WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Еремеева Марина Викторовна

СТИМУЛЯЦИЯ АНГИО/МИОГЕНЕЗА

ПРИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ И АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

14.00.41. - Трансплантология и искусственные органы

14.00.06. - Кардиология


АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

 

МОСКВА 2010

Работа выполнена в Научном Центре Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН                                        Бокерия Лео Антонович

Доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН                        Голухова Елена Зеликовна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бочков Николай Павлович;

  доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич;

  доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна.

Ведущая организация:

ГУ Российский научный центр хирургии им. Б.В. Петровского РАМН.

 

Защита диссертации состоится «__» __________ 2009 года в ____ на заседании диссертационного совета Д.208.055.01 при ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, Москва, ул.Щукинская, 1.

Автореферат разослан «___» __________2010 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор                                Шевченко О.П.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИБС – ишемическая болезнь сердца

СН – сердечная недостаточность

ХИНК – хроническая ишемия нижних конечностей

КШ – коронарное шунтирование

ЛЖ – левый желудочек

VEGF – фактор роста сосудистого эндотелия

FBF – фактор роста фибробластов

ФВ – фракция выброса

ХСН – хроническая сердечная недостаточность

ТМЛР –трансмиокардиальная лазерная реваскуляризация

ДКМП – дилятационная кардиомиопатия

ФК – функциональный класс

ЭКГ – электрокардиография

ЭхоКГ – эхокардиография

КСО – конечный систолический объем

КДО – конечный диастолический объем

КСР – конечный систолический размер

КДР – конечный диастолический размер

Синхро-ОФЭКТ - синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда

ПЭТ – позитронно-эмиссионная томография

РФП – радиофармпрепарат

18F-FDG – меченная фтором фтордезоксиглюкоза

ЛВГ – левовентрикулография

КГ-короноарография

КМЦ – кардиомиоцит

ДП – дефект перфузии

WMSI –индекс региональной сократимости

ККМП – клеточная кардиомиопластика

ДББХ – длительность безболевой ходьбы

ФА – физическая активность

БФ – болевой фактор

ОЗ-  общее здоровье

ЖС – жизнеспособность

ПЗ – психическое здоровье

ЭКП – эндотелиальные клетки – предшественники

ВВЕДЕНИЕ

Хроническая сердечная недостаточность - заболевание многофакторное. Применяемые на сегодня методы лечения способны замедлить развитие болезни, но постепенно заболевание прогрессирует и становится рефрактерным в отношении «традиционной» терапии. На поздних стадиях единственно эффективным методом лечения остается пересадка сердца. Однако возможности применения трансплантации сердца жестко ограничены дефицитом донорских органов. Поэтому в настоящее время сложилась настоятельная потребность в разработке и внедрении альтернативных методов лечения.

Стимуляция регенерации поврежденного органа – следующий после замещения способ лечения. Успех такого лечения существенным образом зависит от понимания молекулярных и клеточных механизмов развития сердечной недостаточности, ее прогрессирования и регрессии в результате регенерации миокарда. В связи с этим представляется важным изучение факторов детерминирующих, а также ограничивающих регенеративные возможности организма взрослого. Открытым остается также вопрос о сохранении способности к регенерации в конечно-дифференцированных тканях человека.

В колоссальном потоке современных исследований на данную тему отчетливо прослеживаются три основных направления. Во-первых, это создание имплантируемых протезов левого желудочка . Конкретные механизмы восстановления сердечной функции у больных при данном методе лечения остаются неясными, однако, предполагается активация регенерации зрелых клеток, либо стимуляция миграции стволовых клеток сердца или костного мозга в пораженный участок миокарда. Эта последняя возможность подкрепляется фактом обнаружения повышенного содержания факторов привлечения стволовых клеток (инсулин-подобного фактора роста 1 и фактора 1 стромы) в миокарде пациентов после операции ( AssmusB., et al., 2002; Adams G. et al., 2007).

Вторым активно развивающимся в последние 20 лет направлением является применение генной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и сердечной недостаточности, в частности (  Isner J., 2002; Henry T. et al., 2003 ). Несмотря на связанные с этим направлением большие ожидания и огромный энтузиазм исследователей, реальный прогресс весьма ограничен, что объясняется как трудностью разработки эффективного метода доставки соответствующего гена в пораженный участок, так и сложностью выбора подходящего гена. Дополнительной возможностью служит применение клеточной терапии в качестве средства доставки «терапевтического» гена. В целом генная терапия остается перспективной возможностью стимуляции регенерации миокарда, как сама по себе, так и в сочетании с другими способами регенеративной терапии. Однако успех этого направления полностью зависит от интенсивности исследовательской работы.

Третьей по порядку изложения, но не по важности, возможностью регенеративной терапии сердечной недостаточности является клеточная терапия. На экспериментальных моделях было продемонстрировано, что кардиомиоциты плода могут формировать межклеточные контакты с клетками миокарда, однако практической перспективы применения данный источник стволовых клеток не имеет ( Strauer B., 2003). Наиболее практичной в настоящее время возможностью представляется использование аутологичных либо гомологичных стволовых клеток взрослого, выделяемых из костного мозга, крови, жировой ткани, скелетных мышц, или непосредственно из сердца. На экспериментальных моделях сердечной недостаточности была продемонстрирована потенциальная способность клеток из вышеперечисленных источников улучшать функцию миокарда (Szmitko P., et al. 2003). Нуждается в дальнейшей отработке еще целый ряд вопросов, таких как оптимизация выбора клеток для введения и способа введения, недостаточное выживание введенных клеток и низкая скорость их пролиферации после инъекции, а также способность введенных клеток к трансдифференцировке и интеграции, либо к воздействию на оставшийся жизнеспособным миокард через паракриновый эффект. Прояснение этих основных моментов необходимо для оптимизации условий клеточной терапии, сочетающей максимальный клинический эффект с минимумом осложнений.

Целью настоящей работы стала разработка безопасных и эффективных методов генной и клеточной терапии, которые могли бы использоваться изолированно или в дополнение к существующим традиционным хирургическим методам для лечения ряда сердечно-сосудистых заболеваний.

Задачи исследования

  1. Проанализировать и охарактеризовать состояние миокарда в предполагаемой зоне введения терапевтических агентов для стимуляции ангио/миогенеза.
  2. На модели ишемии задней конечности крысы исследовать эффективность полученных нами генетических препаратов VEGF165 и bFGF.
  3. В культуре in vitro, а также путем непосредственного анализа выделяемых ex-vivo стволовых клеток-предшественников охарактеризовать их фенотип, а также пролиферативный и дифференцировочный потенциал.
  4. На ограниченном контингенте больных с ИБС и ХИНК провести оценку эффективности клинического применения генетических препаратов – стимуляторов ангиогенеза.
  5. На ограниченном контингенте больных с сердечной недостаточностью и ХИНК провести оценку эффективности клинического применения стволовых клеток-предшественников для стимуляции ангио- и миогенеза.
  6. Выработать и обосновать критерии отбора, а также рациональные и безопасные методы доставки и тактику применения генетических и клеточных препаратов для лечения больных с сердечно-сосудистой патологией.

Научная новизна работы. Создана уникальная плазмидная конструкция, позволяющая эффективно экспрессировать ген VEGF165 в тканях и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей.

Впервые продемонстрирована большая по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками способность клеток CD133+/CD34-/VEGFR-2+ к дифференцировке в направлении эндотелиального ростка, и тем самым обоснована большая перспективность использования маркера CD133 по сравнению с CD34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Впервые показано, что в зависимости от локализации ишемии, внутримышечное и/или интраартериальное введение CD133+ аутологичных костномозговых клеток-предшественников ведет к достоверному улучшению перфузии вследствие формирования новой сосудистой сети.

Практическая значимость работы. Разработанная на основе гена VEGF165 генетическая конструкция внедрена в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева и успешно применяется для лечения больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей с целью реваскуляризации пораженных тканей. В результате изучения потенциала к пролиферации, дифференциации и регенерации стволовых клеток костного мозга разработаны и внедрены в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева методы клеточной терапии ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Материалы работы могут быть рекомендованы к применению в научно-педагогической деятельности кардиохирургических центров нашей страны, в которых осуществляется квалификационная подготовка специалистов, работающих в кардиологии и кардиохирургии.

Результаты данной работы внедрены в клиническую практику Научного Центра Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, а также материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов, в сертификационном курсе для сердечно-сосудистых хирургов, проходящих обучение на базе НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Дополнительная стимуляция процессов ангио/миогенеза в ишемизированных тканях ведет к улучшению прогноза течения заболевания и улучшению качества жизни больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей.
  2. Применение плазмидной генетической конструкции (ангиостимулин) безопасно для больного, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF165, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.
  3. Популяция стволовых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток-предшественников обладает большим дифференцировочным потенциалом в направлении неоангиогенеза по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками, что обусловливает их большую терапевтическую эффективность.
  4. Терапевтическая эффективность аутотрансплантации стволовых CD133+ клеток определяется в том числе способом введения. В то время как интра-миокардиальный способ достоверно улучшает перфузию ишемизированного миокарда, интракоронарное введение не оказывает влияния на данный параметр.

Апробация диссертации состоялась 8 мая 2009 года на заседании апробационного совета НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.

Публикации. По теме работы опубликовано 43 научные работы, из них 16 – в центральной (в том числе зарубежной) печати объемом более 100 страниц.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 186 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты, обсуждение), выводов, практических рекомендаций и указателя литературы из 6 отечественных и 323 зарубежных источников. Диссертация содержит 40 таблиц и 70 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы экспериментальных исследований.

Гистологическая оценка экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним. Для окраски срезов тканей миокарда использовали моноклональные антитела: анти- CD34 Dako Corp., Дания; анти-CD31 Dako Corp., Дания; анти-VEGF Santa Cruz Bio-tech., U.S.A.; анти- Flt-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Flk-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Thrombospondin Boerhinger Manhiem, Германия; анти-CD95, анти-CD95L Novocastra. Биопсийный материал ишемизированного участка миокарда размером не менее 53 мм забирали во время операции КШ. Материал немедленно помещали в 10% раствор нейтрального формалина. Проводка и заливка биопсийного материала в парафин проводилась по стандартной методике. Выдержка в 10% нейтральном формалине не превышала 24-36 часов. Для оценки экспрессии факторов ангиогенеза и других факторов роста использовались срезы толщиной 4мкм. Срезы депарафинировали и дегидратировали по стандартной методике. Для восстановления структуры антигенов срезы обрабатывались в Target Retrieval Solution (Dako) на водяной бане в течение 30 мин при 95-990С. Для блокирования эндогенной пероксидазы и неспецифического связывания срезы инкубировали с 3% Н2О2, 15 мин, а затем с 1% БСА - 15 мин при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами проводили от 30 до 60 мин (в зависимости от вида антител) при комнатной температуре. После инкубации срезы промывали в PBS. Визуализация первичных антител производилась с помощью системы 4SAB plus kt (Dako Corp.) согласно инструкции. Препараты докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. Подсчет количества сосудов проводился в поле зрения микроскопа при увеличении х200-х250.

