WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

Диссертационный совет Д 208.072.12 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» направляет сведения о предстоящей защите диссертации и автореферат диссертации Бахаревой Ирины Викторовны

Отправитель: Ученый секретарь диссертационного совета профессор

Асият Зульчифовна Хашукоева

  На правах рукописи

БАХАРЕВА  ИРИНА  ВИКТОРОВНА

РОЛЬ МЕХАНИЗМОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

В РЕАЛИЗАЦИИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ

ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ ВЫСОКОГО ИНФЕКЦИОННОГО РИСКА

14.00.01. Акушерство и гинекология

  14.00.36.   Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор          Макаров Олег Васильевич 

доктор медицинских наук, профессор  Ганковская Людмила Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор  Агаджанова Анна Арамовна 

доктор медицинских наук, профессор  Кузьмин Владимир Николаевич        

доктор медицинских наук, профессор        Стенина Марина Александровна

Ведущая организация:

Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии (МОНИИАГ).

Защита состоится «19_»_октября_ 2009 года в  14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.12 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава  по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан «______» _________________ 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева А.З.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

 

Актуальность исследования:

Проблема внутриутробной инфекции в современном акушерстве остается  актуальной. Несмотря на определенные успехи, достигнутые в последние годы в решении этой проблемы, появление новых диагностических возможностей, внедрение в клиническую практику большого арсенала новых медикаментозных средств, частота внутриутробной инфекции не имеет тенденции к снижению. ВУИ является причиной широкого спектра патологии: инфекционных заболеваний плода, мертворождений, пороков развития плода,  плацентарной недостаточности, синдрома задержки роста плода, хронической гипоксии, невынашивания беременности [Володин Н.Н. и соавт., 2000; Кулаков В.И. и соавт., 2004; Серов В.Н. и соавт., 2002;  Сидорова И.С. и соавт., 2008; Goldenberg R.L., Thompson C., 2003]. В настоящее время возрастает число данных, подтверждающих взаимосвязь между субклинически протекающей внутриутробной инфекцией и преждевременными родами. Так, 40% преждевременных родов обусловлено инфекционными факторами, а преждевременные роды до 30 недель беременности имеют инфекционную этиологию в 80% случаев [Сидельникова В.М., 2005; Goldenberg R.L. et al., 2000; Lamont R.F., 2003].

       ВУИ представляет сложную диагностическую проблему. Одни и те же инфекционные агенты в одних случаях вызывают тяжелое поражение плода или невынашивание беременности, а в других - практически не влияют на ее течение. Согласно современным представлениям, в возникновении ВУИ важную роль играют ограниченные возможности иммунной системы беременной к своевременному распознаванию и уничтожению этиологического агента инфекции. Иммунологическая защита против различных патогенов осуществляется в результате скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета [Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003; Moffett A., Loke Y.W., 2004]. В последние годы появились работы о важной роли механизмов врожденного иммунитета в репродуктивной функции человека [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Fazelil A. et al., 2005, Romero R., 2005; Wira C.R., Fahey J.V., 2004]. Врожденный компонент иммунной системы особенно важен для развития плода, когда система адаптивного или приобретенного иммунитета еще не сформирована. Особое значение в процессах иммунологической защиты имеют клеточные, рецепторные и молекулярные механизмы врожденного иммунитета.

       Следует отметить, что избыточная активность компонентов врожденного иммунитета может привести к воспалительному процессу и развитию осложнений беременности (плацентарная недостаточность, СЗРП, невынашивание беременности, гестоз). Нарушение взаимодействия в гисто-иммунологических эпителиальных и плацентарных барьерах с различными инфекционными агентами сопровождается развитием инфекционного процесса у плода. В этом аспекте важным является своевременное выявление факторов, способствующих реализации патологического процесса, таких как экспрессия распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета (Toll-подобных рецепторов), цитокинов, в первую очередь провоспалительных, противомикробных пептидов и других факторов врожденного иммунитета [Ковальчук Л.В. и соавт., 2005; Abrahams V.M., Mor G., 2005].

       Распознающие  рецепторы врожденной иммунной системы – Toll-подобные рецепторы имеют важное значение в развитии ряда патологических процессов, в том числе воспаления [Ковальчук Л.В. и соавт., 2005; Medzhitov R., Janeway Jr C.A., 2002; Young S.L. et al., 2004]. Они обеспечивают интегрирующую и регулирующую роль в активации и реализации врожденного иммунного ответа на микробные патогены. TLRs, распознавая консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, увеличивают локальный синтез цитокинов,  простагландинов, хемокинов и противомикробных пептидов, что запускает механизм реализации воспалительного ответа [Abrahams V.M. et al., 2005; Zhang D. et al., 2004]. Экспрессия TLRs доказана в эпителии эндометрия и цервикального канала [Schaefer T.M. et al. 2004; Young S.L. et al., 2004]. Под влиянием различных микроорганизмов, инфицирующих эпителий цервикального канала, TLRs увеличивают локальный синтез провоспалительных цитокинов. Плацентарная ткань при беременности также экспрессирует ТLRs 1-10 на уровне генов [Abrahams V.M., Mor G., 2005]. На современном этапе особый интерес представляет изучение  TLRs в качестве маркеров прогнозирования осложнений беременности.

       Для возникновения восходящего пути инфицирования определяющую роль играет ослабление местных иммунологических механизмов защиты  во влагалище и цервикальном канале, а также снижение бактерицидных свойств амниотической жидкости. Это обусловлено «порочным кругом» факторов, нарушающих биоценоз урогенитального тракта [Радзинский В.Е., Милованов А.П., 2004]. АЖ представляет собой биологический барьер между плодом и экстраэмбриональными структурами, являясь местом проявления локальных иммунных реакций. Изучение системы врожденного иммунитета слизистой цервикального канала, изменений иммунологических параметров АЖ в качестве показателей возможного развития ВУИ у беременных группы высокого инфекционного риска является актуальным на современном этапе.

       В течение всей беременности важную роль в регуляции воспалительных реакций, межклеточных взаимодействий в эндометрии, а также в процессе инвазии трофобласта играет система цитокинов. Однако при различных воспалительных заболеваниях эта система функционирует еще и как защитный агент. При патологическом течении беременности на фоне урогенитальной инфекции отмечается увеличение в периферической крови цитокинов с провоспалительной активностью, таких как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОα и  ИФНγ, что приводит к нарастанию синтеза простагландинов и преждевременному развитию родовой деятельности [Сидельникова В.М., 2005; Тетруашвили Н.К., Сухих Г.Т., 2003; Clark D.A. et al., 1999; Romero R. et al., 2007].

       В развитии иммунного ответа, в осуществлении антибактериальной и противовирусной защиты организма необходимым этапом является активация фагоцитов [Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999]. Активация фагоцитов приводит к выработке активных форм кислорода (АФК), играющих важную роль в защите организма от инфекции.

       Таким образом, в проблеме ВУИ вопросы ее диагностики и прогнозирования являются наиболее актуальными в настоящее время. Имеются основания предполагать, что применение современных технологий для выявления доклинических признаков ВУИ может обеспечить раннюю диагностику данной патологии и возможность новых подходов к разработке комплексных мер профилактики и лечения.

Цель исследования: комплексное изучение факторов системы врожденного иммунитета (цитокинов, экспрессии генов Toll-подобных рецепторов, противомикробных пептидов, функциональной активности клеток фагоцитарной системы)  в сыворотке крови, цервикальной слизи, амниотической жидкости  и плаценте беременных с урогенитальными инфекциями для диагностики и прогнозирования реализации ВУИ, улучшения качества лечения.

Задачи исследования:

  1. Провести анализ течения беременности, родов и послеродового периода у беременных с урогенитальной инфекцией на основании комплексного клинико-лабораторного обследования беременных с урогенитальной инфекцией, для выделения группы риска по реализации внутриутробной инфекции.
  2. Провести анализ уровня цитокинов в сыворотке крови и культурах мононуклеарных клеток беременных с урогенитальной инфекцией как возможных маркеров реализации ВУИ.
  3. В комплексе клинико-лабораторного обследования потомства провести исследование уровня цитокинов в пуповинной крови здоровых новорожденных и больных новорожденных с реализацией ВУИ для улучшения качества диагностики и лечения.
  4. Провести комплексное исследование амниотической жидкости беременных с урогенитальной инфекцией, определить диагностическую значимость определения уровня цитокинов амниотической жидкости как возможных маркеров реализации ВУИ.
  5. Определить количественную экспрессию генов TLR2, TLR4 и противомикробного пептида HBD1 мононуклеарными клетками периферической крови, клетками слизистой цервикального канала и клетками плаценты у здоровых беременных.
  6. Определить количественную экспрессию генов TLR2, TLR4 и противомикробного пептида HBD1 мононуклеарными клетками периферической крови, клетками слизистой цервикального канала и клетками плаценты у беременных с невынашиванием беременности инфекционного генеза и реализацией ВУИ.
  7. Оценить состояние функциональной активности фагоцитарной системы по уровню продукции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами в периферической крови и амниотической жидкости здоровых беременных и беременных с урогенитальной инфекцией.
  8. Разработать алгоритм обследования беременных высокого риска реализации ВУИ для оптимизации тактики ведения.

Научная новизна

В настоящей работе, являющейся клинико-иммунологическим исследованием роли системы врожденного иммунитета в реализации ВУИ у беременных высокого инфекционного риска, впервые проводится комплексное исследование цитокинов на локальном уровне - в амниотической жидкости, системном уровне - в сыворотке крови беременных и их новорожденных, а также в культурах мононуклеарных клеток (лимфоцитов) периферической крови.

       Впервые предполагается исследование системы интерлейкина 1- и  его рецепторного антагониста; оценка роли цитокинов как возможных маркеров внутриутробного инфицирования плода и невынашивания беременности инфекционного генеза.

       Впервые в России проведено исследование провоспалительного цитокина ИЛ-12 в сыворотке крови беременных и их новорожденных, в амниотической жидкости и в культуре клеток, оценена его роль в реализации иммунного ответа при урогенитальных инфекциях.

       Проведен комплексный анализ системы цитокинов у здоровых и больных новорожденных от матерей с урогенитальной инфекцией, что позволяет определить показания к иммунокоррекции. Клинико-иммунологические параллели обследования матерей и их новорожденных позволят своевременно диагностировать изменения иммунного статуса новорожденных от матерей с урогенитальной инфекцией.

       Впервые проведено определение цитокинов в культурах мононуклеарных клеток от беременных с герпес-вирусной инфекцией в стадиях ремиссии  и обострения для обоснования рациональной цитокинотерапии.        

