WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

СОКОЛОВ

Дмитрий Игоревич

РОЛЬ ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ

ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТРОЛЕ

РАЗВИТИЯ ПЛАЦЕНТЫ В НОРМЕ И ПРИ ГЕСТОЗЕ

14.00.36 – аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург, 2009

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт
акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта Северо-Западного отделения РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Сельков Сергей Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Айламазян Эдуард Карпович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна

доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

доктор медицинских наук, профессор Малинин Владимир Викторович

Ведущая организация: Государственный Научный Центр «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России»

Защита состоится «  » _____________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан «  » _____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук                                                Бурова Л.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успешное развитие беременности зависит от иммунологического контроля взаимоотношений матери и плода. Одной из наиболее тяжелых форм патологии беременности, связанной с нарушением регуляторных механизмов, является гестоз, проявляющийся полиорганной функциональной недостаточностью, развитием гипертензии, отеков и протеинурии после 20 недели беременности. Частота гестоза в различных странах колеблется от 2 до 14% к числу всех беременностей [Douglas K.A., 1994; Cавельева Г. М., 2000]. Гестоз остается одной из ведущих причин материнской смертности и составляет в ее структуре 25%. Наиболее часто гестоз развивается у женщин, страдающих соматическими заболеваниями, а также у первородящих и у беременных старше 30 лет. Преждевременные роды при гестозе наблюдаются в 25-41%, частота оперативного родоразрешения составляет 40% [Савельева Г.М., 1996; Серов В.Н., 1997]. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий, до сих пор не существует единых четких представлений об этиологии и патогенезе данного заболевания. К настоящему времени изучены механизмы иммунологического контроля инвазии трофобласта в стенку матки, механизмы создания иммунологической толерантности в системе мать – плод, факторы, действие которых может приводить к патологическому течению беременности. Вместе с тем, до сих пор не проанализированы иммунологические механизмы, связывающие особенности функционирования клеток иммунной системы, эндотелиальных клеток сосудистого русла беременной женщины, эндотелиальных и других клеток плаценты при ее физиологическом развитии и при патологическом течении беременности. Недостаточно изучен до сих пор характер изменений цитокиновой сети плаценты при ее физиологическом развитии и при гестозе. В литературе представлены разрозненные сведения о локализации ростовых факторов в плаценте на ранних и поздних этапах физиологически протекающей беременности. Изучение секреции тканью плаценты цитокинов и других факторов проводилось, как правило, без иммуногистохимического подтверждения наличия или отсутствия исследуемых факторов в плаценте. Комплексное сравнительное изучение иммунологических механизмов регуляции, роли гуморальных и клеточных факторов в контроле развития плаценты в норме и при патологии позволит конкретизировать отдельные звенья иммунопатогенеза гестоза.

Цель работы. Оценить роль иммунологических механизмов в регуляции формирования плаценты при физиологически протекающей беременности и при гестозе.

Задачи исследования.