Электронная микроскопия интраоперационной биопсии миокарда зоны, расположенной рядом с постинфарктной аневризмой левого желудочка. У 16 больных с постинфарктной аневризмой ЛЖ были взяты интраоперационные биопсии миокарда ЛЖ из зоны, расположенной рядом с постинфарктной аневризмой левого желудочка. Биопсийный материал фиксировали в растворе 2,5% глютарового альдегида и 1% параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), дофиксировали в 1,5% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали, заливали в аралдит. На ультратоме Leica изготавливали полутонкие и ультратонкие срезы. Полутонкие срезы ткани окрашивали по методу ШИК с докраской метиленовым синим, изучали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе Philips CM100.

Получение плазмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста VEGF165  (ангиостимулин). Последовательность человеческого гена VEGF была получена из базы данных Genom Database c помощью программы Entrez (NM003376). Для получения гена к его последовательности были синтезированы праймеры: к 5' концу гена TGO GGC CGA AAC CAT GA и CGG CTC ACC GCC TCG GCT T к 3' концу гена. Праймер к 5' концу гена был выбран с учетом последовательности Козак, обеспечивающей эффективное начало трансляции. Для обеспечения возможности проверки экзогенного белкового продукта гена VEGF был также синтезирован праймер на 3' конец гена, который помимо последовательности гена содержал эпитоп распознавания антителами полигистидиновой последовательности, необходимой для последующей очистки белка. Для удобства клонирования и анализа праймеры также включали сайты узнавания уникальными рестриктазами, не содержащимися в последовательности гена. Сайт Eco RI для 5' концевого праймера и Smal сайт для 3' концевого праймера. Фрагменты ДНК, соответствующие по размерам VEGF165 и  VEGF121, элюировались из геля после рестрикции и очищались с помощью набора фирмы Qiagen. Конструкция, содержащая ген VEGF165, была изготовлена на основе вектора pBK-CMV neo (Stratagene). Полученные плазмиды встраивали в соответствующий штамм Escherichia coli с целью наработки белка в процессе ферментации с последующей очисткой препарата из клеточного лизата на аффинных колонках с антителами, специфичными к гистидиновому хвосту молекулы.

Исследование эффективности ангиостимулина in vivo в тесте с матригелем. В экспериментах использовали мышей-самок С57Bl/6 возрастом 6-8 недель. Матригель (BD Bioscience, Discovery Labware) при 40С смешивали со 100 нг/мл VEGF (Becton Dickinson Labware), либо с клетками, трансфецированными геном VEGF165. Смесь Матригеля затем вводили подкожно мышам в подмышечную впадину, где он полимеризовался с формированием имплантанта, который удаляли на 7 день, фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24-36 часов и заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм докрашивались гематоксилин-эозином и по Мейсону (Masson’s trichrome, Sigma Diagnostic). Общий индекс клеточной инвазии определялся при анализе изображений срезов, полученных с помощью цифровой камеры. Количество мигрировавших клеток определялось подсчетом процента области, занятой эндотелиальными клетками к общей области Матригеля.

Исследование эффективности ангиостимулина на модели ишемии нижних конечностей. В эксперименте использовались крысы Vistar, взрослые особи массой 200-250 грамм обоего пола. Для изучения ангиогенного эффекта испытываемых препаратов была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы конечности крысы. Под внутрибрюшинным наркозом раствором тиопентала производилась перевязка бедренной артерии крысы нитью Prolen на двух уровнях – проксимальном и дистальном. На 10-е сутки после перевязки артерии из области ишемии брался кусочек ткани для гистологического исследования, вводился ген ангиогенного фактора в различных дозах. На 30-е сутки после введения препарата брался на гистологический анализ кусочек ткани из места инъекции. Блоки ткани скелетной мышцы замораживали при помощи охлажденного до -800С петролейного эфира. Срезы толщиной 10 мкм приготавливали в криостате Leica. Свежезамороженные срезы скелетной мышцы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон, выявляли активность сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Активность ферментов определяли по методике Burstone M.S., регистрируя восстановление соли нитросинего тетразолия до синего диформазана.

Методика оценки эффективности препаратов по плотности капиллярной сети в ишемизированной ткани. Блоки ткани скелетной мышцы фиксировали в 4% нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы скелетной мышцы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон. Оценка плотности капиллярного русла проводилась при увеличении х1000 с использованием иммерсии. Подсчитывалось количество открытых капилляров при оценке не менее 10 полей зрения на срез. Сравнивались полученные данные от одного животного до введения препарата и через 30 дней после введения.

Метод выделения и получения аутологичных клеток-предшественников CD133+. Использовалась стандартная методика пункции костного мозга под местной анестезией из крыла подвздошной кости в количестве 40 мл. Пункция помещалась в 2х50 мл пробирки с 5 мл PBS и 200U/мл гепарина. Полученная масса разводилась 1:2 средой RPMI 1640, содержащей 0,02% коллагеназы B и 100U/мл ДНКзы. Осторожно перемешивалась при 200C 45 мин. После фильтрации через фильтр 40 мкм выделялся весь пул мононуклеаров методом центрифугирования (35 мин - 400g - 200 C) на градиенте плотности Ficoll. Выделенные мононуклеары двукратно отмывали в растворе PBS, содержащем 2mM EDTA, центрифугировали (10 мин -300g - 200C). Подсчитывали концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Оставляли финальный объем 300мкл PBS/не более 108 клеток для последующей магнитной сепарации CD133+. Для ингибирования неспецифического связывания добавляли FcR блокирующий реагент (100мкл). Инкубировали 10 мин при 200C. После чего сразу вносили антитела CD133 на микросферах (100мкл) и инкубировали 30 мин при 40C. После отмывки в 10х объеме раствора PBS (10 мин - 300g – 200С) ресуспендировали осадок в 500 мкл буфера. Для магнитной сепарации использовали MS колонки. После подсчета и оценки жизнеспособности клетки помещали в инкубатор (370С, 0,5% CO2) в бессывороточной среде X-VIVO 15 согласно рекомендациям GMP, где сохраняли в течение 1-2 суток до процедуры введения пациенту. Для введения CD133+ клетки-предшественники разводили в физиологическом растворе (2мл), содержащем 20% аутологичной сыворотки пациента.

Метод проточной цитофлюориметрии (FACS). Цитометрический анализ проводился с использованием программ MultiGraph и FlowJo.

Иммуноцитохимический анализ. Мононуклеары были выделены на градиенте фикола и в конценрации 4х106  помещены в 24-луночный планшет, предварительно покрытый человеческим фибронектином (10мкг/мл) (Sigma), в эндотелиальной основной среде EBM (CellSystems) c добавлением компонентов SingleQuots и 20% FCS. После культивирования (4 суток) были удалены неприкрепившиеся клетки и прикрепившиеся оставлены для цитохимического анализа.

Для анализа эндотелиального фенотипа выделенных клеток-предшественников использовали 1,1-dioctadecyl-3,3,39,39-tetramethylindocarbocyanine–labeled acetylated LDL (Dil-Ac-LDL)(CellSystems). Клетки инкубировали в среде с 2,4 мкг/мл Dil-Ac-LDL 60мин при 370С. После отмывки в PBS клетки фиксировали в 2% растворе формальдегида в PBS 10 мин при 200C в темноте. Затем клетки отмывали и инкубировали с  FITC-меченным Ulex europaeus agglutinin I (Sigma) в течение 60мин в темноте. Клетки, позитивные и по Dil-Ac-LDL, и по лектину были идентифицированы как эндотелиальные клетки–предшественники (ЭКП) и подсчитаны в каждой лунке. Два независимых исследователя подсчитывали количество ЭКП в каждой лунке трижды в 6 полях зрения.

2. Материалы и методы исследования в клинике.

Общая характеристика больных. В клиническое исследование по оценке эффективности стимуляции ангиогенеза при применении генного препарата «ангиостимулин» и фракции клеток CD133+ было включено всего 101 пациент (29 пациентов с ишемической болезнью сердца, 29 пациентов с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии и 43 пациентa, страдающих ишемией нижних конечностей).

Группа 1: 11 пациентов (средний возраст 49±8,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,0±0,77 ФК ССS, ФВ ЛЖ 52,8±9,2%), которым было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина».

Группа 2: 13 пациентов (средний возраст 51,4±6,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,23±0,73 ФК CCS, ФВ ЛЖ 50,8±8,8%), которым при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ТМРЛ.

Группа 3: 5 пациентов (средний возраст 56,8±9,8 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,4±0,65 ФК CCS, ФВ ЛЖ), которым было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина».

Группа 4: 10 пациентов (средний возраст 56,7±10,5лет) с ИБС (стенокардия напряжения III-IV ФК CCS) и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ =37,7±13,7%), которым были введены клетки CD133+.

Группа 5: 12 пациентов (средний возраст 43,1±14,8лет) с ДКМП и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ = 28,4±7,2%), которым были введены клетки CD133+.

Группа 6: 7 пациентов (средний возраст 55,1 ± 14,1лет), с длительным ревматическим анамнезом, после операции протезирования митрального клапана со сроком послеоперационного периода не менее 1 года, при отсутствии поражения аортального клапана и с сохранной функцией протеза митрального клапана, при отсутствии атеросклеротического поражения коронарных артерий, подтвержденного данными коронарографии, со сниженной сократительной функцией миокарда ЛЖ по данным эхокардиографии (ФВ ЛЖ=36,4±10%, III-IV  ФК NYHA). Всем пациентам этой группы при проведении коронароангиографии были введены транскатетерно интрамиокардиально CD133+ клетки.

Группа 7: 14 пациентов, страдающих ХИНК, которым были введены клетки-предшественники CD133+.

Группа 8: 29 пациентов с ХИНК, которым был введен «Ангиостимулин».

Стандартная электрокардиография (ЭКГ) выполнялась на 6/12 канальном электрокардиографе MWZ BIOSET 8000 (Германия) со скоростью лентопротяжного механизма 25 мм/сек до и после операции в 12 стандартных отведениях.