       Впервые изучена функциональная активность фагоцитарной системы в сыворотке крови беременных и амниотической жидкости, оценена роль данного исследования в диагностике и прогнозировании течения ВУИ.        Впервые в России проведена оценка количественной экспрессии генов распознающих рецепторов врожденного иммунитета (TLRs) и противомикробного пептида (HBD1) на системном и локальном уровнях при невынашивании беременности инфекционного генеза и внутриутробной инфекции.

       Проведен анализ клинических проявлений ВУИ новорожденных и показана корреляция между повышением экспрессии гена TLR2 и снижением экспрессии противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты и эпителиальными клетками цервикального канала при реализации ВУИ, что говорит о дисбалансе в системе врожденного иммунитета. Полученные данные об изменении экспрессии генов TLRs у беременных с урогенитальной инфекцией помогли расширить представление о роли механизмов врожденного иммунитета в патогенезе невынашивания беременности.

       Получен патент на изобретение №2334233 «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции».

       Разработаны новые иммунологические методы диагностики внутриутробной инфекции и выработаны оптимальные профилактические мероприятия для предупреждения реализации внутриутробной инфекции у беременных групп высокого риска по ВУИ (с вирусной, бактериальной и смешанной инфекцией), обоснованы теоретические предпосылки для проведения иммунокоррекции беременным групп риска и их новорожденным.

Практическая значимость

Изучение социально – возрастного состава, а также соматического, и гинекологического статуса беременных позволяет определить факторы риска для развития ВУИ плода у женщин в период беременности. Формирование групп повышенного риска среди женщин во время беременности способствует своевременной диагностике и проведению профилактического лечения ВУИ  плода на ранних стадиях его развития. Определение факторов риска развития ВУИ позволяет выделить когорту беременных для проведения динамического клинико-лабораторного контроля за состоянием будущей матери и плода с применением современных технологий.

       Полученные данные об изменении концентрации цитокинов и функциональной активности фагоцитов углубляют представления о патогенезе реализации ВУИ, что открывает новые возможности в лечении и профилактике данной патологии. Полученные данные доказывают возможность определения исследуемых показателей для диагностики и прогнозирования внутриутробного инфицирования плода и профилактики невынашивания беременности. Полученные иммунологические критерии могут быть использованы для определения показаний к иммунокоррекции у беременных.

       Исследование амниотической жидкости способствует расширению диагностических возможностей при проведении инвазивных методик диагностики интраамниотической инфекции.

       Выявленные изменения в экспрессии гена TLR2, проявляющиеся в ее увеличении и, напротив, снижении экспрессии противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала могут быть рекомендованы в качестве маркеров ВУИ.

       Диагностика нарушений врожденного иммунитета дает возможность своевременно прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммунокорригирующей терапии у беременных и новорожденных. Ранняя диагностика и своевременное лечение внутриутробной инфекции будут способствовать улучшению исходов беременности для матери и плода.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Наличие урогенитальной инфекции (УГИ) у беременной является фактором риска развития акушерских осложнений во время беременности и родов, выраженность которых зависит от вида инфекционного агента, фазы и длительности инфекционного процесса, активности врожденного иммунитета. Наиболее тяжелое течение беременности и родов, а также состояние новорожденных и реализация ВУИ отмечается у пациенток с наличием смешанной (бактериально – вирусной)  инфекции.
  2. У беременных с урогенитальной инфекцией наблюдается выраженный дисбаланс в системе цитокинов периферической крови. Увеличение частоты невынашивания у беременных с вирусной и смешанной инфекцией коррелирует с увеличением продукции ИЛ-1 и снижением ИЛ-1Ра в сыворотке крови. У беременных с вирусной инфекцией ИФН не определялся, что является теоретическим обоснованием интерферонотерапии.
  3. Комплексное исследование АЖ (микробиологическое, молекулярно–генетическое, биохимическое, иммунологическое) представляет особенную диагностическую значимость  для диагностики ВУИ плода. Увеличение уровня цитокинов (ИЛ–1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-12), снижение ИФН и снижение выработки АФК нейтрофилами АЖ позволяет прогнозировать развитие  ВУИ.
  4. Маркером невынашивания беременности инфекционного генеза является дисбаланс компонентов врожденного иммунитета: повышение экспрессии генов TLR2  и снижение экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала и клетками плаценты. Маркером  реализации ВУИ является достоверное увеличение экспрессии гена TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала и клетках плаценты по сравнению со здоровыми беременными.
  5. У беременных с урогенитальной инфекцией вирусной этиологии наблюдается выраженный дефицит продукции активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови и амниотической жидкости, что является показанием к назначению иммунотерапии.
  6. На основании полученных клинико-иммунологических критериев разработан алгоритм диагностики и прогнозирования реализации ВУИ у беременных высокого инфекционного риска.

Внедрение результатов исследования

               Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр акушерства и гинекологии, иммунологии Российского государственного медицинского университета, используются в практической работе родильного отделения ГБ№8 и родильного дома №10 г.Москвы.

               Применение исследования экспрессии генa TLR2 эпителиальными клетками у беременных подтверждено патентом на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». Патентообладатели: Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Заявка №2006144597, приоритет изобретения 14 декабря 2006 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской федерации 20 сентября 2008 г.

Апробация

       Апробация диссертации состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедр акушерства и гинекологии и иммунологии Российского государственного медицинского университета, сотрудников городской клинической больницы №55, городской больницы №8, родильного дома №10 19 мая 2009 года.

       Основные положения работы представлены: на V съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003 г.); VI, IX Российском форуме "Мать и дитя" (Москва, 2004 г., 2007 г.); XI, XIII, XIV, ХV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (2004 г., 2006 г., 2007 г., 2008 г.); IV, VII конгрессе педиатров-инфекционистов России (Москва, 2005 г., 2008 г.); VIII, IX, XI, ХII, XIII Пироговской студенческой научной медицинской конференции (2004 г., 2005 г., 2007 г., 2008 г., 2009 г.); Международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006 г.); VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006 г.); II Всероссийском Конгрессе по детской аллергологии и иммунологии (Москва, 2006 г.); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006 г.); Х Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006 г.); I, II Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии» (Москва, 2006 г., 2007 г.); I Международном Семинаре «Инфекция в акушерстве и перинатологии» (First International Seminar “Infections in Obstetrics and Perinatology”, Москва, 2007 г.); Конференции «Современные вопросы акушерства и гинекологии» (Москва, 2007 г.).

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 67 публикациях, в том числе в 17 статьях в центральной печати, а также в методических рекомендациях «Профилактика и лечение внутриутробных инфекций» (2007) и монографиях «Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет» (2007), «Инфекции в акушерстве и гинекологии» (2007, 2009).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 135 отечественных и 225 зарубежных источников. Работа выполнена на 296 страницах машинописного текста, иллюстрирована  68  таблицами и 70 диаграммами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

       Исследование проводили в 2001-2008 гг. на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (заведующий кафедрой д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ О.В.Макаров): в родильном отделении городской больницы №8 ДЗ г.Москвы (главный врач А.Б.Дуленков) и родильном доме №10 УЗ ЮЗАО г. Москвы  (главный врач Е.П. Озимковская) совместно с кафедрой иммунологии РГМУ (заведующий кафедрой академик РАЕН, д.м.н., профессор Л.В.Ковальчук).

       Проведено клиническое и лабораторное обследование 488 женщин, среди которых 432 беременных, из них 308 беременных с УГИ, входящих в группу риска по внутриутробной инфекции (в III триместре беременности), 124 беременных контрольной группы с нормально протекающей беременностью, 56 небеременных пациенток групп сравнения (36 небеременных с урогенитальной инфекцией и 20 здоровых небеременных женщин).

       Определение цитокинов в сыворотке крови проведено у 196 женщин: у 118 беременных, входящих в группу риска по реализации внутриутробной инфекции (47 беременных с УГИ вирусной этиологии, 38 беременных с бактериальной инфекцией и 33 беременных со смешанной бактериально-вирусной инфекцией), у 44 беременных с нормально протекающей беременностью (контрольная группа), в пуповинной крови их новорожденных, а также у 24 небеременных с УГИ и 10 здоровых небеременных женщин (здоровые доноры).

       Комплексное исследование амниотической  жидкости проведено у 150 пациенток: 100 беременных высокого риска реализации ВУИ (34 беременных с вирусной инфекцией, 33 беременных с бактериальной инфекцией, 33 – со смешанной инфекцией), 50 здоровых беременных контрольной группы.

       Определение количественной экспрессии генов Toll-подобных рецепторов клетками слизистой цервикального канала, клетками плаценты и мононуклеарными клетками периферической крови проведено у 120 беременных: 20 беременных с урогенитальной инфекцией, беременность у которых закончилась  преждевременными родами с реализацией внутриутробной инфекции, 45 беременных с урогенитальной инфекцией, беременность у которых закончилась преждевременными родами без реализации внутриутробной инфекции; 25 беременных с урогенитальной инфекцией и своевременными родами, 30 беременных с нормальным течением гестационного процесса и своевременными родами.

Методы клинического обследования: В исследуемых группах изучали: данные анамнеза, течение настоящей беременности, особенности родового акта, оценивали состояние новорожденных. Всем пациенткам проводили комплексное клинико–лабораторное обследование (клинический анализ крови и мочи, определение группы крови и резус-фактора, биохимический анализ крови, гемостазиограмму, анализ микрофлоры влагалища и цервикального канала). Анализировали течение, сроки выявления и структуру клинических форм УГИ. Ультразвуковой скрининг проводили у всех беременных на аппарате «Aloka 4000» (Япония) с использованием трансабдоминальных и эндовагинальных датчиков. Допплерометрическое исследование кровотока в сосудах системы мать-плацента-плод проводили с использованием трансабдоминальных датчиков в режиме пульсовой допплеровской волны. Для наблюдения за состоянием плода с 30 недель беременности использовали антенатальную кардиотокографию при помощи мониторов фирмы «Hewlett Packard» (США).

       Морфологическое исследование последов осуществляли в патологоанатомических лабораториях  ГКБ №4 (из родильного дома №10) (главный врач С.К.Романов) и ДГКБ №1 (из родильного отделения ГБ №8) (главный врач В.Л.Фомина).

       Получение проб АЖ осуществляли при нарушении целостности плодного пузыря (преждевременном излитии околоплодных вод, амниотомии) с помощью внутриматочного катетера (первые 10 мл не использовали для исследований), а также путем амниоцентеза во время операции кесарева сечения. Получение проб АЖ осуществляли для проведения бактериологического исследования, биохимического и молекулярно – генетического анализа, иммунологического исследования.

