингибирования псевдо-первого порядка свертывающей активности тромбина АТ в присутствии НФГ (0,03 ЕД/мл) или СХ (0,032 ЕД/мл) сопоставимы и равны 0,43 мин-1 и 0,46 мин-1, соответственно. Константы ингибирования свер­тывающей активности тромбина ГК II в присутствии НФГ (2 ЕД/мл) или СХ (2 ЕД/мл) составили 0,31 мин-1 и 0,28 мин-1, соответ­ственно. Для достижения 50% ингибирования свертывающей активности тромбина ГК II в присутствии СХ последнего требовалось в 100 раз больше, чем для блокирования ак­тивности фермента антитромбином.

  С увеличением концентрации СХ снижается не только каталитическая активность Т по отношению к основному субстрату - фибриногену, но и  амидолитическая активность Т (способность расщеплять синтетический хромогенный субстрат, с отделением п-нитроанилида и развитием желтого окрашивания). Исследовали влияние образцов СХ с ММ 45, 75 и 82 кДа на кинетику взаимодействия ме­жду АТ и Т. Для анализа отобрали СХ с близкими значениями аIIa активности по Фармакопейной статье (27, 35 и 37 ЕД/мг) и различными по ФД кривым (13, 12 и 52 ЕД/мг). Более сульфатированный образец СХ с ММ 82 кДа (количество серы 15,9%) показал большую аIIa активность, рассчитанную в системе in vivo. Результаты свидетельствуют о корреляции межу аIIa активностью образцов СХ in vivo и аффинностью к АТ и Т. Константы диссоциации между АТ и Т в присутствии  образцов СХ составили 16-190 нМ и не коррелировали с aIIa активностью, измеренной в системе in vitro по Фармакопейной статье. Таким образом, установлено, что для адекватной оценки специфической аIIa активности образов СХ необходимо использовать для расчета анализ линеаризированных фармакодинмических кривых.

Применяя плазму лишенную АТ можно определить необходимость наличия этого серпина для осуществления АК активности ГАГ [Hoogendoorn H. И др., 1980]. Полученная нами плазма человека, лишенная АТ содержала 4±1% функционально активного АТ (в нормальной плазме - 97±5%).  Уровень АТ определяли с помощью набора фирмы Технология-стандарт, в разработке которого мы принимали непосредственное участие; получен патент на изобретение № 2195673 от 06.12.2000 г. “Способ определения активности антитромбина III”. При сравнении влияния НФГ и образцов СХ с ММ 82 кДа и ММ 123 кДа на  время свертывания плазмы без АТ в тестах АЧТВ, ТВ и ГепаКлот не отмечали достоверных изменений с увеличением концентрации АК. При анализе ингибирования амидолитической активности Т, также не наблюдали изменений с увеличение концентрации АК в плазме без АТ.

При использовании модели венозного стаза у крыс (с активацией внутреннего пути свертывания) наблюда­ли антитромботическую активность СХ с ММ 75 кДа и содержанием серы 13,7% (Дрозд Н.Н., 1991). При в/в введении СХ в единицах антитромбиновой активности, геморрагиче­ский эффект ниже, в сравнении с эффектом НФГ, что можно объяснить незначительным влиянием на тромбоциты и низким агрегационным воздействием СХ при активации аденозиндифосфорной кислотой. ПСТ нейтрализует аIIa активность СХ в гравиметрическом соотношении 1:1.

  Хиторин – механическая смесь СХ (ММ 75 кДа,  СС 1,25) и НФГ в весовом соотношении 1:1. Антитромбиновая активность хиторина составляет 80 ЕД/мг, аХа – 83 ЕД/мг. Хиторин можно использовать в/в в дозе 4 мг/кг, что в единицах активности составляет 320 aIIa ЕД/мг и 332 aXa ЕД/мг. Период полувыведения равен 120 мин, полностью исчезает из кровяного русла через 4 час. Для быстрой нейтрализации АК эффекта в организме можно использовать ПСТ, с которым составляющие компоненты хиторина создают эквимолярные комплексы. При в/в введении хиторина число тромбоцитов снижается в меньшей степени, чем при введении НФГ в такой же дозе. Достоверного снижения числа тромбоцитов в течение 6 час после введения, в сравнении с контролем, не наблюдали. По сравнению с НФГ, хиторин проявляет меньшую геморрагическую активность, почти в два раза. Антитромботическое (АТБ) действие на модели венозного стаза у крыс сопоставимо с действием НФГ. Таким образом, в/в введение экспериментальным животным хиторина вместо НФГ приводит к снижению геморрагического эффекта с сохранением АК и АТБ активностей. Курс лечения хиторином может стоить дешевле, чем курс лечения НФГ, так как стоимость 1 мг СХ в 10-70 раз меньше, чем стоимость 1 мг НФГ.

3. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатов хитозана

  Исследовали АК активность низкомолекулярных сульфатов хитозана (НМСХ) с ММ 1,6 – 25,0 кДа, полученных несколькими независимыми методами. Антитромбиновая активность НМСХ с ММ 4,5-25 кДа [получены гидролизом высокомолекулярных СХ с ММ 75,  82 и 125 кДа ФК Streptomyces kurssanovii (шифр ХФ)] некоторых фракций образцов с ММ 82 и 125 кДа (рис.8) незначительно возрастает. Однако, для СХ с ММ 75 кДа такого эффекта не наблюдали. Какой-либо связи aIIa активности с ММ не отмечено. Активность НМСХ против фактора Ха  составила 0-3 ЕД/мг, СХ – 0 ЕД/мг. Для получения образцов НМСХ с большей АК активностью использовали СХ с ММ 25 кДа (исходные СХ с ММ 75 кДа – СХ К2, 82 кДа – СХ К1 и 125 кДа – СХ К3) и буфер с рН 6,0 (рис. 9). У НМСХ полученных из СХ с ММ 75 и 125 кДа аХа активность увеличивается с уменьшением ММ. Анти-фактор Ха активность полученных НМСХ выше в 1,5-2,0 раза, чем у НМСХ, полученных непосредственно их СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа.

Рис. 8. Антитромбиновая активность образцов СХ с ММ 4,5 – 125 кДа. Сульфатировали хитозан краба (Биопрогресс, Россия). После гидролиза (pH 4,5) СХ с ММ 75,  82 и 125 кДа ФК  Streptomyces kurs.  получали фракции  НМСХ с ММ 4,5; 6; 8,5; 15 и 25 кДа; * - (p<0,05) достоверность различий с aIIa активностью СХ с ММ 75,  82 и 125 кДа.

Рис. 9. Антикоагулянтная активность образцов СХ с ММ 1,6 – 15 кДа. 

Для получения НМСХ с ММ 1,6; 2,5; 3,7; 5,3 и 15 кДа (c большей аХа активностью)  из СХ с ММ 25 кДа ферментативный гидролиз осуществляли при pH 6,0; * - (p<0,05) достоверность различий с АК активностью СХ с ММ 25 кДа.

 

  Анти-фактор Ха активность до 50 -120 ЕД/мг появилась у СХ полученных сульфатированием низкомолекулярных образцов (рис. 10). Максимальная аХа активность НМСХ с ММ 25 – 70 кДа (шифр ХЭ), полученных с помощью экструзионного дезацетилирования высокомолекулярных СХ составила 52 – 61 ЕД/мг, отношение активностей аХа/ aIIa = 1,4 – 22,0 (рис. 10 Б). При сульфатировании низкомолекулярных СХ, полученных кислотным гидролизом хитозана получили образцы НМСХ с ММ 8-25 кДа (шифр ХК), аХа активности составили 51 – 131 ЕД/мг, отношение активностей аХа/ aIIa = 7 – 21 (рис. 10 В). При сульфатировании низкомолекулярных образцов, полученных ферментативным гидролизом Streptomyces kurssanovii, получили образец (ММ 29 кДа, получен из СХ-гидрохлорида) с высокими аХа активностью (68 ± 5 ЕД/мг) и отношением активностей аХа/ aIIa (5,2) (рис. 10 В). Образцы ММ 1,6-25 кДа (получены из СХ с ММ 50 или 300 кДа, рис. 10 А) показали невысокую антикоагулянтную активность.

