WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

  На правах рукописи

Лимарева  Лариса Владимировна

СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ОСТРОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

14.00.36 – аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

  диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Уфа - 2009

Работа выполнена  в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий  Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Жестков Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук  Николаева Алевтина Максимовна

доктор биологических наук  Лютов Андрей Германович  

доктор медицинских наук, профессор Ганцева Халида Ханафиевна

Ведущая организация: Государственный научный центр – Институт иммунологии  Федерального медико-биологического агентства

Защита состоится “____ ” ноября 2009 г.  в _____ часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан  «___»__________ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета К.А. Лукманова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

 



Актуальность проблемы

  Инфаркт миокарда (ИМ) по-прежнему остаётся одной из  главных причин смертности населения во всём мире [Шальнова С.А., 2008; Шахнович Р.М., 2008; Young M.A., 2000]. Согласно прогнозам Всемирной Организации Здравоохранения, к 2020 году смертность от сердечно-сосудистых заболеваний может достигнуть 25 миллионов случаев в год, почти половину из них составит смертность от ишемической болезни сердца, прежде всего от инфаркта миокарда. При этом  в Российской Федерации показатель смертности от данного заболевания значительно  выше, чем  в  развитых индустриальных странах. В связи с этим, в рамках Национального  проекта  «Здоровье» большое внимание уделяется формированию системы кардиологической  помощи,  направленной  на повышение уровня здоровья населения  за счёт раннего выявления заболеваний сердечно-сосудистой системы,  прежде всего, ИМ, его адекватной диагностики, современного лечения и реабилитационных мероприятий [Беленков Ю.Н.,  Горохова С.Г., 2008].

В последнее десятилетие объём информации об особенностях клиники, патогенеза, возможностях ранней диагностики ИМ значительно возрос, однако, одной из важнейших медико-биологических проблем остаётся разработка комплекса клинико-лабораторных методов, позволяющих своевременно поставить диагноз и оценить  характер  течения ИМ. Выявление групп пациентов с повышенным риском осложнений ИМ стало особенно важным после того, как появилась реальная возможность улучшить их состояние с помощью медикаментозных и хирургических методов лечения с использованием клеточных технологий [Бокерия  Л.А. и др., 2008; Симбирцев  А.С. и др., 2008; Темнов А.А., 2008].

Разработка новых терапевтических подходов к лечению ИМ с применением иммунокорректоров и клеточных технологий требует проведения экспериментальных исследований на крупных лабораторных животных. Наиболее удобной моделью для этих целей является модель  воспроизведения экспериментального ИМ у собак. Однако данные об особенностях иммунной системы этих животных в норме и при экспериментальном ИМ, полученные с помощью современных технологий, в том числе и методов лазерной проточной цитофлюориметрии, крайне ограничены.

Бурное развитие иммунологии в последние годы позволило во многом пересмотреть и установить важную роль иммунологических механизмов, взаимодействия иммунной и нервной системы в формировании и течении ИМ. Всё это требует комплексной оценки изменения отдельных компонентов иммунной системы, нейро-иммунных взаимосвязей при данном заболевании.  Анализ данных литературы выявил во многом недостаточно изученную, неполную и неадекватную трактовку  результатов оценки иммунной системы при ИМ в клинике и эксперименте, вследствие  чего до сих пор  отсутствует  доказательная база эффективности проведения иммунокорригирующей терапии при данном заболевании [Моисеев В.С. и соавт., 1998; Чукаева И.И., 2001; Логачева И.В. и соавт., 2002; Weismen I.H et al., 2002; Torre-Amione G. et al., 2008]. 

В настоящее время  установлено, что ИМ характеризуется активацией каскада нейрогуморальных и иммуновоспалительных процессов, влияющих на некротическую и апоптотическую гибель кардиомиоцитов [Потапов И.В., Крашенинников М.Е., 2001;  Маслов Л.Н. и др., 2003; Galang N. et al., 2000; Assmus B. et al., 2002]. Однако, исследования процессов апоптоза  кардио-миоцитов в динамике ИМ, особенностей их реакций на сигналы со стороны нервной системы и апоптотические стимулы методически трудны, проводятся главным образом морфологическими методами, что может быть малоинформативным вследствие неадекватного забора биологического материала. В этой связи  исследования аналогичных процессов  в лимфоцитах  крови, экспрессирующих  рецепторы к нейромедиаторам вегетативной нервной системы, сходные с таковыми на кардиомиоцитах [Красникова Т.Л., Габрусенко С.А., 2000; Yamada S. et al., 1996], имеют значительные преимущества в виду доступности получения биоматериала, возможности стандартизации лабораторных исследований и наличия разнообразных подходов к изучению апоптоза этих клеток. 

В целом, при доказанности  участия иммунологических механизмов в патогенезе ИМ в настоящее время отсутствуют методические подходы к  интегральной, комплексной оценке состояния иммунной системы, её взаимодействия с вегетативной нервной системой при развитии данного патологического процесса в клинике и эксперименте. Проведение подобных исследований необходимо для расширения теоретической базы в целях  разработки новых диагностических и терапевтических подходов к коррекции иммунологических нарушений  при инфаркте миокарда.

 

Цель исследования:

Установить особенности участия иммунологических механизмов в развитии и исходах инфаркта миокарда в клинике и эксперименте, повысить эффективность клинико-лабораторной диагностики и прогнозирования течения данного заболевания на основании системного многофакторного анализа  и математического моделирования морфофункционального состояния иммунной системы.

Задачи исследования: 

1. Разработать комплекс методов in vitro для оценки влияния нейромедиато-ров вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов крови  человека и экспериментальных животных (собак).

2. Определить закономерности изменений показателей морфофункцио-нального состояния лейкоцитов  крови (иммунологические, морфологические, морфометрические), активности системы комплемента,  уровней иммуноглобулинов классов A, M, G и С-реактивного белка в крови  собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда; на основе системного многофакторного анализа разработать математические модели  состояния  иммунной системы собак в зависимости от тяжести поражения сердечной мышцы.

3. Выявить особенности изменений показателей морфофункционального состояния лейкоцитов (иммунологические, морфологические, морфометрические), активности системы комплемента, уровней иммуноглобулинов классов A, M, G; С-реактивного белка и провоспа-лительных цитокинов  (интерлейкин 1, интерлейкин 6, фактор некроза опухоли ) в крови  больных с инфарктом миокарда с зубцом Q и без зубца Q; на основе системного многофакторного анализа разработать  математические модели морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза человека в динамике острого инфаркта миокарда в зависимости от объема поражения сердечной мышцы.

4. Провести сравнительный анализ математических моделей морфофункцио-нального состояния систем иммунного гомеостаза  человека и экспери-ментальных животных при остром инфаркте миокарда.

5.  На основе математического моделирования  обосновать наиболее значимый спектр клинико-лабораторных и иммунологических показателей для улучшения эффективности диагностики, прогнозирования течения и исходов инфаркта миокарда.

Научная новизна исследования

Впервые проведён анализ проапоптотического действия  нейромедиаторов вегетативной нервной системы (норадреналина и ацетилхолина) в сравнении с классическим активатором апоптоза лимфоцитов  преднизолоном. Показано, что инкубация крови человека и экспериментальных животных с ацетилхолином in vitro вызывает апоптоз  лимфоцитов, а норадреналин изменяет экспрессию ряда антигенов дифференцировки на поверхности лейкоцитов.

   Впервые  на основе комплексного системного анализа с применением математического моделирования оценены и сопоставлены особенности изменений состояния иммунной системы человека и экспериментальных животных при остром ИМ, включая  оценку выраженности процессов апоптоза  и чувствительность иммунокомпетентных клеток к нейромедиаторам парасимпатического и симпатического звеньев вегетативной нервной системы, в зависимости от тяжести патологического процесса, что расширило экспериментальную базу для изучения патологических процессов, происходящих при ИМ, а также позволило более адекватно экстраполировать данные экспериментов в клинику.

Впервые на основании комплексной оценки  количественной информации, полученной при иммунофенотипировании лейкоцитов крови методом проточной цитометрии, определены дополнительные параметры и их диагностическая и прогностическая значимость при остром инфаркте миокарда.

  Впервые  проведена комплексная оценка  системы провоспалительных цитокинов  с оценкой содержания вне- и внутриклеточных провоспалительных цитокинов в сравнительном аспекте при остром ИМ. Выявлены  однонаправленные изменения показателей внеклеточного и внутриклеточного (моноциты) содержания провоспалительных цитокинов периферической крови до и после стимуляции в динамике острого инфаркта миокарда, отражающие степень поражения сердечной мышцы.

Впервые проведено исследование корреляционных зависимостей между клинико-лабораторными и иммунологическими параметрами, в результате чего выявлены наиболее значимые с позиций доказательной медицины показатели крови у пациентов в зависимости от тяжести течения инфаркта миокарда. Полученные данные позволяют повысить эффективность диагностики данного заболевания с возможной заменой некоторых сложных и дорогостоящих методов исследования на общеклинические методы при их соответствующей математической обработке.

  Впервые разработаны математические модели морфофункционального состояния иммунной системы при поражении сердечной мышцы различной степени тяжести вследствие острого ИМ в эксперименте и клинике.  Определён  перечень наиболее значимых  параметров  иммунного статуса для оценки выраженности иммуновоспалительных реакций в динамике  острого инфаркта миокарда.

Научно - практическая значимость работы

Дополнены и углублены представления о патогенетическом значении компонентов системы иммунного гомеостаза и реализации процессов  апоптоза  лейкоцитов в развитии и исходах инфаркта миокарда, что расширяет теоретическую базу для разработки новых терапевтических подходов к коррекции иммунологических нарушений при данном заболевании.