Бактериологическое исследование цервикальной слизи и АЖ и определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам  проводили в  бактериологической лаборатории ГКБ № 64 (главный врач д.м.н., профессор Е.Е.Тюлькина), исследование цервикальной слизи и АЖ  методом ПЦР проводили в лаборатории клинической генетики научно – производственной фирмы «ЛИТЕХ» НИИ физико – химической медицины МЗ РФ (директор академик РАМН, д.м.н., профессор Ю.М.Лопухин). Биохимический анализ АЖ (определение уровня глюкозы, креатинина, мочевины, общего белка и фермента щелочной фосфатазы) проводили в клинико – диагностической лаборатории родильного дома №10 (главный врач Е.П. Озимковская).

Иммунологические и молекулярно-генетические методы исследования были проведены на кафедре иммунологии РГМУ (заведующий кафедрой академик РАЕН, д.м.н., профессор Л.В.Ковальчук) и в лаборатории диагностики вирусных инфекций ГУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН» (директор академик РАМН, д.б.н., профессор В.В.Зверев).

       Определение цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-1, ИЛ-1Рa, ИЛ-2,4,8,12, ИФН, ФНО в сыворотке крови обследованных женщин, в пуповинной крови новорожденных, в культуральной жидкости мононуклеарных клеток периферической крови, в амниотической жидкости проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) согласно рекомендуемым методикам. В исследовании были использованы коммерческие иммуноферментные тест-системы, выпускаемые ООО “ЦИТОКИН“ (Санкт-Петербург) и “Cytimmune” ЗАО БиоХимМак. Концентрация цитокинов определялась в пкг/мл.

К иммунологическим и молекулярно-генетическим методам исследования относились методы определения уровня экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD1 в различных биологических средах: клетками слизистой цервикального канала и плаценты, мононуклеарными клетками крови. Для изучения экспрессии генов были использованы следующие методы: выделение общей РНК, реакция обратной транскрипции и полимеразная реакция в реальном времени. Клинические образцы (клетки слизистой цервикального канала, гомогенизат плаценты, мононуклеарные клетки) подвергали лизису и из лизата выделяли РНК. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, были моделированы с помощью программы VectorNTI 8,0.

       Продукцию активных форм кислорода (АФК) измеряли методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) нейтрофилов периферической крови и амниотической жидкости здоровых беременных и беременных с УГИ вирусного, бактериального и смешанного  генеза. Регистрацию ЛХЛ проводили на хемилюминометре ХЛМ-3 («Бикап», Россия). В течение 3 мин регистрировали спонтанную хемилюминисценцию. Затем в кювету добавляли стимулятор – 0,1 мл опсонизированного зимозана А («Sigma», концентрация 1,43 мг/мл) и регистрировали индуцированную ХЛ.

Статистическую обработку данных производили на персональном компьютере с использованием статистического пакета программ STATISTICA 6,0, с применением методов параметрической и непараметрической статистики. Для сравнения групп данных использовали параметрический критерий Стьюдента и степень вероятности (р), а при малом объеме выборки определяли достоверность различия типов распределений с помощью критерия Уилкоксона. Различия между сравниваемыми величинами считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Оценку корреляционной зависимости для непараметрических, ранговых величин проводили по методу Спирмена.

Результаты  обследования и их обсуждение.

       На первом этапе работы проведен комплексный анализ содержания цитокинов на системном уровне: в сыворотке крови беременных с урогенитальной инфекцией и их новорожденных. Определение цитокинов в сыворотке крови проведено у 196 женщин: у 118 беременных, входящих в группу риска по реализации внутриутробной инфекции (47 беременных с УГИ вирусной этиологии, 38 беременных с бактериальной инфекцией и 33 беременных со смешанной бактериально-вирусной инфекцией), у 44 беременных с нормально протекающей беременностью (контрольная группа), в пуповинной крови их новорожденных, а также у 24 небеременных с УГИ и 10 здоровых небеременных женщин (здоровые доноры).

       У большинства пациенток основной группы выявлен отягощенный инфекционный и соматический анамнез. Частота хронической патологии почек у беременных с бактериальной инфекцией составляла 31,6%, у беременных с вирусной инфекцией – 61,7%, у беременных со смешанной инфекцией – 42,4%, тогда как в контрольной группе – 2,3%. Увеличение частоты встречаемости хронических соматических заболеваний непосредственно является предрасполагающим фактором риска развития внутриутробной инфекции.

       При изучении акушерского анамнеза пациенток исследуемых групп отмечена высокая частота самопроизвольных и медицинских абортов в анамнезе, что способствует инфицированию внутренних половых органов. Частота самопроизвольных абортов у пациенток со смешанной и вирусной инфекцией составляла 87,9% и 85,2% соответственно и статистически достоверно выше, чем у здоровых беременных и у беременных с бактериальной инфекцией (9% и 23,7% соответственно; р<0,05). Наиболее частыми осложнениями беременности у пациенток с урогенитальными инфекциями была угроза прерывания и плацентарная недостаточность. В контрольной группе однократно в течение беременности угроза прерывания беременности наблюдалась у 34% пациенток, тогда как у пациенток основной группы это осложнение носило рецидивирующий характер. Частота угрозы прерывания у беременных с вирусной и смешанной инфекцией составляла 68,1% и 60,6% соответственно. Диагноз плацентарной недостаточности установлен у 12 (31,2%) пациенток с бактериальной инфекцией; у 20 (42,6%) пациенток с вирусной инфекцией и у 10 (30,3%) пациенток со смешанной инфекцией.

Частота преждевременных родов в основной группе составила 38,1%,  тогда как в контрольной группе 4,6%.

       В структуре урогенитальной инфекции у пациенток основной группы преобладали Ureaplasma urealyticum (29,7%), Gardnerella vaginalis (19,5%), Chlamydia trachomatis (11,9%), HSVII (28,8%), CMV (33,6%). При бактериологическом исследовании рост микрофлоры был выявлен у 39,5% (15) беременных в подгруппе с бактериальной инфекцией, у 27,3% (9) беременных со смешанной инфекцией,  причем результаты достоверно отличаются от контрольной группы (4,6%; <0,05). Наиболее частыми возбудителями были E.coli, Staphylococcus aureus, Peptostreptococcus sp.

В работе проведены исследования по содержанию цитокинов в сыворотке периферической крови здоровых доноров, здоровых беременных и беременных с УГИ (рис.1). В проспективном исследовании изучено содержание в сыворотке крови беременных с урогенитальной инфекцией ИЛ-1 и ИЛ-1Ра, так как дисбаланс в системе этих цитокинов в сторону увеличения продукции ИЛ-1 стимулирует выработку простагландинов (ПГЕ2), которые, в свою очередь, повышают сократительную деятельность миометрия и могут служить причиной выкидыша и преждевременных родов. У беременных с вирусной инфекцией концентрация ИЛ-1 повышается в 2,6 раза, а содержание ИЛ-1Ра снижается по сравнению со здоровыми беременными  в 2,3 раза; у беременных со смешанной инфекцией концентрация ИЛ-1 повышена в 2,8 раз, а содержание ИЛ-1Ра снижено  в 1,3 раза. Таким образом, проведенный клинический анализ показал, что повышение концентрации ИЛ-1 более чем в 2,6 раз и снижение ИЛ-1Ра в 2,1 раз по сравнению со здоровыми беременными может служить прогностическим критерием невынашивания беременности.

       

Рисунок 1. Содержание цитокинов в сыворотке крови здоровых беременных и беременных с урогенитальной инфекцией (пг/мл);

* р<0,05 - значение достоверно отличается у беременных с УГИ любой этиологии по сравнению со здоровыми беременными.

                                                               

       Во время беременности в связи с активацией многих механизмов иммунной, в том числе и противовирусной защиты, наблюдается возрастание концентраций ИЛ-12. По нашим данным, продукция ИЛ-12 повышена у беременных с вирусной, бактериальной и смешанной инфекцией в 2 раза, причем результаты статистически достоверно отличаются как от здоровых доноров, так и от здоровых беременных. С одной стороны, ИЛ-12 при инфекционном процессе необходим для активации натуральных киллеров, Th1 и цитотоксических Т-лимфоцитов, с другой стороны, гиперстимуляция Th1 неблагоприятно влияет на течение беременности.

       При изучении содержания интерферона было установлено, что у беременных с вирусной инфекцией в 100% случаев ИФН не определялся, что может свидетельствовать о развитии иммуносупрессивного состояния.

       На основании проведенного комплексного анализа цитокинового спектра у беременных данных групп можно сделать вывод:  самые значительные нарушения в системе цитокинов наблюдаются у беременных с УГИ вирусной и смешанной этиологии.

       При анализе состояния новорожденных отмечена высокая частота заболеваемости среди новорожденных основной группы. СЗРП был диагностирован  у 34 (28,8%) новорожденных основной группы. Тяжесть состояния новорожденных в подгруппах с вирусной и смешанной инфекцией была также обусловлена высокой частотой преждевременных родов (32-37 нед.) в этих подгруппах. Инфекционная патология была диагностирована у 40 (33,9%) новорожденных основной группы (внутриутробная пневмония, конъюнктивит, менингит, генерализованная внутриутробная инфекция).

       У беременных с реализацией ВУИ в группе со смешанной бактериально-вирусной инфекцией уровень ИЛ-12 в периферической крови статистически достоверно превышал аналогичный показатель у беременных этой группы без реализации ВУИ в 2,3 раза (p<0,05), этот цитокин может служить маркером реализации ВУИ. Однако анализ уровня других цитокинов в сыворотке крови беременных, родивших детей с реализацией ВУИ, статистически достоверных различий при ВУИ не выявил. Проведенный корреляционный анализ показал, что на системном уровне выявленные изменения цитокинового статуса сопровождаются развитием многих осложнений – угрозы прерывания беременности, преждевременных родов, плацентарной недостаточности, СЗРП.

       В работе проведено сравнение уровня цитокинов в пуповинной крови больных и здоровых новорожденных  от матерей с УГИ различной этиологии.

       Здоровые и больные дети, рожденные от матерей с урогенитальной инфекцией бактериальной этиологии, отличались от здоровых детей, рожденных здоровыми  матерями, по содержанию ИФН и ИЛ-12. Отмечено, что в группе детей, рожденных от матерей с УГИ бактериальной этиологии, содержание ИФН снижено в 45 раз, тогда как содержание ИЛ-12 повышено в 3 раза (p<0,05).

       При сравнении концентрации цитокинов в группе детей от матерей с УГИ бактериальной этиологии мы наблюдали существенные различия по содержанию ИЛ-1 и ИЛ-12. Содержание ИЛ-1 в пуповинной крови больных детей с ВУИ в 2,3 ниже по сравнению со здоровыми детьми, а концентрация ИЛ-12 у больных детей в 1,4 раза выше по сравнению со здоровыми детьми (p<0,05).        

