WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

Трофимов Дмитрий Юрьевич Создание отечественной инновационной технологической платформы для решения актуальных фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на основе ПЦР в реальном времени «14.00.36 - аллергология и иммунология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2009 г.

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Л.П.Алексеев.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В.Яздовский;

доктор медицинских наук, профессор Р.И.Атаулаханов;

доктор медицинских наук, профессор Л.И.Винницкий.

Ведущая организация:

Факультет фундаментальной медицины Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится « 28 » октября 2009 г. в 14 ч. на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:

115478, Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук Сеславина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность работы Одной из центральных проблем исследований в любой области знаний является выбор оптимальных инструментов исследования. Это особенно актуально в области медицины и охраны здоровья человека, где правильная диагностика играет ключевую роль в выборе стратегии и тактики лечения, а впоследствии определяет его успешность.

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия и было отмечено в 1993 г. Нобелевской премией.

Благодаря этому открытию стало возможным быстрое получение исследуемых участков ДНК, находящихся в сложной смеси нуклеиновых кислот, в чистом виде и в количестве, достаточном для дальнейших манипуляций, результатом чего стало почти немедленное практическое применение метода. Это позволило поднять медицинскую диагностику на принципиально новый уровень. Разработка молекулярно-генетических методов, которые во многом определяют успешность исследований в различных областях биологии и медицины, является сегодня одним из наиболее быстро развивающихся направлений современной фундаментальной и прикладной науки. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования. Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 п.н. требовалась неделя, то современные секвенаторы позволяют определять десятки тысяч пар нуклеотидов в день. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов.

Информационные базы нуклеотидных последовательностей сегодня широко используются при разработке методов диагностики инфекционных и наследственных заболеваний, различных методов генотипирования, в исследованиях в области биологической безопасности, в частности, при определениях бактериального и вирусного загрязнения объектов и т.д.

Таким образом, сегодня появились предпосылки для осуществления комплексного подхода к оценке состояния здоровья человека с учетом факторов наследственности, текущего состояния организма, а также его взаимодействия с вирусным и микробным окружением. Такой подход позволит оценивать динамическое состояние организма человека, которое является результатом взаимодействия его генотипа, фенотипа и внешней среды и может быть реализован с применением единого инструмента исследования - ПЦР в реальном времени (полимеразная цепная реакция с детекцией кинетики накопления продуктов реакции непосредственно в ходе процесса).

Несомненным преимуществом метода ПЦР в реальном времени является является его быстрота. В среднем для проведения анализа биологического материала методом ПЦР необходимо от 2-х до 4-х часов. Таким образом, с точки зрения информативности, универсальности и технологичности использования в прикладных лабораторных исследованиях, ПЦР в реальном времени может рассматриваться как универсальная основа единой технологической платформы для создания целого спектра различных молекулярно-генетических методов. Разработка такой платформы на основе отечественной приборной и компонентной базы, максимально независимой от импортной продукции, представляет собой важную задачу, решение которой способно внести значительный вклад в развитие фундаментальной и прикладной науки, а также различных аспектов биобезопасности.

Цели и задачи работы Цели работы:

1. Разработка на единой технологической основе ПЦР в реальном времени и с использованием приборной и компонентой базы отечественного производства инновационной платформы, позволяющей проводить комплексные молекулярно-генетические исследования, включающие:

а).анализ генетической информации; б) оценку профиля экспрессии генов;

в).характеристику вирусного и микробиологического окружения.

2. Создание на основе разработанной технологической платформы тест-систем для решения актуальных фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии.

3. Апробация на клиническом материале комплексного подхода к анализу биоматериала с использованием разработанных методик, тест-систем и алгоритмов анализа результатов ПЦР в реальном времени.

Задачи работы:

1. Разработка методической базы для проведения ПЦР в реальном времени, основанной на приборах и молекулярно-биологических компонентах отечественного производства.

2. Разработка алгоритмов анализа результатов ПЦР в реальном времени на базе программно-аппаратных решений отечественного производства.

3. Разработка метода детекции единичных нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphism, SNP) с помощью ПЦР в реальном времени.

4. Разработка методики типирования локуса HLA DRB1 на уровне групп аллелей на основе технологии ПЦР в реальном времени.

5. Разработка систем для оценки профиля экспрессии генов иммунной системы человека на основе анализа соотношения мРНК исследуемых и нормировочных генов (housekeeping genes) методом количественной ОТПЦР в реальном времени.

6. Разработка систем для детекции и количественной оценки латентных инфекций методом ПЦР в реальном времени.

7. Разработка методов количественной оценки состояния биоценозов различных биотопов человека.

8. Апробация разработанных методик, тест-систем и алгоритмов анализа результатов ПЦР в реальном времени на клиническом материале.

Научная новизна Впервые разработан и внедрен вариант метода типирования однонуклеотидных генетических полиморфизмов с помощью определения температуры плавления примыкающих олигонуклеотидных зондов, полностью основанный на отечественных молекулярно-биологических компонентах и оборудовании.

Впервые получены данные о распределении в русской популяции 22-х генетических полиморфизмов, значимых для иммунного статуса человека.

Впервые разработан метод оценки результатов реакции бластной трансформации лейкоцитов (РБТЛ), основанный на ПЦР в реальном времени и не требующий использования радиоактивных меток.

Определены нормировочные гены и алгоритмы нормировки, оптимальные для оценки уровней экспрессии генов цитокинов и других молекул иммунной системы.

Впервые разработаны системы для определения уровней экспрессии 15-ти генов иммунной системы, полностью основанные на отечественных молекулярно-биологических компонентах и оборудовании.

Впервые разработан метод оценки состояния биоценозов различных биотопов человека на основе анализа 16S РНК с помощью мультиплексной ПЦР в реальном времени.

Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне, позволяющий одновременно получать информацию о бактериологическом фоне и активности генов иммунной системы.

Научно-практическая значимость Выполненная работа является прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития фундаментальных и прикладных аспектов иммунологии, медицины и молекулярной биологии.

Созданная в ходе работы инновационная платформа позволяет проводить комплексный молекулярно-генетический анализ биоматериала на единой технологической основе, позволяя получать всестороннюю информацию о генетических особенностях исследуемого объекта, активности генов иммунной системы и взаимодействии организма с вирусным и микробным окружением. Данный подход представляется перспективным как с точки зрения реализации фундаментальных научных исследований, так и для практического здравоохранения.

Особое значение имеет ориентация инновационной платформы на отечественную технологическую и приборную базу, что позволяет эффективно решать вопрос импортозамещения в области высокотехнологичной продукции, относящейся к прикладным и фундаментальным молекулярногенетическим исследованиям.

По результатам диссертационной работы получено 7 патентов и регистрационных удостоверения:

Патент на изобретение №2294532: «Способ стандартизации данных полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флуоресценции непосредственно во время реакции (ПЦР «в реальном времени»)». Авторы: Трофимов Д.Ю., Саматов Г.А., Семенов П.А. / 2007 г.

Патент на изобретение №2332669: «Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 1- позиция 889(C/T)».

Авторы: Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г. / 2008 г.

Патент на изобретение №2332670: «Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 6 позиция 174(G/C)». Авторы:

Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г. / 2008 г.

Патент на изобретение № 2008105063: «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности».

Авторы: Липова Е.В., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Бородин А.М., Скоркина Ю.А. / 2008 г.

Патент на изобретение №2346986: «Способ определения наличия «горячего старта» в полимеразной цепной реакции». Авторы: Абрамов Д.Д., Трофимов Д.Ю., Ребриков Д.В. / 2009 г.

Патент на изобретение (на регистрации, заявка №2008100303/000331):

«Способ оценки степени пролиферации клеток с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени»». Авторы:

Савилова А.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М.

Патент на изобретение (на регистрации, заявка №2009101460/001805):

«Способ ранней диагностики воспалительных заболеваний (модель ревматоидного артрита на ранней стадии) на основе количественного определения транскриптов генов цитокинов методом ПЦР «в реальном времени»». Авторы: Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю.

Регистрационное удостоверение №ФСР 2007/01250 от 20 ноября 2007 г. на амплификатор детектирующий ДТ-96 по ТУ 9443-002-96301278-20производства ООО «Научно-производственного объединения ДНКТехнология».

Регистрационное удостоверение №ФСР 2009/04663 от 01 апреля 2009 г. на набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени (Фемофлор) по ТУ 9398020-46482062-2008 производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология».

Материалы диссертационной работы широко используются в учебном процессе при подготовке врачей и лаборантов медицинских учреждений к работе с приборами и тест-системами в области молекулярной генетики.

Положения, выносимые на защиту 1. Впервые в отечественной практике создана единая технологическая платформа на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая получать информацию о трёх основных аспектах состояния иммунной системы и здоровья человека в целом: а) о генетических особенностях; б) о профиле экспрессии генов; в) о взаимодействии организма с вирусным и микробным окружением.

2. Разработанная инновационная платформа полностью основана на отечественной приборной и технологической базе.

3. В рамках апробации инновационной технологической платформы:

- получены данные об основных клинически значимых иммуногенетических параметрах русской популяции;

- разработан метод оценки результатов РБТЛ с помощью ПЦР в реальном времени;

- выявлены некоторые особенности экспрессии генов иммунной системы при аллергических заболеваниях и ревматоидном артрите;

- показана возможность комплексной молекулярно-генетической оценки профиля экспрессии генов иммунной системы и бактериального фона в образцах клинического биоматериала.

Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: 13th European Histocompatibility Conference (Crete, Greece, 1999), 14th European histocompatibility Conference (France, Montpellier, 2000), 12th World Congress of Medical Law (Siofok, Hungary, 1999), 5-ом конгрессе РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Москва, Россия, 2002), XVI European Histocompatibility Conference (Strasbourg, France, 2002), 15th European Immunology Congress EFIS (Rodes, Greece, 2003), 17th European Histocompatibility Conference (Baden-Baden, Germany, 2003), 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS (Montreal, Canada, 2004), 3rd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment (Rio de Janeiro, Brazil, 2005), XIII-ом Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2006), XVI Europe Congress of Immunology (Paris, France, 2006), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (Москва, Россия, 2007), 21st EFI Conference (Barcelona, Spain, 2007), VIII-ом Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 2007).

Публикации По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы, в том числе: монография; 35 статей в научной печати, из них 23 статьи в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций; 17 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц, 27 рисунков. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Библиография включает 384 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материал для исследований. В качестве биоматериала для исследований использовали периферическую кровь, синовиальную жидкость, биоптаты тканей, урогенитальные мазки, а также эпителиальные соскобы со щеки.

Выделение ДНК и РНК. В случаях, когда целью исследования являлось типирование генов главного комплекса гистосовместимости, а также определение SNP, ДНК выделяли из ядер лимфоцитов по методу Higuchi [Higuchi, 1989] с некоторыми модификациями. Метод основан на разрушении лимфоцитов с помощью лизирующего буфера, не влияющего на целостность мембран ядер лимфоцитов. После двух отмывок ядра разрушали буфером с протеиназой К 37°С в течение 20 мин с последующей инактивацией фермента при 98°С. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20°С. Концентрация ДНК, определенная на ДНКминифлуориметре (Ноеfer, США), составляла в среднем 50-100 мкг/мл.

Для определения уровня экспрессии генов цитокинов и других генов иммунной системы выделяли РНК лимфоцитов, в том числе мононуклеарных клеток. Выделение лимфоцитов из цельной крови проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл). Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («НПФ ДНК-Технология», Россия). Метод основан на лизисе клеток в 4 М растворе гуанидинтиоционата и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками этанолом и ацетоном. В случае выделения из образца большого объема (более 0,5 мл крови), а также из синовиальной жидкости, использовали метод фенолхлороформной экстракции [Sambrook, 1989], либо применяли хроматографические колонки Qiagen.

При исследовании урогенитальных мазков в случае изучения биоценозов, а также определения патогенных микроорганизмов, использовали наборы для выделения ДНК «Проба ГС» («НПФ ДНК-Технология», Россия). Метод основан на сорбции ДНК на органическом носителе, отмывке примесей с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента.

Выделение вирусных нуклеиновых кислот (вирусы гепатитов, иммунодефицита человека), проводили из плазмы крови после удаления из нее форменных элементов с помощью набора для выделения «Проба НК» («НПФ ДНК-Технология», Россия).

Реакция бластной трансформации лейкоцитов (РБТЛ). Для реакции бластной трансформации лимфоцитов была использована кровь здоровых доноров. Выделение лифоцитов проводили не позднее чем через 2 часа после забора крови. Выделение фракции мононуклеарных клеток проводили, как описано ранее [Current protocols in immunology, 2003], с небольшими изменениями. Полученные клетки раскапывали в стерильный планшет по 1выделенных клеток на лунку и добавляли фитогемагглютинин (ФГА) до конечной концентрации 2,5 мкг/мл. Для контроля спонтанной пролиферации в контрольные лунки ФГА не добавляли. Мониторинг осуществляли путем отбора проб через определенные промежутки времени в ходе культивирования в СО2-инкубаторе.

Оценку РБТЛ по включению меченого Н-тимидина проводили, как описано ранее [Current protocols in immunology, 2003], определяя -излучение на -счетчике (Wallac 1409 DSA). По полученным значениям определяли индекс стимуляции лимфоцитов (ИС):

ИС = CPM(среднее значение опыта) / CPM(среднее значение контроля), (1) где СРМ – число импульсов в минуту;

среднее значение СРМ контроля - среднее значение СРМ образцов, культивированных без добавления ФГА.

Реакция обратной транскрипции (ОТ). Реакцию обратной транскрипции (синтез кДНК из полученной РНК) проводили в объеме 40 мкл.

В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали разработанные специфические олигонуклеотиды и обратную транскриптазу M-MuLV (ООО «СибЭнзим», Россия). Реакцию проводили при температуре 40?С в течение 1 часа, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95?С в течение 15 минут.

Дизайн и синтез олигонуклеотидов. При разработке олигонуклеотидов использовали базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank, dbSNP и программное обеспечение Oligo 6.0. Синтез праймеров и олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов для ПЦР в реальном времени, проводили на синтезаторах ДНК ASM-800 и ASM-102 (Россия, Новосибирск), позволяющих синтезировать как экспериментальные (нмоль), так и препаративные количества (0,5 мкмоль). Использовали флуорофоры (FAM, HEX) и гасители флуоресценции (Dabcyl, BHQ1), синтезированные в лаборатории изотопных методов анализа Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Олигонуклеотиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием обращеннофазных колонок Диасфер-110С18 (Россия). Чистоту полученных олигонуклеотидов контролировали методом аналитического вертикального гель-электрофореза в полиакриламидном геле.





Оборудование для провеления ПЦР в реальном времени.

Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующих амплификаторов «ДТ-322» и «ДТ-96» («НПФ ДНК-Технология», Россия).

Дополнительный контроль результатов ПЦР в реальном времени осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Проведение ПЦР в реальном времени. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали реагенты «НПФ ДНК-Технология», в том числе TaqДНК-полимеразу ТехноTaq, а также ТехноTaq-AT, позволяющую осуществить реализацию «горячего старта» без применения парафина.

Определение замен одиночных нуклеотидов проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды.

Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени.

Ср - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим термоциклером.

Slope – разница в значениях Ср (Ср) при разведении образца в 10 раз.

Эффективность амплификации оценивали по формуле:

Е = 10-(1/slope) или Е(%)= (Е – 1)*100% (2) Уровень экспрессии мРНК исследуемого гена Х относительно мРНК нормировочного гена N определяли по формуле:

[X]/[N] = ENCpN/EXCpX, (3) где ЕN,EX – эффективности амплификации, СpN,CpX - значения пороговых циклов.

Статистика. Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди-Вайнберга проводили по критерию 2-квадрат в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения.

Статистическую ошибку распределения частот аллелей вычисляли по формуле:

sp = sqrt(p(1 – p)/2N), (4) где р – частота аллеля, N – число индивидов в выборке.

Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии генов цитокинов и других генов иммунной системы проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (L-H), где Ме – медиана, L – нижний квартиль, Н – верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при p<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете StatSoft Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В данной работе под инновационной технологической платформой понимается совокупность теоретических знаний, лабораторных методов и производственных технологий, позволяющая в короткие сроки решать фундаментальные и прикладные задачи современной иммунологии, связанные с использованием полимеразной цепной реакции с регистрацией продуктов реакции в режиме реального времени (ПЦР в реальном времени).

Условно можно выделить два уровня составляющие платформу – базовый и прикладной (рис. 1). Базовый уровень представлен согласованным комплексом специального оборудования, программного обеспечения и молекулярно-биологических компонентов и технологий. Прикладной – технологии реализации трех основных аспектов, характеризующих здоровье человека и иммунную систему в частности: генетические особенности (генотип), профиль экспрессии генов (текущее состояние, или фенотип) и взаимодействие организма с микробиологическим и вирусным окружением (нормофлора, патогенные и условнопатогенные инфекционные агенты).

Технологическая платформа Экспрессия Внешняя среда Прикладной Генотип генов (микроорганизмы уровень (фенотип) и вирусы) МолекулярноБазовый Программное биологические Оборудование уровень обеспечение компоненты Рис. 1. Состав инновационной технологической платформы.

Принципиальным моментом в данной работе является использование ключевых компонентов и оборудования отечественного производства, что делает разработанную технологическую платформу максимально независимой от зарубежных производителей.

1.Базовый уровень технологической платформы.

1.1. Оборудование.

Основным специальным прибором необходимым для проведения ПЦР в реальном времени является детектирующий термоциклер (амплификатор).

Этот прибор представляет собой комбинацию программируемого термоциклера, обеспечивающего циклический температурный режим ПЦР, и флуоресцентного детектора, позволяющего измерять уровень флуоресценции в реакционных пробирках во время реакции. В ходе выполнения данной работы осуществлялось тесное взаимодействие с компанией ЗАО «НПФ ДНКТехнология» при разработке серии приборов для постановки ПЦР в реальном времени «ДТ-322» и «ДТ-96». Детектирующий термоциклер «ДТ-96» стал первым серийно выпускаемым и зарегистрированным в МЗ РФ 96-луночным прибором для проведения ПЦР в реальном времени.

По всем основным характеристикам «ДТ-96» не уступает зарубежным аналогами. К особенностям прибора можно отнести: а) полную адаптацию к российским условиям, включая русскоязычный интерфейс и соответствие параметрам российских электрических сетей; б) возможность интеграции в автоматизированные комплексы; в) реализацию тепмпературного градиента по двум направлениям термоблока; г) вариант комплектации секционированным термоблоком, позволяющим одновременно проводить реакции с разными температурными параметрами. Вся экспериментальная часть работы, связанная с постановкой ПЦР в реальном времени, осуществлялась на амплификаторах данной модели.

1.2. Программное обеспечение.

При разработке программного обеспечения приборов серии «ДТ» учитывалась двухуровневая организация технологической платформы, в связи с чем программа реализована в виде двух различных взаимосвязанных приложений – «Работа с прибором» и «Анализ».