Эхокардиография (ЭхоКГ) выполнялась на аппарате Hewlett Packard Sonos 5500 с использованием трансторакального S4 и чрезпищеводного Omniplane II датчиков до и после операции. Определение конечных размеров и объемов полости ЛЖ в систолу и диастолу выполнялось из стандартных позиций по методике Teichkholtz. Оценка фракции выброса миокарда левого желудочка осуществлялась по модифицированному методу Simpson из апикальной 4-х камерной проекции. Из этой же проекции проводилось измерение конечно-диастолического объема левого желудочка (КДО ЛЖ, мл) и конечно-систолического объема ЛЖ (КСО ЛЖ, мл) по формуле площадь-длина в модификации Simpson.

Проба с физической нагрузкой (тредмил тест) выполнялась на системе сопровождения нагрузочных проб «Burdic Quest» (CША) по протоколу Bruce с применением системы 12 модифицированных отведений ЭКГ по методу Mason-Likar на фоне отмены антиангинальных препаратов в утренние часы до операции и перед выпиской пациентов после операции. Производилась оценка толерантности к физическим нагрузкам, оценивалась длительность нагрузки и наличие ЭКГ критериев ишемии.

Рентгеноэндоваскулярные методы исследования артерий. Всем пациентам с заболеваниями сердца была сделана вентрикулоангиография. В группе пациентов с ХИНК было выполнено ангиографическое исследование магистральных сосудов нижних конечностей. Селективная коронароангиография на этапе дооперационного обследования выполнялась на ангиографических установках «Angioscop D» фирмы Siemens (Германия) и «Integris – 3000» фирмы Phillips (Голландия) под местной анестезией по методу M. Jadkins с введением катетера в бедренную артерию по S. Seldinger. Применялся контраст «Омнипак». Анализ ангиограмм выполняли на установке «Integris - V3000» со скоростью киносъемки 25-50 кадров в секунду на пленку фирмы «Kodak». Характер  и  степень поражения коронарного русла определяли по классификации Ю.С. Петросяна и Л.С. Зингермана.

Синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда (синхро-ОФЭКТ). Проба с дозированной физической нагрузкой выполнялась на велоэргометре «Meditronic» фирмы Hellige (Германия) с помощью 12 канального электрокардиографа «Bioset-800» фирмы в положении сидя по стандартному протоколу, принятому в НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Реконструкцию полученных томограмм выполняли с применением стандартной программы AUTOSPECT-plus, реализующей механизм обратного проецирования фильтрованных проекций.

Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ). Для оценки метаболизма глюкозы применяли радиофармпрепарат (РФП) – фтордезоксиглюкозу, меченую фтором (18F-FDG), которую синтезировали по двухстадийному методу R. Hamacher и соавторов на автоматизированном модуле синтеза производства фирмы «Nuclear Interface» (Германия). За 1 час до введения РФП пациенты получали перорально 50 г глюкозы с целью увеличения концентрации глюкозы в крови и подавления потребления жирных кислот в миокарде, что способствовало более высокому накоплению 18F-FDG в миокарде и лучшей его визуализации. Исследование осуществляли на позитронном эмиссионном томографе «Exact 47» фирмы «Siemens» в статическом режиме сбора данных через 40 мин после внутривенной инъекции 370 МБк РФП. Эмиссионное сканирование длилось 20 мин, а трансмиссионное – 10 мин.

Оценка транскутанного напряжения кислорода в тканях осуществлялась с помощью монитора ТСМ-2 фирмы «Radiometer» (Дания) исходно перед введением стимулятора ангиогенеза, через 1, 3 и 6 месяцев после введения (в некоторых случаях дополнительно через 9 месяцев и 1 год). Во время исследования пациент находился в горизонтальном положении на спине с выпрямленными конечностями. Фиксация датчика осуществлялась по стандартной технологии, рекомендуемой фирмой – изготовителем прибора в первом межпальцевом промежутке на тыле стопы. Показатели регистрировались не ранее, чем через 20 минут после помещения откалиброванного датчика на место измерения.

Ультразвуковая допплерография сосудов нижних конечностей проводилась до операции на аппарате Hewlett–Packard Sonos 5500 c линейным сосудистым мультичастотным датчиком. Оценивалась проходимость сосудов, состояние комплекса интима-медиа-адвентиция, состояние просвета сосудов с оценкой степени их стенозирования.

Изучение качества жизни проводилось при помощи опросника общего назначения – Короткая Версия Опросника Здоровья – 36 (MOS 36-item Short – Form Health Survey, или MOS SF – 36), разработанный в США в рамках исследования MOS (Medical Outcome Study, англ. – Изучение Медицинских Результатов).

Статистическая обработка данных. Результаты, представленные в работе, выражались как среднее значение ± стандартное отклонение. При сравнении зависимых переменных использовался W- критерий Уилкоксона, независимых – T-критерий Манна-Уитни. Результаты считались статистически достоверными при значениях р<0,05. Все расчеты проводились при помощи программы «Statistica 6.0» Copyright © Stat Soft, Inc.

Методы введения ангиогенного фактора. «Ангиостимулин» вводился на заключительном этапе операции коронарного шунтирования интрамиокардиально в общей дозе 1000 мкг в зону, нуждающуюся в стимуляции неоангиогенеза. 11 пациентам препарат был введен на заключительном этапе операции, 13 пациентам дополнительно к КШ и введению препарата проводилась ТМЛР. Суммарная доза препарата делилась на 4 интрамиокардиальных инъекции (по 250мкг). Область введения определялась на основании результатов коронароангиографии, сцинтиграфии миокарда, позитронно-эмиссионной томографии, как область ишемизированного, но жизнеспособного миокарда, не подлежащая хирургической реваскуляризации по техническим причинам (плохое дистальное русло, малый диаметр коронарной артерии).

Транскатетерно интракоронарно изолированно клетки CD133+ вводили 6 пациентам. Первоначально выполнялась селективная коронарография, затем ретроградная катетеризация ЛЖ и ЛВГ. Производилась смена катетера и под флюроскопическим контролем в полость ЛЖ проводили 7F Gaid катетер, кончик которого был установлен в область введения, которая определялась заранее на основании данных КГ и сцинтиграфии миокарда. Через Gaid катетер проводилась специальная  гибкая игла 3,5F с ограничителем вкола 0,3мм для интрамиокардиальной пункции (с выбросом гибкой иглы) и выполнялись последовательные (по часовой стрелке) иньекции аутологичных клеток-предшественников CD133+ (в объеме 200-250 мкл) под флюороскопическим контролем положения кончика иглы. Заключительным этапом выполнялась ЛВГ.

Интрамиокардиально клеточный препарат CD 133+ вводили на заключительном этапе операции. 12 пациентам клеточный препарат был введен путем интрамиокардиальной транскатетерной инъекции. 4 пациентам препарат был введен интрамиокардиально транскатетерно (через полость ЛЖ).

В дополнение к хирургической реваскуляризации или при изолированном введении ангиогенных факторов все пациенты с поражением миокарда получали стандартную кардиальную терапию.

Введение стимулятора ангиогенеза (ангиостимулина, либо клеток-предшественников) при ХИНК производилось однократно внутриартриально в магистральную артерию пораженной нижней конечности с помощью катетера, после выполнения исходной ангиографии, или внутримышечно обкалыванием икроножной мышцы в области пораженной артерии через 4-5 вколов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Результаты экспериментальных исследований.

В результате иммуноморфологического исследования полученных в ходе оперативного вмешательства тканей ишемизированного миокарда больных ИБС нами зарегистрирован параллелизм в экспрессии стимулирующих ангиогенез факторов в тканях и рецепторов к этим факторам на отвечающих клетках. При этом в значительной степени подавляется экспрессия маркеров апоптоза на клетках сосудов сердца. Таким образом, в ишемизированном миокарде активизируются механизмы формирования новых кровеносных сосудов, способных компенсировать недостаток кровотока и ишемию в пораженном участке. Нам удалось показать, что в результате хирургической реваскуляризации миокарда с помощью КШ происходит стимуляция  эндогенного компенсаторного ангиогенеза. По-видимому, дополнительное введение факторов, стимулирующих ангиогенез (в частности ДНК, кодирующей VEGF) при ишемии миокарда, может способствовать более эффективным результатам хирургического лечения, а также в сочетании с лазерным воздействием, поддерживая уровень экспрессии ангиогенных факторов, необходимый для терапевтического ангиогенеза.

По данным гистологического анализа у всех больных в анализируемой зоне миокарда содержание соединительной ткани было повышено: у 4 больных наблюдали выраженный склероз, у 2 больных – умеренный. В интерстиции у половины больных отмечены отдельные жировые клетки, у одного больного – единичные тучные клетки.  КМЦ у всех больных были гипертрофированы (средний поперечный диаметр составил от 28,96±6,17 до 32,21±7,03мкм). Большинство КМЦ демонстрировало разную степень утраты миофибрилл: слабую, умеренную или значительную, - с накоплением в саркоплазме повышенного количества гликогена. Наибольшая степень утраты миофибрилл была типична для КМЦ, расположенных в зонах миокарда с более выраженным склерозом.

Электронно-микроскопическое исследование выявило характерные изменения ультраструктуры КМЦ. Ядра этих клеток, как правило, имели сильно извитые контуры, содержали эухроматин с небольшими глыбками гетерохроматина и крупные ядрышки. В околоядерной зоне располагались митохондрии, гранулы гликогена, отложения липофусцина, цистерны и везикулы аппарата Гольджи. У 5 из обследованных 6 больных в некоторых КМЦ рядом с везикулами аппарата Гольджи были обнаружены специфические предсердные гранулы, у 3 больных в околоядерной области КМЦ встречались хорошо развитые цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума. Большинство КМЦ демонстрировало четко организованный сократительный аппарат. Миофибриллы этих клеток имели параллельное расположение, между ними находились цепочки митохондрий межмиофибриллярной популяции. В некоторых КМЦ были выявлены области саркоплазмы, утратившие миофибриллы и заполненные несократительными структурами, в том числе, митохондриями, расширенными везикулами саркоплазматического ретикулума. В межмиофибриллярной и околоядерной зонах КМЦ всех больных определялись отдельные митохондрии с зонами расхождения крист, заполненные хлопьевидным содержимым матрикса. Вставочные диски КМЦ были интенсивно развиты, имели зигзагообразные контуры, включали соединения типа fascia adherence, в меньшей степени – десмосомы и щелевые контакты. У 2 больных некоторые вставочные диски КМЦ демонстрировали локальные расхождения контактирующих мембран. У большинства больных в отдельных КМЦ были обнаружены множественные вставочные диски, расположенные на расстоянии 1-3 саркомеров. Характерным признаком многих КМЦ была дилятация каналов Т-системы. Содержание гликогена в КМЦ сильно варьировало, обычно оно было повышено в клетках с расширенными зонами утраты миофибрилл. Иногда в клетках выявляли скопления гликогена, окруженные мембранами, которые в ряде случаев могли входить в состав миелиноподобных образований. Миелиноподобные фигуры были обнаружены у большинства больных в некоторых КМЦ. Как правило, они располагались под сарколеммой. В отдельных КМЦ присутствовали мелкие жировые капли. Во всех изученных образцах миокарда выявлен умеренный или выраженный склероз, описанный в литературе как характерный признак миокарда больных ИБС (Zimmer G., et al., 1992), в том числе больных с постинфарктной аневризмой ЛЖ (Su X., et al., 2000). Размеры КМЦ были значительно выше нормы, при которой, как установлено (Maron B.J., et al., 1975), диаметр КМЦ составляет 10-15 мкм. Средний диаметр КМЦ у разных КМЦ демонстрировали ультраструктурные признаки, типичные для гипертрофированных больных находился в пределах от 28,96±6,17  до 32,21±7,03 мкм, что соответствовало тяжелой степени гипертрофии миокарда по классификации B.Kunkel, M. Schneider (1987). Таким образом, результаты морфологического исследования миокарда демонстрируют наличие в нем склеротических изменений, тяжелой степени гипертрофии КМЦ с началом их перестройки по типу дедифференцировки, что сопряжено со снижением их сократительной способности, а также выявлены дистрофические изменения КМЦ. Полученные результаты свидетельствуют, что у больных ИБС с постинфарктной аневризмой присутствуют значительные патологические изменения миокарда ЛЖ, что является основанием для целенаправленного применения клеточной и генной терапии для стимуляции регенеративных и ангиогенных процессов в пораженном миокарде.