Разработаны методические подходы к оценке чувствительности лейкоцитов  крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы на основе морфометрических методов и методов проточной цитометрии, позволяющие изучать механизмы нейро-иммунных взаимодействий в норме и при различных патологических состояниях в клинике и эксперименте.

  Комплексно оценены и сопоставлены особенности изменений состояния системы иммунного гомеостаза человека и экспериментальных животных (собак), разработаны рабочие математические модели, отражающие состояние иммунной системы, что позволяет  улучшить эффективность диагностики и прогнозирования исходов  инфаркта миокарда  и  расширяет экспериментальную базу  для разработки новых терапевтических подходов при лечении инфаркта миокарда на основе современных биотехнологий.

Разработана модель in vitro для изучения участия нейромедиаторов вегетативной нервной системы в регуляции процессов апоптоза иммунокомпетентных клеток.

  Предложен  методический подход и разработаны компьютерные программы для комплексной оценки иммунного статуса и  определения наиболее значимых показателей для диагностики и прогноза. 

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Нейромедиатор парасимпатического звена вегетативной нервной системы  ацетилхолин способен индуцировать in vitro апоптоз лимфоцитов крови человека и животных, что свидетельствует о возможности его прямого участия в процессах  регулирования иммуновоспалительных реакций за счёт влияния на программируемую клеточную гибель.
  2. При остром инфаркте миокарда в зависимости от степени поражения сердечной мышцы происходят различные по выраженности, но одинаковые по направленности динамические изменения со стороны иммунной системы, характеризующие этапы развития иммуновоспалительного процесса и свидетельствующие о целесообразности  проведения  иммунокоррегирующей терапии.
  3. Характер динамических изменений общего состояния системы иммунного гомеостаза человека и собак при возникновении инфаркта миокарда совпадает по выраженности и направленности, что подтверждает  общебиологическую сущность  выявленных  изменений, а также  позволяет использовать модель экспериментального инфаркта миокарда у собак для разработки патогенетически обоснованной иммунокоррегирующей терапии при данном заболевании.
  4. Математическое моделирование морфофункционального состояния  иммунного гомеостаза человека и экспериментальных животных  позволяет объективно оценить и описать характер реагирования на возникновение острого инфаркта миокарда и определить показатели, наиболее значимые для состояния иммунной системы в динамике инфаркта миокарда.

Апробация работы

Результаты исследований  доложены на  Итоговых годичных конференциях  ЦНИЛ Куйбышевского медицинского  института (Куйбышев, 1990, Самара, 1994, 1996); II Всероссийском симпозиуме с  международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» и конференции «Теория и практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004); Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008);  Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвящённой памяти члена-корреспондента АМН СССР проф. Ф.М. Лазаренко  (Оренбург, 2008); Х  международном  конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Д. Адо (Казань, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Архангельск, 2009); XIII Всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвящённой 160-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2009).

Внедрение результатов  в практику

Результаты исследований внедрены в научную  работу отделов Института экспериментальной медицины и биотехнологий, в научную и учебно-методическую работу кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, факультетской педиатрии, гистологии и эмбриологии,  в практическую работу отделения гематологии и трансфузиологии, нефрологии,  хирургического отделения пересадки органов клиник  ГОУ ВПО «Самарский  государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 9 – в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации, монография; зарегистрирована  компьютерная программа.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», 7 глав результатов собственных исследований,  заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, который содержит 226 работ отечественных и 342 – зарубежных авторов, приложения. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы и 51 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования были проведены на 54 взрослых беспородных собаках массой тела от 15 до 20 кг обоего пола с соблюдением современных принципов биоэтических норм.

Инфаркт миокарда у собак  вызывали перевязкой нисходящей ветви левой венечной артерии на границе верхней и средней её трети [Виноградов С.А., 1955]. Для этого животным в состоянии премедикации проводили интубирование, катетеризацию бедренной вены, забирали кровь для исследования (контроль), затем вводили тиопентал натрия медленно до исчезновения корнеального рефлекса и снимали исходную электрокардиограмму (ЭКГ)  в 12 отведениях с помощью электрокардиографа ЭЛКАР-6. Через 40 минут после перевязки коронарной артерии снимали ЭКГ для подтверждения воспроизведения инфаркта миокарда по признакам нарастающей ишемии. Через 1, 3, 7  и 14 суток у животных в состоянии премедикации забирали кровь из бедренной вены для иммунологического исследования, выполняли ЭКГ; собак выводили из эксперимента передозировкой наркоза, забирали материал для морфологического исследования из центра ишемизированной области миокарда, из парафиновых срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, готовили гистологические препараты и  анализировали при увеличении  светового микроскопа 8х20.

Для  оценки  изменений морфофункционального состояния иммунной системы человека при остром ИМ были исследованы образцы крови 49 пациентов – мужчин в возрасте 44-56 лет с диагнозом острый ИМ (29 человек с острым ИМ с патологическим зубцом Q, у 3-х из них в период наблюдения развился повторный ИМ;  20 больных с острым ИМ без формирования зубца Q, у 1-го из них в период наблюдения развился повторный ИМ). Диагноз ИМ у больных был выставлен на основании клинических, лабораторных и данных ЭКГ. Верификация острого ИМ без зубца Q проводилась с помощью качественного теста на тропонин Т (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Швейцария).  Все больные  получали стандартную терапию -блокаторами, дезагрегантами, антикоагулянтами, нитратами ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента. У всех обследованных пациентов в анамнезе имела место ишемическая болезнь сердца, отсутствовали  сопутствующие заболевания, вызывающие выраженные изменения иммунного статуса, ранее перенесённый инфаркт миокарда. 

  В группу контроля вошло 37 практически здоровых мужчин  сопоставимого  возраста. Все исследования крови проводились на основании добровольно-информированного согласия. Для иммунологических исследований кровь у больных острым ИМ и здоровых добровольцев получали из локтевой вены утром натощак на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после возникновения ИМ. 

  Комплексную оценку иммунной системы при ИМ в клинике и эксперименте осуществляли с помощью иммунологических, морфологических, морфометрических методов и методов лазерной проточной цитометрии. С помощью исследования мазков периферической крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе, рассчитывали лейкоцитарную формулу крови и индексы:

лейкоцитарный индекс интоксикации по Кальф-Калифу: ЛИИ = (4Мл+3метаМл+2П+С)*(Пл+1) /(Л + Мон)*(Э+1); индекс сдвига лейкоцитов крови: ИСЛК = (Э+Б+С+П+Мл+метаМл)/(Л+Мон); лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс: ЛГИ=Л*10/(Мл+метаМл+П+С+Э+Б).

Оценку морфометрических параметров лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов  крови проводили в окрашенных мазках с помощью автоматизированной системы визуализации изображений на основе микроскопа Olympus (Япония), цифрового фотоаппарата Nikon (Индонезия)  и программного обеспечения Image Tool (UTHSCSA, Version 2.00, США). Определяли площадь лейкоцитов  (Sк), ядра (Sя), ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО= Sя / (Sк-Sя). Оценку структурно-функциональных  характеристик клеток крови проводили методом лазерной проточной цитофлюориметрии (ЛПЦМ) на проточном цитометре  Becton Dickinson FACS Calibur с помощью компьютерной программы Cell Quest Pro (США).  Анализировали параметры светорассеяния: forward scattering (FSC),  характеризующего размеры клеток и side scattering (SSC), интегрально оценивающего  структурную «гранулярность»  лейкоцитов.





Определение активности миелопероксидазы, фосфолипидов и гликогена в нейтрофильных гранулоцитах определяли с помощью тест систем производства «Абрис+» (Санкт-Петербург, Россия) с расчётом среднего цитохимического коэффициента, согласно приложенным инструкциям.

Уровень провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1 (ИЛ-1), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли (ФНО) в сыворотке, плазме и надосадке клеток крови определяли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем производства Вектор-Бест (Новосибирск, Россия); С-реактивного белка (С-РБ) в сыворотке крови – методом ИФА (тест-системы производства  ИМТЕК, Россия) на иммуноферментном анализаторе «Пикон» (Москва, Россия). Внутриклеточное содержание цитокинов оценивали методом ЛПЦМ, используя  конъюгированные с флюорохромами мышиные  моноклональные антитела к  ИЛ-1 , ИЛ-6 и ФНО человека (R&D Systems, США), согласно инструкции производителя. Определяли базальный уровень цитокинов в сыворотке и плазме крови, а также способность клеток вырабатывать цитокины in vitro после 4-х часов инкубации цельной гепаринизированной крови в присутствии (опыт) и отсутствии (контроль) бактериального липополисахарида (Sigma, США). Рассчитывали индекс стимуляции  продукции цитокинов по отношению разностей показателей контроля  и опыта к показателю контроля, результат выражали в условных единицах.

  Содержание иммуноглобулинов классов A, M, G в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии с помощью тест-систем производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Москва, Россия).

  Оценку гемолитической активности системы  комплемента оценивали по 50%-му гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана (Фримель Г., 1987).