Приложение «Работа с прибором» обеспечивает все базовые функции, необходимые для управления прибором и постановки ПЦР в реальном времени, включая определение циклического температурного профиля реакции, время и аппаратные параметры измерения флуоресценции, формирование протокола, содержащего информацию о проводимом исследовании, в том числе расположение пробирок в термоблоке, сервисные функции и т.д. Модуль «Анализ» соответствует прикладному уровню технологической платформы и обеспечивает математическую обработку и анализ полученных экспериментальных данных в соответствии с решаемой прикладной задачей.

При разработке учитывалось, что технологическая платформа должна отвечать требованиям как научных так и медицинских диагностических лабораторий. В тоже время, в ряде случаев эти требования являются прямо противоположными. В частности, для решения научных задач широкому кругу сотрудников лаборатории необходимо иметь доступ к максимальному спектру различных параметров настройки прибора и анализа данных, в то время как в диагностических лабораториях все параметры исследований должны быть строго детерминированы, а работа с прибором максимально упрощена. Данное противоречие было успешно преодолено в программном обеспечении приборов серии «ДТ». Это удалось сделать благодаря впервые реализованному подходу, основанному на понятии «Тест». Под «тестом» понимается полный комплекс пользовательских настроек, состоящий из блока связанных с функционированием прибора аппаратных параметров, программы амплификации, конфигурации исследования (наличие контрольных образцов, стандартов и т.д.), типа и параметров анализа данных, ряда других параметров. Таким образом, при создании и редактировании «теста» существует возможность максимально гибко изменять широкий спектр параметров исследования, в то время как при использовании стандартных, созданных ранее «тестов», требуется лишь выбрать наименование теста и количество анализируемых пробирок. Совместное хранение аппаратных настроек и параметров конкретного прикладного исследования крайне важно в ситуации, когда в лаборатории проводятся несколько различных видов ПЦР исследований и/или работает несколько сотрудников, каждый из которых решает свои задачи. Независимо от того, как был настроен прибор при предыдущем запуске, при выборе «теста» автоматически загружаются все корректные настройки. Кроме того, «тесты» могут быть сохранены в виде файла и переданы новым пользователям при инсталляции прибора или позднее в электронном виде, что очень удобно в условиях медицинских диагностических лабораторий.

1.3. Молекулярно-биологические компоненты и технологии.

К ключевым молекулярно-биологическим компонентам, необходимым для реализации ПЦР в реальном времени, относятся: Taq-ДНК-полимераза, дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ), олигонуклеотидные праймеры и зонды, флуоресцентные красители (FAM, HEX) и гасители флуоресценции (Dabcyl, BHQ1). В данной работе все перечисленные компоненты были российского производства (табл. 1).

Исследования по сравнению с зарубежными аналогами показали полное соответствие компонентов российского производства всем выдвигаемым требованиям.

2. Прикладной уровень технологической платформы.

Как уже отмечалось, прикладной уровень разработанной технологической платформы состоит из трех частей, соответствующих трем аспектам, характеризующим здоровье человека в целом и иммунную систему в частности: генотип (иммуногенетика), активность генов (текущее состояние системы) и взаимодействие организма с вирусным и микробным окружением.

2.1. Иммуногенетика. В ходе выполнения данной работы были разработаны два технологических направления, позволяющие охарактеризовать наиболее важные составляющие иммуногенетического профиля человека: типирование генов главного комплекса гистосовместимости (HLA) и определение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов цитокинов и ряда других белков иммунной системы, обеспечивающих развитие полноценного иммунного ответа.

Табл. 1. Состав базового уровня технологической платформы.

Наименование Фирма-производитель Оборудование Детектирующие термоциклеры «НПФ ДНК-Технология», Москва «ДТ-322», «ДТ-96» Программное обеспечение Пакет программ к приборам серии «НПФ ДНК-Технология», Москва ДТ версия v7.3.Молекулярно-биологические компоненты Taq-ДНК-полимераза «НПФ ДНК-Технология», Москва Обратная транскриптаза M-MuLV ООО «СибЭнзим», г.Новосибирск дНТФ ООО «СибЭнзим», г.Новосибирск Олигонуклеотиды: праймеры и «НПФ ДНК-Технология», флуоресцентно-меченые зонды г.Москва Флуоресцентные красители, Институт биоорганической химии гасители: FAM, HEX, Dabcyl, им. акад. М.М.Шемякина и BHQ1 Ю.А.Овчинникова РАН, г. Москва Для типирования локуса DRB1 системы HLA был выбран и оптимизирован метод сиквенс-специфических праймеров, реализованный в варианте ПЦР в реальном времени (real-time PCR-SSP). Метод основан на использовании праймеров, расположенных в полиморфных участках исследуемого гена, и детекции результатов с помощью флуоресцентномеченных олигонуклеотидных зондов типа Taqman или Beacon. Возможны два варианта реализации систем генотипирования на подобной основе. В первом случае специфичность реакции полностью определяется праймерами (или одним праймером), при этом используется универсальный флуоресцентый зонд. Во втором случае специфичность обеспечивается комбинацией типирующих праймеров и зондов. Для типирования большинства специфичностей, за исключением DR14 был реализован первый вариант, для гуппы аллелей DR14 - второй.

Особенностью разработанного метода является использование внутреннего эндогенного контроля с модифицированной системой амплификации. Целью модификации было решение двух связанных задач – снижение конкурентного влияния внутреннего контроля и получение референсного сигнала, относительно которого оценивается основная реакция.

В этом случае интерпретация результатов осуществляется не только по наличию или отсутствию продуктов ПЦР в соответствующей реакционной смеси, но и по смещению характеристического цикла основной реакции относительно модифицированного внутреннего контроля. Такой подход особенно эффективен в тех случаях, когда отличия между типируемыми специфичностями малы, и возможна неспецифичная амплификация, но на более поздних циклах.

Исходя из изложенных выше принципов в модуле «Анализ» программного обеспечения к прибору «ДТ-96» была реализована функция автоматической интерпретации результатов ПЦР для определения генотипов HLA DRB1 (рис. 2) Для типирования однонуклеотидных полиморфизмов генов цитокинов и других белков иммунной системы в ходе данной работы был разработан оригинальный вариант метода «примыкающих» олигонуклеотидных зондов (adjacent probes, kissing probes). Метод основан на определении температуры плавления олигонуклеотидых зондов, которая напрямую зависит от Рис. 2. Реализация функции интерпритации результатов типирования локуса HLA DRB1 в программном обеспечении к прибору «ДТ-96» наличия / отсутствия нуклеотидных замен в матрице ДНК в области гибридизации зондов.

Для определения температуры плавления, помимо флуоресцентномеченого типирующего зонда, в реакционную смесь добавляется тугоплавкий олигонуклеотидный зонд с гасителем флуоресценции, который гибридизуется на матрице ДНК в непосредственной близости к типирующему зонду («примыкает» к нему). При низкой температуре происходит гибридизация зондов с амплифицированной в ходе ПЦР ДНК, в результате чего флуоресцентный краситель оказывается рядом с гасителем флуоресценции. По увеличению флуоресцентного сигнала при повышении температуры можно определить температуру плавления типирующего зонда и, следовательно, определить наличие однонуклеотидной замены. Для повышения надежности типирования, что особенно важно во время клинических исследований, в данной работе предложен метод одновременной гибридизации с двумя Рис. 3. Анализ кривых плавления и определение однонуклеотидных замен в программном обеспечении к прибору «ДТ-96» альтернативными типирующими зондами, меченными различными флуорофорами.

Для автоматического анализа флуоресцентных кривых с последующим типированием в модуле «Анализ» программного обеспечения к прибору «ДТ-96» создан раздел «Анализ полиморфизмов, плавление» (рис. 3).

Температура плавления зондов определяется по максимуму функции dF/dT, полученной путем дифференцирования экспериментальной зависимости флуоресценции от температуры после аппроксимации кубическими сплайнами (метод наименьших квадратов).

С помощью разработанной технологии были созданы системы для типирования 22-x замен одиночных нуклеотидов, в генах CTLA4, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1RN, IL2, IL4, IL4R, IL6, IL10, IL12B, IL18, INFG, TNF и TGFb1.

Данные полиморфизмы связаны с характеристикой иммунного статуса человека и входят в список рекомендованных 15-м международным рабочим совещанием по гистосовместимости и иммуногенетике (15th International Histocompatibility and Immunogenetics Workshop, Brazil, September 2008) для изучения в клинико-диагностических целях. Перечень полиморфизмов и значения температур плавления олигонуклеотидных зондов для различных аллельных вариантов приведены в таблице 2.

Табл. 2. Температурные характеристики типирующих зондов (С).

Аллель Зонд A1 (FAM) Зонд A2 (HEX) Ген rs-номер А1 A2 A1 A2 A1 A CTLA4 rs231775 A G 57,0 47,0 48,0 58, IL1A rs1800587 С T 50,0 47,0 37,0 52, IL1B rs16944 A G 58,5 47,0 48,0 57, IL1B rs1143634 C T 51,0 41,0 43,0 51, IL1B rs1143627 C T 51,5 44,0 42,0 52, IL2 rs2069762 G T 53,5 50,0 45,0 55, IL2 rs2069763 G T 54,8 42,0 50,0 55, IL4 rs2070874 C T 55,0 51,0 46,0 54, IL4 rs2243250 C T 53,0 42,0 44,0 51, IL4 rs2243248 G T 56,5 45,5 46,0 56, IL4R rs1801275 A G 54,5 45,0 49,0 56, IL6 rs1800795 C G 51,0 41,0 35,0 51, IL10 rs1800872 A C 55,0 49,0 48,0 56, IL10 rs1800871 C T 58,5 48,0 52,0 55, IL10 rs1800896 A G 50,5 37,0 38,0 49, IL12B rs3212227 A C 51,0 45,0 43,5 53, IL18 rs187238 C G 52,0 46,0 40,0 52, IL18 rs1946518 G T 50,0 42,0 44,0 51, IL18 rs1946519 A C 55,5 47,0 51,0 56, TNF rs361525 A G 55,0 44,0 45,0 54, TNF rs1800629 A G 53,8 44,5 46,5 54, INFG rs2430561 A T 53,2 47,5 46,0 53,2.2. Экспрессия генов.