В работе получена и оценена плазмидная конструкция, содержащая ген васкулоэндотелиального фактора роста VEGF165  (ангиостимулин). На модели ишемии задней конечности крысы и в тесте с матригелем продемонстрирована эффективность препарата и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей. Было выявлено, что эта конструкция позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF165 в тканях экспериментальных животных. Также в эксперименте продемонстрированы высокая переносимость и отсутствие токсичности препарата. Для изучения эффективности ангиогенных препаратов VEGF165 и bFGF была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Достоверный прирост количества капилляров был обнаружен через 30 дней после введения гена VEGF165, даже при введении минимальной в нашем исследовании (250 мкг) дозы препарата. Плотность капиллярной инфильтрации мышечной ткани после введения гена bFGF не отличалась от таковой в контроле (физиологический раствор). При изучении  проангиогенной активности генных препаратов в тесте с матригелем клетки человека линии НЕК 293 были трансфецированы плазмидой, содержащей ген VEGF165. В качестве контроля использовался аналогичный препарат, не экспрессирующий белок VEGF165 .

С целью более полной характеристики стволовых клеток-предшественников мы выделяли CD133+ клетки методом магнитной сепарации на покрытых антителами бусах из костного мозга больных ИБС. Анализ на проточном цитофлуориметре позволил выявить наличие двух субпопуляций в составе данной клеточной фракции: большая CD34+/CD133+ (69±3% от всех CD133-положительных клеток) и меньшая  CD34-/CD133+ (29±3%) субпопуляции. Обе эти субпопуляции в равной мере экспрессируют на поверхности рецептор к VEGF (99%) и не экспрессируют моноцитарно-макрофагальный маркер CD14.

В процессе культивирования в условиях, благоприятствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки, на протяжении 4 дней в популяции CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клеток параллельно с усилением экспрессии CD34 и маркера эндотелиальных клеток CD31, было зарегистрировано прогрессивное снижение экспрессии CD133 на клеточной поверхности. Тем самым, наши данные показывают, что субпопуляция клеток-предшественников CD34+/CD133+/VEGFR-2+ находится на более продвинутой стадии дифференцировки в направлении эндотелиальных клеток по сравнению с CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клетками. Дополнительно было проанализировано поглощение DiIAc-LDL и связывание лектина U. europaeus клетками. При этом удалось продемонстрировать, что в большей степени двойное положительное окрашивание этими специфическими для клеток эндотелия маркерами свойственно субпопуляции CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клеток по сравнению с CD34+/CD133+/VEGFR-2+ клетками (Рисунок 1). В отличие от этой последней субпопуляции клеток-предшественников, двойное положительное окрашивание по маркерам эндотелия проявляется уже через 24 часа культивирования, что позволяет предположить, что их более высокий дифференцировочный потенциал в направлении зрелых клеток эндотелия может быть связан с более высокой адгезивностью этих клеток. В связи с этим предположением, в тестах на адгезивность нам удалось показать, что стимулированная SDF-1 и зависимая от 1-интегрина адгезия выше в субпопуляции CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клеток по сравнению с CD34+/CD133+/VEGFR-2+ клетками (Рисунок 2).

Рисунок 1. 

Выделенные методом магнитной сепарации клетки разделяли на CD34+ и CD34- субпопуляции, культивировали в основной эндотелиальной среде. В обозначенные на рисунке сроки по методике приведенной в главе «Материалы и методы» определяли поглощение Dil-Ac-LDL и присоединение лектина U europaeus. (*Р<0,05 по сравнению с CD34+/CD133+ клетками, культивированными в течение 24 часов; #P<0,05 по сравнению с CD34+/CD133+ клетками, культивированными в течение 4 дней).

Рисунок 2.

Прилипание обозначенных на рисунке субпопуляций ЭПК к покрытому фибронектином предметному стеклу в присутствии или отсутствии SDF-1 (100 nmol/L, 5 min) оценивали под световым микроскопом (х100) путем прямого подсчета прилипших клеток после 3 интенсивных отмывок 1х PBS. Для каждой группы оценивали по 5 препаратов; (*Р<0,05 по сравнению с нестимулированными клетками; #P<0,05 по сравнению с SDF-1-стимулированными CD34+/CD133+ клетками).

В итоге экспериментальных исследований была отработана методика получения высокоочищенной популяции CD133+ стволовых клеток костного мозга. Показано, что данная популяция состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток и более дифференцированных CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток. В экспериментах in vitro установлено, что субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток обладает большим по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками потенциалом к дифференцировке в направлении эндотелиального ростка. Тем самым обоснована большая перспективность использования маркера CD133 по сравнению с CD34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ИБС и ХИНК.

2. Результаты клинического применения ангиогенных факторов.

На ограниченном контингенте больных (n=101) с ишемическим поражением миокарда и при ишемии нижних конечностей проанализирована эффективность трансплантации генного препарата и клеток-предшественников для стимуляции регенеративных процессов.

Препарат «Ангиостимулин» был введен 29 пациентам, страдающим ИБС. Из 29 пациентов исходно 24 (83%) находились в III – IV ФК стенокардии (ССS), после операции  большинство пациентов (21 человек, 84%) относились к I и II ФК. 11 пациентам было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина».13 пациентам при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ТМРЛ. 5 пациентам было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина», в дальнейшем эта группа выбыла из наблюдения. Сравнение результатов лечения проводилось между 1 группой (КШ+VEGF) и 2 группой (КШ+VEGF+ТМЛР). Значительно снизилась потребность в приеме нитратов и возросла толерантность к нагрузке у пациентов обеих групп. При оценке  изменения сократимости миокарда ЛЖ по данным ЭхоКГ было выявлено в леченных, а также в смежных к пролеченным сегментах обеих групп наблюдался прирост количества нормокинетичных и уменьшение гипо- и акинетичных сегментов. При оценке индекса региональной сократимости было определено достоверное уменьшение значения WMSI в первой группе при оценке всех пациентов вместе в сроки от 2 месяцев. Во второй группе также отмечается небольшая, однако, недостоверная положительная динамика. Большая  выраженность данной тенденции у пациентов 1 группы, возможно, связана с более тяжелым исходным состоянием сократимости миокарда у этих больных.

При оценке изменения перфузии миокарда оперированных больных с помощью  ОФЭКТ с 99mТс-тетрофосмином  все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 3 подгруппы: леченные, смежные к леченным и нелеченные.

Леченные сегменты: у пациентов 1-й группы (АКШ+VEGF) отмечается достоверное увеличение накопления РФП при нагрузке в ранние сроки после операции (до 1 месяца), затем наблюдается некоторая тенденция к снижению (статистически недостоверная), но с сохранением положительного эффекта в сравнении с дооперационным исследованием (таблица 1). В покое наблюдаются схожие изменения, но не такие существенные, как при нагрузке. У пациентов 2-й группы (АКШ+ТМЛР+VEGF) в нагрузке в  раннем постоперационном периоде наблюдаются схожие с 1-й группой достоверные изменения (прирост накопления РФП в сроки до 1 месяца), а также, в отличие от 1-й группы, наблюдается достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (1 год). Изменения в покое менее выражены (недостоверный прирост в 1-й месяц, положительная динамика в отдаленном периоде).

Смежные сегменты: у пациентов 1-й группы при исследовании в нагрузке отмечен незначительный, но достоверный прирост накопления РФП и далее – достоверное снижение (даже в сравнении с исходным накоплением) при наблюдении до 1 года (таблица 2). Наблюдения в покое повторяют результаты исследования в нагрузке. У пациентов 2-й группы мы не нашли достоверных изменений при исследовании в нагрузке.  В покое отмечено незначительное достоверное снижение накопления РФП к 2-4 месяцам и затем небольшой прирост в сроки до 1 года.

Таблица 1. Показатели накопления РФП (в %) в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции у пациентов 1 и 2 групп.

N

Срок наблюдения (п/о)

Накопление РФП (%) в леченных сегментах:

Ме (10-90%)

На нагрузке

В покое

1 группа n=100

2 группа n=132

1 группа

n=132

2 группа n=132

1

Исходно

58 (29-80)

63 (41-84)

68 (34-83)

68 (49-86)

2

До 1 месяца

70 (41-85)

71 (50-86)

69 (44-88)

73 (51-90)

3

2-4 месяца

66 (42-82)

69 (49-85)

70 (49-86)

70 (52-87)

4

6-8 месяцев

65 (39-80)

69 (50-83)

67 (45-83)

70 (51-83)

5

1 год

64 (32-78)

80 (64-90)

64 (37-86)

79 (58-88)

р < 0,05

1-2, 1-3,

1-4, 1-5

1-2, 1-3, 1-4, 1-5,

2-3, 2-4, 2-5, 4-5

1-2, 1-3, 2-4, 3-5

1-5, 2-3, 2-5, 4-5

Таблица 2. Показатели накопления РФП (в %) в смежных сегментах исходно и в различные сроки после операции у пациентов 1 и 2 групп.