Рис. 10. Антикоагулянтная активность сульфатированных НМСХ, полученных кислотным (ХК) / ферментным (ХФ) гидролизами  или  экструзионным дезацетилированием (ХЭ).

Сульфатирование низкомолекулярных образцов осуществляли на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета; ось Х – молекулярная масса, кДа;  ось Y – антикоагулянтная активность, ЕД/мг

  СХ с ММ  30 кДа, полученный из исходного хитозана, как СХ с ММ 25 кДа и 35 кДа, полученные из ХЭ-45 кДа, демонструют незначительное отношение активностей  с аХа/aIIa, что  коррелирует с относительно высокой средней ММ образцов и с низким содержанием низкомолекулярных фракций, а также подтверждается высокими аIIa активностями (37-85 ЕД/мг) и фактом, что и нефракционированный сульфат хитозана из ХЭ-45  с ММ 25  кДа и его фракция с ММ 15 кДа характеризуются более низкой aIIa активностью,  соответственно более высоким отношением активностей аХа/aIIa. Очевидно, что ММ 15 кДа не достаточно низка, для того чтобы аХа активность возрастала. Даже понижение ММ СХ до 11 кДа (получен ферментативным гидролизом хитозана) не обеспечивает достижение высокой аХа активности. И только два образца СХ со средней ММ 8-10 кДа (получены из хитозана ХК), и, очевидно, более обогащенные низкомолекулярными фракциями, демонстрируют довольно высокую аХа активность, в 4-5 раз превышающую аIIa активность. С уменьшением ММ образцов СХ аХа активность возрастает. Коэффициент корреляции между аХа активностью и ММ составляет r =-0,64. Изменение содержания серы, в пределах 15,7-16,2 %, фактически не влияет на активность (r = 0,03). Для аIIа активности обнаружена  положительная корреляция с ММ (r = 0,69) и содержанием серы (r = 0,38). При сульфатировании хитозанов происходит существенное снижение степени полимеризации полимеров – в 2-4 раза, что обеспечивает получение СХ, ММ которых находится на уровне таковых коммерческих образцов НФГ (10-20 кД), но превышает ММ НМГ. Анализ связи между структурными элементами исследуемых аминогликанов и АК активностью позволил заключить, что: 1. Данные относительно зависимости аIIа активности образцов СХ  от ММ противоречивы (от умеренной степени зависимости до отсутствия таковой), по всей вероятности, в силу различия способов приготовления образцов СХ. Однако это не помешало всем исследованным образцам СХ, независимо от способа приготовления, продемонстрировать умеренно-сильную связь аХа активности с ММ. 2. С увеличением количества серы аIIа активность образцов СХ возрастает, при этом связь не сильная. Анти - Ха активность исследованных СХ либо возрастает с увеличение количества серы, либо не зависит от содержания серы.

Химически модифицированные полисахариды привлекают большой интерес, так как, изменяя структуру можно добиться увеличения АК активности. При карбоксиметилировании СХ с ММ 56 кДа антитромбиновая активность увеличивается в 10 раз, аХа – в 6 раз.

Рис 11. Высота пиков преципитации между СХ с аХа активностью 2-112 ЕД/мг (ММ 9-40 кДа, количество серы 12,0-16,8%, aIIa активность 13-58 ЕД/мг) и сульфатом протамина

  С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы продемонстрировано наличие комплексов между СХ с ММ 9-40 кДа (количество серы 12,0-16,8%, aIIa активность 13-58 ЕД/мг, аХа активность 2-112 ЕД/мг) и сульфатом протамина (ПСТ). С увеличением аХа активности высота пиков преципитации возрастает (r = 0,75 - 0,92, рис. 11), тесная отрицательная корреляция существует между высотой (h) и площадью (S) пиков преципитации, с одной стороны, и  количеством серы (rS/h,250=-0,99; р<0,05) и aIIa активностью (raIIa/S,500=-0,86; р<0,05), с другой. Умеренная отрицательная связь от r -0,41 до -0,74 (р<0,05) отмечена между ММ и размерами пиков преципитации.

  Замечено, что контуры пиков преципитации у СХ с ММ 10 кДа наиболее четкие и выраженные, а сами пики более светлые, в отличие от более темно окрашенных с менее выраженными границами пиков преципитации СХ с большими ММ. Подобное может свидетельствовать о меньшей подвижности комплексов СП с СХ с ММ больше 20 кД.

Рис. 12 Коэффициенты корреляции (p<0,05) между молекулярной массой хитозанов и высотой пиков преципитации с сульфатами хитозана (СХ)

Рис. 13. Коэффициенты корреляции (p<0,05) между степенью дезацетилирования хитозанов и высотой пиков преципитации с СХ

А. Влияние поликатионов (конечная концентрация 0,03 мкг/мл) на ингибирование антикоагулянтами (К; 0,03 мкг/мл) амидолитической активности тромбина

Б. Влияние поликатионов (конечная концентрация 0,03 мкг/мл) на ингибирования антикоагулянтами (К; 0,03 мкг/мл) амидолитической активности фактора Ха

Рис. 14. Нейтрализация хитозанами (Х) с ММ 16 кДа и 21 кДа и сульфатом протамина (ПСТ) ингибирования антикоагулянтами амидолитической активности тромбина и фактора Ха (без антикоагулянтов А 405/мин=150±0,03 для рис. 14 А и 0,200±0,028 для рис. 14 Б); * - (p<0.05) достоверность различий с показаниями К.

Комплексообразование СХ с ММ 9-40 кДа с хитозанами [ММ 6-21 кДа,  степень дезацетилирования (СД) 61-93%] также показано при биоспецифичном электрофорезе в геле агарозы. Все образцы хитозанов демонстрируют наличие пиков преципитации с сульфатами хитозана. Сравнимый с ПСТ эффект показали образцы хитозана c ММ не ниже 6 кДа и СД 60-85%.

В диапазоне количества серы в СХ 14,6 – 16,8 % коэффициенты корреляции между высотой пиков преципитации и ММ поликатионов-хитозанов возрастают до 0,47-0,58 (рис.12). С увеличением степени дезацетилирования поликатионов-хитозанов высота пиков преципитации для СХ с ММ 9-30 кДа снижается [r = (-0,59) – (-0,77] (рис. 13).

Ингибирование амидолитической активности Т посредством СХ с ММ 9 кДа нейтрализовали с помощью ПСТ и хитозана с ММ 16 и СД 91%. В меньшей степени нейтрализует аIIa активность хитозан с ММ 21 кДа и СД 61% (рис. 14 А). ПСТ полностью снимает ингибирование амидолитической активности фактора Ха у СХ и только на 17% у НФГ и НМГ (рис. 14 Б).

Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых морских водорослей, травянистых и древовидных высших растений на свертывание крови человека и экспериментальных животных in vitro и in vivo.

  Учитывая случаи появления заболеваний обусловленных прионами, которые могут сопровождать лекарственный материал из тканей млекопитающих [Daz-Nido J. и др., 2002], внимание исследователей привлекают полисахариды из водорослей, травянистых и древовидных растений [Farias W.R.L. и др., 2002; Matsubara K, 2004; Ciancia M.и др., 2007].

  1. Антикоагулянтная активность фукоиданов и сульфатированной альгиновой кислоты из бурых морских водорослей in vitro и in vivo.