Одной из ключевых характеристик клеток организма является профиль экспрессии генов, описывающий их состояние и функциональную активность. Для оценки профиля экспрессии генов была использована технология относительного анализа количества мРНК в образцах с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).

Проведена оптимизация параметров реакции обратной транскрипции для оценки количества транскриптов генов иммунной системы. В частности, было установлено, что использование смеси коротких (12-17 п.н.) специфических ОТ-праймеров предпочтительнее по сравнению с использованием случайных гексамеров и поли-(Т) праймеров. Значения пороговых циклов ПЦР для специфических ОТ-праймеров в среднем были на 1,8±0,6 и 2,4±0,7 меньше, чем в случае гексамеров и поли-(Т) праймеров. При этом соответствующие коэффициенты корреляции количественных оценок мРНК были равны 0,97 и 0,95, в то время как коэффициент корреляции результатов, полученных с использованием случайных гексамеров и поли-(Т) праймеров был менее 0,93.

Проанализированы семь генов-кандидатов в качестве нормировочных для оценки экспрессии генов иммунной системы: 18S рибосомальная РНК (18SrRNA), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), -актин (ACTB), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза (HPRT1), -2микроглобулин (B2M), TATA-связывающий протеина (ТВР), -глюкоронидаза (GUSB). Одним из главных требований к нормировочным генам является соответствие диапазонов уровней экспрессии нормировочных и исследуемых генов. Около 80% фракции суммарной РНК представлено рибосомальной РНК и только 2-5% пулом мРНК, причем соотношение рРНК/мРНК не всегда остается постоянным [Huggett, 2005]. Гены GAPDH и ACTB также экспрессируются в клетках на высоком уровне. Помимо этого к недостаткам GAPDH и ACTB следует отнести большое число псевдогенов: 52 для GAPDH и 18 для ACTB [http://www.pseudogene.org].

Оптимальными для нормировки выбраны гены HPRT1, ТВР и GUSB.

Апробированы алгоритмы нормировки, основанные на использовании одного, двух и трех нормировочных генов. Необходимый для оценки уровней экспрессии генов функционал реализован в программном обеспечении к прибору «ДТ-96».

Разработаны и охарактеризованы системы для определения количества мРНК следующих 15-ти генов иммунной системы: IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12a, IL15, IL17A, IL18, IL-2Ra, IFNG, TGFB1, TNF, Foxp3 (табл. 3).

Табл. 3. Основные характеристики систем для определения уровня мРНК цитокинов.

мРНК Размер ЭффекЛокализация ПЦР Варианты Какие варианты Ген тивность Адресация Число гена продукта, альтернативного определяет ПЦР( Е ) основной формы экзонов пн сплайсинга система IL1B 2q14 NM_000576.2 7 нет NM_000576.2 131 1,IL2 4q26-q27 NM_000586.3 4 нет NM_000586.3 203 1,IL4 5q31.1 NM_000589.2 4 NM_172348.1 NM_000589.2 214 1,IL6 7p21 NM_000600.1 5 нет NM_000600.1 334 1,IL8 4q13-q21 NM_000584.2 4 нет NM_000584.2 174 1,IL10 1q31-q32 NM_000572.2 5 нет NM_000572.2 188 1,IL12A 3q25.33-q26 NM_000882.2 7 нет NM_000882.2 177 1,NM_172174.NM_172175.IL15 4q31 NM_172174.1 8 NM_172175.1 327 1,NM_000585.NM_000585.IL17A 6p12 NM_002190.2 3 нет NM_002190.2 310 1,IL18 11q22.2-q22.3 NM_001562.2 6 нет NM_001562.2 175 1,IL2Ra 10p15-p14 NM_000417.1 8 нет NM_000417.1 265 1,IFNG 12q14 NM_000619.2 4 нет NM_000619.2 216 1,TGFB1 19q13.1 NM_000660.3 7 нет NM_000660.3 175 1,TNF 6p21.3 NM_000594.2 4 нет NM_000594.2 83 1,NM_014009.Foxp3 Xp11.23 NM_014009.3 12 NM_001114377.1 210 1,NM_001114377.CDC2 10q21.1 NM_001786.3 8 - NM_001786.3 200 1,TOP2A 17q21-q22 NM_001067.2 35 нет NM_001067 356 1,Впервые на основе созданной технологии проведено исследование возможности использования ПЦР в реальном времени для оценки результатов реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ). Был проведен анализ генов-кандидатов и синтезированы праймеры и зонды для определения уровня экспрессии генов СDC2 и TOP2A.

2.3. Внешняя среда.

Важным аспектом, характеризующим состояние иммунной системы, является её взаимодействие с микробиологическим и вирусным окружением, включая патогенные, условнопатогенные и латентные инфекции, а также нормофлору организма. Диагностика патогенных инфекционных агентов с помощью «классической» ПЦР и ПЦР в реальном времени является сегодня стандартным подходом и широко используется в клинико-диагностических лабораториях.

С точки зрения взаимодействия с иммунной системой среди латентных инфекций наиболее интересными и клинически значимыми являются вирусы семейства Herpesviridae. По данным многочисленных исследований [Stowe et al., 2007] более 90% людей в течение жизни инфицируются хотя бы одним из герпесвирусов (простого герпеса 1 и 2-го типов, цитомегаловирусом, варицелла-зостер, Эпштейна-Барр, герпеса человека 6 типа). Для диагностики герпесвирусов, особенно в случаях иммунодифицитных состояний, важен количественный анализ вирусной нагрузки. В данной работе разработаны и апробированы на клиническом материале системы для количественного определения методом ПЦР в реальном времени вирусов HSV, CMV, VZV, EBV, HHV6 и вируса BK, диагностика которого имеет важное клиническое значение в трансплантологии. Линейный диапазон тест-систем составил 103 - 108 копий вирусной ДНК на 1 мл образца, чувствительность – 300-500 копий/мл.

На базе созданной технологической платформы разработан метод оценки состояния биоценозов различных биотопов человека, основанный на количественном анализе 16S РНК бактерий и 18S РНК грибов. Создана система для исследования состояния вагинального биоценоза у женщин, позволяющая получить информацию о 15 основных группах микроорганизмов (более 150 видов), представляющих нормальную и условно-патогенную флору (табл. 4). Кроме того, в состав системы входит оценка общего количества бактерий в образце и контроль взятия материала по наличию ДНК эпителиальных клеток человека.

Табл. 4. Состав прикладного уровня технологической платформы.

Прикладной аспект технологической Назначение разработанных систем платформы Иммуногенетика Типирование локуса DRB1: DRB1*01, DRB1*15(2), DRB1*16(2), DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11(5), DRB1*12(5), DRB1*13(6), DRB1*14(6), DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*Однонуклеотидные замены (SNP): CTLA4(+49A/G), IL1A(-889С/T), IL1B(-511A/G), IL1B(+3953C/T), IL1B(-31C/T), IL2(-330G/T), IL2(+166G/T), IL4(-33C/T), IL4(-590C/T), IL4(-1098G/T), IL4R(+1902A/G), IL6(-174C/G), IL10(-592A/C), IL10(-819C/T), IL10(-1082A/G), IL12B(-1188A/C), IL18(-137C/G), IL18(-607G/T), IL18(-656A/C), TNF(-238A/G), TNF(-308A/G), INFG(+874A/T) IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12a, IL15, IL17A, IL18, Экспрессия генов IL-2Ra, IFNG, TGFB1, TNF, FoxpВзаимодействие Латентные вирусные инфекции: HSV, CMV, VZV, организма с EBV, HHV6, BK-вирус вирусами и Исследование биоценозов: Общая бактериальная микроорганизмами масса, Lactobacillus spp., Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Leptotrihia spp., Fusobacterium spp., Megasphaera spp., Veilonella spp., Dialister spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp., Mobiluncus spp., Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Candida spp.

3. Апробация разработанной технологической платформы.

3.1. Иммуногенетика Впервые проведена работа по изучению частот 22 однонуклеотидных полиморфизмов в генах IL1A, IL1B, IL1R1, IL1RN, IL2, IL4, IL4R, IL6, IL10, IL12B, IL18, INFG, TNF и TGFb1, у здоровых индивидов в русской популяции.

Все изученные полиморфизмы значимы для иммунного статуса человека и входят в список рекомендованных 15-м международным рабочим совещанием по гистосовместимости и иммуногенетике (15th International Histocompatibility and Immunogenetics Workshop, Brazil, September 2008) для изучения в клиникодиагностических целях.

В качестве материала для настоящего исследования использовали коллекцию периферической крови здоровых индивидов (доноров первичной кроводачи, идентифицирующих себя как русские) в количестве 300 человек, из них 188 мужчин и 112 женщин.

Определение замен одиночных нуклеотидов проводили с помощью разработанных в ходе данной работы систем и программного обеспечения на основе анализа кривых плавления «примыкающих» зондов. Распределение частот генотипов для всех полиморфизмов кроме IL2 -330G>T (rs2069762) соответствовало закону Харди-Вайнберга. Результаты исследования и значение критерия 2-квадрат в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения приведены в таблице 5.

Полученные данные о частотах встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов в генах, продукты которых обеспечивают иммунный ответ, могут быть использованы для создания базы данных, служащей референсной при проведении популяционно-иммуногенетических исследований, направленных на определение вклада генетической компоненты в этиологию и патогенез многофакторных заболеваний в русской популяции. Для подобных исследований наличие информации о генетическом профиле контрольной группы (как правило, здоровых индивидов) достаточного объема, может быть залогом адекватного проведения статистической обработки и корректного результата исследования в целом.