       Здоровые и больные дети, рожденные от матерей с урогенитальной инфекцией вирусной этиологии, отличались от здоровых детей, рожденных здоровыми  матерями, по содержанию ИФН и ИЛ-12. ИФН в 100% случаев не определялся. Дефицит продукции ИФН может иметь серьезные последствия при развитии инфекционного процесса. Низкая способность новорожденных к синтезу ИФН обусловливает нарушение показателей иммунорегуляторного индекса в сторону преобладания супрессорной активности Т-лимфоцитов и снижения киллерной активности клеток. Концентрация ИЛ-12 в 3 раза выше по сравнению со здоровыми детьми, рожденными здоровыми матерями (p<0,05). ИЛ-1 у больных детей, рожденных от матерей с УГИ вирусной этиологии, снижен в 2 раза по сравнению со здоровыми детьми, тогда как другие цитокины не имели существенных отличий.

       При сравнении концентрации цитокинов у детей, рожденных от здоровых матерей и от матерей с УГИ смешанной этиологии обнаружено отличие по ИЛ-12 (p<0,05). У детей, рожденных от матерей  с УГИ смешанной этиологии содержание ИЛ-12 повышено в 4,5 раза. Концентрация ИЛ-1 у больных детей, рожденных от матерей с УГИ смешанной этиологии, в 1,7 раз ниже по сравнению со здоровыми детьми  (p<0,05).

       На основании проведенного исследования можно сделать вывод, что как здоровые,  так и больные дети, рожденные от матерей с УГИ различной этиологии, отличаются по содержанию в пуповинной крови данных цитокинов от детей, рожденных здоровыми матерями. При этом спектр цитокинов как у больных, так и у здоровых детей, рожденных матерями с УГИ различной этиологии, не отличается от спектра цитокинов у их матерей.

       Во время беременности отмечается активация системы фагоцитов, связанная с повышенной противоинфекционной защитой. У здоровых беременных действие опсонизированного зимозана, стимулятора НАДФН-оксидазы, вызывает значительное повышение индуцированной выработки АФК. При изучении ЛХЛ нейтрофилов крови беременных с урогенитальной инфекцией было обнаружено, что данные клетки обладали измененной способностью продуцировать АФК как спонтанно, так и в ответ на стимуляцию опсонизированным зимозаном. Наиболее выраженные изменения в кислородном метаболизме нейтрофилов наблюдались в группе беременных с инфекцией вирусной этиологии. У беременных с вирусной инфекцией отмечено выраженное снижение как спонтанной, так и индуцированной выработки АФК. По-видимому, этот феномен связан с длительной персистенцией вируса у больных и его влиянием на синтез цитокинов, а также последующей иммуносупрессией.

               Таким образом, первый этап проведенного исследования освещает проблему иммунного ответа при инфицированной беременности с позиций действия системных иммунных реакций. По мере расширения представлений о молекулярных механизмах врожденного иммунитета и появления новых диагностических возможностей исследование системного иммунного ответа было продолжено в группе пациенток с невынашиванием беременности инфекционного генеза.

               В данное исследование было включено 120 пациенток. Основную группу составили 65 пациенток с УГИ и невынашиванием беременности инфекционного генеза (в 1а подгруппе (20) - недоношенные дети имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции; в 1б подгруппе (45) - клинические признаки внутриутробной инфекции отсутствовали). Контрольную  группу  составили 30 здоровых женщин с физиологически  протекающей  беременностью,  которая  завершилась  своевременными  родами (2 подгруппа). Группу сравнения составили 25 пациенток с УГИ, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации внутриутробной инфекции не было (3 подгруппа). 

        Данные лабораторного обследования подтвердили инфекционный генез невынашивания  у беременных основной группы. Результаты определения антигенов микроорганизмов в цервикальной слизи свидетельствуют о высокой частоте встречаемости у беременных с невынашиванием инфекционного генеза микоплазменной инфекции с превалированием Ureaplasma urealyticum (20% (4) пациенток 1а подгруппы, 33,3% (15) - 1б подгруппы основной группы). В 1а подгруппе статистически достоверно выше частота хламидиоза (20%), чем в 1б подгруппе и группе сравнения (8,8% и 8% соответственно). ВПГ II типа выявлен у 23,1% (15) беременных основной группы с невынашиванием беременности (25% (5) - 1а подгруппа, 22,2% (10) - 1б подгруппа), ЦМВ – у 29,2% (19) беременных основной группы (рис.2).

Рисунок 2. Общая структура урогенитальных инфекций у беременных основной группы и группы сравнения.

*p<0.05 – достоверные различия по сравнению с группой сравнения (3)

гр.1а – беременные с УГИ, преждевременные роды, с реализацией ВУИ (основная группа)

гр.1б – беременные с УГИ, преждевременные роды, без реализации ВУИ (основная группа)

гр.3 – беременные с УГИ, своевременные роды (группа сравнения)

Как показало изучение влагалищного микроценоза, у беременных с УГИ имела место высокая частота бактериального вагиноза, которая составила  20% (4) в 1а подгруппе у беременных с преждевременными родами и реализацией ВУИ, 8,9% (4) в 1б подгруппе с преждевременными родами без ВУИ. Вагинальный кандидоз отмечен у 20% и у 31,1% беременных с УГИ в 1а и 1б подгруппах соответственно, в 12% в группе сравнения, тогда как в группе контроля диагностирован нормоценоз.

       При бактериологическом исследовании рост микрофлоры был выявлен у 40% беременных при наличии УГИ и реализации ВУИ в 1а группе, у 27% при  преждевременных родах в 1б группе,  причем результаты достоверно отличаются от группы сравнения (12%). При бактериологическом обследовании преобладали E. coli, St. aureus, Streptococcus gr. B, Peptostreptococcus  sp.

       Согласно полученным данным,  в большинстве случаев у пациенток основной группы с невынашиванием беременности наблюдалась персистенция в цервикальном канале бактериальной инфекции и бактериально-вирусных ассоциаций. В основной группе выявлено наличие только бактериальной инфекции у 27 пациенток (41,5%), персистенция бактериально-вирусных ассоциаций диагностирована у 23 пациенток (35,4%), присутствие вирусов как единственного инфекционного агента отмечено у 15 пациенток (23,1%). Влияние бактериальной и вирусной инфекции на течение беременности выражается в развитии ряда осложнений беременности, наиболее характерными из которых являются: угроза прерывания беременности, плацентарная недостаточность, многоводие, маловодие. У 67,7%  пациенток основной группы недоношенная беременность осложнилась преждевременным разрывом плодных оболочек.

В основной группе у 65 беременных с преждевременными родами (26-36 нед. беременности) родились недоношенные дети. У 20 детей от матерей данной группы были признаки ВУИ, состояние при рождении данных детей было тяжелое, обусловленное недоношенностью и внутриутробной инфекцией. Частота внутриутробной пневмонии в подгруппе с реализацией ВУИ составила 80%.

В работе проведено определение количественной экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 мононуклеарными клетками периферической крови во втором и третьем триместрах беременности у пациенток обследованных групп. TLRs широко экспрессируются клетками, участвующими в воспалительном ответе: моноцитами, макрофагами, нейтрофилами и др.

       При физиологически протекающей беременности уровень экспрессии генов TLR2 и TLR4 мононуклеарными клетками был различен. В мононуклеарных клетках периферической крови у беременных экспрессия гена TLR2 (16,92±3,98 х 105 копий гена) превышала уровень экспрессии гена TLR4 (0,45±0,04 х 105 копий гена). Это можно объяснить более широким спектром микробных агентов, распознаваемых  TLR2. У беременных с урогенитальной инфекцией, независимо от исходов беременности, нами не установлено достоверного изменения экспрессии гена TLR2 мононуклеарными клетками (в основной группе - 26,00±6,05 х 105 копий гена, в группе контроля – 16,92±3,98 х 105 копий гена). Экспрессия гена TLR4 несколько увеличивалась при наличии урогенитальной инфекции и развитии преждевременных родов, но статистически достоверных различий не выявлено.  В основной группе у беременных с реализацией ВУИ новорожденных  также не отмечено достоверного изменения уровня экспрессии генов исследуемых TLRs мононуклеарными клетками периферической крови по сравнению с контрольной группой и с подгруппой  без реализации ВУИ (TLR2 – 27,13±7,07 х 105, 16,92±3,98 х 105, 25,47±4,05 х 105 копий гена соответственно; TLR4 – 0,79±0,29 х 105, 0,45±0,04 х 105, 0,87±0,16 х 105  копий гена соответственно). Анализируя механизмы ответа врожденного иммунитета на инфекционные патогены через TLRs, мы пришли к выводу, что этот механизм защиты функционирует на локальном уровне – границе мать-плод, тогда как на системном уровне изменения экспрессии не столь выражены.

       Одним из классов биологически активных веществ, вырабатываемых в ответ на активацию TLRs, являются противомикробные пептиды. Нами была изучена экспрессия мононуклеарными клетками периферической крови гена противомикробного пептида HBD1 при беременности высокого инфекционного риска. HBD1 относится  к -дефензинам и является универсальным физиологически активным веществом бактерицидного действия, ведущая роль которого – участие в формировании неспецифической резистентности организма к инфекции, киллинг микроорганизмов.

       Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 мононуклеарными клетками в исследуемых группах показало, что статистически достоверного изменения экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 в мононуклеарных клетках периферической крови при преждевременных родах не отмечалось, однако имелась тенденция к снижению по сравнению с контрольной группой. При реализации ВУИ достоверного изменения экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 мононуклеарными клетками периферической крови не было выявлено.

       Таким образом, при наличии урогенитальной инфекции исследование параметров врожденного иммунитета в мононуклеарных клетках периферической крови малоинформативно и не отражает возможности распространения инфекции и реализации внутриутробной инфекции плода и новорожденного.

       Перспективным в изучении патогенеза осложнений беременности и открытии возможных маркеров развития ВУИ и других осложнений беременности является изучение местного иммунитета, изменений иммунологических параметров на уровне гистологических барьеров мать-плод при физиологически протекающей беременности и при патологии беременности. В последние годы появляется все больше данных о локальных иммунных реакциях, защищающих от инфекции или приводящих к прерыванию инфицированной беременности [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Макаров О.В., Савченко Т.Н. и соавт., 2005; El-Bastawissi A.Y. et al., 2000; Esplin M.S. et al., 2002; Romero R. et al., 2005], поэтому следующие этапы нашего исследования были посвящены изучению изменений иммунологических параметров на локальном уровне (слизистая цервикального канала, амниотическая жидкость, плацента).

       В работе проведены исследования по изучению экспрессии генов TLR2, TLR4 и противомикробного пептида HBD1 клетками слизистой цервикального канала во всех группах: у здоровых беременных, беременных с урогенитальной инфекцией и беременных с реализованной ВУИ. У беременных с невынашиванием беременности инфекционного генеза экспрессия гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала возрастала в 8,7 раз по сравнению с группой здоровых беременных. Экспрессия гена TLR2 эпителием цервикального канала при реализации ВУИ возрастала в 31,6 раз (группа контроля – здоровые беременные – 1,87±0,35 х 105  копий гена, подгруппа с реализацией ВУИ  - 59,14±9,43 х 105 копий гена, р<0,05) (рис.2).