Чувствительность лимфоцитов крови к действию ацетилхолина и норадреналина  in  vitro определяли по изменению морфометрических и морфоструктурных характеристик, ДНК-цитометрии, экспрессии CD95-антигена и экспрессии CD3-антигена клетками  до и после инкубации с различными разведениями нейромедиаторов в полной питательной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия). Для этого  кровь (для ДНК-цитометрии – суспензию мононуклеарных клеток, выделенных с помощью градиента плотности Lympholyte, Канада) в объеме 0,1 мл вносили в пластиковые микропробирки  на 1,5 мл и инкубировали при температуре 370С  в атмосфере 5%-ого СО2 в течение 1-го, 2-х  и 24-х часов с равным объемом питательной среды (контроль), ацетилхолина хлорида (Диа М, Россия) или норадреналина гидротартрата (раствор для инъекций, ГНИИ стандартизации и контроля лекарственных средств МЗ России), используемых в конечных концентрациях 110-3, 110-5 и 110-6 моль/л или преднизолона (Gedeon Richter, Германия; конечная концентрация  10-3, 0,510-3 и 0,2510-3 моль/л). Через 1 и 2 часа инкубации проводили оценку жизнеспособности лейкоцитов с трипановым синим (Sigma, США) и оценку морфометрических (площадь клетки и ядра, ЯЦО) и морфоструктурных характеристик (FSC и SSC). Через 24 часа проводили  определение  относительного количества CD3+,  СD3+СD95+, СD3-СD95 лимфоцитов с учётом параметров FSC и SSC; осуществляли ДНК-цитометрию методом ЛПЦМ (тест-системы DNA QC, Becton Dickinson, США), а также при помощи иммунофлюоресцентного микроскопа Люмам – ПР1 (ЛОМО, Россия), используя окраску пропидиума йодидом (Sigma, США). Для каждого показателя рассчитывали в условных единицах индекс сдвига значений под действием нейромедиатора или гормона (ИСд), как отношение разностей показателей опыта и контроля к показателю контроля.

  Влияние ацетилхолина и норадреналина на нейтрофильные  гранулоциты оценивали по изменению их фагоцитарной активности  в тесте поглощения полистерольного латекса [Фримель Г.,1987] после инкубирования  гепари-низированой крови в течение 2-х часов при  температуре 370С в питательной среде в атмосфере 5%-ого СО2 в присутствии ацетилхолина или норадреналина с расчетом ИСд.

Для иммунофенотипирования лейкоцитов крови человека методом ЛПЦМ использовали следующие комбинации моноклональных антител (Caltag, Австрия): CD14-FITC+CD45-PE, CD8-FITC+CD4-PE+CD3-Pc5, CD3-FITC+CD19-PE, CD3-FITC+CD16-PE+CD56-PE, CD3-FITC+CD25-PE, CD3-FITC+CD95-PE, CD3-FITC+HLA-DR-PE. Для дополнительной характеристики функционального состояния лейкоцитов оценивали интенсивность  флюоресценции  меченых  моноклональных антител на соответствующих клетках, используя параметры «Mean», отражающие среднестатистическое положение максимума пика распределения частиц на гистограммах в выбранном канале флюоресценции.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью параметрических и непараметрических методов анализа. Рассчитывали средние арифметические значения (М), их средние квадратичные отклонения (). Сравнение групповых данных  проводилось с использованием критерия Стьюдента, для возможности использования которого предварительно вычисляли критерий Фишера-Снедекора, в случае отсутствия нормального распределения – использовали критерий Манна-Уитни (Вилкоксона). Взаимозависимость между рядами оценивалась с помощью рангового анализа сопряженности по Спирмену. Различия считали  достоверными при уровне значимости p<0,05. Данные представлены в виде М± (Реброва О.Ю., 2002). Для оценки характера и направленности изучаемых процессов на математических моделях применяли системный многофакторный анализ, в процессе которого вычисляли  интегральные показатели (ХBi) и  весовые коэффициенты (коэффициенты влияния) конкретных показателей (Рi) [Углов Б.А. и др., 2004].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка чувствительности лимфоцитов крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы  норадреналину и ацетилхолину in vitro

   На первом этапе исследования нами были разработаны методологические подходы (условия инкубации, концентрации, показатели морфо-функционального состояния клеток) к оценке чувствительности лимфоцитов к норадреналину и ацетилхолину по показателям выраженности апоптоза  и экспрессии на их поверхности CD3-антигена. Апоптотическое  действие нейромедиаторов  на лимфоциты крови оценивали в сравнении с классическим индуктором апоптоза – преднизолоном. 

В ходе проведения нескольких серий предварительных экспериментов in vitro нами было установлено, что наиболее оптимальными для оценки влияния исследуемых нейромедиаторов и преднизолона на лимфоциты крови являются следующие концентрации норадреналина и ацетилхолина: 110-5 моль/л (кровь человека), 110-6 моль/л (кровь собак), преднизолона – 0,2510-3 моль/л; время инкубации для оценки морфометрических и морфоструктурных характеристик клеток - 2 часа,  для проведения ДНК-цитометрии и оценки экспрессии CD95- и CD3-антигенов – 24 часа.  Эти условия инкубации были нами использованы  в дальнейших исследованиях.

Анализ полученных данных выявил, что инкубация крови с  норадреналином в течение 2-х часов не приводит к изменению морфометрических и морфоструктурных характеристик лимфоцитов, а преднизолон  и  ацетилхолин (рис. 1)  вызывают снижение  (p<0,05)  значений 

Рис. 1. Изменение морфоструктурных характеристик лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных после 2-х часов инкубации с ацетилхолином и преднизолоном

показателей площади клеток и ядер, параметра FSC; повышение (p<0,01) ЯЦО, что может свидетельствовать об апоптотических изменениях в клетках.  Статистически значимых изменений SSC параметра, отражающего  оптическую гранулярность лимфоцитов, под действием нейромедиаторов и преднизолона выявлено не было из-за высокой вариабельности значений показателя.

Известно, что на лейкоцитах, способных принимать сигналы к апоптотической гибели, появляется CD95 (Fas)-антиген. Вместе с тем, этот антиген рассматривается как  активационный, появляющийся, прежде всего, на активированных клетках, гиперпродукция которых может в дальнейшем  ограничиваться их гибелью по пути апоптоза.

Для оценки изменений экспрессии данного антигена на поверхности лимфоцитов крови, как признака апоптотической гибели, нами была проведена сравнительная оценка изменений содержания CD3+95+, CD3-95+, CD95+ лимфоцитов и параметров FSC данных клеток, а также количества гиподиплоидных лимфоцитов после 24-х часов инкубации с нейромедиаторами  и преднизолоном (рис. 2). 

  1- CD3+(%); 2- CD3+95+(%); 3- CD3-95+(%); 4- CD95+(%); 5- CD3+95+(FSC);

  6- CD3-95+(FSC); 7- CD95+(FSC); 8- гиподиплоидные лимфоциты (%).

 

Рис.2. Сравнительная оценка чувствительности лимфоцитов крови к  ацетилхолину, норадреналину и преднизолону.

Анализ полученных результатов показал, что ацетилхолин статистически значимо увеличивал относительное содержание  CD95+ - , CD3+95+ -  и CD3-95+ лимфоцитов по сравнению с контролем в 1,7; 1,95 и 1,4 раза соответственно. При этом под влиянием ацетилхолина на гистограммах распределения клеток по параметру FSC появлялся дополнительный пик, свидетельствующий о появлении лимфоцитов  с уменьшенными размерами.

Одновременно при проведении ДНК-цитометрии на гистограммах появлялся выраженный пик гиподиплоидных клеток (процент гиподиплоидных лимфоцитов возрастал с 0,5±0,2 в контроле до 11,5±1,2; р<0,001). Преднизолон оказывал аналогичное действие на изменение параметра FSC и содержание ДНК в лимфоцитах, но увеличение содержания клеток, позитивных по CD95-антигену было не столь выраженным, как под влиянием ацетилхолина.

  Инкубация крови с норадреналином приводила к снижению экспрессии  CD95-  и CD3- антигенов  на лимфоцитах,  но при этом  изменений FSC 

параметров и содержания ДНК,  характерных для апоптоза лимфоцитов, не

происходило.

Таким образом, анализ изменений показателей чувствительности лимфоцитов крови здоровых людей и экспериментальных животных к нейромедиаторам вегетативной нервной системы выявил, что ацетилхолин in vitro способен индуцировать апоптоз лимфоцитов, а норадреналин только подавляет их активность, снижая экспрессию CD3- и CD95- антигенов. 

Разработанный методический подход был  использован в дальнейшем для комплексной оценки изменений иммунной системы в динамике ИМ в эксперименте и клинике.

2. Результаты воспроизведения экспериментального инфаркта миокарда

  При перевязке коронарной артерии ИМ был подтвержден характерными изменениями на ЭКГ и/или морфологическими признаками у 49 из 54 прооперированных собак (90,7%): у 24 животных (44,4%) развивался трансмуральный, в 27 случаях (50,0%) - нетрансмуральный инфаркт миокарда. В 7,4% случаев при развитии нетрансмурального ИМ не было выявлено наличия патологического зубца Q на ЭКГ, однако, наличие  некроза сердечной мышцы было подтверждено на гистологических препаратах. Следует отметить, что у четырёх собак (7,4 % от числа прооперированных животных) на ЭКГ были выявлены  признаки нового повреждения миокарда:  у одной на 7-е и у трёх - на 14-е сутки эксперимента, в дальнейшем подтверждённые морфологически.

  Анализ гистологических препаратов выявил характерные для экспериментального ИМ морфологические изменения в сердечной мышце животных: через 24 часа  после операции в зоне ишемии обнаруживались признаки, характерные для завершения предынфарктной стадии; через 3-е суток морфологические изменения в сердечной мышце соответствовали стадии формирования ИМ; на 7-е сутки эксперимента  обнаруживались признаки организации ИМ. При нетрансмуральном ИМ к 14-м суткам наблюдения выявлялись признаки завершения стадии организации ИМ, начала процессов рубцевания; при трансмуральном ИМ в эти сроки процессы организации ИМ прогрессировали незначительно по сравнению с 7-ми сутками, что означало некоторое замедление процессов заживления. При этом у двух животных данной группы на 7-е сутки и у трёх собак на 14-е сутки  эксперимента были выявлены рецидивирующие инфаркты на фоне распространенных первичных трансмуральных очагов.