Табл. 5. Частоты полиморфизмов генов иммунной системы в русской популяции (N=300).

Аллель Частота аллеля, % Частота генотипа, % Позиция в Ген Rs-номер гене А1 A2 A1 A2 A1A1 A1A2 A2A CTLA4 +49 Rs231775 58,8 ± 2,0 41,2 ± 2,0 35,0 47,7 17,3 0, IL1A -889 rs1800587 С T 70,5 ± 1,9 29,5 ± 1,9 50,7 39,7 9,7 0, IL1B -511 rs16944 A G 33,7 ± 1,9 66,3 ± 1,9 11,7 44,0 44,3 0, IL1B +3953 rs1143634 C T 75,2 ± 1,8 24,8 ± 1,8 57,3 35,7 7,0 0, IL1B -31 rs1143627 C T 33,6 ± 1,9 66,4 ± 1,9 11,3 44,3 44,3 0, IL2 -330 rs2069762 G T 37,0 ± 2,0 63,0 ± 2,0 10,3 53,3 36,3 6,14* IL2 +166 rs2069763 G T 63,8 ± 2,0 36,2 ± 2,0 39,7 48,3 12,0 0, IL4 -33 rs2070874 C T 76,2 ± 1,7 23,8 ± 1,7 56,3 39,7 4,0 2, IL4 -590 rs2243250 C T 76,2 ± 1,7 23,8 ± 1,7 57,7 37,0 5,3 0, IL4 -1098 rs2243248 G T 5,3 ± 0,9 94,7 ± 0,9 0,0 10,7 89,3 1, IL4R +1902 rs1801275 A G 78,5 ± 1,7 21,5 ± 1,7 61,0 35,0 4,0 0, IL6 -174 rs1800795 C G 44,8 ± 2,0 55,2 ± 2,0 18,0 53,7 28,3 2, IL10 -592 rs1800872 A C 22,8 ± 1,7 77,2 ± 1,7 4,7 36,3 59,0 0, IL10 -819 rs1800871 C T 77,0 ± 1,7 23,0 ± 1,7 58,7 36,7 4,7 0, IL10 -1082 rs1800896 A G 56,5 ± 2,0 43,5 ± 2,0 31,0 51,0 18,0 0, IL12B -1188 rs3212227 A C 77,7 ± 1,7 22,3 ± 1,7 61,7 32,0 6,3 1, IL18 -137 Rs187238 C G 28,2 ± 1,8 71,8 ± 1,8 8,3 39,7 52,0 0, IL18 -607 rs1946518 G T 57,8 ± 2,0 42,2 ± 2,0 34,7 46,3 19,0 0, IL18 -656 rs1946519 A C 42,3 ± 2,0 57,7 ± 2,0 19,0 46,7 34,3 0, TNF -238 Rs361525 A G 3,3 ± 0,7 96,7 ± 0,7 0,0 6,7 93,3 0, TNF -308 rs1800629 A G 14,0 ± 1,4 86,0 ± 1,4 1,0 26,0 73,0 2, INFG +874 rs2430561 A T 43,3 ± 2,0 56,7 ± 2,0 19,0 48,7 32,3 0,*p=0,Кроме того, на той же коллекции образцов была проведена апробация разработанной системы генотипирования локуса HLA DRB1 на уровне групп аллелей. Полученные данные о распределении аллелей гена DRB1 в русской популяции (табл. 6) в целом соответствуют опубликованным ранее сведениям [Болдырева и др., 2005].

Табл. 6. Частоты групп аллелей гена DRB1 в русской популяции.

Группа Генотипическая частота, % Фч*, аллелей % 0,00 0,05 0,10 0,15 0,DRB01 22,2 11,4 ± 1,15(2) 24,2 12,7 ± 1,16(2) 11,6 6,0 ± 1,03 15,6 8,3 ± 1,04 19,2 10,4 ± 1,11(5) 27,2 14,7 ± 1,12(5) 3,3 1,8 ± 0,13(6) 28,8 15,7 ± 1,14(6) 3,6 1,8 ± 0,1 07 24,8 13,4 ± 1,1 08 4,3 2,2 ± 0,1 09 1,3 0,8 ± 0,10 1,3 0,7 ± 0,3 1 * фенотипическая частота Использование ПЦР в реальном времени вместо распространенного ранее «классического» варианта ПЦР-SSP, основанного на детекции методом электрофореза, существенно снижает трудоемкость и время типирования и упрощает требования к организации типирующей ПЦР-лаборатории.

3.2. Экспрессия генов 3.2.1. Оценка результатов РБТЛ с помощью ПЦР в реальном времени. Одним из классических методов исследования функциональной активности лимфоцитов является реакция бластной транформации лимфоцитов (РБТЛ). Принцип метода основан на митогенном влиянии на лимфоциты некоторых веществ растительного и бактериального происхождения. Классическим примером митогена является фитогемаглютинин (ФГА). Инкубация монононуклеарных клеток периферической крови (ПК) в присутствии ФГА осуществляется в течение часов, результаты реакции оценивают по включению меченого тритием Н тимидина. Использование радиоактивной метки существенно ограничивает применение РБТЛ в клинических лабораториях, в связи с чем разработка альтернативных способов оценки РБТЛ является актуальной задачей. Одним из возможных подходов является использование ПЦР в реальном времени для описания изменений уровней экспрессии генов во время РБТЛ. В качестве маркеров реакции были выбраны гены, активность которых возрастает при митозе: TOP2A (топоизомераза II альфа) [Christensen et al., 2002] и белка CDC(cell division cycle 2) [Berthet et al., 2006], контролирующего клеточный цикл.

Ранее было показано [Goswami et al., 1996], что содержание мРНК этих генов увеличивается в клетках, претерпевающих митотическое деление.

В работе была использована кровь здоровых добровольцев. Кровь брали натощак в вакутейнеры с гепарином, выделение лифоцитов из ПК проводили не позднее чем через 2 часа после забора крови.

Мониторинг осуществляли путем оценки уровня мРНК генов CDC2 и TOP2A в определенные временные промежутки времени РБТЛ. Каждая временная точка ставилась в двух повторах, в расчетах использовали среднее значение. Помимо стимулированных лимфоцитов, в качестве отрицательного контроля использовали точки спонтанной пролиферации без добавления ФГА.

При планировании исследования предполагалось измерять уровень экспрессии мРНК генов CDC2 и TOP2A относительно мРНК гена HPRT1, который широко используется в качестве нормировочного при исследовании лейкоцитов [Carrol et al., 2007]. Выбор данного гена был обоснован его невысоким уровнем экспрессии, сопоставимым с уровнем экспрессии исследуемой мРНК. В ходе экспериментов было установлено, что в период активной пролиферации лимфоцитов происходит значительное увеличение экспрессии гена HPRT1, что, по-видимому, обусловлено его участием в обмене пуринов [Keebaugh et al., 2007]. В связи с этим ген HPRT1 оказался непригоден для нормировки при постановке РБТЛ, но может быть использован для контроля стадий выделения нуклеиновых кислот и обратной транскрипции.

Поскольку в данной работе количество клеток и условия культивирования были стандартизованы, а протокол взятия проб и выделения нуклеиновых кислот минимизировал деградацию мРНК, оказалось возможным определять динамику изменения и соотношение уровней экспрессии мРНК генов CDC2 и TOP2A напрямую, без применения нормировочных генов. В качестве контроля использовали корректировку по количеству ДНК, определяемому с помощью ПЦР в реальном времени. Соотношения скорректированных по ДНК уровней экспрессии мРНК в большинстве случаев соответствовали значениям, полученным без нормировки.

В первые часы после взятия крови и выделения мононуклеарных клеток в них отмечено резкое снижение уровня экспрессии генов CDC2 и TOP2A, что, вероятно, вызвано стрессовым воздействием в связи с процедурой выделения.

В связи с этим значения уровней мРНК в «нулевой» точке имеют большой разброс и не могут быть использованы в качестве референсных при изучении динамики. Спустя 10-12 часов после выделения мононуклеарных клеток из периферической крови значения уровней мРНК генов TOP2A и CDC2 выходят на плато, и именно эти значения были выбраны для нормировки в данной работе.

Табл. 7. Пример сравнения результатов оценки степени пролиферации лимфоцитов, полученных двумя методами: по включению меченого Н-тимидина (индекс стимуляции) и с помощью ПЦР в реальном времени.

Нормированное количество мРНК, Индекс Донор стимуляции, 72 часа 106 часов 128 часов 72 часа CDC2 TOP2A CDC2 TOP2A CDC2 TOP2A 1 6,1 72,1 45,4 288,9 181,9 419,3 358,2 9,3 138,7 119,8 282,8 330,8 158,8 263,В таблице 7 приведены примеры оценки степени пролиферативного ответа клеток, полученные с помощью классического метода включения меченого 3Н-тимидина после культивации лимфоцитов в течение 72 часов и с помощью ПЦР в реальном времени через 72, 106 и 128 часов культивации.

Результаты обоих методов через 72 часа культивации хорошо соответствуют друг другу, однако не являются максимальными в случае определения количества мРНК.

443322110 24 48 72 96 120 144 1часы CDC2 - 1 T0P2A - CDC2 - 2 T0P2A - Рис. 4. Примеры кинетики изменения уровней экспрессии мРНК генов CDC2 и TOP2A в мононуклеарных клетках периферической крови, взятых у двух здоровых доноров и стимулированных ФГА.