N

Срок наблюдения (п/о)

Накопление РФП (%) в смежных сегментах:

Ме (10-90%)

На нагрузке

В покое

1 группа n=41

2 группа n=56

1 группа

n=44

2 группа n=56

1

Исходно

52 (29-65)

58 (38-76)

56 (39-73)

60 (42-74)

2

До 1 месяца

55 (34-73)

57 (43-73)

57 (36-77)

58 (46-71)

3

2-4 месяца

46 (33-59)

59 (43-70)

51 (40-76)

57 (41-76)

4

6-8 месяцев

46 (30-59)

56 (41-80)

52 (37-72)

60 (45-77)

5

1 год

44 (30-54)

61 (47-73)

46 (34-54)

64 (59-81)

р < 0,05

1-2, 2-3,

2-4, 2-5

-

1-2, 2-3, 2-4, 3-4, 3-5

1-3, 1-5, 2-3, 2-5, 3-4, 4-5

Каких-либо существенных изменений в нелеченных сегментах не выявлено.

При оценке площади дефектов перфузии в динамике было выявлено, что у пациентов обеих групп отмечалось существенное уменьшение площади ДП (%) как при нагрузке, так и в покое в 1-й месяц после операции в сравнении с дооперационными значениями. Помимо этого, практически исчезает разница площадей дефектов при нагрузке и в покое, что свидетельствует о редукции ишемии миокарда. В 1-й группе в дальнейшем наблюдалось постепенное увеличение площади дефекта в течение года наблюдений, не достигшее, однако дооперационных значений. Во 2-й группе небольшое увеличение площади дефектов в 2-4 месяца сменялось второй волной снижения к 6-12 месяцам наблюдения. Суммарно результаты изучения динамики площадей дефектов перфузии повторяют тенденции, обнаруженные при сегментарной оценке накопления РФП.

Аутологичные клетки-предшественники CD133+ были введены 22 пациентам с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии. Все пациенты находились под динамическим наблюдением, в течение которого им было проведено комплексное обследование в различные сроки после операции. Из 22 пациентов исходно 9 (41%) находились в III ФК и 13 (59%) в IV ФК СН по классификации. В послеоперационном периоде у большинства пациентов (68%) отмечается переход в более благоприятный функциональный класс сердечной недостаточности классификации NYHA. После операции улучшение в функциональном классе сердечной недостаточности наблюдается как у пациентов с ИБС, так и у больных с ДКМП. Средний ФК исходно составил: в группе ИБС – 3,4±0,5, в группе ДКМП – 3,75±0,45; после операции достоверно уменьшился и составил при обследовании в отдаленном периоде (к 1 году): в группе ИБС – 2,0±0,6, в группе ДКМП – 2,0±0,4. У больных ИБС достоверно снизился функциональный класс стенокардии по классификации CCS. Толерантность к нагрузке возросла у пациентов обеих групп, что было подтверждено при проведении тредмил-теста. При проведении ЭхоКГ также было выявлено достоверное улучшение сократимости миокарда ЛЖ в группах пациентов, страдающих ИБС и ДКМП.

При оценке индекса региональной сократимости было получено достоверное уменьшение значения WMSI в группе ИБС, в группе ДКМП небольшая положительная динамика оказалась недостоверной. Данные отличия в динамике сократимости между больными ИБС и ДКМП предположительно связаны с более благоприятным исходным состоянием миокарда ЛЖ у больных ИБС.

При сравнении до- и послеоперационных объёмных показателей ЛЖ выявлено достоверное уменьшение КДО и КСО ЛЖ в обеих группах. В группе пациентов с ИБС до операции КДО составил 262,0 ± 53,2 (122-335) мл/м2, КСО - 173±69,5 (55-279) мл/м2 , а к 1 году после операции 207,4 ± 40,5 (97-253) мл/м2 и 114,2 ± 43,5 (47-222) мл/м2 соответственно. У больных ДКМП КДО и КСО в различные сроки после вмешательства так же достоверно уменьшались по сравнению с исходными значениями: КДО 296,3 ± 56,2 (186-394) мл/м2 против 222,7 ± 49,1 (187-257) мл/м2; КСО 214,8 ± 51,4 (116-289) мл/м2 против 143,7 ± 38,2 (99-170) мл/м2 . Тенденция к уменьшению объёмных показателей ЛЖ у больных с ДКМП менее выражена, что объясняется более тяжелым исходным состоянием миокарда в данной группе больных.

Анализ посегментарной сократимости по данным ЭхоКГ показал, что и у больных ИБС, и ДКМП отмечается положительная динамика к 1 году после клеточной кардиомиопластики (ККМП). У больных ИБС количество нормокинетичных сегментов увеличилось на 14%. У пациентов с ДКМП через 1 год после процедуры ККМП отмечали уменьшение количества сегментов со значительным гипокинезом, акинетичных сегментов не наблюдали, нормокинетичные сегменты составили 6%.

При оценке перфузии миокарда ЛЖ с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) с 99mТс-тетрофосмином все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 2 подгруппы: леченные (согласно зонам миокарда, в которые были введены аутологичные клетки-предшественники CD133+) и нелеченные. Сначала были проанализированы средние показатели накопления РФП (%) в каждой группе без разделения их по степени исходного нарушения перфузии. При этом в леченных сегментах у пациентов ИБС отмечалось достоверное увеличение накопления РФП (прирост от 10% и более) на нагрузке в поздние сроки после операции (к 1 году). В покое не наблюдалось достоверных изменений перфузии миокарда в этих зонах. У пациентов ДКМП на нагрузке также наблюдался достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (прирост накопления РФП в сроки к 1 году). Изменений перфузии в покое не отмечали. Результаты исследования нелеченных сегментов показали, что для них характерно отсутствие каких-либо существенных изменений в динамике.

Чтобы оценить эффективность методики, дополнительно была проанализирована  динамика количества нормально перфузируемых и с различной степенью нарушения перфузии сегментов до операции и через 1 год после вмешательства. Оказалось, что количество нормально перфузируемых сегментов увеличилось только в группе леченных сегментов у больных ИБС и ДКМП, при этом количество сегментов с различной степенью нарушения перфузии уменьшилось. В нелеченных сегментах, аналогичных изменений выявлено не было. При анализе показателей систолического утолщения,  в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается достоверно положительная динамика. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения.

На рисунках 3 и 4 представлена динамика величины дефектов перфузии (ДП) на нагрузке и в покое у больных ДКМП и ИБС. Как видно из рисунков, у пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке, так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационными показателями. Помимо этого, отмечается незначительное уменьшение разницы площади дефекта перфузии на нагрузке и в покое.

Рисунок 3. Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на  нагрузке и в покое у больных  ИБС.

Рисунок 4. Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на  нагрузке и в покое больных ДКМП.

Для оценки клинической эффективности клеточной кардиомиопластики в зависимости от способа введения аутологичных клеток-предшественников CD133+ проводилась оценка перфузии миокарда в динамике после операции у 6 больных с изолированным интракоронарным способом введения CD133+ (группа 1) и у 4 пациентов при изолированном интрамиокардиальном транскатетерном способе доставки клеточного материала (группа 2). Всего у данной группы пациентов было проанализировано 200 миокардиальных сегментов, из которых леченных – 104, нелеченных – 96. Для анализа эффективности способа введения клеток использовали интегральный показатель прироста накопления РФП к году после операции относительно исходного уровня. В леченных сегментах, при интрамиокардиальном способе введения накопление РФП достоверно увеличивалось на нагрузке в сегментах с умеренным, значительным и выраженным снижением перфузии в среднем на 20% относительно исходного уровня. В сегментах с выраженным нарушением перфузии накопление РФП, хотя достоверно и увеличивалось, но ни в одном сегменте в послеоперационных исследованиях уровень накопления РФП не превышал 50% от максимального. В сегментах с исходно нормальной перфузией достоверных изменений выявлено не было. При интракоронарном способе введения накопление РФП также увеличивалось, но ни в одном сегменте не было выявлено достоверной разницы изменения перфузии ни на нагрузке, ни в покое. Прирост накопления РФП не превышал в среднем 10%. В нелеченных сегментах достоверной и выраженной разницы в показателях накопления РФП, в исходно нормально перфузируемых сегментах и в сегментах с различными типами нарушения перфузии до операции и в зависимости от способа введения CD133+ выявлено не было ни на нагрузке, ни в покое. При анализе показателей систолического утолщения в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается более выраженная достоверно положительная динамика при интрамиокардиальном способе введения клеток. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения. У пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке так  и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационным. Однако при интрамиокардиальном введении клеток эта тенденция выражена более явно.

Качество жизни пациентов ИБС и ДКМП после лечения с помощью аутологичных клеток-предшественников CD133+ достоверно улучшилось по всем шкалам опросника SF – 36. Достоверное улучшение качества жизни наблюдается уже спустя 3 месяца после вмешательства и постепенно возрастает к 1 году в сравнении с исходными значениями.

Результаты терапевтического применения аутологичных клеток-предшественников CD133+ у пациентов с ревматическим анамнезом и хронической сердечной недостаточностью.

При сравнении результатов ЭхоКГ исследования пациентов до и после введения клеток CD133+ было отмечено достоверно уменьшение размеров ЛЖ (КДО, КСО, КДР и КСР), что сопровождалось улучшением сократительной функции ЛЖ.

Результаты применения терапевтического ангиогенеза при ХИНК.

При применении терапевтического ангиогенеза при ХИНК побочных эффектов после введения стимуляторов ангиогенеза отмечено не было. Уровень мочевины в сыворотке пациентов, получивших «Ангиостимулин», в динамике значимо не отклонялся от нормальных показателей (15-50 мг/%) в течение всего периода наблюдения.

Через 1 месяц после введения стимулятора клиническое улучшение состояния нижней конечности отмечалось в 80 % случаев. Заживление трофических язв через 1,5-3 месяца наблюдалось в 3 из 6 случаев, положительная динамика со стороны долго незаживающих послеоперационных ран – также в 3 случаях. Отмечалось уменьшение болевого синдрома у пациентов. При раздельном анализе эффект лечения через 1 месяц более выражен у пациентов 1-ой группы (p<0,05): клиническое улучшение появилось у 90% пациентов 1-ой группы и у 73 % больных 2-ой группы. Если во 2-ой группе клиническое улучшение ограничилось минимальным (+1 по Рутерфорду), то в 1-й в 40 % случаев возникло умеренное улучшение (+2 по Рутерфорду). Через 3 месяца клинический эффект наступил у 100 % пациентов в обеих группах. В 1-й группе умеренное улучшение отмечено у 78 % пациентов, а во 2-й – у 57 %; минимальное в 1-й группе – у 22 % больных, во 2-й – у 43 %.

К 6-му месяцу эффект сохраняется у всех пациентов 1-й группы и у 81 % - 2-й группы. Положительная динамика в обеих группах в лучшем случае не превысила «+2» по Рутерфорду (умеренное улучшение), однако, и ухудшения по причинам, связанным с исследованием, отмечено не было. Возврат состояния конечности к исходному установлен в 2 случаях во 2-й группе исследования (19 %) , что обусловлено атроэмболией из аорты.