  В последнее время возрос интерес к нанообъектам различной природы.  Это связано с тем, что многие физические, химические и биологические свойства наночастиц значительно отличаются от аналогичных свойств у макроскопических объектов. Антитромбиновая активность сульфатированной альгиновой кислоты из бурой водоросли Macrocystis pyrifera (ММ 48-186 кДа)  составляет 76 ЕД/мг (у альгиновой кислоты АК активнотси нет). Антитромбиновая активность сульфатированной альгиновой кислоты в наноструктурах (70-100 нм) достоверно увеличивается в 1,3 раза (рис. 15), аХа – в 2 раза при использованииив качестве осадителя CaCl2 (рис. 16).

Рис. 15. Антитромбиновая активность сульфата альгиновой кислоты в растворе (1) и в виде наночастиц [2- осадитель CaCl2, 3- осадитель Ba(NO3)2], измеренная в тесте АЧТВ

Рис. 16. Анти-фактор Ха активность сульфата альгиновой кислоты в растворе (1) и в виде наночастиц [2- осадитель CaCl2, 3- осадитель Ba(NO3)2], измеренная в тесте РеаКлот

  В отличие от альгиновой кислоты из бурых водорослей нативные фукоиданы сульфатированы. Фукоиданы, выделенные из водорослей Fucus evanescens, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Costaria Costata, Laminaria saccharina с ММ 20 – 80 кДа влияют на внешний и общий пути свертывания крови удлинняя время появления фибринового сгустка в тестах тромбинового и протромбинового времени;  ингибируют активность тромбина (aIIa активность достигает 1,9 – 53,2 ЕД/мг) и фактора Ха (аХа активность – 6,1 – 31,4 ЕД/мг) свертывающей системы крови. Различия в ингибировании сериновых протеаз связаны с тем, что моносахаридный состав исследованных фукоиданов, количество серы и ММ различаются, а также присутствием разных типов гликозидных связей в молекулах полисахаридов. Так, АК активность возрастает с увеличением количества серы, снижением количества ксилозы и увеличением количесвта фукозы. Почти у всех фукоиданов, за некоторым исключением, в амидолитических определениях (в “чистой системе” с антитромбином и тромбином) снижается на один – два порядка активность в сравнении с коагулологическими определениями, это свидетельствует о том, что свою активность фукоиданы осуществляют, в основном, посредством  не антитромбина, а других серпинов.

  Дезацетилирование фукоидана из водоросли Fucus evanescens приводит к изменению способности фукоидана ингибировать активность тромбина и фактора Ха (по всей вероятности, ацетаные группы необходимы для проявления АК активности), тогда как после очистки его от белка и полифенолов АК активность снижается. Гидролиз фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens и L. cichorioides иммобилизованным целлюлолитическим ФК целловиридин привел к получению фракций с большим отношением активностей аХа/aIIa (до 2,3) и меньшей АК активностью, которая коррелирует с величиной пиков преципитации с ПСТ при биоспецифичном электрофорезе.  С целью деполимеризации фукоидана из бурых водорослей F. evanescens использовали гепариназу и получили фракции с ММ 8-18 кДа, у которых способность ингибировать амидолитическую активность Т посредством АТ исчезает. При сохранении ингибирования фибриногенсвертывающей активности тромбина это может свидетельствовать о вероятности участия в коагуляции кофактора гепарина II или о разрушении сайта молекулы полисахарида, ответственного за связь с антитромбином.

  Фукоидан из водоросли F. evanescens в конечных концентрациях 0,01-5,00 мг/мл не способстует агрегации тромбоцитов человека; в конечных концентрациях 0,1-0,5 мг/мл достоверно снижает в 1,5-1,8 раз АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

  Ферментативная деполимеризация фукоидана из водорослей  Laminaria saccharina (аХа = 9,6±0,9 ЕД/мг) при обработке экстрактом из гепатопанкреаса камчатского краба приводит к получению образа с достоверно большей в 1,7 раз ингибиторной активностью по отношению к фактору Ха, антитромбиновая активность не увеличивается. Анализ двойных эффективных концентраций в коагулологических и амидолитических тестах показал, что для осуществления аIIa активности  необходим АТ. Для осуществления аХа активность требуются другие серпины. Значительную роль в проявлении АК активности фукоидана из водорослей  L. saccharina играют остатки фукозы и сульфат, что определено в результате анионообменной хроматографии. В зависимости от состава исследованных фракций фукоиданов для проявления aIIa активности необходимы либо только АТ (для фукоидана с наибольшим количеством серы и фукозных остатков), либо еще и другие серпины. Снижение аХа активности в 5-10 раз при определениях в тестах с АТ (“чистая система”) свидетельствует о необходимости других серпинов. 

   

Рис. 17. Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов сульфатом протамина в тесте АЧТВ; * - (p<0.05) достоверность различий с данными ПСТ 0 мкг/мл при снижении антитромбиновой активности

 

  Показана электрофоретическая подвижность комплексов исследованных фукоиданов (нативных; дезацетилированных; фракций с меньшей ММ, полученных ферментативным гидролизм нативных) в агарозном геле с сульфатом протамина. Фукоиданы со специфическими АК активностями менее 5 ЕД/мг не образуют комплексы с ПСТ. Величина пиков преципитации сильно положительно коррелирует с антитромбиновой и аХа активностями и слабо - с количеством фукозы. С увеличением ксилозы размеры пиков преципитации уменьшаются. Чем больше концентрация фукоидана, тем больше размеры пиков преципитации. Зоны преципитации гидролизованного образца фукоидана имеют характерные для низкомолекулярных сульфатированных полисахаридов размытые контуры.

  Сульфат протамина нейтрализует аIIа активность фукоиданов из Fucus evanescens (рис. 17 А) и L. cichorioides (рис. 17 Б) в тесте АЧТВ. Гравиметрическое отношение антидот/антикоагулянт для фукоидана из F. evanescens составляет 1, для фукоидана из  L. cichorioides находится в диапазоне 0,67-1,35 (сравнение с НФГ: 0,75-1,49). Известно, что 1 мг ПСТ нейтрализует 100 ЕД (0,53-0,83 мг) НФГ [Fourtounas C, 2008]. Учитывая большую в 5-6 раз аIIa активность НФГ, можно утверждать, что механизм нейтрализации АК активности исследованных фукоиданов сульфатом протамина отличается от такого же механизма у НФГ.

 

Рис. 18. Антитромботический эффект фукоидана из F. evanescens; * - (p<0,05) достоверность различий с показаниями в контроле (0 мг/кг)

Рис. 19. Геморрагический эффект фукоидана из F. evanescens; * - (p<0,05) достоверность различий с показаниями для НФГ

  Внутривенное введение фукоиданов из водорослей F. evanescens (крысам в дозах 1,3 и 5 мг/кг; кроликам в дозах 5 и 10 мг/кг)  и L. cichorioides (крысам в дозах 1,3 и 5 мг/кг) приводит к возрастанию АК активности и длительности действия с увеличением дозы.  Наблюдали достаточную для терапевтического эффекта aIIa активность плазмы крыс до 2,5 и 3,0 ЕД/мл. Анти-фактор Ха активность плазмы крыс при введении фукоидана из L. cichorioides достигает 1 ЕД/мл. Несмотря на большее соотношение активностей аХа/aIIa плазмы крыс для фукоидана из F. evanescens, сила и длительность АК эффекта фукоидана из L. cichorioides больше. Это можно объяснить различием в специфических аIIa активностях образцов (у фукоидана из L. cichorioides aIIa активность в два раза выше, чем у фукоидана из F. evanescens), при практически одинаковых ингибиторных активностях по отношению к фактору Ха.

  По весу влажного тромба, полное ингибирование роста тромба на модели венозного стаза у крыс наблюдали при дозах фукоидана из F. evanescens 7 и 10 мг/кг (рис. 18). Геморрагический эффект фукоидана из F. evanescens выражен в меньшей степени, чем у НФГ (рис. 19).

  Наиболее перспективными для углубленного фармакологического исследования являются образцы F. evanescens, U. pinnatifida, L. gurjanovae.

2. Антикоагулянтная активность сульфатированных галактоманнанов и арабиногалактана in vitro и in vivo.