Были установлены следующие закономерности (рис. 4):

- в РБТЛ с применением ФГА экспоненциальное нарастание уровня экспрессии генов CDC2 и TOP2A начинается со вторых суток культивирования;

- кинетика изменения уровней мРНК генов CDC2 и TOP2A и, возможно, процесса пролиферации в целом отличается у разных доноров, что необходимо учитывать при интерпретации значений РБТЛ, полученных через 72 часа.

относительная экспрессия - максимум экспрессии генов CDC2 и TOP2A приходится на 4-6 сутки реакции (114-140 часов);

- изменение уровней экспрессии генов CDC2 и TOP2A во время РБТЛ составляет сотни раз по сравнению с исходными значениями и может быть надежно детектировано с помощью метода ПЦР в реальном времени.

Полученные результаты показывают, что мРНК генов CDC2 и TOP2A является надежным маркером пролиферации клеток в РБТЛ, что позволяет создать тест-системы для оценки функциональной активности лимфоцитов in vitro без использования радиоактивной метки.

Следует отметить, что помимо использования радиоактивной метки РБТЛ имеет еще один недостаток – длительное время исследования, обусловленное использованием финальной пролиферативной стадии активации лимфоцитов для оценки результатов реакции. В то же время, при использовании в качестве маркеров мРНК некоторых генов, например, цитокинов, существует принципиальная возможность оценки степени стимулирующего воздействия на более ранних стадиях.

В качестве предварительного исследования, иллюстрирующего такую возможность и апробации разработанной технологической платформы, было проведено исследование динамики изменения количества мРНК интерлейкина 6 (IL-6) в лимфоцитах, выделенных из периферической крови, в ответ на воздействие иммуностимулирующего олигонуклеотида CpG-ODN-2006.

Максимум экспрессии IL-6 соответствовал 5-7 часам. В случае подтверждения в дальнейшем полученные результаты могут позволить существенно сократить время анализа.

3.2.2. Исследование экспрессии генов Foxp3, IL-2Ra, TGF- и IL-при аллергических заболеваниях у детей. Ключевую роль в контроле иммунных реакций и связанные с этим перспективы понимания патогенеза многих заболеваний и развитие методов иммунотерапии отводят в последнее время T-регуляторным клеткам (Тreg-клетки) [Beissert еt al., 2006]. Для Трегуляторных клеток характерен высокий уровня экспрессии транскрипционного фактора Foxp3 и -цепи рецептора интерлейкина 2, кроме того, фукциональную активность Т-регуляторных клеток связывают с экспрессией TGF- и IL-10.

С использованием разработанных систем были проведены исследования по анализу экспрессии генов Foxp3, IL-2Ra, TGFB1 и IL10 при аллергических заболеваниях (АЗ) у детей (атопическая бронхиальная астма, атопический дерматит, аллергический риноконъюнктивит). Дети с аллергическими заболеваниями (всего 75 человек) были разделены на четыре группы по наличию или отсутствию на момент наблюдения следующих двух признаков: а) состояние обострения или ремиссии заболевания; б) использование препаратов, содержащих ингаляционные глюкокортикостероиды (ИГКС). Контрольная группа условно-здоровых пациентов без признаков аллергических заболеваний составляла 16 человек. В качестве нормировочного использовали ген HPRT1. Медианы уровней относительной экспрессии исследованных генов приведены в таблице 8.

Табл. 8. Медианы уровней относительной экспрессии генов Foxp3, IL2Ra, TGFB1 и IL10 в обследованных группах.

Группа Foxp3 IL10 TGFB1 IL-2Ra Контроль 0,055 0,0069 7,2 0,0Обострение АЗ 0,051 0,0075 11,7 0,0Обострение АЗ + ИГКС 0,068 0,0045 6,5 0,0Ремиссия АЗ 0,050 0,0054 8,3 0,0Ремиссия АЗ + ИГКС 0,087 0,0044 7,7 0,0Полученные данные свидетельствуют о повышении уровня мРНК гена TGF- (p=0,0016) и снижении уровня мРНК гена IL-2R (р=0,024) при обострении аллергических заболеваний по сравнению с контрольной группой.

При применении терапии ингаляционными глюкокортикостероидами возрастают уровни экспрессии генов Foxp3 (p=0,0073 и p=0,00007 для групп в обострении и ремиссии АЗ, соответственно) и IL-2Ra (p=0,019 для групп в ремиссии АЗ). В то же время терапия ИГКС при обострении аллергических заболеваний приводит к снижению уровня экспрессии TGF- (p=0,002).

Поскольку экспрессия контрольных генов (housekeeping genes) может изменяться при некоторых обстоятельствах, а нормировка по группе из нескольких таких генов достаточно трудоемка, поиск генов, соотношение экспрессии которых может служить самостоятельным индексом (маркером) того или иного состояния, представляет большой интерес для использования в диагностических целях. В этом случае соотношение экспрессии вычисляется по формуле:

[Ген1]/[ Ген2] = E2Cp2/E1Cp1, где Сp1 и Сp2- значения характеристических циклов ПЦР, а Е1 и Е2 – эффективности амплификации соответствующих генов.

В случае исследования групп детей с аллергическими заболеваниями в качестве такого индекса могли бы служить соотношения экспрессии TGFB1/Foxp3 или TGFB1/IL-2Ra. На рисунке 5 приведены значения медиан и квартилей для этих соотношений в обследованных группах.

654TGFB1 / Foxp3TGFB1 / IL2Ra 210 1 2 3 4 5 Группа Рис. 5. Соотношения уровней экспрессии генов TGFB1, Foxp3 и IL2Ra в обследованных группах (1 - контроль; 2 - обострение АЗ; 3 - обострение АЗ + ИГКС; 4 - ремиссия АЗ; 5 - ремиссия АЗ+ИГКС). Показаны медианы и квартили.

Отношение количества мРНК 3.2.3. Определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови и синовиальной жидкости при ревматоидном артрите.

В качестве апробации систем для определения количества мРНК генов иммунной системы на клиническом материале было обследовано 24 пациента с диагнозом ревматоидный артрит (биологический материал – синовиальная жидкость и мононуклеарные клетки крови). Диагноз был поставлен в соответствии с рекомендациями Американской ассоциации ревматологов [Arnett et al., 1988].

Уровнь экспрессии мРНК генов цитокинов определяли по формуле (3) (см. Материалы и методы). В качестве нормировочного использовали ген HPRT1. Медианы и квартили значений относительного количества мРНК цитокинов в исследованных образцах представлены в таблице 9.

Табл. 9. Медианы нормированных уровнией экспрессии мРНК генов цитокинов в синовиальной жидкости и мононуклеарах периферической крови при ревматоидном артрите. В скобках указаны нижний и верхний квартили.

Цитокин Cиновиальная жидкость Периферическая кровь TNF 5,0х10-1 (2,7х10-1 – 8,3х10-1 ) 1,7х10-1 (1,4х10-1 – 3,0х10-1 ) IL-1 4,7 (0,9 – 11,6) 4,8 (3,2 – 7,2) IL-6 3,6х10-4 (1,9х10-4 – 1,7х10-3 ) 1,2х10-3 (4,4х10-4 – 2,4х10-3 ) IL-10 5,5х10-2 (3,2х10-2 – 1,5х10-1 ) 3,5х10-3 (2,1х10-3 – 7,4х10-3 ) IL-17 4,0х10-4 (1,5х10-4 – 8,1х10-4 ) 1,2х10-4 (8,5х10-5 – 2,0х10-4 ) IFN 1,5х10-1 (5,2х10-2 – 4,1х10-1 ) 1,2х10-1 (8,0х10-2 – 1,4х10-1 ) IL-15 9,7х10-2 (7,9х10-2 – 1,6х10-1 ) 2,5х10-1 (1,9х10-1 – 3,3х10-1 ) IL-4 6,8х10-5 (3,9х10-5 – 1,8х10-4 ) 9,3х10-3 (3,9х10-3 – 1,6х10-2 ) IL-8 36 (5,5 – 258,3 ) 39,5 (15,5 – 57,7 ) IL-2,7х10-3 (1,4х10-3 – 5,9х10-3 ) 7,8х10-3 (5,1х10-3 – 1,4х10-2 ) Сопоставление результатов исследования уровня экспрессии мРНК генов цитокинов в синовиальной жидкости и мононуклеарных клетках крови в исследованных образцах показало, что в синовиальной жидкости достоверно выше содержание мРНК TNF (p<0,001), IL-17 (p<0,05), IL-10 (p<0,001);

достоверно ниже - IL-15 (p<0,001), IL-4 (p<0,001), IL-2 (p<0,001). При этом наибольшие отличие отмечены в случаях IL-4 и IL-10, для которых соотношения мРНК в образцах периферической крови и синовиальной жидкости составили 137 и 0,06, соответственно.

3.3. Комплексный молекулярно-генетический анализ методом ПЦР в реальном времени на примере поиска неблагоприятных факторов имплантации эмбриона в программе ЭКО.

Исследование факторов, влияющих на вероятность успешной имплантации эмбриона при проведении программ экстракорпорального оплодотворении (ЭКО) является актуальной задачей современной иммунологии репродукции.

Совместно с ФГУ НЦАГиП им. В.И.Кулакова Росмедтехнологий в рамках подготовки к программе ЭКО было проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование с помощью разработанных в ходе данной работы методов, включавшее: а) оценку профиля экспрессии мРНК цитокинов в ткани эндометрия; б) состояния биоценоза влагалища; в) степень контаминации эндометрия условно-патогенной флорой. Было обследовано 23 женщины с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.

Уровень экспрессии мРНК генов цитокинов (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL8, IL-10, IL-12a, IL-15, IL-17А, IL-18, TNF, TGFB1, IFNG, Foxp3, LIF и IL-2Rа) измеряли относительно группы нормировочных генов HPRT1, TBP и B2M.