В отдалённом периоде (больше 6 месяцев) обследовано 3 пациента. По причине стабильной положительной динамики со стороны нижних конечностей и отсутствия отрицательной со стороны других артериальных бассейнов им не проводилась дополнительная терапия. У двоих из них наступило клиническое выздоровление (полностью исчезли симптомы ишемии) через 9 месяцев после введения стимулятора ангиогенеза (клетки-предшественники); у одного – достигнутый к 6-му месяцу эффект (умеренное улучшение) сохраняется уже в течение 2 лет.

Средний прирост напряжения кислорода через 1 месяц в 1-й группе составил 7,5 мм рт. ст., во 2-й группе – 6,5 (р<0,05 в обеих группах), через 3 месяца в 1-й группе – 14,0 мм рт.ст., во 2-й – 10,4 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц), через 6 месяцев в 1-й группе – 16,0 мм рт.ст., во 2-й – 13,0 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц и через 3 месяца для 1-й группы). Средний прирост напряжения кислорода в 1-й группе выше на всех этапах наблюдения, но статистическая достоверность получена лишь через 3 месяца (p<0,05).

При анализе результатов транскутанного напряжения кислорода в 1-й группе в зависимости от способа введения стимулятора наблюдалось достоверное увеличение показателя Тк РО2. При внутриартериальном введении клеток-предшественников в течение 3 месяцев, при внутримышечном – в течение всего периода наблюдения. Средний прирост Р О2  при внутримышечном введении клеток-предшественников выше на всех этапах наблюдения, но статистической достоверности различий между группами с разными способами введения стимулятора не получено (p>0,05).

Для оценки толерантности к физической нагрузке у пациентов с перемежающейся хромотой проводился тредмил-тест. ДББХ и МДХ достоверно увеличиваются в течение всего периода наблюдения: в меньшей степени за первый месяц, в большей – за последующие месяцы. Через 1 месяц ДББХ увеличивается на 0,58 минуты, через 3 месяца ещё на 1,88 минуты, через 6 месяцев – на 3,17 минуты (суммарно за 6 месяцев на 5,63 минуты). МДХ к 6 месяцу возросла на 5,82 минуты. В 2 случаях через 3 месяца и в 4 (44 %) – через 6 месяцев тредмил-тест прекращен через 12 минут (512 метров) по причине его полного выполнения (переход во 2А степень ХИНК).

Через 3 месяца после введения стимулятора ангиогенеза появление новых видимых коллатеральных сосудов отмечено у всех ангиографически обследованных пациентов. В среднем увеличение коллатеральной сети в 1-й группе составило +2,28+/-0,75 (p>0,05, n=7), во 2-й – +2,0+/-0,45 (р<0,01, n=11). Установлена прямая достоверная связь между динамикой увеличения коллатеральной сети и изменением клинического статуса конечности (по Рутерфорду), транскутанным напряжением кислорода, средним показателем перфузии. Возраст и исходная тяжесть ишемии конечности достоверно не влияли на увеличение количества коллатеральных сосудов по данным ангиографии.

Клиническое улучшение состояния нижних конечностей оказало существенное влияние на качество жизни пациентов. Физическая активность (ФА), показатель влияния болезни на выполнение физических нагрузок, достоверно ниже принятого за норму показателя качества жизни здоровой популяции г. Санкт-Петербург исходно в обеих группах (р<0,05). В динамике наблюдается улучшение данного параметра. В 1-й группе значимо ФА возрастает к 3 месяцу, приближаясь к нормальному значению через 6 месяцев. Во 2-й группе лишь через 6 месяцев установлено значимое увеличение ФА, не достигшей нормального значения (p<0,05), что вероятно обусловлено преклонным возрастом пациентов и большим количеством сопутствующих заболеваний.

Интенсивность боли и её влияние на повседневную деятельность, достоверно снижается и, соответственно, увеличивается показатель болевого фактора (БФ) через 3 месяца в обеих группах исследования. Значимого отличия между показателями БФ на различных этапах наблюдения у пациентов 1-й группы и нормальным значением установлено не было. Во 2-й группе значение БФ значительно ниже нормального уровня в течение первых 3 месяцев и приближается к нормальному значению к 6 месяцу.

Общее здоровье (ОЗ), на момент заполнения опросника и перспектив лечения достоверно отличалась на начальном этапе в обеих группах от нормального значения. В последующем данный показатель приближается к нормальному даже во 2-ой группе, где отсутствует значимый прирост ОЗ, что подтверждает наличие положительной динамики в лечении.

В отличие от показателя ОЗ жизнеспособность (ЖС), сравнима с нормальным значением, а через 6 месяцев в 1-ой группе – превышает его (p<0,05), что объясняется значительным улучшением эмоционального настроя пациентов на фоне улучшения физического состояния. То же можно сказать и о психическом здоровье (ПЗ) пациентов. При исходно значительно сниженном ПЗ у пациентов 1-ой группы по сравнению с нормальным значением (p<0,05), уже в течении первого месяца эмоциональная картина меняется – ПЗ стремится к нормальному. Показатель РПП (влияния эмоционального состояния на жизнедеятельность) достоверно увеличивается у пациентов 2-й группы через 1 месяц, у пациентов 1-й группы – через 3 месяца. Социальная активность ожидаемо возростает, достоверно не отличаясь от нормального значения. Часть пациентов (6 человек – 24 %) изменили планы на будущее: трое снова начали, а трое продолжили работать после длительного перерыва.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Значительное число больных ИБС (от 5 до 21% по разным оценкам) имеют противопоказания к реваскуляризации хирургическими и интервенционными методами, либо у них таким способом не удается достичь полной реваскуляризации (de Feyter P., 1992; Mukherjee D. и соавт., 1999) и снять симптоматику стенокардии. В такой ситуации целесообразно рассматривать возможность применения терапевтического ангиогенеза, позволяющего обеспечить полноценный кровоток путем стимуляции формирования  новых сосудов (Laham R. и соавт., 2000). Аналогичным образом, заметное количество больных хронической ишемией нижних конечностей (до 5%) страдают от остаточных симптомов после хирургии и традиционной терапии (Baumgartner I. и соавт., 2000). Несомненно, в этой группе больных терапевтический ангиогенез выглядит перспективным дополнением хирургического лечения. Более того, тяжелая сердечная недостаточность – прогрессирующий синдром, характеризующийся необратимой утратой миоцитов, теоретически может быть компенсирован за счет стимуляции регенерации миоцитов, т.е. миогенеза.

Первый этап нашего исследования был посвящен созданию генетической конструкции для терапевтической стимуляции ангиогенеза у нуждающихся в этом больных. В качестве преспективных генов-кандидатов были выбраны VEGF165 и bFGF. Полученные на основе pBK-CMV генетические конструкции эффективно воспроизводятся в культуре E. coli, и с высокой степенью чистоты могут быть выделены из клеточного лизата на колонках фирмы Qiagen. Созданная таким образом конструкция позволяет относительно легко нарабатывать значительные (15 – 50 мг за один цикл выделения) количества плазмидной ДНК, пригодной для введения больным. Мы остановились на плазмидной конструкции в качестве стимулятора ангиогенеза основываясь, во-первых, на относительной дешевизне и простоте получения значительного количества препарата, во-вторых, на данных об эффективной экспрессии плазмидной ДНК в мышечной ткани (Tripathy и соавт., 1996), и, в-третьих, из-за опасения осложнений, связанных с применением у больных вирусного вектора (Marshall и соавт., 2003). Последующее исследование токсичности и переносимости препаратов подтвердили безопасность их применения в эксперименте на животных, и в перспективе – для лечения больных. Первично эффективность препарата VEGF165  была проверена в стандартном тесте с матригелем. Продемонстрирована экспрессия кодируемого плазмидой белка VEGF165 в человеческих клетках НЕК 293, а имплантация крысе помещенных в матригель трансфецированных плазмидой клеток приводила к эффективной стимуляции процессов ангиогенеза в коже.

Следующим этапом нашего исследования стала проверка эффективности сконструированных препаратов на модели хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Сравнительное изучение эффективности двух генетических конструкций показало, что через 30 дней после введения в зону ишемии даже минимальной из использованных нами в эксперименте доз (250 мкг/животное) VEGF165 отмечается достоверное по сравнению с контролем увеличение плотности капиллярного русла, в то время как введение даже максимальной в рамках данного исследования дозы bFGF (750 мкг/животное) не оказывает существенного влияния на кровоток в ишемизированной конечности. Ангиогенная эффективность белковых препаратов FGF была продемонстрирована в ряде экспериментов на животных, как при локальном, так и при интракоронарном способах введения (Lazarous D. и соавт., 2000; Rajanayagam M. и соавт., 2000). В то же время результаты клинических испытаний белковых и генетических препаратов FGF далеко не так однозначны (Ruel M. и соавт., 2002; Simons M. и соавт., 2002). На данном этапе наших исследований, мы решили сосредоточиться на клинических испытаниях содержащей VEGF165 плазмиды (препарат «Ангиостимулин»).

Поскольку ишемия органа приводит, в том числе к истощению регенеративных возможностей за счет уменьшения числа резидентных стволовых клеток, введения ангиогенных факторов может оказаться недостаточно для полноценного восстановления функции органа. В этой связи привлекательной альтернативой выглядит использование стволовых плюрипотентных клеток. Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) представляют собой гетерогенную группу клеток, характеризуемую экспрессией ряда поверхностных маркеров, таких как CD34, CD133 и VEGFR-2 (KDR или Flk-1), способностью накапливать DiI-Ac-LDL и связывать считающиеся специфичными для эндотелия лектины, такие как Ulex europaeus. Маркер стволовых клеток  CD34 в меньшем количестве выявляется также на зрелых клетках эндотелия, и поиск более специфичных маркеров привел к обнаружению CD133, с высокой плотностью экспрессируемого на незрелых стволовых клетках, и утрачиваемого в процессе дифференцировки (Handgretinger R. и соавт., 2003). Предполагается, что в популяции ЭПК наличествуют две субпопуляции: более примитивная CD133+/CD34-/VEGFR-2+ и более зрелая CD133+/CD34+/VEGFR-2+. Нашей задачей было более подробно исследовать субпопуляционный состав ЭПК, а также фенотипически и функционально охарактеризовать эти клетки в условиях in vitro и in vivo.

Использованный в нашей работе способ выделения позволяет с высокой эффективностью получать очищенный препарат аутологичных стволовых клеток пациента. На выходе с колонки мы получали 1-3 миллиона стволовых клеток.