  Одним из доступных видов растительных полисахаридов считается арабиногалактан, который содержится в древесине лиственницы сибирской в количестве до 20 % массы. Антитромбиновая активность равная 2 ЕД/мг появляется при сульфатировании арабиногалактана из древесины лиственницы до степени сульфатирования 4 %. Известно, что АК активность сульфатированных полисахаридов увеличивается с возрастанием количества серы [Li B. и др., 2009; Costa L.S. и др., 2009].

  Специфические АК активности сульфатированных галактоманнанов (СГМ) из семян бобового травянистого растения Cyampsis tetragonlobus с ММ от 54,2 до 245,6 кДа достигают 76 – 87 aIIa ЕД/мг и 6,8 – 12,6 аХа ЕД/м и не зависят от ММ (рис. 20).

Рис. 20. Антикоагулянтная активность сульфатированных фракций галактоманнана гуар из Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub.

  При в/в введении СГМ с ММ 127 кДа (aIIa активность - 35,8 ± 1,8 ЕД/мг; аХа - 6,6 ±  0,5 ЕД/мг) время свертывания плазмы крыс в тесте АЧТВ удлиняется с увеличением дозы от 1 до 3 мг/кг. Активность плазмы против тромбина в результате введения СГМ возрастает с увеличением дозы. Продолжительность эффекта достигает 180 – 300 мин. То есть, СГМ с ММ 127 кДа и степенью сульфатирования 1,46 при невысокой специфической аIIa и совсем незначительной аХа активностях вызывает высокую АК активность плазмы при внутривенном введении крысам. Противотромботическую активность в 100% наблюдали при дозе 3 мг/кг. Для достижения одинакового АТБ эффекта СГМ потребуется в 1,8 раза больше, чем НФГ (рис. 21).

 

Рис. 21. Антитромботическая активность СГМ (ГМ-HSO3Na) с ММ 127 кДа на модели венозного тромбоза у крыс; достоверность различий с показаниями в контроле (доза 0 мг/кг) при введении 1мл физиологического раствора: * - p< 0,05- p< 0,001; n=10.

  При проведении биоспецифичного электрофореза наблюдали перемещение комплексов между исследуемыми образцами СГМ и ПСТ. Характер комплексов преципитации ПСТ/СГМ и ПСТ/НФГ несколько отличается в силу структурных различий полианионов. Высота и площадь пиков преципитации возрастает с увеличением  концентрации как  НФГ, так и СГМ.

  Агрегация тромбоцитов человека, вызванная добавлением АДФ достоверно снижается в 1,9 - 6,8 раз при инкубации с СГМ (ММ 127 кДа) в концентрациях 0,1 – 0,5 мкг/мл (в сравнении с контролем 67,1±4,1 %).

Антикоагулянтная активность образцов СГМ из травянистых и древовидных растений семейства бобовых [Гуар из Cyampsis tetragonlobus (L.) Taub. - однолетнее травянистое растение из семейства бобовых;  Галега Galega orientalis Lam - Козлятник восточный – многолетнее травянистое растение из семейства бобовых; софора  из семян софоры японской (Styphnolobium japonicum - листопадное дерево семейства бобовых и ГМ Локуст бин (Locust Bean) из – смолы рожкового дерева (Ceratoniae fructus)] возрастает с увеличением отношения Man:Gal. АК активность значительно снижается (в 1,34 раза по aIIa активности и в 90 раз по аХа активности) после ферментативного гидролиза СГМ Гуар из однолетнего травянистого растения семейства бобовых Cyampsis tetragonlobus (L.) Taub. целлюлолитическим ферментным комплексом.

Сульфатирование ГМ и карбоксиметилированных ГМ приводит к увеличению аIIa активности в 50 раз и появлению незначительной аХа активности (22 ЕД/мг) в коагулологических исследованиях. При анализе ингибирования амидолитических активностей Т и фактора Ха в присутствии АТ сульфатированный карбоксиметилированный ГМ показывает увеличение aIIa активности в 370 раз, а СГМ -  в 76 раз. Различия показаний aIIa активностей, измеренных по ингибированию способности гидролизовать фибриноген или хромогенный субстрат, для одних и тех же образцов можно объяснить несколько отличающимся механизмом действия НФГ и сульфатированных ГМ. Так как, для активных образцов наблюдали достоверность различий по эффективным концентрациям в тесте АЧТВ. Кроме того, различие в aIIа активности (в амидолитическом тесте) почти в 5 раз, может свидетельствовать о том, что для сульфатированного КМГМ достаточно АТ, а для СГМ может быть необходимы другой серпин.

Для использования per os ряд авторов получили коньюгат НФГ с натрий N-[8(2-гидроксибензоил)амино] каприлатом, микрокапсулы на основе НМГ тинзапарина и комплекс на основе НМГ эноксапарина и дендримеров полиамидоамина [Jiao Y. и др., 2002; Lamprecht A. и др., 2007; Bai S. и др., 2007]. Полисахаридные ионные комплексы (ПИК), содержащие галактозилированный хитозан, СГМ  и  сукцинил-хитозан в разных весовых пропорциях демонстрируют in vitro АК активность. В ПИК, содержащих СГМ со степенью сульфатирования 1,46 с увеличением доли ГМ от 50 до 67% аIIa активность возрастает в 1,6 раз, в сравнении с СГМ. Добавление к СГМ  галактозилированного хитозана и сукцинил-хитозана не изменяет активности против фактора Ха. Отсутствие в ПИК сукцинил - хитозана приводит к возрастанию двойных эффективных концентраций и снижению aIIa и аХа активностей.  Использование в ионных комплексах СГМ с меньшей степенью сульфатирования – 0,60 приводит к увеличению двойных эффективных концентраций в коагулологических тестах и к снижению специфической АК активности. 

На основе СГМ получены наночастицы с АК активностью. Антитромбиновая активность наночастиц на основе СГМ возрастает с увеличением ММ. Анти-фактор IIа активность наночастиц достоверно возрастает в 1,4 – 2,1 раза (в сравнении с исходным), анти-фактор Ха активность наночастиц  c ММ 177 кДа достоверно увеличивается, в сравнении с исходным образцом в 2,9 раза. Отношение активностей аХа/aIIa наночастиц возрастает до 0,34; отношение активностей аХа/aIIa сульфатированного ГМ  составило 0,23.

  3. Антикоагулянтная активность in vitro химически модифицированной целлюлозы, крахмала, пектина и цианидинов.

С уменьшением ММ до 10-30 кДа антитромбиновая активность сульфатов целлюлозы хлопка (СЦ: ММ 100 кДа СС 1,7 и  ММ 10 – 50 кДа СС 1,00 – 2,50) возрастает достигая величины 144 ЕД/мг (аХа – 30 ЕД/мг). Сульфаты карбоксиметил целлюлозы (СКМЦ: ММ 30 – 50 кДа и СС 3.0), амидоэтил целлюлозы (СКЭЦ: ММ, кДа/ CC/CЗ по амидным группам: 120/1,37/0,3 и 150/0,8/0,3) и альдегидцеллюлозы (СДАЦ: ММ, кДа/ CC/CЗ по альдегидным группам: 100/0,3/0,075 и 150/0,6/0,5) демонстрируют антитромбиновую активность 4-30 ЕД/мг (аХа = 0,14 – 27,00 ЕД/мг). Столь незначительные показатели АК активности могут быть  связаны со слабым зарядом карбоксиметильных / амидоэтильных групп и пространственным фактором. Альдегидные группы сильно искажают конформацию целлюлозной цепи. Антитромбиновая активность сульфатов монофосфатов целлюлозы (СФЦ: ММ, кДа/ CC/CЗ по монофосфатным группам: 40/1,21/0,75;40/1,06/1,73; 75/1,2/1,02; 75/1,34/1,22) достигает 38 – 80 ЕД/мг (аХа 10-30 ЕД/мг). С увеличением СС и снижением ММ aIIa и аХа активности сульфатов целлюлозы и карбоксиметил целлюлозы возрастают. При анализе амидолитической активности Т и фактор Ха соединениями группы СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ отмечаем, что у подавляющей части соединений aIIa активность по гепарину в сравнении с коагулологическим методом снижается в 3-20 раз (вероятно, кроме АТ необходим другой серпин); в двух случаях не меняется (достаточно только антитромбина). Таким образом, у соединений внутри групп СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ можно наблюдать разный механизм ингибирования активности Т. Способность ингибировать амидолитическую активность фактора Ха соединениями модифицированной целлюлозы (групп СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ) значительно возрастает только для трех образцов; вероятно, плазменные факторы влияют на механизм активации этими полисахаридами активности антитромбина. При анализе амидолитической активности Т и фактор Ха  группой СФЦ отмечаем для всех случаев падение aIIa активности в 5-50 раз, аХа – в 3-40 раз.  Кроме четкой закономерности в ряду этих веществ, можно заметить, что для осуществления АК активности в плазме этой группе необходим/мы кроме АТ другой/гие серпин/ы.