При количественной оценке биоценоза влагалища учитывали общую бактериальная масса, количество лактобацилл Lactobacillus spp. и основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору. Абсолютные патогены Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis у всех женщин отсутствовали. Взятие материала эндометрия осуществляли в фазу пролиферации эндометрия (7-9 день менструального цикла) и период «имплантационного окна», мазков влагалища — на 7-9 день менструального цикла, предшествующего началу стимуляции суперовуляции.

Из числа обследованных женщин перенос эмбриона был осуществлен в 9-ти случаях, положительный результат получен в 2-х случаях, отрицательный – в 6-ти, у одной женщины имплантация осуществилась в шейке матки. По результатам исследования к неблагоприятным факторам исхода имплантации эмбриона можно отнести повышенный уровень экспрессии ряда провоспалительных цитокинов: IL-1 (Me 142 vs 1,1), IL-(Me 366 vs 6,0), TNF (Me 12,5 vs 2,0), IL-18 (Me 7,9 vs 1,3). Повышенный уровень экспрессии провоспалительных цитокинов часто сопровождался повышением бактериальной массы на 1-2 порядка и контаминацией эндометрия условно-патогенной флорой. В качестве маркеров, ассоциированных с успехом имплантации, могут быть рассмотрены низкие уровни экспрессии провоспалительных цитокинов, умеренные уровни экспрессии LIF и TGF- и отсутствие контаминации эндометрия условнопатогенной флорой.

ВЫВОДЫ 1. Разработана отечественная инновационная технологическая платформа на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая получать информацию о трёх основных аспектах функционирования иммунной системы человека и состояния здоровья в целом: а) о генетических особенностях; б) о профиле экспрессии генов; в) о взаимодействии организма с микробным и вирусным окружением.

2. Разработанная технологическая платформа не уступает зарубежным аналогам и позволяет эффективно решать фундаментальные и прикладные задачи современной иммунологии.

3. На основе созданной технологической платформы разработан и апробирован метод типирования локуса HLA DRB1 на уровне групп аллелей.

4. На базе отечественных компонентов разработана модификация метода типирования однонуклеотидных полиморфизмов с помощью ПЦР в реальном времени.

5. Впервые получены данные о частотах 22 наиболее значимых однонуклеотидных полиморфизмах генов иммунной системы в русской популяции.

6. Разработан нерадиоактивный метод оценки результатов РБТЛ, основанный на анализе количества мРНК генов CDC2 и TOP2A методом ПЦР в реальном времени.

7. Установлено, что при обострении аллергических заболеваний повышается уровень экспрессии гена TGF- и снижается уровнь экспрессии гена IL-2R.

8. Показано, что при использовании терапии ингаляционными глюкокортикостероидами при аллергических заболеваниях возрастает уровень экспрессии генов Foxp3 и IL-2R.

9. Охарактеризован профиль экспрессии 10-ти основных цитокинов иммунной системы в периферической крови и синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом.

10. Разработан метод комплексной молекулярно-генетической оценки профиля экспрессии генов иммунной системы и бактериального фона в образцах клинического биоматериала.

Работа выполнялась в рамках заданий ФМБА по темам: «Создание реагентов для установления генетических маркеров особенностей иммунного статуса населения, проживающего на территориях, обслуживаемых ФМБА России» (2007-2009гг.), «Разработка оригинальных тест-систем на основе молекулярно-генетических методов в интересах ФМБА России для обеспечения биобезопасности населения, в условиях возможного радиационного и/или химического поражения: скринингового HLAгенотипирования потенциальных доноров кроветворных стволовых клеток» (2006-2008гг.), «Разработка биомедицинской технологии HLA- типирования, отвечающей международным стандартам, для использования в системе ФМБА России при лечении профессиональных заболеваний» (2007-2009гг.), а также при финансовой поддержке грантов Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы (проекты ЖС-КП.5/002 и 2006РИ-34.0/002/081) и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (проекты 2007-2-2.2-04-04 и 2007-2-1.2-04-02-116).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Монография:

1. ПЦР «в реальном времени» / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., и др.; под ред. д.б.н. Д.В.Ребрикова; предисл. Л.А.Остермана и акад.

РАН и РАСХН Е.Д.Свердлова. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 2с.: ил. ISBN 978-5-94774-927-4.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

2. Хаитов М.Р., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П. Изучение роли респираторных вирусов в этиологии и патогенезе бронхиальной астмы. // Иммунология. – 2003. – Т.24. – №2. – С.9699.

3. Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – Т. 42. – № 5. – С.520–528.

4. Абрамов Д.Д., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Частоты аллелей гена HLA-LMP2 в русской популяции. // Иммунология. – 2006. – №4. – С.196-197.

5. Sokolenko A.P., Mitiushkina N.V., Buslov K.G., Bit-Sava E.M., Iyevleva A.G., Chekmariova E.V., Kuligina E.Sh., Ulibina Y.M., Rozanov M.E., Suspitsin E.N., Matsko D.E., Chagunava O.L., Trofimov D.Y., Devilee P., Cornelisse C., Togo A.V., Semiglazov V.F., Imyanitov E.N. High frequency of BRCA1 5382insC mutation in Russian breast cancer patients. // Eur. J. Cancer. – 2006. – V.42. – №10.

– Р.1380-1384.

6. Абрамов Д.Д., Дедов И.И., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Кураева Т.Л., Алексеев Л.П. Полиморфизм гена CTLA4 (49A/g) в русской популяции у больных сахарным диабетом 1 типа и здоровых доноров. // Сахарный диабет. – 2007. – №3. – С.2-3.

7. Абрамов Д.Д., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Полиморфизм гена PTPN22 (1858C/T) в русской популяции у больных сахарным диабетом 1-го типа и здоровых доноров. // Иммунология. – 2007. – Т.28. – №4. – С.200-201.

8. Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Замараев В.С., Плеханова Н.Г., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2007. – №3. – С.22-26.

9. Донецкова А.Д., Бурменская О.В., Ярцев М.Н., Трофимов Д.Ю., Ярилин А.А. Анализ экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток FOXPв норме и при аллергопатологии у детей. // Медицинская иммунология:

официальный журнал Санкт-Петербургского Регионального Отделения Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов. – 2007. – Т.9. – № 2-3. – С.180.

10. Донецкова А. Д., Бурменская О. В., Ярцев М. Н., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Регуляторные Т-клетки при аллергии у детей. // Российский аллергологический журнал. – 2007. – №.3. – прилож.1. – С.17.

11. Донецкова А. Д., Шарова Н.И.,Бурменская О.В., Топтыгина А.П., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Выработка цитокинов эпителиальными клетками тимуса человека. // Российский аллергологический журнал. – 2007. – № 3. – прилож.1. – С.70.

12. Акимов В.С., Хаитов М.Р., Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Соминина А.А., Зверев В.В. Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA. // Вопросы вирусологии. – 2007. – Т.52. – №2. – С.8-12.

13. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Распределение ВИЧ-протективных аллелей генов CCR2, CCR5 и SDF1 в российских популяциях. // Иммунология. – 2007. – Т.28. – №1. – С.10.

14. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Распределение аллелей генов CCR5, CCR2, и SDF1 ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции в российских популяциях. // Доклады Академии Наук. – 2007. – Т.415. – № 6. – С.320-323.

15. Ряпис Л.А., Брико Н.И., Дмитриева Н.Ф., Ещина А.С., Пронский А.В., Филатов Н.Н., Иваненко А.В., Салова И.Я., Сизых Е.В., Павловский С.С., Скоркина Ю.А., Трофимов Д.Ю., Кириллов М.Ю., Соболев В.И. Комплексное типирование стрептококков группы А, выделенных в разных социальновозрастных группах населения. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – № 1. – С.30-34.

16. Korobova S., Nikolaeva I., Chevalier A., Gornostaeva Yu., Trubcheninova L., Gorbunova Z., Goudima G., Pinegin B., Chernousov A., Petrova T., Trofimov D., Sidorovich I. Analysis of the safety and the immunogenicity of the gag-env HIVrecombinant protein-based vaccine “VICHREPOL” in healthy adults. // Allergy. – 2007. – V.62. – S.83. – P.493.

17. Савилова А.М., Трофимов Д. Ю., Бурменская О. В., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Метод оценки результатов РБТЛ с помощью количественной полимерезной цепной реакции. // Иммунология. – 2008. – Т.29. – №3. – С.178182.

18. Трофимов Д.Ю., Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Семенов П.А., Балуев А.Б., Гончарова Е.В., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Метод повышения точности ПЦР в реальном времени. // Доклады академии наук. – 2008. – Т.419 – №3. – С.118-121.

19. Трофимов Д. Ю., Бурменская О. В., Донецкова А. Д., Батенева Е.И., Ярилин А.А., Алексеев Л.П. Разработка тест-системы для определения уровня экспрессии мРНК Foxp3 на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени. // Иммунология. – 2008. – Т.29. – №3. – С.182-187.

20. Донецкова А. Д., Шарова Н.И., Литвина М.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ярцев М.Н., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Регуляторные Тклетки при аллергии у детей. // Медицинская иммунология. – 2008. – Т.10. – №2-3. – С.159-166.

21. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., Дедов И.И., Болдырева М.Н., Шестакова М.В., Трофимов Д.Ю., Кураева Т.Л., Петеркова В.А. Иммуногенетика сахарного диабета 1-го типа. // Иммунология. – 2008. – Т.29. – №4. – С.233236.

22. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Батенева Е.И., Алексеев Л.П., Насонов Е.Л., Александрова Е.Н., Новиков А.А. Разработка комплекса тест-систем на основе ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» для определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови и синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. // Медицинская иммунология. – 2008. – Т.10. – №6. – С.563-570.