Анализ поверхностного фенотипа выделяемых клеток позволил продемонстрировать наличие в костном мозге обследованных пациентов CD133+/CD34- субпопуляции стволовых клеток, которые в дальнейшем дифференцируются в субпопуляцию, экспрессирующую CD133+/CD34+, и в ходе последующей дифференцировки в соответствующих условиях in vitro приобретают фенотип зрелых эндотелиальных клеток. В то же время, эта субпопуляция CD133+/CD34- ЭКП функционально оказалась более активной, чем теоретически более зрелая субпопуляция ЭКП CD133+/CD34+. В условиях in vitro эта субпопуляция клеток-предшественников после обработки SDF-1 более активно прилипает к обработанной фибронектином поверхности и более эффективно дифференцируется в зрелые эндотелиальные клетки по сравнению с субпопуляцией CD133+/CD34+ клеток.

Со времени первого сообщения в научной литературе (Asahara T. и соавт., 1997) было принято считать, что фенотип ЭКП определяется экспрессией на поверхности маркеров CD34 и VEGFR-2. В дальнейшем, обнаружение маркера стволовых клеток CD133 (Peichev M. et al., 2002), экспрессия которого, в отличие от CD34 утрачивается по мере дифференцировки ЭКП в клетки эндотелия, позволило подразделить популяцию ЭКП на субпопуляцию CD133+/CD34+/VEGFR-2+, предположительно состоящую из более ранних клеток-предшественников, и субпопуляцию CD133-/CD34+/VEGFR-2+ клеток, предположительно далее продвинувшуюся по пути дифференцировки эндотелиального ростка (Peichev M. c соавт.). Полученные нами данные указывают на вероятность существования третьей, потенциально более примитивной субпопуляции ЭКП, определяемой экспрессией на поверхности CD133 и VEGFR-2 при отсутствии экспрессии CD34. Этот вывод подкрепляется результатами, полученными  Guo Y. и соавт.  В своей работе они показали, что в процессе культивирования in vitro CD34-отрицательные стволовые клетки, выделенные из костного мозга мышей, приобретают способность экспрессировать CD34, т.е. CD34- стволовые клетки могут быть предшественниками CD34+ клеток. Аналогичным образом, в нашем исследовании CD133+/CD34- ЭКП из костного мозга человека дифференцировались в CD133+/CD34+ клетки при культивировании in vitro в условиях, способствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки. Описанная нами субпопуляция CD133+/CD34- ЭКП отличается от субпопуляции ЭКП, описанной Rehman и соавторами, поскольку последнюю характеризует высокий уровень экспрессии CD14 (95,7%) и низкий уровень экспрессии CD133 (0,16%) на поверхности клеток, в то время как исследованные нами CD133+/CD34- не экспрессируют CD14. Kuci S. и соавторы (Hangretinger R.  и соавт., 2003) показали, что получаемая при культивировании in vitro мононуклеаров человеческой крови в присутствии Flt3/Flk2 лиганда и интерлейкина-6 субпопуляция стволовых CD133+ клеток не экспрессирует CD34 и обладает способностью репопулировать костный мозг мышей с двойной мутацией: тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом I-го типа. После трансплантации эти клетки приживались на значительно более длительное время, чем свежевыделенные CD34+ клетки. Кроме того, на ограниченном контингенте больных (6 пациентов) было показано, что трансплантация CD133+ клеток ведет к улучшению функционирования миокарда в постинфарктный период (Stamm C. et al.,2003). Наблюдение за пересаженными бестимусным мышам CD133+ клетками-предшественниками из пуповинной крови человека показало, что они участвуют в формировании капиллярной сети в ишемизированной задней конечности, стимулируют процессы неоваскуляризации и способствуют восстановлению ишемизированых тканей задней конечности. Тем не менее, конкретные механизмы, опосредующие миграцию стволовых клеток в ишемизированные ткани, а также регуляция и механизм регенеративного действия CD133+ стволовых клеток требуют дальнейшего, более углубленного экспериментального исследования.

Хотелось бы подчеркнуть, что по нашему мнению, субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ ЭКП костномозгового происхождения играет ключевую роль в регенерации эндотелия и восстановлении поврежденных тканей. Учитывая их высокую регенеративную способность, представляется рациональной трансплантация таких клеток в терапевтических целях. По результатам наших экспериментов, мы предполагаем, что субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток содержит предшественники CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток и обладает более высоким по сравнению с последними потенциалом восстановления сосудистого русла. Полученные нами данные расширяют современные представления о гетерогенности популяций ЭКП и могут иметь значение для лечения ишемической болезни сердца и патологии магистральных сосудов.

При ИБС в основе всех патологических процессов лежит, как правило, постепенное прогрессирование артериальной недостаточности с нарушением периферической макрогемодинамики в результате развития стенотических и облитерирующих процессов в артериях. Прежде всего, это касается микроциркуляторных расстройств, которые развиваются вторично из-за низкого перфузионного давления (Савельев В.С. и соавт., 1997). Отмечается поражение капилляров, питающих мышечные волокна конечностей, дегенеративные изменения эндотелия в них и агрегация форменных элементов крови. Поэтому клиника тяжелой ишемии определяется как микроциркуляторными нарушениями, так и изменениями гемореологическими. Несостоятельность капиллярного кровообращения является одним из ведущих факторов в развитии грубых трофических нарушений у пациентов с декомпенсацией каппилярного кровотока (Казаков Ю.И. и соавт., 1997). Следует отметить, что даже при идеально выполненной операции микроциркуляция в конечности не нормализуется в течение 2-3 лет после операции и ухудшается из-за продолжающегося прогрессирования основного патологического процесса. Поэтому все пациенты после операции нуждаются в продолжении консервативной терапии, независимо от исхода хирургического лечения (в том числе по причине сопутствующего поражения других артериальных бассейнов). Больным же с неоперабельным поражением дистального артериального русла нижних конечностей, слабым развитием коллатеральных путей кровотока и, соответственно, минимальным клиническим улучшением и при отсутствии динамики после операции (по результатам нашего исследования всего в 15 % случаев) помимо принятого объёма консервативной терапии требуется более интенсивное воздействие на коллатеральное русло глубокой бедренной и подколенной артерий.

При клиническом применении генных технологий (плазмидной конструкции VEGF165) для лечения хронической критической ишемии нижних конечностей (терапевтическая доза препарата составляет 1000 мкг (Isner J. И соавт., 1999) различной этиологии (атеросклероз и облитерирующий тромбангиит) по данным литературы уже через 1 месяц после введения препарата получен статистически достоверный положительный результат. Максимальный терапевтический эффект отмечен к третьему месяцу. Сходная динамика установлена и нами. У большей части пациентов (до 71 %) полностью прекратились или уменьшились боли покоя (до 86 % по данным литературы), у 4 из 5 пациентов зажили или значительно уменьшились трофические язвы (57-67 % по данным литературы), на 10,4-13 мм рт.ст. увеличилось транскутанное напряжение кислорода, показатели перфузии конечности по данным лазерной допплеровской флоуметрии, в среднем на 0,1 – индекс лодыжечного давления (по данным литературы на 0,15-0,19), на 1,88 минуты – длительности безболевой ходьбы (на 1,3 минуты по данным литературы); возросло количество новообразовавшихся видимых коллатеральных сосудов на уровне колена, голени и стопы по данным ангиографического исследования – средний прирост составил +2,0+/-0,45 (по разным данным литературы в среднем +1,3+/-0,04). В той или иной степени к 3 месяцу клиническое улучшение отмечается у всех пациентов (90% пациентов по данным литературы), при этом умеренное улучшение по шкале Рутерфорда – в 57 % случаев (50% по данным литературы (Baumgartner I. и соавт., 1998).

ВЫВОДЫ

  1. Активизация восстановительных процессов в ишемизированных тканях достигается путем индукции в них процессов ангио/миогенеза, которые могут быть усилены применением ангиогенезстимулирующих факторов.
  2. Созданная плазмидная конструкция ангиогенного препарата – ангиостимулин - биосовместима, нетоксична, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF165, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях. 
  3. Высокоочищенная популяция CD133+ стволовых клеток костного мозга состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток и более дифференцированных CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток, причем субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток обладает более высоким потенциалом дифференцировки в направлении неоангиогенеза.
  4. Клетки CD133+ обладают более выраженной ангиогенной активностью по сравнению с CD34+, и поэтому именно эти клетки должны использоваться для стимуляции ангиогенеза при лечении ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.
  5. Препарат «ангиостимулин» улучшает перфузию миокарда в наиболее пораженных ишемией сегментах и этот эффект сохраняется не менее года.
  6. При сравнительной оценке эффективности способов введения аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133+ для стимуляции регенеративных процессов в миокарде, показано что при интрамиокардиальном введении отмечается достоверное улучшение перфузии в леченных сегментах с исходно умеренным и значительным снижением перфузии. При интракоронарном способе введения достоверных изменений показателей перфузии получено не было.
  7. Как при артериальном, так и при внутримышечном введении аутологичных клеток-предшественников CD133+ или гена VEGF165 зарегистрировано образование новой сосудистой сети при лечении ХИНК.
  8. После аутотрансплантации клеток-предшественников CD133+ достоверно улучшалось качество жизни больных ИБС и ХИНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Исходя из результатов проведенных исследований представляется целесообразным

применение внутримышечного введения генного препарата VEGF165 (ангиостимулина) при ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей (с учетом критериев включения и исключения пациентов).

Использование аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133+ можно рекомендовать для лечения сердечной недостаточности в сочетании с хирургическими методами, при этом наиболее эффективным является метод изолированного интрамиокардиального введения.