3. Оценка морфофункционального состояния лимфоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда

При изучении особенностей состояния лимфоцитов крови в динамике трансмурального и нетрансмурального ИМ в эксперименте нами были проанализированы изменения 20-ти показателей, характеризующих морфологические, морфометрические параметры, выраженность процессов апоптоза и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы.

При возникновении нетрансмурального ИМ в эксперименте были выявлены изменения показателей морфофункционального состояния лимфоцитов крови в зависимости от срока реализации возникшего патологического процесса в сердечной мышце (рис.3).

Через сутки после перевязки коронарной артерии в крови у собак происходило снижение относительного содержания лимфоцитов. Для них было характерно значительное увеличение размеров клеток и ядер. При этом прирост площади ядер преобладал и  приводил к повышению ЯЦО, что могло быть связано с перераспределением популяционного состава лимфоцитов и активацией клеток вследствие неспецифической реакции лейкоцитов на стресс. В данный срок эксперимента отмечалось повышение  чувствительности клеток к проапоптотическому действию ацетилхолина in vitro.

  На  3-и сутки  наблюдалось снижение  числа лейкоцитов в крови, возрастало содержание лимфоцитов, отмечалась некоторая  стабилизация

Рис.  3. Изменение основных параметров морфофункционального состояния лимфоцитов  крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда.

размеров клеток, однако, повышенные значения ЯЦО сохранялись. Чувствительность клеток к ацетилхолину продолжала нарастать.

  Реализация процессов организации инфаркта миокарда (7-е сутки эксперимента) сопровождалась нормализацией морфометрических параметров клеток. Оставались изменёнными только параметры, характеризующие чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину. На 14-е сутки после возникновения нетрансмурального ИМ наблюдалось практически полное восстановление большинства показателей состояния лимфоцитов крови, их чувствительности к ацетилхолину, оставались повышенными (р<0,05) только значения абсолютного содержания лимфоцитов.

При развитии трансмурального ИМ характер изменений морфофункционального состояния лимфоцитов крови отличался более выраженным снижением относительного содержания лимфоцитов в крови в течение всего срока наблюдения и повышением чувствительности клеток к ацетилхолину. В 1-е сутки формирования очага некроза в сердечной мышце циркулирующие в крови лимфоциты отличались низким ЯЦО, из-за  интенсивного снижения площадей их ядер. Чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину достигала максимальных уровней. На 3-и  сутки после операции, в стадию формирования ИМ, отмечалась некоторая стабилизация морфометрических параметров лимфоцитов крови. При этом чувствительность клеток к ацетилхолину начинала постепенно снижаться. На 7-е и 14-е сутки после операции при нормализации большинства морфологических признаков чувствительность лимфоцитов к апоптотическому действию ацетилхолина оставалась высокой. Необходимо отметить, что максимальные значения индексов сдвига ацетилхолина наблюдались у животных непосредственно до возникновения новых очагов некроза в сердечной мышце на фоне развившегося трансмурального инфаркта миокарда.

  Таким образом, в ходе исследования были выявлены сложные,  отличающиеся по выраженности, динамические изменения состояния лимфоцитов, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы. Наиболее значительные изменения были характерны для  показателей чувствительности лимфоцитов к апоптотическому действию  ацетилхолина, максимальные при трансмуральном инфаркте миокарда. Все это свидетельствует о реактивном характере изменений показателей морфофункционального состояния лимфоцитов, максимально выраженных на начальных этапах реализации патологического процесса в сердечной мышце и отражающих, в первую очередь,  неспецифическую реакцию лимфоцитов на появление очага некроза в организме. Выявленные изменения чувствительности к ацетилхолину при отсутствии реакции на норадреналин свидетельствуют о структурных и функциональных перестройках в лимфоцитах, связанных с их вовлечением в патологический процесс при ИМ и регуляции вегетативной нервной системой иммунологических реакций посредством модуляции апоптоза лимфоцитов.

  С целью проведения интегральной и объективной оценки выявленных изменений в лимфоцитах, а также определения закономерностей и направленности их реагирования в динамике экспериментального ИМ  мы применили системный многофакторный анализ с построением математических моделей (рис.4).

Рис. 4.  Изменения интегральных показателей морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак при экспериментальном инфаркте миокарда.

Анализ математической модели морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак при возникновении  нетрансмурального ИМ выявил, что изменения интегральных показателей системы носили колебательный характер, с максимальной активацией системы на 1-е сутки и постепенной нормализацией состояния к 14 суткам наблюдения. В 1-е и 3-и сутки после возникновения  нетрансмурального ИМ наибольшее влияние на общее состояние  модельной системы лимфоцитов, оцененное по изменениям  весовых коэффициентов отдельных показателей, оказывали значения ЯЦО (Pi=388,6 и 545,3, соответственно), относительное содержание лимфоцитов в крови (Pi=147 и 60, соответственно), индексы сдвига ацетилхолина  по площадям клетки (Pi=136,3 и 116,4, соответственно).

На 7-е сутки эксперимента наибольшее влияние имели значения ЯЦО (Рi=170,3), общее содержание лейкоцитов (Pi=100,1) и индекс сдвига ацетилхолина по площади клеток (Pi=85,3). На 14-е сутки после развития нетрансмурального ИМ,  при приближении интегрального показателя к норме,  максимально высокие значения весовых коэффициентов были у ЯЦО (Pi=389,2); индекса сдвига ацетилхолина (Pi=113,3); относительного содержания лимфоцитов (Pi=100,7).

  При развитии  трансмурального экспериментального  ИМ характер и направленность математической модели морфофункционального состояния системы лимфоцитов крови отличались от описанных для нетрансмурального,  особенно на 3-и сутки эксперимента. К 14-м суткам наблюдения  имели место признаки активации системы, выражающиеся в увеличении значений интегрального показателя. Полной нормализации состояния модельной системы лимфоцитов не происходило. Через сутки после развития трансмурального ИМ наиболее значимый вклад в функционирование системы вносили такие параметры лимфоцитов, как индекс сдвига ацетилхолина по площади ядра (Pi=342,9) и площади клетки (Pi=297,2), ЯЦО (Pi=100,2). На  3-и сутки эксперимента - в момент максимального отклонения состояния системы от нормы – наиболее важными для её активности являлись показатели, характеризующие чувствительность клеток к апоптотическому действию ацетилхолина (для показателей индекса сдвига ацетилхолина по площади лимфоцитов Pi=562,0). На 7-е сутки наибольшее влияние на морфофункциональное состояние системы оказывали ЯЦО (Pi=542,0) и индекса сдвига ацетилхолина по площади лимфоцитов (Pi=102,0). На 14-е  сутки  наиболее важными для состояния системы явились изменения ЯЦО (Pi=545,5) и относительное содержание лимфоцитов в крови (Pi=104,5).

Таким образом, в динамике развития экспериментального инфаркта отмечаются колебательные изменения активности лимфоцитов с максимальным отклонением от  нормы на 1-е (при нетрансмуральном ИМ)  и 3-и (трансмуральный ИМ) сутки после перевязки коронарной артерии. Наиболее выраженные  отклонения в состоянии модельной системы лимфоцитов от нормы  наблюдаются при трансмуральном  инфаркте миокарда. Наиболее значимыми для состояния системы являются показатели ЯЦО и чувствительности лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина, что подтверждает важную роль парасимпатической нервной системы в регуляции иммунокомпетентных клеток при экспериментальном инфаркте миокарда.

Вне зависимости от степени повреждения сердечной мышцы в начальный период формирования очага некроза в миокарде именно изменения парасимпатической регуляции состояния иммунной системы являются ведущими. В стадию формирования ИМ (3-и сутки), в момент максимальной активации системы при нетрансмуральном ИМ критическое значение имеют значения ЯЦО и сниженное содержание лимфоцитов в крови, а при трансмуральном - высокая чувствительность клеток к ацетилхолину. На 7-е сутки, в период организации ИМ, при его более тяжелом течении чувствительность клеток к ацетилхолину менее выражена. В период завершения стадии организации ИМ и начала процессов рубцевания (14-е сутки), возрастание коэффициентов влияния ацетилхолина на лимфоциты является отражением напряженности системы и готовности лимфоцитов к восприятию регулирующих сигналов. Максимальная выраженность значений коэффициентов влияния показателей чувствительности лимфоцитов к ацетилхолину является признаком неблагоприятного течения патологического процесса. 

4. Оценка морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда

При изучении особенностей состояния нейтрофильных гранулоцитов  крови  собак в динамике нетрансмурального и трансмурального ИМ в эксперименте нами были проанализированы изменения 16-ти показателей, характеризующих морфологические, морфометрические, цитохимические параметры, фагоцитарную активность и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы  - ацетилхолину и норадреналину в реакции фагоцитарной активности; проведены расчет и оценка лейкоцитарных индексов (ИСЛК, ЛИИ).

  При возникновении  нетрансмурального ИМ у собак реализация стадий формирования, организации и начала рубцевания ИМ сопровождалась динамическими  изменениями показателей морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов (рис. 5).

Рис. 5. Изменения основных параметров морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда

В 1-е сутки  в крови животных на фоне выраженного увеличения общего количества лейкоцитов статистически значимо  (р<0,05)  возрастало относительное и абсолютное содержание нейтрофильных гранулоцитов (в 1,9 и 1,7 раз по сравнению с контролем, соответственно). Происходило  увеличение значений ИСЛК и ЛИИ в 2,5 раза и в 1,6  раза соответственно; морфометрические характеристики при этом не изменялись. Возрастала активность миелопероксидазы, фагоцитарная активность, увеличивалось содержание в клетках гликогена.