       

Рисунок 3. Экспрессия гена TLR2 эпителием цервикального канала при преждевременных родах и ВУИ.

По оси ординат абсолютные значения количества копий гена        

*p<0.05 – достоверные различия по сравнению с контрольной группой (здоровые беременные).

гр.1а – беременные с УГИ, преждевременные роды, с реализацией ВУИ (основная группа)

гр.1б – беременные с УГИ, преждевременные роды, без реализации ВУИ (основная группа)

гр.2 – здоровые беременные (контрольная группа)

       

       Особенно выраженные изменения экспрессии гена TLR2 были выявлены у беременных основной группы с бактериальным вагинозом. Экспрессия гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала у  беременных с бактериальным вагинозом основной группы с преждевременными родами (105,21±23,49 х 105  копий гена) более чем в 50 раз превышала экспрессию гена TLR2 у здоровых беременных контрольной группы (1,87±0,35 х 105  копий гена, р < 0,05). Значительное увеличение экспрессии гена TLR2 при бактериальном вагинозе объясняет отрицательное влияние БВ на течение беременности и увеличение частоты самопроизвольных абортов, преждевременных родов, хориоамнионита [Guaschino S. et al., 2008; Romero R. et al., 2004; Witkin S.S. et al., 2007; Xu J. et al., 2008].

               Следовательно, эпителиальные клетки могут осуществлять иммунный ответ на микроорганизмы через TLRs, которые играют важную роль в осуществлении механизмов защиты во время беременности. Нарушение механизмов иммунного ответа, в частности, гиперэкспрессия TLRs под воздействием инфекционных агентов приводит к невынашиванию беременности.

               Учитывая клеточно-тканевую топографию дефензинов и участие, в первую очередь, в формировании неспецифической резистентности организма к инфекции, в эпителиальных клетках цервикального канала было обнаружено максимальное изменение экспрессии противомикробного пептида HBD1. Недостаточная экспрессия противомикробного пептида HBD1 клетками слизистой цервикального канала отмечена в основной группе с невынашиванием беременности инфекционного генеза: снижение экспрессии гена HBD1 эпителиальными клетками в 6,4 раза по сравнению с контрольной группой. Возможно, это связано с неполноценностью механизмов противомикробной защиты на уровне слизистой цервикального канала, следствием чего является распространение инфекции и преждевременные роды.

               Независимо от пути инфицирования, на определенном этапе патогенетической «цепи» и развития патологических процессов в системе «мать-плацента-плод» весомая роль принадлежит функциональным изменениям амниотической жидкости, являющейся местом проявления локальных иммунных реакций. Изучение цитокинов в АЖ привлекает внимание исследователей не только с возможной целью дальнейшего использования полученных данных в прогностических целях, но  и в связи с несомненно важной патогенетической ролью данных иммунопептидов. В патогенезе преждевременных родов существенную роль играет воздействие бактериальных эндотоксинов (липополисахаридов), поступающих в АЖ, которые, воздействуя на Tоll-подобные рецепторы трофобласта  и амниотических оболочек, способствуют выработке провоспалительных  цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) [Kim Y.M. et al., 2004; Кан Н.Е., 2005; Romero R. et al., 2007]. Это, в свою очередь, ведет к образованию арахидоновой кислоты и далее к синтезу простагландинов Е2 и F2α. Последние, воздействуя на миометрий, вызывают сокращения матки и развитие родовой деятельности [Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003].

В работе проведено комплексное исследование амниотической жидкости, включающее в себя: бактериологическое, молекулярно – генетическое, биохимическое и иммунологическое исследования.

При бактериологическом исследовании АЖ выявлено преобладание в большей степени грамотрицательной флоры (E. coli), в меньшей степени – грамположительных микроорганизмов (St .epidermidis, Peptostreptococcus sp.). Превышение общей обсемененности 105 КОЕ/ мл и 106 КОЕ/ мл чаще наблюдалось у женщин с наличием одновременно нескольких разных штаммов патогенных микроорганизмов. С помощью ПЦР – исследования АЖ у 33% беременных основной группы обнаружены  различные возбудители УГИ. Ureaplasma urealyticum была обнаружена в 8-ми пробах  (24,2%), Mycoplasma genitalis в 5-ти случаях (15,1%), Gardnerella vaginalis в 4-х пробах (12,1%), Chlamydia trachomatis в 5 случаях (16,7%). Обнаружение в амниотической жидкости HSV II типа регистрировалось у 4-х рожениц (12,1%), HPV 16/18 типов – у 2-х женщин (6,1%), CMV – в 6 случаях (18,1%).

       Наибольшее количество акушерских осложнений отмечено у пациенток со смешанной бактериально – вирусной инфекцией: угроза преждевременных родов у 51,5% пациенток, многоводие - у 30,3%, плацентарная недостаточность – 18,1%, хроническая гипоксия плода - 48,5%, СЗРП – 27,3%. 

       При проведении биохимического исследования проб АЖ выявлены изменения следующих биохимических показателей АЖ в основной группе по сравнению с контрольной: повышение уровня белка в 2 раза; глюкозы в 2,6 раз; мочевины в 4-5 раз (р<0,05).

       Проводили определение в АЖ как цитокинов, продуцируемых фагоцитарными клетками (ИЛ-1, ИЛ-12), так и цитокинов, являющиеся продуктами Т-хелперов 1 типа (ИЛ-2, ИФН) и 2 типа (ИЛ-4) (табл.1). 

                                                                                         Таблица 1.

Cодержание цитокинов в АЖ

у беременных основной и контрольной групп.

Цитокины, пкг/мл

Беременные с УГИ

(основная группа)

Здоровые

беременные

(контрольная

группа)

1а (n=33)

1б (n=34)

1в (n=33)

Всего(n=100)

2 (n=50)

ИЛ-1

63,5±12,1

98,4±13,1*

142,1±26,2*

101,1±13,4*

40,1±12,3

ИЛ-12

26,0±8,0*

20,4±5,6*

29,6±14,1*

28,6±7,8*

6,3±1,4

ИЛ-2

26,2±4,8*

26,5±5,2*

28,4±7,6*

27,3±6,9*

0

ИФН

17,5±9,0*

9,8±2,6*

14,3±2,7*

13,8±3,0*

261,2 ±62,0

ИЛ-4

25,2±11,2

55,7±19,0*

60,1±26,4*

43,6±23,0*

13,4±4,0

*р<0,05 – достоверность различий между основной и контрольной группами

гр. 1а – беременные с УГИ бактериальной этиологии (основная группа)

гр.1б – беременные  с УГИ вирусной этиологии (основная группа)

гр. 1в – беременные с УГИ смешанной этиологии (основная группа)

гр. 2 – здоровые беременные (контрольная группа)

 

       Помимо концентрации цитокинов в АЖ, оценивали также частоту выявляемости цитокинов. В АЖ в контрольной группе (здоровые беременные) достаточно редко определяются  ИЛ-12 и ИЛ-4, никогда не определяется ИЛ-2, в то время как ИФН определяется у 94% беременных. Надо отметить, что частота выявляемости коррелирует с концентрацией: те цитокины, которые редко определяются, имеют в АЖ низкие концентрации, и наоборот. Интересно, что ИЛ-1 встречается в АЖ здоровых достаточно часто (38%) в  значительной концентрации 40 пкг/мл. По всей видимости, полученные данные подтверждают представления о роли данного цитокина в развитии родовой деятельности.

Показатели исследуемых интерлейкинов  у здоровых беременных были значительно ниже аналогичных (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-12) или отсутствовали (ИЛ-2) в отличие от значений данных показателей в АЖ пациенток с высоким риском развития ВУИ плода. Полученные данные согласуются с данными литературы о повышении содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-6) в АЖ беременных с УГИ, однако большая часть таких работ посвящена изучению роли ИЛ-6 [Poggi S.H. et al., 2004; Shobokshi A. et al., 2002; Vesce F. et al., 2004]. Интересно отметить, что, согласно полученным на первом этапе нашего исследования данным, в сыворотке крови здоровых беременных наблюдается аналогичная тенденция наличия низкого содержания ИЛ-1 и ИЛ-12 на фоне значительных концентраций ИФН, в то время как у беременных с УГИ происходят обратные изменения.        

Нами выявлена повышенная продукция  ИФН в АЖ здоровых беременных (261,2±62,0 пкг/мл) по сравнению с беременными из группы высокого инфекционного риска  (13,8±2,1 пкг/мл, р<0,05). При анализе показателей ИФН среди подгрупп основной группы наибольшее снижение уровня  данного цитокина отмечено у пациенток с наличием вирусной инфекции (9,8±2,6 пкг/мл). ИФН выявлен в АЖ только у 5,9% беременных данной группы, в то время как у здоровых частота его выявляемости составляет 94%. Среди пациенток 1а и 1в подгрупп статистически значимых различий в уровне ИФН не выявлено (17,5±9,0 пкг/мл и 14,3±2,7 пкг/мл соответственно). Выраженное угнетение интерфероногенеза у пациенток высокого риска развития ВУИ плода говорит о подавлении иммунных реакций вследствие активации патогенной инфекции.        

       Проведенный анализ корреляционной зависимости между уровнем различных цитокинов в АЖ пациенток исследуемых групп показал, что в группе беременных с урогенитальной инфекцией выявлена сильная положительная корреляция между уровнем ИЛ-1 и ИЛ-12 (r=0,76; р<0,05) и между уровнем ИЛ-2 и ИЛ-12 (r=0,71; р<0,05);  умеренная положительная корреляция между уровнем ИЛ-1 и ИЛ-2 (r=0,67; р<0,05), уровнем ИЛ-1 и ИЛ-4 (r=0,68; р<0,05), уровнем ИЛ-4 и ИЛ-12 (r=0,61; р<0,05), уровнем ИЛ-2 и ИЛ-4 (r=0,57; р<0,05); умеренная отрицательная корреляция между уровнем ИФН и ИЛ-1 (r= - 0,53; р<0,05), уровнем ИФН и ИЛ-4 (r= - 0,54; р<0,05).

       Cогласно полученным результатам, повышение уровня цитокинов в амниотической жидкости (ИЛ-1  в 2,6 раза; ИЛ-4 в 3,2 раза; ИЛ-12 в 4 раза)  и резкое снижение уровня ИФН по сравнению с данными здоровых пациенток позволяет отнести пациенток с вышеуказанными изменениями цитокинового статуса в группу риска по реализации ВУИ.        