При лечении ХИНК можно рекомендовать как внутриартериальное,  так и внутримышечное введение аутологичных клеток-предшественников CD133+ или ангиостимулина (гена VEGF165).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Бокерия Л.А., Еремеева М.В.Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, 2000, №2, 57-61.
  2. Еремеева М. В., Голухова Е.З. Факторы ангиогенеза при ишемии. Стимуляция неоангиогенеза в миокарде. Лекции по кардиологии, в 3-х томах, под ред. Бокерия Л.А. и Голуховой Е.З., изд. НЦССХ им. А.Н.Бакулева, Москва, 2001, с.161-170.
  3. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М. В., Киселев С.Л. Стимуляция неоангиогенеза при ишемии миокарда. Первый этап доклинических испытаний плазмидной ДНК VEGF. Пятая ежегодная сессия Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр. 136.
  4. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Э.С. Полякова. Разработка клинико-диагностических критериев отбора больных ИБС для применения терапевтического ангиогенеза. Седьмой всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр.231.
  5. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Полякова Э.С., Серов Р.А. Про- и антиангиогенные факторы при ишемической болезни сердца в зависимости от степени выраженности атеросклероза. VI ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2002, №3, стр.161.
  6. . Eremeeva M., Golukhova E., Alshibaya M., Berishvili I., Bockeria L.  Angiogenic factors production stimulated by different methods of myocardial revascularisation. 8-th International Local Drug Delivery meeting and cardiovascular course on Radiation and molecular strategies, Geneva, Switzerland, 2002, p.18.
  7. Eremeeva M.V., Golukhova E.Z., Bockeria L.A. Endogenous angiogenesis activation in ischemic heart disease patients: different methods of myocardial revascularization of strategies for therapeutic angiogenesis. In book “Angiogenesis bench to bedside”, 2003, Medical and Engineering Publishers Inc., pp.275-292.
  8. Л.А. Бокерия, М.В. Еремеева, Э.С. Полякова, Т.Т. Какучая, М.А. Лукашкин.  Прогностическая значимость определения уровня pro-ANP и pro-BNP для оценки  степени сердечной недостаточности и эффективности терапевтического ангиогенеза. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, №3, стр.161.
  9. Л.А.Бокерия, Е.З.Голухова, И.П.Асланиди, М.В.Еремеева, В.Ю.Мерзляков, И.И.Беришвили, А.Ф.Клюева, Т.Т. Какучая, Э.С. Полякова, М.А.Лукашкин.  Экспериментальное и клиническое исследование препаратов на основе генов ангиогенных факторов (VEGF и bFGF человека) при ишемии. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференции молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003,  стр.161.
  10. Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Different methods of revascularization combined with intramyocardial VEGF gene transfer administration in IHD patients. International Journal of Medical Implants and Devices, Vol. l, No l, 2003 Medical and Engineering Publishers, Inc, USA, pp 100-155.
  11. Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A.  Intramyocardial VEGF gene administration in IHD patients during different methods of surgical revascularisation. Angiogenesis: Novel basic science insights and human therapy. Keystone symposia 2004 abstract book, p.12.
  12. Л.А.Бокерия, М.В.Еремеева, Э.С.Полякова. Диагностика сердечной недостаточности с помощью  определения концентраций предшественников натрийуретических пептидов в плазме крови больных ИБС. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». Москва. Ноябрь 2003, стр.326.
  13.   Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Мерзляков В.Ю., Беришвили И.И., Клюева А.Ф.,  Какучая Т.Т.,  Полякова Э. С., Лукашкин М.А.  Первые результаты клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGF165 человека. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, № 11, стр.326.
  14. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В.,  Полякова Э.С.  Использование предшественников натрийуретических пептидов в диагностике сердечной недостаточности ишемической этиологии до и после операции аортокоронарного шунтирования. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца» 2004, т. 5, № 3, стр.156-161. 
  15. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П., Голухова Е.З., Еремеева М.В., Гнучев Н.В.,  Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Ким А.И., Асланиди И.П., Вахромеева М.Н., Какучая Т.Т.,  Полякова Э.С., Лукашкин М.А., Волковская И.В., Демидова О.А..  Возможности использования генных и клеточных технологий для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004,  № 3, стр.19-38.
  16. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Джитава Т.Г., Чеботарева, Еремеева М.В.. Некоторые особенности клинического течения, диагностики и реваскуляризации миокарда у больных ишемической болезнью сердца, страдающих сахарным диабетом. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, № 3, стр. 89-96.
  17. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. с соавт. Первый опыт клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGF165 человека. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, №4, стр. 134 -142.
  18. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Новые подходы к лечению ишемической болезни сердца: терапевтический ангиогенез в сочетании с хирургической реваскуляризацией миокарда. Терапевтический архив, 2004, т. 76, №6, с.25-30.
  19. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Генные и клеточные технологии при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (опыт НЦ ССХ им А. Н. Бакулева). Сердечно-сосудистые заболевания: проблемы трансплантологии. 2004, т.5, №7, стр. 70-91.
  20. Bockeria L.A., Golukhova E.Z., Eremeeva M.V., I.I. Berishvili. Gene and cell therapy: alternative approach for myocardial revascularization. Proceedings of the 6th International Congress on Coronary Artery Disease 2005, Istanbul, Turkey, 29 oct.-1 nov. 2005, p.383-386.
  21. Бокерия Л.А.,  Глянцев С.П.,  Серов Р.А.,  Еремеева М.В. и соавт.От открытия клетки к ее лечению (к 165-летию учения о клетке), часть 1 . Клиническая физиология кровообращения, 2005, №1, стр.14-23.
  22. Бокерия Л.А., Глянцев С.П.,  Серов Р.А.,  Еремеева М.В. и соавт. От открытия клетки к ее лечению, ч. 2, Клиническая физиология кровообращения, 2005, №2, стр.19-29.
  23. Бокерия Л.А.,  Глянцев С.П., Серов Р.А.,  Еремеева М.В. с соавт. От открытия клетки к ее лечению, ч. 3, Клиническая физиология кровообращения, 2005, №3, стр.5-12.
  24. Бокерия Л.А.,  Муратов Р.М.,  Беридзе И.З.,  Асланиди И.П.,  Никитина Т.Г.,. Еремеева М.В., Волковская И.В. Новый подход к хирургическому лечению клапанной и дилатационной кардиомиопатии. Сердечно-сосудистые заболевания: клапанная патология сердца, 2005, т.6, № 6, стр.9-13.
  25. M. Eremeeva, E. Golukhova, L. Bockeria, I. Volkovskaya, N. Chigogidze et al.Cell therapy by mesenchymal stem cells (CD133+) in advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: clinical experience. The J. of cardiovascular surgery, v.46, suppl. 1, №3, June 2005, p.120., 15-th Word Congress WSCTS, Vilnius, June 19-23 2005.
  26. Бокерия Л.А.,  Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Первые результаты терапевтического ангиогенеза у пациентов с ишемической болезнью сердца с использованием гена VEGF165 человека. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, №3, стр.123-131.
  27. Bockeria L., Golukhova E., Eremeeva M.et al. Experimental rationale and the first experience of therapeutic angiogenesis using VEGF165 gene in patients with ischemic heart disease. The J. of cardiovascular surgery, v.46, suppl. 1, №3, june 2005, p.47, 15-th Word Congress WSCTS,Vilnius, june 19-23 2005.
  28. Eremeeva M.V., Golukhova E.Z.,  Volkovskaya I.V., Chigogidze N.A.,  Aslanidi I.P., Vachromeeva M.N., Svobodov A.A., Bockeria L.A..  Stem cells (CD133+) therapy in advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: clinical experience. 12-th International Local Drug Delivary meeting and cardiovascular course on Revascularization & molecular strategies, feb. 2-4, 2006, p.102.
  29. Бокерия Л.А., Спиридонов А.А., Еремеева М.В., Аракелян В.С., Демидова О.А. Первый опыт комбинированного лечения хронической ишемии нижних конечностей с использованием стимуляторов неоангиогенеза. Сердечно-сосудистые заболевания: ангиология и сосудистая хирургия, 2006, т. 7, №4, стр. 73-80. 
  30. Бокерия Л.А., Демидова О.А., В. Аракелян В.С., Еремеева М.В.. Опыт лечения хронической ишемии нижних конечностей с помощью генного препарата сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF165 – ангиостимулина. Сердечно-сосудистые заболевания: ангиология и сосудистая хирургия, 2006, т. 7, №1, стр. 74-81.
  31. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., Eremeeva M.V. et al.Clinical application of mesenchymal stem cells (CD 133+) in patients with advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy. Europace suppl., v. 8, supl.1, june 2006, 15-th World Congress in Cardiac Electrophysiology and Cardiac Techniques, june 14-17, 2006, Nice, France. 
  32. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., Eremeeva M.V. et al.First experience of therapeutic angiogenesis using VEGF165 gene in patients with ischemic heart disease and its experimental rationale. Europace supplements, v. 8, supl.1, june 2006, 15-th World Congress in Cardiac Electrophysiology and Cardiac Techniques, june 14-17, 2006, Nice, France.
  33. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., M.V. Eremeeva et al.VEGF165 gene in therapy the treatment of patients with ischemic heart disease. 16-th World Congress of cardio-thoracic surgeons, 2006, Ottawa, Canada, p.82. .
  34. Golukhova E.Z., Bockeria L.A.., Eremeeva М.В. et al. Mesenchymal stem cells (CD133+) in the treatment of patients with advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: results of the pilot study. 16-th World Congress of cardio-thoracic surgeons,  2006, Ottawa, Canada, p.83.
  35. Еремеева М.В.,  Голухова Е.З., Чигогидзе Н.А. и соавт. Генная и клеточная терапия  для стимуляции ангио/миогенеза при сердечно-сосудистых заболеваниях. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Ежегодная сессия НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», 2006, №3, стр. 215
  36. Еремеева М.В.,  Голухова Е.З., Чигогидзе Н.А. и соавт.Лечение сердечно-сосудистых заболеваний и терапевтический ангио/миогенез. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Всероссийский XII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2006, №5, стр.266.
  37. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Голухова Е.З.,  Ким А.И. и соавт.Клеточные и генные технологии в кардиохирургии. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Всероссийская научно-практическая конференция и выставочная экспозиция «Высокие медицинские технологии», 25-26 сентября 2007 года, стр.114.
  38. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Серов Р.А., Чудиновских Ю.А. Резидентные стволовые клетки миокарда: роль в клеточном гомеостазе миокарда и потенциально возможные направления их применения в лечении сердечной недостаточности. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 297.
  39. Бокерия Л.А., Голухова Е.З, Чигогидзе Н.А., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Никитина Т.Г., Какучая Т.Т., Шурупова И.В., Волковская И.В., Свободов А.В. Результаты клинических исследований с использованием клеточных технологий в лечении пациентов с застойной сердечной недостаточностью. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 296. 
  40. Бокерия Л.А., Демидова О.А., Еремеева М.В., Аракелян В.С.Использование стимуляторов ангиогенеза в лечении хронической ишемии нижних конечностей. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 296.
  41. L. Bockeria., M. Eremeeva, T. Suchacheva, J. Chudinovskikh.Resident human cardiac stem cells: role in cardiac cellular homeostasis and in different heart diseases.  Baltic Summer School 2008: Genetic and clinical aspects of arrhythmias. Abstract book.
  42. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Серов Р.А., Чудиновских Ю.А.  Резидентные стволовые клетки миокарда: роль в клеточном гомеостазе миокарда и потенциально возможные направления их применения в лечении сердечной недостаточности. Всероссийский XIV съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2008, стр.290.
  43. Еремеева М.В. Возможности применения стволовых клеток и клеток-предшественников для стимуляции реваскуляризации и регенерации органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов, октябрь 2009, принята к печати.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.