Образцы целлюлозы из древесины осины и соломы пшеницы не влияют на внешний путь свертывания крови человека, о чем свидетельствует отсутствие удлинения времен свертывания плазмы в тесте ПВ. Сульфатированная метилцеллюлоза из древесины осины демонстрирует крайне незначительную аIIa активность (0,064±0,021 ЕД/мг). Антитромбиновая активность микрокристаллической целлюлозы из древесины осины составляет 51,0±5,2 ЕД/мг, аХа активность в 3,6 раза меньше. Антитромбиновая активность наиболее активных образцов микрокристаллической сульфатированной целлюлозы из соломы пшеницы (количеством серы 6%) и древесины осины (количество серы 3,6%)  достигает 119 и 134 ЕД/мг (аХа активность = 30 – 40 ЕД/мг). С увеличением количества серы АК активность образцов возрастает. Вещества с такой aIIa активностью могут претендовать на статус АК средства  для  лечения и профилактики тромбозов  после токсикологических и клинических испытаний.

  Сульфаты пектина из бадана толстолистного (Bergeniacrassifolia (L.) Fritsch.), сабельника болотного (Comarum palustre L.), ряски малой (Lemna minor L.), рдеста плавающего (Potamogeton natans), пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) удлиняют время свертывания плазмы в тесте ТВ с увеличение концентрации, влияя на конечный этап свертывания крови; наибольшей aIIa активностью 32,7±4,6 ЕД/мг обладает сульфат пектина из ряски малой. Влияние на внешний путь свертывания показали только сульфаты пектина из ряски малой и сабельника болотного. В тестах АЧТВ и РеаКлот сульфат пектина из ряски малой продемонстрировал aIIa активность 53,1±9,89 ЕД/мг и аХа - 3,4±0,55 ЕД/мг, АК активность остальных образцов в 30-75 раз меньшие. Снижение аХа активности, определенной амидолитическим методом в 10 раз, в сравнении с определенной в коагулологическом методе, свидетельствует о том, что для проявления анти-Ха активности образцу сульфата пектина из ряски малой, кроме АТ, необходим другой серпин.  С увеличением степени сульфатирования некоторых пектинов появляется аХа активность, а аIIa активность возрастает в 100 – 250 раз.

  С увеличением степени замещения по сульфатным группам (СЗ) образцов крахмала картофеля (СК) от 0,37 до 2,50 аIIa активность возрастает. Наибольшую aIIa активность (70±7 ЕД/мг) демонстрирует образец с СЗ 1,67 (рис. 22). При степени замещения 1,90 время свертывания плазмы человека в тесте ПВ (при концентрации образцов СК 0,059 мг/мл) – наибольшее. Активность против фактора Ха возрастает с увеличением степени сульфатирования. Судя по коэффициентам корреляции между количеством серы в образцах СК и показателями АК активности, aIIa и аХа активности необходимо определять по двойным эффективным концентрациям, так как чувствительность используемых методов определений для стандарта НФГ и СК различна. Исследованные СК  ингибируют скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата. Ни один из исследованных образцов в диапазоне концентраций  0,048 – 480,000 мкг/мл не снижает амидолитическую активность Т в отсутствии АТ. Образец с С3=1 в концентрации 5 мкг/мл наоборот увеличивает амидолитическую активность Т в 10 раз. В диапазоне концентраций 0,2 – 4,0 мкг/мл исследованные образцы снижают скорость гидролиза Т хромогенного субстрата в присутствии АТ. Образец с СЗ=1 в меньшей степени, в сравнении с другими образцами, снижает амидолитическую активность Т в присутствии АТ.

Рис. 22. Влияние степени замещения по сульфатным группам образцов картофельного крахмала на антикоагулянтную активность.

  Препарат пикногенол (Pycnogenol) с антиоксидантными и антиагрегантными свойствами получают экстрагированием горячей водой коры сосны приморской (Pinus maritima). Пикногенол состоит из процианидинов разной длины - от димеров до гептамеров [Packer D. и др., 1999]. Цианидины, выделенные из коры сосны, ели, лиственницы и берёзы имеют незначительную АК активность; антитромбиновая активность достигает 0,02 - 4,40 ЕД/мг, аХа активность есть только у цианидинов из коры ели, кедра, березы и составляет всего 0,11 – 0,52 ЕД/мг. Для такого рода препаратов большей АК активности и не требуется.

  Антикоагулянтная активность синтетических олигосахаридов и пептидов.

  Определена связь между молекулярной массой, степенью сульфатирования и АК активностью синтетических тетра-, гекса-  и октасахаридов, полученных в результате направленного синтеза крупных фрагментов фукоиданов заданного строения. Анализировали аIIa и аХа активности олигосахаридов, полученных двумя разными способами.

  В одном случае октасахариды с ММ 2044 Да и 2148 Да имели соотношение Fuc:SO3Na = 1:1, аIIa активность составила 0,08 – 0,19 Ед/мг, активности против фактора Ха не наблюдали. Антитромбиновая активность полученных другим способом, полностью сульфатированных олигосахаридов с ММ: тетрасахарид – 1563 Да (Fuc:SO3Na = 1,0:2,1); гексасахарид – 2264 Да (Fuc:SO3Na = 1.00:2,17); октасахарид – 2964 Да (Fuc:SO3Na = 1,00:2,13) составила 9,8 – 29,4 Ед/мг, анти-фактор Ха активность - в диапазоне 0,34 – 5,3 ЕД/мг.

  То есть, увеличение степени сульфатирования синтетических тетра-, гекса- и октасахаридов приводит к возрастанию аIIa активности, появлению аХа активности и увеличению способности удлинять время свертывания плазмы по внешнему пути. Антикоагулянтная активность увеличивается с увеличением молекулярной массы (Рис. 23).

Рис. 23. Антикоагулянтная активность полностью сульфатированных синтетических олигосахаридов фукоиданового типа

  С увеличением концентрации синтетических производных пептидов [1. ZАla-Ala-Arg-Рip* TFA (ММ 632 Да); 2. Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr (ММ 601 Да); 3. Ac-Trp-Arg-Mf*HCl (ММ 508 Да); 4. Fta-Gly-Arg-Pip* TFA (ММ 560 Да); 5. (Ac-Trp-Arg-Pip* TFA (ММ 584 Да)] в тестах АЧТВ и ТВ время свертывания плазмы крови человека возрастает, амидолитическая активность Т снижается, что свидетельствует о наличии у исследованных пептидов АК активности, связанной с ингибирование активности Т. Наибольшей ингибиторной активностью по отношетнию к Т обладает образец 4 (IC 50 = 281±15µМ). При в/в введении самого активного синтетического производного пептида самцам крыс линии Wistar время свертывания плазмы крови животных в тестах АЧТВ и ТВ удлиняется с увеличением дозы. Минимальная эффективная доза, при которой время свертывания плазмы крыс удлиняется в два раза в сравнении с контролем в тестах АЧТВ и ТВ составляет 3 мг/кг.