Нами была проанализирована структура патологии новорожденных, родившихся от пациенток, включенных в исследование. Детей с признаками ВУИ, рожденных от матерей с урогенитальной инфекцией (1-ая группа), было 29 (29%), во 2-ой группе детей с ВУИ не было. Наиболее частыми клиническими признаками  ВУИ являлись кожные проявления (24,1%), пневмония (20,7%), конъюнктивит (17,2%), омфалит (10,3%).

       Проведенный сравнительный анализ содержания цитокинов в амниотической жидкости пациенток с УГИ, родивших здоровых детей и детей с признаками внутриутробной инфекции, показал, что статистически достоверно возрастает уровень ИЛ-12 в АЖ при рождении детей с ВУИ в подгруппах с бактериальной и смешанной инфекцией (в 3-5 раз), статистически достоверно снижается уровень ИФН при смешанной инфекции (в 5-6 раз) (табл. 7). Непараметрический корреляционный анализ показал, что уровень ИЛ-12 коррелирует с реализацией ВУИ (Spearman test; r=0,58; p<0,05), уровень ИФН коррелирует с реализацией ВУИ (r=0,53; p<0,05).

       При изучении окислительного метаболизма нейтрофилов АЖ при нормальной и осложненной УГИ беременности выявлено изменение активности нейтрофилов АЖ у пациенток с признаками ВУИ смешанной и вирусной этиологии в сторону усиления спонтанной продукции активных форм кислорода (АФК) и супрессии индуцированной продукции. Полученные результаты свидетельствуют о глубоком нарушении бактерицидной активности нейтрофилов АЖ, которое проявляется в подавлении выработки кислородных радикалов клетками при стимуляции. Нарушение кислород-зависимых механизмов приводит к увеличению бактериальной обсемененности амниотической жидкости.

       Таким образом, на основании вышеизложенных результатов и данных литературы факторы врожденного иммунитета амниотической жидкости рассматриваются нами в качестве возможных маркеров реализации ВУИ. Изменения иммунологических показателей амниотической жидкости  имеют прогностическое значение при реализации внутриутробной инфекции и могут быть использованы в клинической практике с целью своевременной коррекции и улучшения исходов беременности для матери и плода.

       Следующим этапом работы стало исследование параметров врожденного иммунитета на уровне высокоспециализированного гистологического барьера, защищающего  плод от инфекции – плаценты. Показано, что с ранних сроков беременности клетки трофобласта могут взаимодействовать с микроорганизмами в зоне имплантации и способны инициировать иммунный ответ, т.е. трофобласт может функционировать как активный участник системы врожденного иммунитета [Guleria I., Pollard J.W., 2000]. Плацентарная ткань при физиологической доношенной беременности также экспрессирует ТLRs 1-10 на уровне генов [Abrahams V.M., Mor G., 2005]. Определенные внутриутробные инфекции во время беременности оказывают как прямое, так и непрямое влияние на апоптоз клеток плаценты, что зависит от активации различных TLRs. Грамположительные бактерии, экспрессирующие пептидогликан или липотейхоевую кислоту, могут напрямую вызывать гибель клеток плаценты через TLR2. ЛПС через TLR4 индуцирует продукцию клетками плаценты провоспалительных цитокинов, которые играют большую роль в инициации родовой деятельности, раскрытии шейки матки и разрыве плодных оболочек [Abrahams V.M., Mor G., 2005].

В работе проведено определение количественной экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 клетками плаценты у здоровых беременных, беременных с урогенитальной инфекцией и  беременных с реализацией ВУИ.

       Согласно полученным данным, в группе контроля (здоровые беременные, своевременные роды) среднее значение показателя экспрессии гена TLR2 клетками плаценты составило 59,19 ±5,85 х 105 копий гена, TLR4 – 0,6±0,06 х 105 копий гена. У беременных с урогенитальной инфекцией бактериального и вирусного генеза  и благоприятным исходом беременности - своевременными родами (группа сравнения) возрастает экспрессия гена TLR2 (122,64±16,76 х 105 копий гена) клетками плаценты в 2 раза по сравнению со здоровыми беременными из группы контроля (59,19 ±5,85 х 105 копий гена, р<0,05), уровень ТLR4 достоверно не изменяется. Таким образом, определенный уровень защиты от инфекционных агентов обеспечивается повышенной экспрессией TLR2 по сравнению с группой женщин с физиологически протекающей беременностью.

       При сопоставлении уровня экспрессии TLR2 у женщин в конце второго, третьем  триместре с исходами беременностей удалось установить взаимосвязь многократного его повышения с развитием преждевременных родов. При невынашивании беременности инфекционного генеза (беременные основной группы) нами было отмечена гиперактивация экспрессии гена ТLR2 - (458,97±36,06 х 105 копий гена) в 7,8 раз по сравнению  с  нормой (59,19±5,85 х 105, р<0,05). Нами отмечена взаимосвязь высокого уровня экспрессии TLRs плацентой с развитием ПРПО. У 44 пациенток с наличием урогенитальной инфекции и несвоевременным излитием вод, входящих в основную группу, уровень экспрессии клетками плацентой TLR2  превышал нормативные в 5 раз (р<0,05), TLR4 в 1,5 раз.

       Показатели экспрессии генов TLRs у беременных основной группы были сопоставлены с данными морфологического исследования плацент. Как показали результаты гистологического исследования, в основной группе выявлены расстройства кровообращения в виде расширения кровеносных сосудов, тромбоза сосудов различного калибра в строме ворсин и в межворсинчатом пространстве. Наряду с сосудистыми нарушениями выявлены дистрофические изменения в виде гипоплазии плаценты и повышенного отложения фибриноида. Оболочки  последов у пациенток с реализацией ВУИ имели полиморфноклеточную лейкоцитарную инфильтрацию в 50% случаев. Признаки хориоамнионита описаны в 16,9% последов, базального децидуита – в 24,6% последов основной группы, причем статистически достоверно чаще у пациенток с реализацией ВУИ (35% и 40% соответственно). Воспалительные изменения последа (лейкоцитарная инфильтрация, хориоамнионит, базальный децидуит) отмечены у 80% (52) пациенток основной группы с преждевременными родами, у пациенток с реализацией ВУИ этот показатель достигает 90% (18). Различные варианты патологической незрелости плаценты описаны в 15,4% случаев у пациенток основной группы.        

Данные проведенных исследований свидетельствуют о связи между 5-8-кратным повышением уровня экспрессии TLR2 плацентой с развитием гемодинамических и дистрофических нарушений в плацентах. Возможно, патологическая активация экспрессии TLR2  непосредственно активизирует  клеточную гибель трофобласта путем апоптоза и вызывает ряд осложнений беременности, в том числе и плацентарную недостаточность.

       Анализ средних значений экспрессии генов TLRs клетками плаценты у пациенток основной группы показал достоверное и значительное их повышение при реализации внутриутробной инфекции новорожденных. Экспрессия гена ТLR2 при невынашивании беременности инфекционного генеза и реализации внутриутробной инфекции новорожденных в 7,1 раз превышала норму (группа контроля – здоровые беременные – 59,19±5,85 х  105 копий гена, подгруппа  с реализацией ВУИ – 420,48±36,02 х 105 копий гена, р<0,05), ТLR4 в 3 раза (группа контроля – 0,6±0,06 х 105 копий гена, подгруппа с реализацией ВУИ – 1,77±0,28 х 105 копий гена, р<0,05) (рис. 4).

Таким образом, увеличение экспрессии генов TLR в клетках плаценты может быть связано с прямым действием  патогенов или является вторичным к действию других провоспалительных медиаторов, вырабатываемых в ответ на инфекционные лиганды. Эти изменения можно рассматривать как механизм положительной обратной связи, усиливающей воспалительный ответ в матке, что приводит к преждевременным родам и обеспечивает  тем самым защиту материнского организма от инфекции путем избавления от инфицированной беременности.

Рисунок 4. Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов клетками плаценты при преждевременных родах и реализации ВУИ.

По оси ординат - отношение показателя экспрессии гена TLR исследуемой группы по сравнению с контролем.

*p<0.05 – достоверные различия по сравнению с контрольной группой (здоровые беременные).

гр.1а – беременные с УГИ, преждевременные роды, с реализацией ВУИ (основная группа)

гр.1б – беременные с УГИ, преждевременные роды, без реализации ВУИ (основная группа)

гр.2 – здоровые беременные (контрольная группа)

гр.3 – беременные с УГИ, своевременные роды (группа сравнения)

Нами проведен анализ экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты, так как сигнальная функция TLRs осуществляется путем индукции экспрессии дефензинов, обладающих способностью уничтожать микроорганизмы и стимулировать фагоцитоз.        Реализация ВУИ в основной группе происходила при локальной супрессии выработки противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты. Отмечалось снижение экспрессии гена HBD1 в 3,2 раза по сравнению с нормой (группа контроля – здоровые беременные – 5,69±0,59 х 104 копий гена, 1а подгруппа – с реализацией ВУИ – 1,76±0,22 х 104, р<0,05) (рис.5).                        

       

       Рисунок 5. Экспрессия гена HBD1 клетками плаценты при реализации ВУИ.

По оси ординат абсолютные значения количества копий гена        

*p<0.05 – достоверные различия по сравнению с контрольной группой (здоровые беременные).

гр.1а – беременные с УГИ, преждевременные роды, реализация ВУИ (основная группа)

гр.2 – здоровые беременные (контрольная группа)

       Проведенный корреляционный анализ (Spearman test) экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 и экспрессии гена TLR2 показал, что при  преждевременных родах инфекционного генеза в подгруппе без реализации ВУИ отмечена сильная отрицательная корреляция (r=-0,74; р<0,05) между экспрессией генов TLR2 и HBD1 в клетках плаценты и умеренная отрицательная корреляция (r=-0,62; р<0,05) в клетках эпителия цервикального канала. В подгруппе с невынашиванием беременности инфекционного генеза и реализацией ВУИ выявлена сильная отрицательная корреляция (r=-0,84; р<0,05) между экспрессией генов TLR2 и HBD1 в клетках плаценты и сильная отрицательная корреляция (r=-0,73; р<0,05) в клетках эпителия цервикального канала.

       Результаты исследования указывают на важное значение локального иммунитета в невынашивании беременности инфекционного генеза и реализации ВУИ. Сочетание повышенной экспрессии гена TLR2 и недостаточной экспрессии гена  HBD1 является чувствительным тестом, позволяющим выделить группу риска по возникновению преждевременных родов. Дисбаланс параметров врожденного иммунитета наблюдался при реализации ВУИ.