Описанные изменения свидетельствовали о функциональной активации нейтрофильных гранулоцитов и перераспределительном лейкоцитозе, связанном со стрессовой реакцией  организма на возникновение очага некроза.  Оценка чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к нейромедиаторам  вегетативной нервной системы выявила снижение реакции клеток на норадреналин и ацетилхолин. На 3-и сутки выраженность изменений количественных и функциональных показателей нейтрофильных гранулоцитов снижалась. Реакция клеток на норадреналин нормализовалась, чувствительность к ацетилхолину возрастала. На 7-е сутки оставались повышенными только ИСЛК и ЛИИ (р<0,05). К 14-м  суткам эксперимента происходила нормализация большинства показателей морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов. 

  При развитии трансмурального ИМ изменения морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови были более выраженными.

  В 1-е сутки формирования очага некроза в сердечной мышце отмечался максимально выраженный нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы крови влево, вследствие чего максимально возрастали значения ИСЛК и ЛИИ. В нейтрофильных гранулоцитах  значительно падала активность миелопероксидазы,  уменьшалось содержание гликогена и возрастало содержание фосфолипидов, клетки отличались сниженной фагоцитарной активностью. Чувствительность клеток к норадреналину  была максимальной, к ацетилхолину – минимальной.

На 3-и сутки отмечалась тенденция к нормализации показателей состояния нейтрофилов, однако, менее выраженная, чем при нетрансмуральном ИМ. На  7-е  сутки эксперимента были повышены средние значения относительного содержания нейтрофильных гранулоцитов, их площадь, ИСЛК, снижена  чувствительность клеток к норадреналину и ацетилхолину. У животных с развившимся в дальнейшем повторным ИМ отмечалась максимальная выраженность указанных изменений. К 14-м суткам достоверно повышались  средние значения общего содержания лейкоцитов в кровотоке и абсолютное количество нейтрофильных гранулоцитов, ЛИИ, ИСЛК, ЯЦО, реакция нейтрофильных гранулоцитов на нейромедиаторы вегетативной  нервной системы оставалась сниженной.

Математические модели морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови при нетрансмуральном и трансмуральном ИМ (рис.6) отличались по выраженности отклонений интегральных показателей от нормы, однако общая направленность изменений активности системы была сходной с отклонением в сторону отрицательных величин на 7-е сутки. 

Рис. 6. Изменение интегральных показателей системы нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда

Анализ изменения ранжированных коэффициентов влияния показал, что при нетрансмуральном ИМ в 1-е сутки развития патологического процесса  наиболее значимыми для функционирования системы являлись показатели чувствительности к норадреналину (Pi=202,0); относительного содержания нейтрофилов (Pi=208,4); площади ядра (Pi=203,6), при  трансмуральном  ИМ  - ЛИИ (Pi=1664,4); активности миелопероксидазы (Pi=537,4); индекса сдвига  ацетилхолина (Pi=166,4). Ранжированное  распределение  коэффициентов влияния  показателей на 3-и сутки нетрансмурального и трансмурального ИМ было одинаковым: наиболее весомыми были активность миелопероксидазы (Pi=538,4 и 412,5, соответственно), содержание фосфолипидов (Pi=334,6 и 212,5 соответственно), индекс сдвига  ацетилхолина (Pi=105,3 и 102,5, соответственно).

На 7-е сутки наблюдения  распределение показателей  по значимости для функционирования системы отличались только тем, что максимальные значения при трансмуральном ИМ имело изменение площадей ядер нейтрофильных гранулоцитов (Pi=208,2). Через 14 суток, независимо от формы ИМ, ведущими были изменения значений площадей клеток,  активности в них миелопероксидазы и, при трансмуральном ИМ, индексы сдвига ацетилхолина (Pi=102,4) и норадреналина (Pi=104,2).

В целом, системный многофакторный анализ морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов позволил выявить характерные закономерности реагирования данных клеток на возникновение очага некроза в сердечной мышце. Выраженность изменений морфофункционального состояния клеток отражает динамику их перераспределения в крови и тканях, а также функциональную активность в зависимости от этапов развития экспериментального ИМ. Установлено, что изменения показателей чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к нейромедиаторам коррелировали с тяжестью течения патологического процесса.

5. Математическое моделирование морфофункционального состояния  иммунной системы при экспериментальном инфаркте миокарда

С целью комплексной оценки морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза  животных при экспериментальном ИМ нами на основе системного многофакторного анализа с учётом показателей, характеризующих  морфофункциональное состояние лейкоцитов крови, уровней имму-ноглобулинов основных классов и С-РБ в крови, а также  активности системы комплемента была создана математическая модель состояния иммунной системы в целом. Для рабочей модели были выбраны показатели с высокими значениями весовых коэффициентов в соответствующей модельной системе (рис. 7).

  Согласно результатам сравнительного анализа математических моделей,  в первые трое суток после воспроизведения экспериментального ИМ характер  и

 

Рис. 7. Математические модели морфофункционального состояния иммунной системы при экспериментальном инфаркте миокарда

направленность изменений активности иммунной системы определяется  состоянием  как лимфоцитов,  так  и  нейтрофильных  гранулоцитов,  после 7-х суток максимально значимой является активность лимфоцитов крови. При развитии трансмурального ИМ отклонения интегральных показателей  иммунной системы от нормативных значений  были наиболее выраженными. С учётом ранжированной оценки весовых коэффициентов, эти результаты отражают этапы реагирования иммунной системы на возникновение ИМ и подтверждают важную роль вегетативной нервной системы в регуляции иммунологических процессов при инфаркте миокарда. 

Выявленные изменения чувствительности лимфоцитов крови к  норадреналину и ацетилхолину сопровождались изменениями морфометрических  характеристик клеток, что могло явиться как отражением перераспределения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, так и изменением  плотности рецепторов к нейромедиаторам в ответ на  изменения активности вегетативной нервной системы. 

Для определения закономерностей выявленных изменений и  сопоставления их  с  клиническими данными,  нами была  проведена  комплексная,  на основе системного многофакторного анализа, оценка морфофункционального состояния  системы иммунного гомеостаза человека  при остром ИМ с зубцом Q и без формирования зубца Q.

  6. Оценка морфофункционального состояния лимфоцитов,  нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов крови у больных с острым инфарктом миокарда

         При изучении особенностей состояния лимфоцитов крови в динамике острого ИМ с патологическим зубцом Q и без зубца Q нами были проанализированы изменения 38-ми показателей, характеризующих морфологические, морфометрические параметры клеток, их иммунофенотип, выраженность процессов апоптоза и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы.

Анализ морфологических, морфометрических и морфоструктурных показателей лейкоцитов крови  в динамике острого ИМ у человека выявил изменения, во многом сходные с описанными для экспериментального ИМ  у собак. Исключение составила динамика изменений ЯЦО лимфоцитов, значения которого не отличались при остром ИМ с зубцом Q и без зубца Q. При возникновении острого ИМ с патологическим зубцом Q изменения  показателей морфофункционального состояния лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов также носили более выраженный  характер, чем при ИМ без зубца Q, без нормализации на 14-е и 21-е  сутки. Как и при экспериментальном ИМ, наблюдались статистически значимые изменения морфометрических характеристик клеток и их чувствительности к норадреналину (нейтрофильные гранулоциты) и ацетилхолину с наибольшей выраженностью на 1-е и 3-и сутки. У пациентов с развившимся после 7-х суток повторным ИМ отмечалось максимальное снижение чувствительности клеток к ацетилхолину.

Общая направленность изменений морфофункционального состояния иммунной системы при остром ИМ в клинике и эксперименте была подтверждена при сравнительном анализе математических моделей (рис.8).

 

Рис. 8. Математические модели морфофункционального состояния  лимфоцитов (А), нейтрофильных гранулоцитов (Б) человека при остром инфаркте миокарда.

Максимальные отклонения интегральных показателей состояния  лимфоцитов и нейтрофильных  гранулоцитов отмечались на 1-е и 3-и сутки, независимо от тяжести поражения  сердечной мышцы. На 14-е  и 21-е сутки 

при остром ИМ без зубца Q интегральные показатели систем приближались к норме, в случае острого ИМ с патологическим зубцом Q нормализации интегрального показателя не происходило. При сходной динамике изменений  интегральных показателей, их отклонения от  нормы при ИМ  у человека во все сроки наблюдения были более выраженными, чем при экспериментальном инфаркте миокарда.

Распределение отдельных показателей морфофункционального состояния  модельных систем в зависимости от их весовых коэффициентов в целом не отличалось от описанного для экспериментального ИМ, наибольшие значения  Pi имели такие показатели, как ЯЦО лимфоцитов, размер клеток,  содержание 

миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах, чувствительность клеток  к ацетилхолину, лейкоцитарные индексы.

Таким образом, проведённый анализ математических моделей морфофункционального состояния лимфоцитов и нейтрофильных  гранулоцитов показал, что характер динамических изменений состояния  лейкоцитов человека и собак при возникновении инфаркта миокарда совпадает по выраженности и направленности, при этом отмечается более быстрая нормализация состояния модельных систем в случае  экспериментального ИМ, связанная с ускоренными сроками заживления у животных.

У человека и экспериментальных животных в динамике ИМ наблюдаются сходные изменения чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы, прежде всего ацетилхолину, что подтверждает  общебиологический характер  выявленных  изменений и возможность регуляции  иммуновоспалительных реакций  со стороны вегетативной нервной системы через механизмы апоптотической гибели лимфоцитов. Полученные данные подтверждают возможность использования модели экспериментального инфаркта миокарда у собак для разработки патогенетически обоснованной иммунокоррегирующей терапии при инфаркте миокарда. 