23. Korobova S., Chevalier A., Nikolaeva I., Gudima G., Gornostaeva Y., Trubcheninova L., Chernousov A., Pinegin B., Karamov E., Pavlova T., Kornilaeva G., Petrova T., Trofimov D., Sidorovich I. Phase I clinical trials of a candidate vaccine based on fusion recombinant gag-gp41 protein in healthy HIV negative volunteers. // AIDS Research and Human Retroviruses. – 2008. – V.24. – S.1. – P.237.

24. Трофимов Д.Ю., Рагимов А.А., Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Гончарова Е.В., Сергеев И.В., Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Популяционноиммуногенетическая характеристика русской популяции в части генетических полиморфизмов, значимых для иммунного статуса человека. // Иммунология.

– 2009. – в печати.

Другие публикации:

25. Alexeev L., Dedov I., Boldyreva M., Demidova I., Evseeva I., Guskova I., Trofimov D., Rakhimova D., Zilov A., Cicinova T., Vasilov R. Comparative analysis of the HLA markers of IDDM conducted in three ethnic from the territory of former USSR. // European J. of Immungen. – 1998. – V.25. – P.52.

26. Болдырева М.Н., Евсеева И.В., Букина А.М., Грудакова Е.Г., Гуськова И.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Распределение аллелеей HLA в этнических группах, проживающих на Европейской части России. // Russian Journal of Immunology. – 1999. – V.4. – Р.96.

27. Мальков И.Г., Трофимов Д.Ю., Петрова Т.В., Павлова О.Г., Сергеев И.В., Алексеев Л.П. Создание комплекса приборов и реагентов для диагностики и мониторинга ассоциированных с иммунологической недостаточностью инфекционных заболеваний. // Аллергология, астма и клиническая иммунология. – 2001. – №1. – С.108-109.

28. Болдырева М.Н., Грудакова Е.Г., Кабдулова Д.О., Гуськова И.А., Богатова О.В., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Создание ПЦР-наборов для молекулярно-генетического типирования генов главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) разного уровня разрешения. // Аллергология, астма и клиническая иммунология. – 2001. – №1. – С.161-162.

29. Sechkin A.V., Alexeev L.P., Dolbin A.G., Boldyreva M.N., Dmitrieva N.G., Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Smirnov V.L. Effective use of a regional limited waiting list fro renal transplants at the selection based on HLA DRB1 genotyping. // Europ.J. of Immungen. – 2001.– V.28. – №.2. – Р.261.

30. Хаитов М.Р., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П. Молекулярная диагностика вирусных инфекций при бронхиальной астме. Сообщение №2. Исследование роли респираторных вирусов в возникновении приступов бронхиальной астмы. Аспекты МНСобусловленной предрасположенности к вирус-индуцированной бронхиальной астме. // Аллергология, астма и клиническая иммунология. – 2002. – №8. – С.17-21.

31. Khaitov M.R., Alexeev L.P. Trofimov D.Yu., Boldyreva M.N., Petrova T.V., Yakovleva K.P. HLA-associated markers of susceptibility to virus-induced bronchial asthma. // Immunology letters. – 2003. – V.87. – №1-3. – Р.56.

32. Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П., Ярцев М.Н., Ильина Н.И., Алексеев Л.П., Зверев В.В., Киселев О.И., Гервазиева В.Б., Семенов Б.Ф. Разработка ПЦР-диагностикума для детекции респираторно-синцитиального вируса. // Физиология и патология иммунной системы. – 2004. – №2. – С.85-91.

33. Николаева И.А., Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Игнатьева Г.А., Коробова С.В., Гасанов В.А., Кисилев А.В., Истамов Х.И., Ефремов Е.Е., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Воробьева М.С., Чеканова Т.А., Петрова Т.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Разработка тестсистем для диагностики и мониторинга результатов иммунизации и лечения больных СПИДом. // Физиология и патология иммунной системы. – 2005. – №12. – С.3-11.

34. Федоров Н.А., Петрова Т.В., Елов А.А., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Жибурт Е.Б. Калибровка HCV-содержащей плазмы крови на детектирующем амплификаторе ДТ-322. // Здравоохранение и медицинская техника. – 2005. – №7. – С.27.

35. Abramov D.D., Bateneva E.I., Grudakova E.G., Trofimov D.Yu., Alexeev L.P.

Polymorphism of CTLA4 (49A/G), IL18(137G/C), TNF-alpha(308G/A) and IL6(174G/C) genes in Russian population group in both patients with type diabetes mellitus and healthy controls. // Tissue antigens. – 2007. – V.69. – №5. – P.470.

36. Хаитов Р.М., Акимов В.С., Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Зверев В.В. Использование нанобиотехнологических подходов для создания новых средств диагностики и лечения респираторносинцитиальной вирусной инфекции. // Физиология и патология иммунной системы. – 2008. – Т.12. – № 9. – С.12-19.

Материалы симпозиумов и конференций 37. Khaitov R., Dedov I., Boldyreva M., Trofimov D., Ruzybakiev R., Taklas N., Rahimova D., Alexeev L. HLA-markers of insulin-dependent diabetes mellitus in Uzbeck population. // 13th European Histocompatibility Conference. – 1999. – Crete. – P.50.

38. Boldyreva M., Evseeva I., Boukina A., Groudakova E., Gouskova I., Trofimov D., Ginter E., Alexeev L. Distribution of HLA alleles in 14 ethnic groups from the European part of Russia. // 13th European Histocompatibility Conference. – 1999. – Crete. – P.32.

39. Sechkin A., Boldyreva M., Dolbin A., Trofimov D., Benenson L., Groudakova E., Dmitrieva N., Alexeev L. Three year experience in HLA DRB1 donor selection at Moscow center for organ donation. Human Immunology. // 14th European Histocompatibility Conference. – 2000. – V.61. – Suppl.1. – P.53-54.

40. Sechkin A.V., Dolbin A.G., Alexeev L.P., Trofimov D.Yu., Boldyreva M.N., Beneson L.I., Plavunov N.F. Genetic testing and organizing of donor organs’ selection and their distribution for further transplantation among the clinics of Moscow region. // The 12th World Congress of Medical Law. – 1999. – Siofok.

41. Alexeev l., Boldyreva M., Trofimov D., Dedov I., Zilov A. IDDM associated HLA markers among three population groups residing at the territory of former USSR. Human Immunology. // 14th European Histocompatibility Conference. – 2000. – V.61. – Suppl.1 – P.59.

42. Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г., Алексеев Л.П. Изучение полиморфизма неклассических генов HLA в русской популяции. // 5-й конгресс РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. – 2002. – Т.2. – С.197.

43. Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Петрова Т.В., Алексеев Л.П. Разработка подходов к генетической предикции вирус-опосредованной бронхиальной астмы. // 5-й конгресс РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. – 2002. – Т.2. – С.201.

44. Trofimov D., Sergeev I., Groudakova E., Alexeev L. The MIC-A alleles’ frequencies in healthy Russians and in type I diabetic patients. // XVI European Histocompatibility Conference. – 2002. – Strasbourg. – V.29. – №2. – Р.147.

45. Alexeev L.P., Dolbin A.G., Boldyreva M.N., Trofimov D.Yu., Minina M.G., Benenson L.I., Dmitrieva N.G. HLA-genotyping and clinical transplantology prospects in Russia. // 15th European Immunology Congress EFIS. – 2003. – Rhodes – Р.283.

46. Boldyreva M.N., Trofimov D.Yu., Yankevich T.E., Bogatova O.V., Gouskova I.A., Philippova E.V., Sergeev I.V., Alexeev L.P. HLA-genes diversity among Russian groups from different regions of Russian European part. // 17th European Histocompatibility Conference. 11 Annual Meeting. German Society of Immunogenetics. – 2003. – Baden-Baden. – P.S29.

47. Boldyreva M., Trofimov D., Bogatova O., Goudima G., Zelov A., Kouraeva T., Petrakova V., Dedov I., Alexeev L. Genetic Markers for Type I Diabetes among 8 Population Groups from ex-USSR. // 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS. Clinical and Investigative medicine. – 2004. – Montreal. – V.27. – №4. – P.78A.

48. Korobova S., Nikolaeva I., Chevalier A., Gornostaeva Y., Trubcheninova L., Gorbunova Z., Gudima G., Pinegin B., Trofimov D., Sidorovich I. Clinical trail of recombinant gag-env HIV1 protein based vaccine VICHREPOL in healthy adults. // 3rd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment. – 2005. – Rio de Janeiro. – Abstract A-042-0045-04695.

49. Kofiadi I., Trofimov D., Gudima G., Alexeev L. Genetic succeptibility to HIV1 infection in 4 populations from Russia. // Proc. XVI Eur. Congr. Immunol. – 2006.

– Paris. – P.129.

50. Папуашвили М.Н., Петрова Т.В., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю.

Диагностическая значимость количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) при альтернативной терапии у ВИЧинфицированных пациентов методом ОТ-ПЦР в режиме «реального времени».

// Труды XIII Конгресса «Человек и лекарство». – 2006. - Т.2.

51. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н., Новиков А.А., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В, Ребриков Д.В. Разработка комплексной технологии ранней диагностики воспалительных заболеваний на основе молекулярных маркеров иммунного ответа. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы». – 2007. – С.124-125.

52. Kofiadi I.A., Trofimov D.Yu., Rebrikov D.V. Genetic susceptibility to HIV-infection in Russian populations. // 21st EFI Conference. -2007. - Barcelona.

53. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Анализ распространения ВИЧ-протективных аллелей среди этнических групп, проживающих на территории России и сопредельных государств. // VIII Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». – 2007. – Москва.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.