       Таким образом, можно предположить, что иммуногенетические особенности могут приводить к неполноценности системы врожденного иммунитета, как одного из основных факторов защиты от инфекции в системе мать-плод. Изучение рецепторов сигнальной трансдукции TLRs в цепи: лиганд (патоген) – рецептор – сигнал – клеточный ответ – позволяет по новому осмыслить функциональное значение врожденного иммунитета при беременности. На основании полученых в данной работе данных нами была разработана схема патофизиологических изменений при реализации ВУИ с участием механизмов врожденного иммунитета. Нами приведены результаты изучения показателей врожденного иммунитета в норме у беременных, а также убедительные данные о Toll-опосредованной патологической гиперактивации врожденного иммунитета при инфекции у беременных, которая является причиной, приводящей к невынашиванию беременности, плацентарной недостаточности, реализации внутриутробной инфекции и другим осложнениям. Показано, что TLRs,  как основные рецепторы врожденного иммунитета, могут служить маркерами осложнений беременности, а также потенциальной мишенью новых терапевтических вмешательств.

       Исследование параметров врожденного иммунитета на ранних сроках беременности позволяет прогнозировать вероятность развития данных осложнений, и своевременно назначать и проводить корригирующую терапию. Коррекция врождённого иммунитета, естественно с учетом других компонентов иммунной системы, позволит в будущем эффективно решить проблему невынашивания и предупреждения инфицирования плода и новорождённого.

Схема изменений показателей врожденного иммунитета

при реализации ВУИ

ВЫВОДЫ:

  1. Факторами риска реализации ВУИ являются наличие УГИ  во время беременности в сочетании с хроническими инфекционными заболеваниями, анемией, угрозой прерывания беременности, плацентарной  недостаточностью, хронической гипоксией плода, изменением количества околоплодных вод – маловодием и многоводием.
  2. У беременных с урогенитальной инфекцией вирусной и смешанной этиологии наблюдается выраженный дисбаланс в системе выработки цитокинов, характеризующийся:

       - возрастанием концентрации ИЛ-1 и снижением уровня рецепторного антагониста ИЛ-1 в сыворотке крови, что коррелирует с угрозой прерывания беременности и развитием преждевременной родовой деятельности;

       - повышением продукции ИЛ-12 в сыворотке крови по сравнению со здоровыми беременными в 2 раза; уровень ИЛ-12 у беременных высокого инфекционного риска может служить маркером реализации ВУИ;

       - отсутствием выработки ИФН в сыворотке крови беременных с урогенитальной инфекцией вирусной этиологии, что свидетельствует о возможности проведения интерферонотерапии в этой группе пациенток.

  1. Здоровые и больные дети, рожденные от матерей с урогенитальной инфекцией любой этиологии, не отличаются по содержанию основных цитокинов в пуповинной крови от их матерей. У инфицированных детей в связи с незрелостью иммунной системы наблюдается снижение концентрации ИЛ-1 в 2 раза по сравнению со здоровыми детьми. У здоровых и больных новорожденных от матерей с вирусной инфекцией ИФН не определялся в 100% случаев в пуповинной крови, что является обоснованием терапии препаратами группы интерферона.
  2. Анализ цитокинов амниотической жидкости при УГИ выявил достоверное повышение цитокинов: ИЛ-1 в 2,6 раза,  ИЛ-12 в 2,2 раза, ИЛ-4 в 3,2 раза,  а также резкое снижение уровня  ИФН, по сравнению с аналогичными показателями здоровых пациенток. В группе пациенток с УГИ, родивших детей с признаками  внутриутробной инфекции, статистически достоверно повышается уровень ИЛ-12 в АЖ в 3-5 раз и статистически достоверно снижается ИФН в 5-6 раз, что позволяет прогнозировать реализацию ВУИ у пациенток группы риска.
  3. При физиологической беременности отмечается различный уровень экспрессии генов TLRs (TLR2 и TLR4) в эпителиальных клетках цервикального канала.  Уровень экспрессии гена TLR2 превышает TLR4 в 8 раз.
  4. В группе пациенток с УГИ, родивших детей с признаками внутриутробной инфекции, отмечалось достоверное увеличение экспрессии гена TLR2: клетками эпителия цервикального канала в 31,6 раз, клетками плаценты в 7 раз по сравнению со здоровыми беременными.
  5. При субклиническом течении инфекционного процесса без выраженных системных изменений у беременных с наличием УГИ и преждевременными родами наблюдается дисбаланс параметров врожденного иммунитета:

        - повышение экспрессии гена TLR2 отмечается в клетках плаценты и эпителиальных клетках в 7,8 и 8,7 раз соответственно по сравнению со здоровыми беременными;

       - снижение экспрессии противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты в 3,2 раза, эпителиальными клетками в 6,4 раза по сравнению со здоровыми беременными.

       Этот дисбаланс может служить маркером развития преждевременных родов инфекционного генеза и реализации ВУИ. Повышение уровня TLR2 в цервикальной слизи беременных высокого инфекционного риска является показанием к проведению комплексной терапии, направленной на пролонгирование беременности, в том числе антибактериальной терапии.

  1. У беременных с урогенитальной инфекцией вирусной этиологии наблюдается выраженный дефицит продукции активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови и амниотической жидкости, что является показанием к назначению иммунотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