Антитромботическая активность экспериментального концентрата антитромбина человека и пара-аминобензойной кислоты (ПАБК). 

  Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата АТ человека и НФГ [НФГ (Bauer) 40 ЕД/кг и АТ в растворе 56 ЕД/кг, НФГ (Bauer) 30 ЕД/кг и АТ высушенный лиофильно 100 ЕД/кг, НФГ (ООО “Белмедпрепарат”) 50 или 60 ЕД/кг и АТ высушенный лиофильно 100 или 55 ЕД/кг (рис. 24)], которые позволяют достигнуть 100% предотвращения роста тромба при в/в введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

  Анализ АК активности показал, что пара-аминобензойная кислота (ПАБК, ММ 137 Да) обладает aIIa и аХа активностями (7,00 ± 0,32 ЕД/мг и 16,70 ±0,12 ЕД/мг, соответственно). Такой важный параметр, определяющий антитромботический (АТБ) потенциал препаратов, как отношение активности аХа к aIIa, у ПАБК равен 2,4. ПАБК, обладая свойствами АК прямого действия в системе in vitro и, демонстрируя не только аIIa активность, но и ингибируя активированный фактор X, при в/в введении крысам в дозе 1,5 мг/кг, проявляет АТБ эффект через 1,5 часа после введения, с пиком активности на третьем часу и окончанием действия на пятом часу (рис. 25). 

Рис. 24. Влияние совместного внутривенного введения лиофильно высушенного концентрата АТ человека и НФГ ОАО “Белмедпрепарат” на развитие моделированного венозного тромбоза у крыс самцов Wistar,  через 15 мин экспозиции антикоагулянтов.

Рис. 25. Антитромботическая активность ПАБК при внутривенном введении крысам

Необходимо отметить одинаковую АТБ активность плазмы крыс после введения широко используемого НМГ фраксипарина в дозе 40 аХа ЕД/кг и ПАБК в дозе 25 аХа ЕД/кг (1,5 мг/кг). То есть, ПАБК несмотря на низкую удельную аХа активность, оказывает равный, но отдаленный во времени, в сравнении с фраксипарином, АТБ эффект. Какого-либо воздействия ПАБК в концентрации 1,5 мг/кг на число тромбоцитов и их агрегационную активность индуцированну АДФ или адреналином не обнаружено. При введении ПАБК per os крысам наблюдается увеличение aIIa активности плазмы при увеличении дозы (6 - 18 мг/кг). Продолжительность эффекта составляет 5-7 час. Способность ПАБК при введении per os крысам увеличивать aIIa активности плазмы может явиться дополнительным аргументом для применения этого вещества в качестве профилактического АТБ средства при гомоцистеинемии, так как синтез последнего зависит от фолиевой кислоты, а фолаты синтезируются de novo из птеринов и ПАБК.

  Таким образом, экспериментально обоснована возможность конструирования  новых лекарственных препаратов на основе низкомолекулярных гепаринов, фукоиданов из бурых водорослей Охотского моря, сульфатированных производных хитозана, целлюлозы, пектина, крахмала, галактоманнанов для профилактики и лечения тромбозов. Исследованные СП животного и растительного происхождения, натуральные или химически модифицированные имеют АК активность, которая осуществляется в основном посредством АТ. Анализ связи между структурой (степень сульфатирования, наличие разных функциональных групп, молекулярная масса) и аIIa / аХа активностями, установление механизма АК действия СП имеет фундаментальное значение для проектирования новых лекарственных средств на основе СП разного происхождения.  При анализе АК активности in vitro и in vivo СП разного происхождения выделили образцы со специфическими аIIa и аХа активностями более 70 ЕД/мг (за исключением фукоидана), что необходимо для противотромботического лекарственного средства. Для парентерального введения: низкомолекулярный гепарин с ММ 7,0 кДа; низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа; СС 1,26) и  нефракционированного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46).  Для введения per os :  пара-аминобензойная кислота.

  Для окончательной оценки возможности выбора оптимального для клинического применения антикоагулянта необходимо изучить острую и хроническую токсичность указанных соединений, их побочные эффекты, связанные с влиянием на различные органы и системы и экономическую целесообразность производства. Эти данные совместно с результатами наших исследований могут лечь в основу создания новых отечественных антикоагулянтов прямого действия.

ВЫВОДЫ

1. Для получения низкомолекулярных гепаринов с высоким противотромботическим потенциалом требуется использовать ферментные комплексы из культуры Streptomycess kurssanovii и препарата протеаза С, либо протеолитический фермент - лизоцим при гидролизе нефракционированных гепаринов. С уменьшением молекулярной массы гепаринов до 1,6 – 9,3 кДа антитромбиновая активность снижается в 2-10 раз. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных низкомолекулярных гепаринов и фраксипарина при подкожном введении экспериментальным животным совпадают.

2. Ингибирование активности тромбина сульфатами хитозана (ММ 20-123 кДа) осуществляется с участием плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина, в больших концентрациях – с участием кофактора гепарина II. Антитромбиновая активность сульфатов хитозана возрастает с увеличением степени сульфатирования в диапазоне молекулярных масс от 56 до 82 кДа. Для создания эффективного антитромботического средства с меньшей, чем у нефракционированного гепарина, геморрагической активностью необходимо комбинировать сульфат хитозана (ММ 75 кДа,  степень сульфатирования 1,25) с нефракционированным гепарином в весовом соотношении 1:1. Для получения сульфатов хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (аХа активность) следует использовать кислотный гидролиз высокомолекулярных сульфатов хитозана. 

3. Исследованные фукоиданы из бурых водорослей в большей степени ингибируют активность тромбина преимущественно антитромбином. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных фукоиданов и нефракционированного гепарина при внутривенном введении экспериментальным животным сравнимы. 100% антитромботический эффект появляется при внутривенном введении крысам фукоидана из F. evanescens в дозе 7 мг/кг, геморрагический эффект этого фукоидана выражен в меньшей степени, чем у нефракциоинрованного гепарина. Для получения фракций фукоиданов из водорослей F. еvanescens и  L. saccharina с меньшей молекулярной массой и большей антикоагулянтной активностью необходимо использовать фукоиданазу или экстракт из гепатопанкреаса камчатского краба.

4. Антикоагулянтная активность исследованных полисахаридных ионных комплексов и сульфатов галактоманнана уменьшается со снижением степени сульфатирования последнего. Фармакодинамические параметры при внутривенном введении крысам сульфата галактоманнана с молекулярной массой 127 кДа  и нефракционированного гепарина – сопоставимы. Определена доза сульфата галактоманнана для достижения 100% антитромботической активности. 

5. Для нейтрализации антикоагулянтной активности исследованных сульфатов полисахаридов растительного и животного происхождения in vitro можно использовать сульфат протамина и хитозны с молекулярной массой 16 и 21 кДа.

6.  Механизм антикоагулянтного действия сульфатов целлюлозы из древесных и травянистых растений и сульфатов монофосфатов-, карбоксиметил-, диальдегид-, амидоэтилцеллюлозы связан с ингибированием активности тромбина и фактора Ха преимущественно антитромбином. С уменьшением молекулярной массы до 10-30 кДа и увеличением степени сульфатирования целлюлозы до 2,5 антикоагулянтная активность возрастает.

7. Исследованные сульфаты пектина и крахмала ингибируют активность тромбина и фактора Ха посредством антитромбина и других плазменных ингибиторов сериновых протеаз свертывающей системы крови, но сульфаты крахмала ингибируют амидолитическую активность тромбина только в присутствии антитромбина. Антикоагулянтная активность сульфатов пектинов увеличивается с возрастанием степени сульфатирования и зависит от вида растения и моносахаридного состава. Зависимость антикоагулянтной активности сульфатов крахмала от степени сульфатирования – колоколообразна, с пиком при степени сульфатирования 1,67.