Для более полной оценки характера изменений в иммунной системе при  ИМ и изучения механизмов действия нейромедиаторов вегетативной нервной системы на лимфоциты нами было проведено иммунофенотипирование  лейкоцитов крови больных острым ИМ методами ЛПЦМ, изучены корреляционные взаимосвязи изменений морфо-структурных и иммунофенотипических характеристик клеток в зависимости от  их чувствительности  к норадреналину и ацетилхолину. 

Анализ результатов  иммунофенотипирования  лимфоцитов крови  (рис. 9) показал, что независимо от наличия или отсутствия зубца Q на ЭКГ, при остром ИМ через сутки после возникновения очагов некроза в сердечной мышце отмечалось увеличение относительного содержания CD3+8+ лимфоцитов по сравнению с  контролем (р<0,01), причём у  больных  с  острым  ИМ с зубцом Q  содержание CD3+8+-клеток достигало максимальных значений, составляя в среднем 37,4 ±3,9% (в контроле и группе больных с острым ИМ без зубца Q -  26,1±1,9% и 31,4±2,1%, соответственно). 

Рис. 9. Изменение иммунофенотипических параметров лимфоцитов крови человека при остром инфаркте миокарда.

Одновременно увеличивалось (р<0,01) относительное содержание других эффекторных клеток -  CD3-8+- и CD3-16+56+-лимфоцитов. Относительное содержание CD3+- ,  CD3+4+- , CD3-19+- клеток не изменялось, уменьшалось (р<0,05) только их абсолютное  количество вследствие значительного снижения (р<0,01) общего числа лимфоцитов в крови. При остром ИМ с зубцом Q отмечалось значительное снижение процентного содержания CD3+25+- лимфоцитов (до 3,7±0,3%; в контроле - 5,8±0,6%),  CD3+HLA-DR+- лимфоцитов (до 6,8±0,4% против 11,1±1,9% в контроле) и CD3+95+клеток (до 6,3±0,04 % против 12,4±2,0% в контроле). Одновременно отмечалось снижение экспрессии CD3-антигена на активированных лимфоцитах. В случаях острого ИМ без зубца Q изменений относительного содержания данных клеток по сравнению с контрольными значениями не происходило, имело место только снижение интенсивности флюоресценции связанных с CD3-антигеном  антител. Перераспределение субпопуляционного состава лимфоцитов крови сопровождалось увеличением чувствительности лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина, при этом была выявлена  сильная  положительная  корреляция между изменениями значений площади клеток, параметров FSC и содержанием CD3+8+- (r=0,81 и 0,89, соответственно), CD3-8+- (r=0,79 и 0,85, соответственно) и CD3-16+56+-лимфоцитов (r=0,84 и 0,91, соответственно). Чувствительность к норадреналину не изменялась.

  На 3-и сутки острого ИМ  изменения субпопуляционного состава лимфоцитов и их чувствительности к ацетилхолину сохранялись и были более выражены при остром ИМ с зубцом Q. Возрастала чувствительность клеток к норадреналину, что проявлялось снижением экспрессии CD3- и CD95- антигенов на лимфоцитах после инкубации крови с норадреналином in vitro (р<0,05 и  р<0,01 при ИМ без зубца и с зубцом Q, соответственно).

На 7-е сутки  у пациентов с острым  ИМ без зубца Q  содержание  основных популяций и субпопуляций лимфоцитов статистически не отличалось от  значений контрольной группы,  но было повышено  относительное и абсолютное содержание CD3+95+-клеток, чувствительность к нейромедиаторам нормализовалась. У больных ИМ с патологическим зубцом Q содержание эффекторных лимфоцитов оставалось повышенным, также повышалось количество CD3+95+-клеток, чувствительность клеток к ацетилхолину была высокой. Максимальные значения  содержания CD3+8+- CD3-8+ - и CD3-16+56+ - лимфоцитов, экспрессии CD3-антигена и индексов сдвига ацетилхолина наблюдались у двух пациентов с развившимся на 9-е – 12-е  сутки повторным инфарктом на фоне острого ИМ с зубцом Q. На 14-е – 21-е сутки наблюдения в группе больных  ИМ без зубца Q  продолжалась нормализация  популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, их чувствительности к нейромедиаторам вегетативной нервной системы.  При ИМ с зубцом Q  значения большинства показателей  приближались к контрольным только на 21-е сутки, однако количество CD3+95+-клеток и чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину оставались достоверно повышенными (р<0,05).

Таким образом, иммунофенотипирование лимфоцитов показало, что при развитии острого ИМ уже в первые сутки отмечалось перераспределение субпопуляционного состава клеток за счёт значительного увеличения содержания лимфоцитов, выполняющих эффекторные функции (Т-цитотоксические клетки, естественные киллеры), наиболее выраженные при остром ИМ с зубцом Q.

В дальнейшем  при развитии  резорбционно-некротических процессов в миокарде происходит дополнительная активация эффекторных лимфоцитов, повышение количества клеток, экспрессирующих поздний активационный  антиген CD95 и готовых воспринимать сигналы к индукции апоптоза. При этом наиболее неблагоприятными для течения острого ИМ являются  значительное (более чем  в 1,5-2 раза) увеличение в крови относительного содержания CD3+8+-, CD3-8+ -, CD3-16+56 и  CD95+- лимфоцитов при повышенной чувствительности клеток  к проапоптотическому действию ацетилхолина.

Выявленные изменения подтверждают и дополняют данные литературы  об активации иммунной системы у больных ишемической болезнью сердца, связанной с хроническим воспалительным процессом, развивающимся вследствие атеросклеротических поражений сосудов. Выявленная тесная положительная корреляционная связь между количеством  CD3+8+-, CD3-8+-, CD3-16+56- и CD95+- лимфоцитов в крови  и  чувствительностью лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина in vitro, по нашему мнению, убедительно свидетельствует о том, что именно через апоптоз эффекторных клеток вегетативная нервная система, и прежде всего её парасимпатическое звено, может регулировать интенсивность иммуно-воспалительных реакций в организме.

  Известно, что система моноцитов/макрофагов играет важную роль в реализации иммуно-воспалительных реакций. Одной из ключевых функций  данной системы является продукция провоспалительных цитокинов. В связи с этим в рамках комплексной оценки системы иммунного гомеостаза при остром ИМ нами была проведена оценка содержания ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО  в плазме крови при остром  ИМ, а также способность лейкоцитов (моноцитов) крови больных ИМ вырабатывать провоспалительные цитокины при стимуляции бактериальным липополисахаридом in vitro.

При анализе спонтанных уровней  провоспалительных цитокинов в плазме крови у всех больных ИМ (табл. 1) было выявлено статистически значимое (по сравнению  с группой практически здоровых доноров) повышение  ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО через сутки после возникновения очага некроза в миокарде (64,7± 9,9; 40,1± 6,9 и 42,9± 8,7 пг/мл, соответственно против 5,38±1,8, 11,2±2,5 и 9,5±2,2 пг/мл).

Таблица 1. Изменение  уровней провоспалительных цитокинов в плазме  крови  больных  острым  инфарктом  миокарда (M±)

Показатель

Контроль

n =37

Острый инфаркт миокарда

1 сутки

n =49

3 сутки

n =49

7 сутки

n =49

14 сутки

n =49

21 сутки

n =49

ИЛ-1, пг/мл

5,38±1,8

64,7± 9,9*

57,4± 6,7*

27,4± 3,3*

10,4± 1,7

9,9± 1,3

ИЛ-6, пг/мл

11,2±2,5

40,1± 6,9*

46,1± 4,8*

27,4± 3,7*

17,6± 2,1

15,4± 2,1

ФНО, пг/мл

9,5±2,2

42,9± 8,7*

46,6± 5,3*

185,6±10,4*

92,3±10,6*

35,6±4,6*

Примечание: * - статистически значимые отличия (р<0,001) от соответствующих значений в группе практически здоровых доноров (контроль)

Статистически значимых отличий между группами больных ИМ с зубцом Q и ИМ без зубца Q не было выявлено в силу достаточно большого индивидуального разброса показателей. Через 3-е суток после возникновения ИМ показатели претерпевали незначительные изменения. Отмечено значительное повышение уровня ФНО в плазме крови больных с Q-образующим ИМ (до 185,6±10,4 пг/мл) на 7-е сутки  заболевания, максимальные значения наблюдались у пациентов с осложнениями ИМ.

Наибольшие отличия в динамике показателей у  больных ИМ с зубцом Q и ИМ без зубца Q во все сроки наблюдения проявили индуцированные липополисахаридом уровни внеклеточных и внутриклеточных провоспалительных  цитокинов. Индексы стимуляции  продукции цитокинов были статистически значимо выше при ОИМ с зубцом Q. Возрастание значений индексов стимуляции коррелировали с неблагоприятным прогнозом  дальнейшего течения заболевания. 

Таким образом, динамика изменений спонтанных и индуцированных уровней провоспалительных цитокинов  в плазме крови больных с острым  ИМ отражает динамику  развития системной воспалительной реакции, важную роль иммуно-воспалительных процессов  при развитии ИМ  и свидетельствует о перспективности  применения  иммунокоррегирующей, в том числе и цитокиновой, терапии при данном заболевании. Длительная гиперпродукция  ФНО, являющегося индуктором апоптоза как для лейкоцитов крови, так и  кардиомиоцитов, максимально выражена при более тяжёлом течении ИМ, развивается  на фоне  повышенной чувствительности  лимфоцитов крови к проапоптотическому действию ацетилхолина, что подтверждает важность  процессов регуляции апоптотической гибели клеток в патогенезе  инфаркта миокарда.