  1. Выявление факторов повышенного риска  развития ВУИ у беременных (острая или рецидив хронической инфекции во время настоящей беременности, наличие воспалительных заболеваний органов малого таза, анемия, рецидивирующая угроза прерывания беременности, плацентарная недостаточность, многоводие, маловодие, хроническая гипоксия, СЗРП) дают основание относить данный контингент к группе высокого риска по её развитию, и, соответственно, подвергать целенаправленному обследованию согласно разработанному алгоритму.
  2. Снижение функциональной активности фагоцитарных клеток и дисбаланс в системе цитокинов, а именно повышение выработки ИЛ-1, ИЛ-12 и снижение выработки ИЛ-1Ра, ИФН в сыворотке периферической крови беременных с урогенитальной инфекцией вирусной этиологии и в пуповинной крови новорожденных могут быть использованы для прогноза осложнений течения беременности, родов и определения показаний к иммунокоррекции.
  3. Комплексное обследование амниотической жидкости, включая бактериологическое исследование АЖ с определением чувствительности выявленных микроорганизмов к антибиотикам и методом ПЦР, позволяет проводить своевременную профилактику и лечение послеродовых гнойно-септических заболеваний матери и новорожденного.
  4. Повышение уровня цитокинов в амниотической жидкости (ИЛ-1  в 2,6 раза; ИЛ-4 в 3,2 раза; ИЛ-12 в 2,2 раза)  и резкое снижение уровня ИФН по сравнению с данными здоровых пациенток позволяет отнести данных пациенток в группу риска по реализации ВУИ.
  5. С целью прогнозирования реализации ВУИ у пациенток высокого инфекционного риска в алгоритм клинико-лабораторного обследования данного контингента беременных целесообразно включать комплексное исследование экспрессии генов TLR2 и HBD1 клетками эпителия цервикального канала и клетками плаценты. Достоверное повышение экспрессии гена TLR2 клетками эпителия цервикального канала по сравнению со здоровыми беременными позволяет отнести данных пациенток в группу риска по ВУИ. Сочетание увеличения экспрессии гена TLR2 клетками эпителия цервикального канала и снижения экспрессии противомикробного пептида HBD1 по сравнению со здоровыми беременными может служить прогностическим критерием  развития преждевременных родов, что позволяет проводить своевременную терапию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н. Диагностическое значение амниотической жидкости при внутриутробном инфицировании.// Актуальные вопросы акушерства и гинекологии. Юбилейный сборник, посвященный 200-летию Московской городской клинической больницы №1 им. Н.И.Пирогова и 80-летию совместной работы кафедры и больницы. Под редакцией проф. О.В.Макарова. Москва, 2002, стр.94-99.
  2. Озолиня Л.А., Бахарева И.В., Сорокина А.В. Гнойно-воспалительные послеродовые осложнения и пути их профилактики.// Актуальные вопросы акушерства и гинекологии. Юбилейный сборник, посвященный 200-летию Московской городской клинической больницы №1 им. Н.И.Пирогова и 80-летию совместной работы кафедры и больницы. Под редакцией проф. О.В.Макарова. Москва, 2002, стр.99-103.
  3. Озолиня Л.А., Бахарева И.В., Сорокина А.В. Гнойно-воспалительные послеродовые осложнения и пути их профилактики.// Проблемы беременности, 2002, №6, стр.48-54.
  4. Бахарева И.В.,  Таранец А.Н.,  Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Макаров О.В., Таранец И.Н., Долгина Е.Н. Система цитокинов у больных с урогенитальной инфекцией. // Материалы V съезда иммунологов и аллергологов СНГ, Санкт-Петербург, Россия 5-11 июля 2003 года. Аллергология и иммунология, 2003, Том 4, №2, стр.160.
  5. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н. Выработка активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови беременных с урогенитальной инфекцией. // Тезисы докладов IV Конгресса РААКИ (Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов), 2003 г., стр.112.
  6. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Таранец А.Н. Диагностическое значение исследования амниотической жидкости при внутриутробном инфицировании. // Акушерство и гинекология, 2003, №4, стр.3-4.
  7. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н.. Клеточные и гуморальные компоненты амниотической жидкости в норме и при внутриутробном инфицировании. // Иммунология, 2003, т.24, №6, стр.350-351.
  8. Макаров О.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н. Современные представления о внутриутробной инфекции. // Акушерство и гинекология, 2004, №1, стр.10-13.
  9. Макаров О.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н., Алегина Е.В. Диагностическое и прогностическое значение определения цитокинов у беременных с урогенитальной инфекцией. // Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 2004 г., стр. 298.
  10. Бахарева И.В., Таранец А.Н., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Долгина Е.Н. Функциональная активность нейтрофилов и система цитокинов у беременных с урогенитальной инфекцией. // Вестник Российского государственного медицинского университета. Специальный выпуск: акушерство и гинекология. - М.: РГМУ.- 2004, №5 (36), стр.41-45.
  11. Макаров О.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С. Значение исследования околоплодных вод в диагностике состояния плода при внутриутробной инфекции. // Российский вестник акушера-гинеколога, 2004, т.4, №4, стр.24-29.
  12. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С.. Анализ цитокинов амниотической жидкости в норме и при внутриутробном инфицировании. // Материалы VI Российского форума "Мать и дитя", Москва, 12-15 октября 2004 года, стр. 122.
  13. Макаров О.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н., Алегина Е.В. Диагностическое и прогностическое значение определения цитокинов у беременных с урогенитальной инфекцией. // Материалы конференции "Здоровье и образование в XXI веке", Москва, 21-23 октября 2004 г., стр. 142.
  14. Макаров О.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С. Анализ цитокинов в околоплодных водах при внутриутробной инфекции. // Материалы III Конгресса педиатров-инфекционистов России, Москва, 8-10 декабря 2004 г., стр.141-142.
  15. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Идрисова Л.С. Исследование околоплодных вод при внутриутробной инфекции. // Тезисы докладов V Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс», г. Кисловодск, 2004 г., стр.19-20.
  16. Бахарева И.В., Идрисова Л.С. Биохимическое исследование состава амниотической жидкости у рожениц с высоким риском развития внутриутробной инфекции плода. // Материалы IV Конгресса педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей (диагностика и лечение)», Москва, 14-16 декабря 2005 г., стр. 31-32.
  17. Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С., Гуменюк С.А. Окислительный метаболизм нейтрофилов и уровень провоспалительных цитокинов в амниотической жидкости при нормальной и осложненной урогенитальной инфекцией (УГИ) беременности. //Там же, стр. 50.
  18. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Долгина Е.Н., Таранец А.Н., Идрисова Л.С. Исследование особенностей окислительного метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов у беременных с урогенитальной инфекцией. //Там же, стр. 108 - 109.
  19. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Таранец А.Н., Идрисова Л.С. Анализ цитокинов у беременных с урогенитальной инфекцией и их новорожденных. //Там же, стр. 109.
  20. Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Долгина Е.Н., Идрисова Л.С. Оценка окислительного метаболизма нейтрофилов и уровень провоспалительных цитокинов в амниотической жидкости при нормальной и осложненной урогенитальной инфекцией беременности. // Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 3 – 7 апреля 2006 года, стр.664.
  21. Идрисова Л.С., Бахарева И.В., Долгина Е.Н. Окислительный метаболизм нейтрофилов амниотической жидкости и периферической крови при нормальной и осложненной урогенитальной инфекцией беременности. //Там же, стр. 668-669.
  22. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Идрисова Л.С. Современные представления о диагностике внутриутробной инфекции. // Российский вестник акушера-гинеколога, 2006, т. 6, стр. 11-15.
  23. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Долгина Е.Н., Идрисова Л.С., Гуменюк С.А, Макаров О.В. Окислительный метаболизм нейтрофилов и уровень провоспалительных цитокинов в амниотической жидкости при нормальной и осложненной урогенитальной инфекцией беременности. // Иммунология, 2006, №3, стр. 163-167.
  24. Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Макаров О.В., Идрисова Л.С., Долгина Е.Н. Система цитокинов амниотической жидкости при внутриутробной инфекции.// Материалы VI съезда иммунологов и аллергологов СНГ, Москва, Россия, 11-13 сентября 2006 года. Аллергология и иммунология, том 7, №3, стр.385.
  25. Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Долгина Е.Н. Исследование особенностей окислительного метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией. //Там же, стр.385-386.
  26. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С. Оценка окислительного метаболизма нейтрофилов амниотической жидкости при нормальной и осложненной урогенитальной инфекцией беременности. //Там же, стр. 386.
  27. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Долгина Е.Н. Анализ цитокинов периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией и их новорожденных. //Там же, стр. 386-387.
  28. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Гришук А.Ю., Ганковская О.А., Фензелева В.А. Врожденный иммунитет при  урогенитальной инфекции вирусного генеза у беременных. //Там же, стр. 382.
  29. Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Идрисова Л.С. Окислительный метаболизм нейтрофилов амниотической жидкости у беременных с урогенитальной инфекцией. // Материалы II Всероссийского Конгресса по детской аллергологии и иммунологии «Иммунитет и болезни детского возраста: «органные» и «системные» принципы диагностики, терапии и профилактики», Москва, 2-4 октября 2006 года. «Аллергология и иммунология в педиатрии», 2006; 2-3 (9), стр. 59.
  30. Бахарева И.В., Макаров О.В., Долгина Е.Н. Изучение особенностей окислительного метаболизма нейтрофилов амниотической жидкости, периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией. //Там же, стр. 59-60.
  31. Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. Экспрессия TLR-4 клетками цервикального канала у беременных женщин при урогенитальной инфекции. //Там же, стр. 74.
  32. Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская Л.В., Долгина Е.Н. Изучение особенностей окислительного метаболизма нейтрофилов амниотической жидкости, периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией. // Материалы VIII Всероссийского форума "Мать и дитя", Москва, 3 - 6 октября 2006 года, стр.30.
  33. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С., Долгина Е.Н. Система цитокинов амниотической жидкости при внутриутробной инфекции. //  Там же, стр.66.
  34. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Долгина Е.Н., Таранец А.Н.. Анализ цитокинов периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией и их новорожденных. //Там же, стр.148.
  35. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Оценка уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов при урогенитальной инфекции. //Там же, стр.353.
  36. Ганковская О.А., Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Макаров О.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская Л.В. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета (Toll-подобные рецепторы) при урогенитальной инфекции у беременных. // Сборник тезисов докладов V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии», Оренбург, 2006г., с.47.
  37. Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская Л.В., Козлов П.В., Долгина Е.Н. Исследование особенностей окислительного метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией. // Материалы Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии» (Москва, 21-22 ноября 2006). Вопросы практической педиатрии, 2006, том 1, №4, стр. 10-11.
  38. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С., Долгина Е.Н. Система цитокинов амниотической жидкости при внутриутробной инфекции. //  Там же, стр. 19.
  39. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Увеличение уровня экспрессии TLR-2 у беременных женщин при урогенитальной инфекции. //Там же, стр. 36.
  40. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Козлов П.В., Идрисова Л.С. Окислительный метаболизм нейтрофилов амниотической жидкости при нормальной и осложненной урогенитальной инфекцией беременности. //Там же, стр. 36-37.
  41. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Экспрессия TLR-4 клетками цервикального канала у беременных женщин при урогенитальной инфекции. //Там же, стр.37.
  42. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Долгина Е.Н., Таранец А.Н. Анализ цитокинов периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией и их новорожденных. //Там же, стр.37.
  43. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Гришук А.Ю., Ганковская О.А., Макаров О.В. Оценка уровней цитокинов у беременных женщин с вирусной инфекцией. //  Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии, 2007; том 6, №2, стр. 11-13.
  44. Gankovskaya O.A., Lavrov V.F., Koval’chuk L.V., Gankovskaya L.V., Bahareva I.V., Zverev V.V. Herpes viral infection induces the expression of Toll-like receptors, proinflammatory cytokines and human -defensin-1 in cervical epithelial cells. // Acta Biochimica Polonica, 2007, vol. 54, sup.2, pp.45-46.
  45. Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Роль Toll-подобных рецепторов при патологии беременности. // Медицинская иммунология, 2007, том 9, №2-3, стр.256-257.
  46. Макаров О.В.,  Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Романовская В.В. Современные подходы к прогнозированию преждевременных родов. // Российский вестник акушера-гинеколога, 2007, том 7,  №6, стр.10-15.
  47. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Молекулярные механизмы врожденного иммунитета при невынашивании беременности. // Материалы первого регионального научного форума «Мать и дитя», Казань, 2007 г., с.102.
  48. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Роль врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. // Материалы I Международного Семинара «Инфекция в акушерстве и перинатологии» (First International Seminar “Infections in Obstetrics and Perinatology”), Москва, Россия, 3-6 апреля 2007 г., стр. 94.
  49. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Романовская В.В. Роль механизмов врожденного иммунитета у беременных женщин с урогенитальной инфекцией и их новорожденных. // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 16 – 20 апреля 2007 года, стр.538.
  50. Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В. Система цитокинов амниотической жидкости при внутриутробной инфекции. //Там же, стр.554.
  51. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Роль механизмов врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. // Материалы V Всемирного конгресса по иммунопатологии и аллергии, V Европейского конгресса по астме, Москва, Россия, 22-25 апреля 2007 г. Аллергология и иммунология, Том 8, №1, март 2007 г., стр. 122.
  52. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Бахарева И.В., Фензелева В.А. Экспрессия генов Toll-подобного рецептора-2 и -дефензина-1 человека при урогенитальной инфекции беременных. // Тезисы докладов  VIII Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 27-29 июня 2007 г., Москва.
  53. Gankovskaya L.V., Bahareva I.V., Kartashov D.D. Expression of defensins in pregnant woman with urogenital infection. // Тезисы докладов II Конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», 10-14 сентября 2007 г., Москва.
  54. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы в инициации невынашивания беременности. // Материалы II Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии», Москва, 1-2 октября 2007 г. Вопросы практической педиатрии, 2007; том 2, №5, стр.26.
  55. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы в инициации невынашивания беременности. // Материалы IХ Всероссийского научного форума "Мать и дитя", Москва, 2 - 5 октября 2007 года, стр.150.
  56. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Показатели врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. //Там же, стр.150 - 151.
  57. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы как маркеры осложнений беременности. // Материалы XII Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Паттайя, Таиланд, 6-9 декабря 2007 года; «Аллергология и иммунология, Том 8; №3 (октябрь) 2007 года, стр.236.
  58. Сидорова И.С., Макаров О.В., Манухин И.Б., Радзинский В.Е., Макаров И.О., Бахарева И.В. Профилактика и лечение внутриутробных инфекций (методические рекомендации). // М., 2007 год.
  59. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А.. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет (монография). // Москва, «ГЭОТАР-Медиа», 2007 год.
  60. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы в генезе невынашивания беременности. // Акушерство и гинекология, 2008, №2, стр. 22-28.
  61. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Романовская В.В. Оценка уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов при урогенитальной инфекции. // Сборник Материалов ХV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля, 2008 г., с.353.
  62. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Прогностическое значение Toll-подобных рецепторов и противомикробного пептида HBD1 у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции их новорожденных. // Материалы III Ежегодного конгресса и VI Съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины, «Современная перинатология: организация, технология и качество». Вопросы практической педиатрии, 2008, Том 3, №5, с. 34.
  63. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Прогностическое значение Toll-подобного рецептора 2 и противомикробного пептида HBD1 у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции их новорожденных. //  Материалы IV Съезда акушеров-гинекологов России, 2008, с.151-152.
  64. Макаров О.В., Козлов П.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Кузнецов П.А. Основные аспекты ведения недоношенной беременности и преждевременных родов. // Акушерство и гинекология, 2008,  №5, стр.19-24.
  65. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Патент на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». // Официальный бюллетень федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.09.2008 г.
  66. Коллектив авторов (О.В.Макаров, В.А.Алешкин, Т.Н.Савченко, С.С.Афанасьев, Е.А.Воропаева, Л.В.Ганковская, А.З.Хашукоева, И.В.Бахарева, С.И.Каюкова, Л.О.Протопопова, М.С.Афанасьев, Е.И.Гиммельфарб, Л.И.Новикова). Под редакцией Макарова О.В., Алешкина В.А, Савченко Т.Н. Инфекции в акушерстве и гинекологии (руководство для врачей). // Москва, «МЕДпресс-информ», 2007 г., 2009 г.
  67. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В. Молекулярные механизмы инфекционного невынашивания беременности. // РМЖ, 2009,  №2, стр. 24-29.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.