8. Антикоагулянтная активность исследованных синтетических фрагментов олигосахаридов фукоиданового типа увеличивается с увеличением молекулярной массы и степени сульфатирования. Синтетические производные пептидов ZАla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA ингибируют амидолитическую активность тромбина и задерживают появление фибринового сгустка плазмы человека в тестах при оценке состояния внутреннего и конечного  этапов свертывания плазмы. При внутривенном введении экспериментальным животным наиболее активного производного пептида Fta-Gly-Arg-Pip-ТFА антикоагулянтная активность плазмы увеличивается с возрастанием дозы.

9. Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата антитромбина человека (55-100 ЕД/кг) с нефракционированным гепарином (40-60 ЕД/кг) и доза пара-аминобензойной кислоты при которых достигается 100% предотвращения роста тромба при внутривенном введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шер, А.И. О стандартизации протамина [Текст] / А.И. Шер, М.Ю. Мазов, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд // Хим. Фарм. Ж.- 1988.-№ 4.- С. 486-490.

2. Дрозд, Н.Н. Механизм антикоагулянтного действия эфира сульфата хитозана [Текст] / Н.Н. Дрозд, Г.В. Башков, В.А. Макаров, А.Б. Хейломский, И.Н. Горбачева // Вопр. Мед. Хим.- 1992.- Т.38, № 5.- С. 12-14.

3. Дрозд, Н.Н. Взаимодействие между антикоагулянтными эффектами и образцами полисульфатов хитозана [Текст] / Н.Н. Дрозд, А.И. Шер, В.А. Макаров, Л.С. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева //Эксп. Клин. Фарм.- 1994.- Т. 57, № 4.- С. 42-45.

4. Дрозд, Н.Н. Влияние совместного введения гепарина и сернокислого эфира хитозана на функцию гемостаза [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Г.В. Башков, Л.С. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева // Эксп. Клин. Фарм.- 1996.- Т. 59, № 1.- С. 30-33. 

5. Пат. 2076712 С1 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/725, 31/73. Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромботческой активностью [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, А.И. Шер, Г.В. Башков, Л.С. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева; Москва, Гематологический научный центр — № 93053060; заявл. 23.11.1993; опубл. 10.14.1997.- Бюлл. 10.- с. 11. (С.1-15.) 

6. Дрозд Н.Н. Лабораторный контроль за противотромботической терапией // Исследование системы крови в клинической практике [Текст] / под ред. Г.И. Козинец, В.А. Макарова.- М. ; [Триада-Х], 1997.- глава 4.- C. 41-43. 

7. Дрозд, Н.Н. Парааминобензойная кислота как противотромботический агент [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова // Онтогенез.- 2000.- Т. 31, № 4.- С. 265-266.

8. Строева, О.Г. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты при экспериментальном тромбозе [Текст] / О.Г. Строева, С.И. Акберова, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин // Извест. Акад. Наук Сер. Биол.- 1999.- Т. 26, №3.- С. 265-271.

9. Пат. 2146138 С1 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/245. Антикоагулянтное средство [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова; Москва, Гематологический научный центр — № 96113786; заявл. 08.07.1996; опубл. 10.03.2000, С. 1-12.

10. Пат. 2195673 С2 Российская Федерация, МПК7 G01N 33/68. Способ определения активности антитромбина III [Текст] / Т.Л. Воюшина, О.Е. Неведрова, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, А.П. Момот; Барнаул, ООО Фирма “Технология-Стандарт”— № 2000130498/ 15; заявл. 06.12.2000; опубл. 27.12.2002, С. 1-15. 

11. Макаров, В.А. Методические указания по изучению фармакологических веществ, влияющих на гемостаз [Текст] / В.А. Макаров, Г.Н. Петрухина, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская, О.Е. Неведрова // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. В.П.Фисенко. — М. : [Ремедиум], 2000. — С. 250-256. 

12. Дрозд, Н.Н. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А.  Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова // Эксп. Клин. Фарм.- 2000.- Т. 63, №3.- С.40-44. 

13. Потетинова, Ж.В. Фармакологическое ингибирование активности тромбина и плазмина [Текст] / Ж.В. Потетинова, Т.Л. Воюшина, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров // Эксп. Клин. Фарм.- 2001.- Т. 64, №5.- С.72-78. 

14. Drozd, N.N. Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosn derivatives in in vitro and in vivo system [Text] / N.N. Drozd, A.I. Sher, V.A. Makarov, G.A. Vichoreva, L.S, Galbraikh, I.N. Gorbachiova //Thromb Res.- 2001.- V. 102, N 5.- P. 445-455.

15. Дрозд, Н.Н. Влияние сульфата хитозана на взаимодействие между тромбином и антитромбином [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А. Макаров, Л.С.Гальбрайх, Г.А.Вихорева, И.Н.Горбачева // Молекулярная биология, химия и физика гетерогенных систем: материалы 6-ой  Международной конф. — Плес: Юнона, 2002. — С. 52-56.

16. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность сульфатированных производных хитозана [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова.- М.:  [Наука], 2002.- С. 302-314. 

17. Дрозд, Н.Н. Исследование антикоагулянтной активности низкомолекулярных образцов сульфата хитозана [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.П.Варламов, Г.Е.Банникова, Л.С.Гальбрайх, Г.А.Вихорева, П.П.Столбушкина // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Седьмой  Международной конф. — Санкт-Петербург: ВНИРО, 2003. — С. 169-171.

18. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, Г.Е.Банникова, В.П. Варламов, П.П.Столбушкина, Г.А.Вихорева // Молекулярная биология, химия и физика гетерогенных систем: материалы 7-ой  Международной конф. — Плес: Юнона, 2003. — С. 33-36. 

19. Макаров, В.А. Современные препараты крови для коррекции патологии гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская // Проблемы гематологии и переливания крови.- 2004.- N3.- С. 32-35. 

20. Макаров, В.А. Препараты крови, регулирующие функцию гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская // Новое в трансфузиологии.- 2004.- выпуск 37.- С. 5-12.

21. Drozd, N.N. The inhibition of the sulphate chitosan thrombin activity [Text] / N.N. Drozd, V.A. Makarov , G. Vikhoreva // Eur J. Bioch. – 2004.- V. 270, suppl. 1.- PS4-29. 

22. Малыхина, Л.С. Некоторые показатели тератогенного и эмбриотоксического действия нового антикоагулянта хиторина [Текст] / Л.С. Малыхина, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров // Токсикологический вестник.- 2001.- N1.- С. 23-28. 

23. Пат. 2221578 С1 Российская Федерация, МПК7 А61К 35/36, С07К 14/745. Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови [Текст] / А.Л. Берковский, Е.В. Сергеева, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, А.А. Козлов, Ю.А. Градова, А.В. Суворов; Москва, Межрегиональная благотворительная общественная организация инвалидов “Общество больных гемофилией”— № 2002128481/ 15; заявл. 24.10.2002; опубл. 20.01.2004, Бюл. 2. — 5 с. (С.1-19).

24. Столбушкина, П.П. Получение и антикоагулянтная активность образцов низкомолекулярных гепаринов [Текст]  / П.П. Столбушкина, Г.Е. Банникова, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, В.П. Варламов, Г.Е.  Вихорева // Хим. Фарм. Ж. – 2004.- Т.38,№ 2.- С. 82-85.

25. Банникова, Г.Е. Гидролиз гепарина иммобилизованным ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii [Текст] / Г.Е.Банникова, П.П.Столбушкина, Н.Н.Дрозд, Г.А.Вихорева, В.П. Варламов, В.А.Макаров // Прикл. Биох. Микробиол.- 2004.- Т.40, № 4.- С.365-369.