Для интегральной, комплексной оценки состояния системы иммунного гомеостаза человека при остром ИМ, выявления общей направленности изменений и определения наиболее важных прогностических параметров все полученные количественные данные были обработаны с помощь системного многофакторного анализа, с расчётом коэффициентов влияния отдельных показателей и рассчитаны обобщающие интегральные показатели для каждого срока наблюдения; построены математические модели состояния системы иммунного гомеостаза (рис. 10).

Рис. 10. Математические модели состояния системы иммунного гомеостаза человека при остром инфаркте миокарда.

Анализ математических моделей подтвердил наличие изменений со стороны иммунной системы в динамике острого инфаркта миокарда с наибольшим отклонением интегральных показателей системы на  3-и сутки после возникновения острого ИМ. Максимальная активация во все сроки наблюдения и отсутствие нормализации общего состояния иммунной системы  отмечались в случаях ИМ с зубцом Q. Общий характер и направленность изменений активности модельной системы иммунного гомеостаза  определялись в первые 3-е суток после возникновения ИМ морфофункциональным состоянием лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, что подтверждается сравнительным анализом значений соответствующих интегральных показателей и ранжированной оценкой коэффициентов влияния отдельных параметров. Начиная с 7-х суток основной вклад в общее состояние иммунной системы вносили параметры морфофункционального состояния лимфоцитов и их чувствительность к ацетилхолину. Более  выраженное отклонение  интегрального показателя морфофункционального состояния иммунной системы при остром ИМ с зубцом Q  на 21-е сутки после возникновения  ИМ свидетельствовало  об относительной стабилизации  и патогенетической незавершённости изучаемых процессов при  более тяжёлом поражении сердечной мышцы. 

Сопоставление средних значений и весовых коэффициентов  отдельных иммунологических показателей выявило, что в  первые 3-е суток развития острого ИМ  отмечалась тесная корреляция в изменении ряда иммунологических и клинико-лабораторных показателей. Так, коэффициенты влияния уровней в крови ИЛ-1,  ИЛ-6, ФНО были сопоставимы с весовыми коэффициентами таких параметров, как ИСЛК и ЛИИ. Максимальную прогностическую значимость проявляли показатели чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам  вегетативной нервной системы.

На 7-е и 14-е сутки возрастала прогностическая значимость уровня ФНО, ЯЦО лимфоцитов, относительного  содержания CD3+CD8+-  и CD3-CD16+56+- лимфоцитов. Наибольшую прогностическую значимость на 21-е сутки  течения острого ИМ приобретали такие показатели, как ЛИИ, содержание CD3+CD95+ лимфоцитов, чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину.

С целью получения рабочей математической модели для использования в клинической практике нами  был  проведён расчёт интегральных показателей  системы иммунного гомеостаза с учётом иммунологических параметров, имеющих наибольшие значения весовых коэффициентов в конкретные сроки наблюдения (табл.2). При совпадении значений весовых коэффициентов  отдельных параметров в рабочую модель включали  наиболее простые и воспроизводимые показатели. Учитывая, что отдельные результаты наблюдений каждого показателя при оценке средних арифметических значений принадлежат одному распределению с наиболее вероятным отклонением в пределах доверительного интервала, для определения группы риска  в рабочую модель подставляются значения единичного показателя обследуемого пациента, не зависимо от наличия или отсутствия  патологического зубца Q на ЭКГ, рассчитывается интегральный показатель и

Таблица 2.  Изменения  интегральных показателей  морфофункционального состояния  иммунной системы  при остром инфаркте миокарда (рабочая модель для оценки группы риска)

Сутки

Иммунологические параметры

Интегральные показатели

Группа невысокого  риска

Группа высокого риска

1

-ядерно-цитоплазменное отношение

в лимфоцитах

- FSC лимфоцитов

- индекс сдвига ацетилхолина (FSC)

- миелопероксидаза нейтрофильных гранулоцитов

- индекс сдвига лейкоцитов крови

- CD3+8+лимфоциты

0,312±0,001

0,280±0,001

3

- ядерно-цитоплазменное отношение в лимфоцитах

- FSC лимфоцитов

- индекс сдвига ацетилхолина (FSC)

- индекс сдвига лейкоцитов крови

- CD3+8+лимфоциты

0,445±0,003

0,512±0,004

7

- ядерно-цитоплазменное отношение в лимфоцитах

- FSC лимфоцитов

- индекс сдвига ацетилхолина (FSC)

- индекс сдвига лейкоцитов крови

- CD3+8+лимфоциты

- ФНО в плазме крови

0,283±0,031

0,480±0,004

14

- ядерно-цитоплазменное отношение в лимфоцитах

- FSC лимфоцитов

- индекс сдвига ацетилхолина (FSC)

- индекс сдвига лейкоцитов крови

- CD3+8+лимфоциты

- ФНО в плазме крови

0,094±0,020

0,184±0,012

21

- ядерно-цитоплазменное отношение в лимфоцитах

- FSC лимфоцитов

- индекс сдвига ацетилхолина (FSC)

- лейкоцитарный индекс интокси-кации

- CD3+95+лимфоциты

0,039±0,008

0,294±0,035

определяется группа риска по максимальному приближению к  диагностическим значениям интегральных показателей  системы.

В целом, комплексная, на основе системного многофакторного анализа, сравнительная оценка состояния иммунной системы человека при остром ИМ и собак при экспериментальном ИМ выявила общие закономерности изменений  иммунологических показателей в динамике ИМ, зависящие от  тяжести поражения сердечной мышцы и являющиеся отражением участия  иммунологических механизмов в патогенезе  инфаркта миокарда. Показана ведущая роль лимфоцитов на всех этапах  реализации иммуно-воспалительных процессов при ИМ, раннее увеличение содержания  эффекторных лимфоцитов при  ИМ, что свидетельствует о предсуществующей активации иммунной системы у больных инфарктом миокарда.

  Использованный комплекс методов позволил доказать важную роль вегетативной нервной системы, особенно её парасимпатического звена,  в регуляции иммунных реакций посредством влияния на апоптоз лимфоцитов. Полученные математические модели состояния иммунной системы человека и  экспериментальных животных подтвердили общебиологический характер выявленных изменений со стороны иммунной системы и позволили  определить наиболее значимые для диагностики и прогноза иммунологические  показатели, позволяющие выделять среди больных с острым ИМ пациентов с высоким риском развития осложнений. 

Выводы

  1. Анализ изменений средних размеров лимфоцитов, параметров светорассеяния  FSC после 2-х часов инкубации цельной крови при 370С в присутствии ацетилхолина хлорида (10-5 моль/л и 10-6 моль/л для крови человека и собак, соответственно) и экспрессии CD95-антигена на клетках через 24 часа инкубации позволяет выявлять и оценивать проапоптотическое действие нейромедиатора на лимфоциты крови.
  2. Развитие экспериментального инфаркта миокарда у собак сопровождается динамическими изменениями показателей морфофункционального состояния иммунной системы, зависящими от стадии патологического процесса и тяжести поражения сердечной мышцы и отражающими выраженность иммуновоспалительной реакции.
  3. При возникновении нетрансмурального инфаркта миокарда у собак максимальные изменения иммунологических показателей наблюдаются в первые трое суток и проявляются в увеличении  площади лимфоцитов крови, их ядер, ядерно-цитоплазменного отношения, чувствительности к проапоптотическому действию  ацетилхолина, активации нейтрофильных гранулоцитов при сниженной реакции на ацетилхолин и норадреналин, увеличении содержания С-реактивного белка, возрастании индекса сдвига лейкоцитов крови и лейкоцитарного индекса интоксикации. Нормализация  показателей отмечается на 14-е сутки после возникновения очага некроза в сердечной мышце.
  4. В динамике трансмурального инфаркта миокарда изменения морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак носят сходный характер, но выражены  в большей степени, с отсутствием нормализации чувствительности к ацетилхолину на 14-е сутки. Для нейтрофильных гранулоцитов характерны: снижение  фагоцитарной активности и активности внутриклеточной миелопероксидазы при максимальной  чувствительности клеток к норадреналину в 1-е и 3-и сутки; увеличение ядерно-цитоплазменного отношения и снижение чувствительности  к норадреналину и ацетилхолину на 7- е и 14-е сутки; содержание С-реактивного белка и значения  лейкоцитарных индексов повышены во все сроки наблюдения.
  5. Использование системного многофакторного анализа с построением математических моделей позволило выявить максимальную активацию иммунной системы экспериментальных животных на 3-и сутки после воспроизведения инфаркта миокарда. При этом трансмуральный инфаркт миокарда сопровождается более выраженными и длительными изменениями морфофункционального состояния иммунной системы, с развитием дисбаланса чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы.
  6. У пациентов с острым инфарктом миокарда выявляются динамические изменения показателей морфофункционального состояния лейкоцитов, уровней иммуноглобулинов классов A, M, G; С-реактивного белка и активности системы комплемента, сходные с таковыми у экспериментальных животных и отражающие участие иммунной системы в патогенезе инфаркта миокарда и влияние на неё со стороны вегетативной нервной системы.
  7. Иммунофенотипирование лимфоцитов крови человека выявило, что при инфаркте  миокарда без зубца Q в первые трое суток заболевания  происходит увеличение относительного содержания эффекторных  лимфоцитов (CD3+8+–,CD3-8+–,CD3-16+56+–клетки), коррелирующее с повышенной чувствительностью клеток к ацетилхолину и норадреналину, на 7-е сутки увеличивается содержание CD3+95+лимфоцитов, начиная с 14-х суток происходит постепенная нормализация показателей; при инфаркте миокарда с зубцом Q данные изменения выражены в большей степени, сопровождаются в первые трое суток снижением количества активированных клеток (CD3+25+, CD3+HLA-DR+ и CD3+95+ лимфоциты) и экспрессии CD3-антигена на них; высокий уровень CD3+95+лимфоцитов наблюдается с 14-х по 21-е сутки,  повышенная чувствительность клеток к проапоптотическому действию ацетилхолина сохраняется на протяжении 21-х суток после возникновения инфаркта миокарда.
  8. Перераспределение субпопуляций лимфоцитов и изменение их чувствительности к проапоптотическому действию ацетилхолина сопровождается динамическими изменениями спонтанных и индуцированных уровней провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1, интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли ) в крови, что свидетельствует о целесообразности разработки иммунокоррегирующей терапии при остром инфаркте миокарда.
  9. Комплексная сравнительная оценка состояния иммунной системы при остром инфаркте миокарда в клинике и эксперименте выявила общие закономерности изменений иммунологических показателей, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы и являющиеся отражением участия иммунологических механизмов в патогенезе инфаркта миокарда, с позиций доказательной медицины подтвердила целесообразность использования модели экспериментального инфаркта миокарда у собак для возможной разработки иммуннокоррегирующей терапии.
  10. Системный многофакторный анализ позволил обосновать спектр наиболее значимых иммунологических показателей для повышения эффективности диагностики и прогнозирования течения инфаркта миокарда.