26. Пат. 2248801 С2 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/727. Способ получения низкомолекулярных гепаринов [Текст] / В.П. Варламов, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Н.Т. Мифтахова, Г.А. Вихорева, Л.С. Гальбрайх, П.П. Столбушкина; Москва, Гематологический научный центр РАМН— № 2003111205/ 15; заявл. 21.04.2003; опубл. 27.03.2005, Бюл. 9. — 7 с. (С.1-10).

27. Vikhoreva, G. Anticoagulant activity of low-molecular-weight sulfated chitosan [Text] / G. Vikhoreva, P. Stolbushkina, G. Bannikova, A. Panov, N. Drozd, V. Makarov, V.Varlamov // Carbohydr Polym.- 2005.- V. 62, N4.- P. 327-332.

28. Дрозд, Н.Н. Антитромботческая активность российского низкомолекулярного гепарина [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов, П.П. Столбушкина, Г.А. Вихорева // Омский научный вестник.- 2005.-  №1(30).- С. 125-128.

29. Drozd, N.N. Mobility of the sulphate protamin/ low molecular weight heparin complexes in an electrical field [Text] / N.N. Drozd, I. Migal, M. Kiutina, V.A. Makarov, G.E. Bannikova, V.P. Varlamov // FEBS J.- 2005.-V.272, suppl. 1.- B3-016P.

30. Кузнецова, Т.А. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов, выделенных из бурых водорослей [Текст] / Т.А. Кузнецова, Н.Н. Беседнова, А.М. Урванцева, И.У. Бакунина, Т.Н. Звягинцева, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров // Вестник ДВО РАН.- 2006.- № 6.- С. 105-110. 

31. Дрозд, Н.Н. Фармакодинамические параметры антикоагулянтов на основе сульфатированных полисахаридов из морских водорослей [Текст] / Н.Н Дрозд, А.С. Толстенков, В.А Макаров, Т.А. Кузнецова, Н.Н Беседнова, Н.М.Шевченко, Т.Н.Звягинцева // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2006.- Т.- 142, № 11.- С. 537-540. 

32. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов [Текст] / Н.Н. Дрозд, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, В.П. Варламов // Эксп. Клин. Фарм.- 2006.- Т. 69, №6.- С. 51-60.

33. Макаров, В.А. Характеристика лекарственных средств для коррекции системы гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская, Г.Н. Петрухина // Очерки по производственной и клинической трансфузиологии / под. ред. А.И.Воробьева — М. : [Ньюдиамед], 2006. — С. 374-382. 

34. Толстенков, А.С. Биоспецифичный электрофорез комплексов между низкомолекулярными гепаринами и хитозанами [Текст] / А.С.Толстенков, Н.Н. Дрозд, В.А.Макаров, Г.Е.Банникова // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Восьмой Международной конф. — Казань: ВНИРО, 2006. — С. 253-256.

35. Дрозд, Н.Н. Антитромботическая активность отечественного препарата "Антитромбина III" на модели индуцированного венозного тромбоза [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, Н.Т.Мифтахова, Т.Л.Дереза, М.А.Ажигирова // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2006.- Т.- 142, № 7.- С. 75-78. 

36. Дрозд, Н.Н. Определение активности низкомолекулярных гепаринов против активированного фактора Ха с помощью диагностических наборов "Реахром-Гепарин" (НПА "Ренам") [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, А.Л. Берковский, Е.В. Сергеева, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов // Пат. Физ. Эксп. Тер.- 2006.- N 2.- С.16-18. 

37. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью комплекса гидролаз [Текст] / Н.Н. Дрозд, А.С. Толстенков, Г.Е Банникова, Н.Т. Мифтахова, Е.С  Лапикова, В.А. Макаров, В.П. Варламов // Эксп. Клин. Фарм.- 2007.- Т. 70, №6.- С. 19-24.

38. Местечкина, Н.М. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатированных производных галактоманнана семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub. [Текст] / Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухин, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов, Н.Н.Дрозд, А.С. Толстенков, В.А. Макаров, В.Е. Тихонов // Прикл. Биох. Микроб.- 2007.- Т. 43, № 6.- С. 732-737.

39. Дрозд, Н.Н. Влияние низкомолекулярного гепарина, полученного с помощью хитинолитического комплекса, на антикоагулянтную активность плазмы кроликов и крыс [Текст] / Н.Н. Дрозд, А.С. Толстенков, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, Г.Е. Банникова, П.П. Суханова, В.П. Варламов, Г.Е. Вихорева // Эксп. Клин. Фарм.- 2007.- Т. 70, №2.- С. 40-44.

40. Пат. 2295538 С2 Российская Федерация, МПК7 С08В 37/10, А61К 31/727. Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой [Текст] / Н.Н. Дрозд, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, В.П. Варламов, В.Е. Тихонов, К.Г. Скрябин; Москва, Гематологический научный центр РАМН и  Центр “Биоинженерия” РАН— № 2005105423/ 15; заявл. 01.03.2005; опубл. 20.03.2007, Бюл. 8. — 5 с. (C. 1-12). 

41. Davydova, A.I. Anticoagulant properties of the cellulose derivatives with various substituents [Text] / A.I. Davydova, N.N. Drozd, V.A. Makarov, M.A. Torlopov // FEBS J.- 2008.-V.275, suppl. 1.- PP8A-2. 

42. Дрозд, Н.Н. Гликозаминогликан-зависимая регуляция каскада свертывания крови [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А. Макаров // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана : материалы Девятой Международной конф. — Ставрополь : ВНИРО, 2008. — С. 165-168. 

43. Дрозд, Н.Н.Влияние внутривенного введения сульфатированного галактоманнана на антикоагулянтную активность плазмы крыс [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, А.С. Толстенков, Лапикова Е.С., Мифтахова Н.Т., Местечкина Н.М., В.Д. Щербухин, Ильина А.В., В.П.Варламов// Пат. Физ. Эксп. Тер.- 2008.- № 3.- С. 20-23.

44. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность оригинальных синтетических производных пептидов [Текст] / Н.Н Дрозд, А.С. Толстенков, В.А Макаров, Н.Т.Мифтахова, Т.Л.Воюшина, М.Е.Сергеев//  Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2008.- Т. 145, № 1.- С. 57 – 60.

45. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность in vitro сульфатированного арабиногалактана и экстракта коры кедра [Текст]/ Н.Н. Дрозд, С.А. Кузнецова, Е.С. Лапикова, А.И. Давыдова, В.А. Макаров, Б.Н. Кузнецов, А.И. Бутылкина, Н.Ю. Васильева, Г.П. Скворцова // Эксп. Клин. Фарм.- 2008.- Т. 71, № 4.- С. 30-34.

46. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан [Текст] / Н.Н. Дрозд, А.В.Ильина, Н.М.Местечкина, А.С. Толстенков, Е.С. Лапикова, В.А. Макаров, В.П.Варламов, В.Д.Щербухин // Вопр. Биол. Мед. Фарм. Хим.- 2008.- № 4.- С. 28-32.

47. Лапикова, Е.С. Ингибирование тромбина и фактора Ха фукоиданом из Fucus evanescens и его модифицированными аналогами [Текст] / Е.С. Лапикова, Н.Н. Дрозд, А.С. Толстенков, В.А. Макаров, Т.Н. Звягинцева, Н.М. Шевченко, И.Ю. Бакунина , Н.Н. Беседнова, Т.А. Кузнецова // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2008- Т. 146, №3.- С.328-333.

48. Il’ina, A. V. The production of nanoparticles based on sulfated polysaccharides and a study of their anticoagulation activity [Text]/A. V. Il’ina, A. N. Levov, N. M. Mestechkina, N. N. Drozd, V. N. Orlov, V. A. Makarov, V. D. Shcherbukhin, V. P. Varlamov, K. G. Skryabin// Nanotechnologies in Russia.- 2009.- V.4, Nos. 3–4.- P. 244–252.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.