Практические рекомендации

  1. Разработанный комплекс методов оценки морфофункционального состояния иммунной системы на основе системного многофакторного анализа целесообразно использовать наряду со стандартными клинико-лабораторными показателями для повышения эффективности  диагностики и прогнозирования течения острого инфаркта миокарда и разработки подходов к иммунокоррегирующей терапии при данном заболевании.
  2. Рекомендуется для изучения влияния вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов in vitro использовать инкубацию цельной гепаринизированной крови с раствором ацетилхолина хлорида (конечная концентрация 10-5 моль/л) при 370С в полной питательной среде RPMI в течение 2-х и 24-х часов с дальнейшей оценкой параметров фронтального светорассеяния (FSC) и содержания CD3+95+,CD3-95+,CD95+лимфоцитов. При проведении исследований на лимфоцитах крови собак концентрация ацетилхолина хлорида при тех же условиях инкубации должна составлять 10-6 моль/л.
  3. Для оптимального анализа данных иммунологических исследований, оценки адекватности возможной иммунокоррегирующей терапии в динамике инфаркта миокарда и других заболеваний целесообразно использовать разработанную компьютерную программу обработки параметров состояния иммунной системы пациента «Иммунолог».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лимарева Л.В. Изменение адреночувствительности лимфоцитов периферической крови собак в дневное и ночное время суток / Л.В. Лимарева, Т.В. Суздальцева // Сборник научных трудов по материалам итоговой годичной конференции ЦНИЛ под ред. Проф. М.В. Угловой - Куйбышев, 1990 г.- С. 57 – 60.

2. Лимарева Л.В. Морфофункциональное состояние нейтрофильных лейкоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева,  В.В.Богуш,  Е.А.Захарова // Сборник научных трудов "Математическое моделирование в теоретической и практической медицине"- под ред. Проф. М.В.Угловой и Г.П.Котельникова., посвященный 75-летию Самарского гос.мед.университета. -Самара, 1994.- С. 36 - 38.

3.  Лимарева Л.В.  Изучение морфофункционального состояния лейкоцитов крови в дневное и ночное время / Л.В. Лимарева  // Сборник  научных работ "Иммунологические и гуморальные аспекты клинической патологии" под  ред. проф. С.М. Бабкина по материалам итоговой годичной конференции НИЦ Самарского мед. института.- Самара, 1996.- С. 43-45.

4. Лимарева Л.В. Использование иммунологических методов в оценке функциональных свойств лейкоцитов и фибробластов in vitro / Л.В. Лимарева, В.В. Богуш, И.Ю. Николаева, Т.В. Яценко  // Материалы II Всероссийского симпозиума с международным участием "Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий". Под общей ред. Г.П. Котельникова, С.П. Миронова,  В.Д. Фёдорова, Л.Т. Воловой //  Самара, Издательство «Офорт»,  2004. - С.  139 – 140.

5. Лимарева Л.В.  Комплексная оценка чувствительности лимфоцитов крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы при остром инфаркте миокарда в клинике и эксперименте / Л.В. Лимарева // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. – 2006. - № 9 (49). -  С. 205 – 212.

6. Лимарева Л.В. Оценка  диагностической и прогностической значимости параметров  иммунофенотипирования  лейкоцитов крови при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. – 2007. - № 9/1(59). - С. 391 - 397  (принята в печать 26.12.2006).

7. Меленберг Т.В. «Иммунолог» - программа для обработки данных о состоянии иммунной системы пациента / Т.В. Меленберг, А.В. Жестков, Л.В. Лимарева, М.Ю. Доладов // Вестник Самарского государственного универ-ситета. Естественнонаучная серия. -  2006. - № 6/2 (46). - С. 165 -169.

8. Лимарева Л.В. Сравнительная оценка влияния преднизолона и нейромедиаторов вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов периферической крови / Л.В. Лимарева, О.П. Данильченко // Аллергология. Иммунология. – 2006. – Т.7- № 3. -  С. 272.

9. Лимарева Л.В. Методы проточной цитометрии в оценке влияния нейромедиаторов вегетативной нервной системы на морфофункциональное состояние  лейкоцитов крови / Л.В. Лимарева // Морфология. Научно-теоретический медицинский журнал. - 2008. -Т. 134. -  №5. - С. 79.

10. Фёдорова О.И. Реакции периферической крови у больных пожилого возраста при распространенных заболеваниях / О.И. Фёдорова, В.А. Кондурцев, И.Л. Давыдкин, Л.В. Лимарева // Клиническая медицина: Ежемесячный научно-практический журнал. -  2008. -  Т.86. - №2. - С. 48-51.

11. Попова Л.Л. Сравнительная оценка характера изменений основных иммунологических показателей при различных патологических состояниях / Л.Л. Попова, Л.В. Лимарева, М.В. Комарова // Уральский Медицинский Журнал . – 2008. - №14 (54). – С. 89-93.

12. Лимарева Л.В. Оценка диагностической и прогностической значимости показателей иммунного статуса при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева //  Российский Иммунологический Журнал. – 2008. –Т. 2(11). -  № 2-3. – С. 322-323

13. Лимарева Л.В.  Оценка диагностической и прогностической значимости показателей иммунного статуса у реципиентов аллотрансплантата почки / Л.В. Лимарева, А.В. Колсанов, С.И. Попова, А.А. Авдеева // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток: Материалы всероссийской конференции с международным участием // Самара, Издательство «Офорт», 2008. -  С. 276 - 277.

14. Кельцев В.А. Ранние артриты у детей и подростков – иммунный статус больных и перспективы лечения / В.А. Кельцев, Л.И. Гребёнкина, Л.В. Лимарева,  М.А. Бочкарёва, Ю.Г. Григорьева, // Научно-практическая ревматология. – 2008. - № 2. - С. 64 - 68.

16. Лимарева Л.В. Математическое моделирование в оценке прогностической  значимости иммунологических показателей при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Сборник трудов Х  международном  конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, посвященном столетию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Россия, Казань, 20-23 мая  2009). - С. 365.

17. Лимарева Л.В. Определение интенсивности флюоресценции меченных моноклональных антител к CD3 антигену на  поверхности Т-лимфоцитов в комплексной оценке иммунного статуса больных ишемической болезнью сердца / Л.В. Лимарева // Вестник  Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии -  2009. - № 2/1 (24). - С. - 319 - 320.

18.  Лимарева Л.В.  Сравнительная оценка иммунного статуса больных ИБС в динамике гипертонического криза, острого инфаркта миокарда и после аортокоронарного шунтирования / Л.В. Лимарева, И.В. Новокшёнова, И.В. Губарева // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - № 4-5. - С. 468.

19. Лимарева Л.В. Особенности  морфофункционального состояния  лейкоцитов крови  при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Морфологические  ведомости. – 2009. - № 3-4. - С. 59 - 61.

20.  Лимарева Л.В. Комплексная оценка иммунной  системы  при остром инфаркте миокарда в клинике и эксперименте // Самара, Издательство  Офорт, 2009, 147с.

21. Меленберг Т.В. Программа для обработки данных о состоянии иммунной системы пациента «Иммунолог» / Т.В. Меленберг, А.В. Жестков, Л.В. Лимарева, М.Ю. Доладов // Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006610352 (Заявка № 2005612520 дата поступления 4 октября 2005  зарегистрирована  в реестре программ для ЭВМ 20 января 2006 г.).

Список сокращений

ИМ – инфаркт миокарда

ИСЛК – индекс сдвига лейкоцитов крови

ИСд – индекс сдвига показателя под действием нейромедиатора

Ист – индекс стимуляции

ИЛ-1 – интерлейкин бета

ИЛ- 6 – интерлейкин 6

ИФА – иммуноферментный анализ

ЛГИ – лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс

ЛПЦМ – лазерная проточная цитофлюориметрия

ФНО – фактор некроза опухоли альфа

С-РБ – С - реактивный белок

ЯЦО – ядерно-цитоплазменное отношение

CD – clusters of differentiation

Sк – площадь клетки

Sя – площадь ядра

FSC –forward scattering

SSC – side scattering






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.