  1. Провести сравнительную оценку популяционного состава лимфоцитов периферической крови женщин с физиологически протекающей беременностью и при гестозе.
  2. Сравнить функцию адгезии мононуклеаров периферической крови беременных женщин к эндотелиальным клеткам при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
  3. Изучить интенсивность поглощения липидов сыворотки крови моноцитами периферической крови и эндотелиальными клетками при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
  4. Сопоставить особенности продукции иммунологически значимых секреторных вариантов поверхностных молекул, ростовых факторов, хемокинов, цитокинов тканью плаценты на ранних и поздних этапах ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
  5. Охарактеризовать экспрессию и локализацию ангиогенных и антиангиогенных факторов в плаценте на различных этапах ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
  6. Оценить характер экспрессии и локализации апоптогенных и антиапоптогенных факторов, а также определить степень выраженности апоптоза в плаценте на ранних и поздних этапах ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Беременность, осложненная гестозом, характеризуется нарушением иммунологической регуляции развития плаценты, проявляющимся выраженными изменениями морфологии ткани плаценты и секреции биологически активных молекул клетками плаценты.
  2. Сбалансированная продукция ангиогенных и антиангиогенных, антиапоптогенных и проапоптогенных факторов, а также цитокинов клетками плаценты определяет ее нормальное развитие и препятствует проявлению цитотоксических эффектов лимфоцитов матери. При этом антиангиогенные и проапоптогенные факторы на ранних этапах физиологически протекающей беременности ограничивают избыточную пролиферацию клеток плаценты, а в третьем триместре способствуют формированию структуры плаценты. Напротив, при гестозе в третьем триместре беременности происходит повышение продукции IL-6, IL-8, антиангиогенных и проапоптогенных факторов, сопровождающееся повышенной гибелью клеток трофобласта.
  3. Физиологическое развитие плаценты сопровождается изменением локализации процессов апоптоза при сохранении их интенсивности, что позволяет плаценте выполнять свои функции и обеспечивать растущие потребности плода вплоть до родоразрешения.
  4. В плаценте при гестозе запускаются компенсаторные механизмы защиты против избыточных антиангиогенных, апоптогенных стимулов и цитотоксических эффектов лимфоцитов матери, к которым относится повышение секреции ангиогенина, PDGF, TGF и растворимых форм поверхностных рецепторов sFas, sFasL при одновременном снижении экспрессии Fas, FasL и повышенной экспрессии TRAIL.
  5. Некоторые из обнаруженных нами изменений, в частности, увеличение продукции тканью плаценты при гестозе секреторных вариантов поверхностных молекул sVEGF-R1 и sVE-cadherin, являются отражением нарушения функций клеток плаценты. Повышение концентрации sICAM-1 в сыворотке периферической крови беременных с гестозом свидетельствует об активации лейкоцитов периферической крови и нарушении функций эндотелиальных клеток кровеносного русла.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное сопоставление иммунологических механизмов, контролирующих физиологическое развитие плаценты и особенностей иммунологической регуляции и иммунопатологических механизмов при гестозе.

Впервые выявлено усиление функции адгезии к эндотелиальным клеткам линии EA.Hy926 у мононуклеаров периферической крови беременных с гестозом по сравнению со здоровыми беременными.

Впервые показана более выраженная способность эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 поглощать липиды из сывороток беременных с гестозом по сравнению с сыворотками здоровых беременных. Также впервые выявлена повышенная способность моноцитов периферической крови беременных с гестозом в сравнении с моноцитами периферической крови здоровых беременных поглощать липиды из аутологичной сыворотки крови.

Установлено, что продукция тканью плаценты секреторных вариантов поверхностных молекул sVEGF-R1, sVE-cadherin, sICAM-1, sFas, sFasL не вносит существенного вклада в их накопление в периферической крови. В то же время, повышение в сыворотке крови беременных женщин уровня sICAM-1 можно расценивать как отражение системной эндотелиальной дисфункции и активации лейкоцитов при гестозе.

Впервые продемонстрировано, что снижение экспрессии проангиогенных и антиангиогенных факторов, секреции IL-6, IL-8, а также увеличение секреции IFN, IL-4, IL-10 в плаценте в динамике от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности не сопровождается изменением интенсивности апоптоза. В отличие от этого при гестозе снижение экспрессии ангиогенных факторов, увеличение секреции IL-6, IL-8 и экспрессии антиангиогенных и проапоптогенных факторов в плаценте сопровождается апоптотической гибелью преимущественно клеток трофобласта и эндотелиальных клеток плодовых сосудов.

Впервые обнаружено, что повышение секреции ангиогенина, PDGF, TGF и растворимых форм поверхностных рецепторов sFas, sFasL, а также снижение экспрессии мембранных рецепторов Fas, FasL и повышение экспрессии рецептора TRAIL отражают реализацию компенсаторных механизмов защиты клеток плаценты при гестозе.

Практическая значимость. Среди общепринятых иммунологических тестов отобраны наиболее информативные, позволяющие уточнить раннюю диагностику гестоза, начиная с первого триместра беременности: определение уровня содержания молекул sICAM-1 в сыворотке крови, оценка функции адгезии мононуклеаров периферической крови к эндотелиальным клеткам, оценка поглощения липидов эндотелиальными клетками и моноцитами.

Разработана модификация метода для оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 из сыворотки крови. Метод позволяет изучать механизмы, лежащие в основе нарушений липидного обмена, в том числе при гестозе, оценивать риск развития эндотелиальной дисфункции и тяжесть гестоза. Метод также может быть использован для мониторинга проводимой терапии.

Модифицированный метод оценки интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови беременных из аутологичной сыворотки крови позволяет оценить функциональную активность моноцитов и их потенциальную способность образовывать пенистые клетки при гестозе. Метод может быть использован для мониторинга проводимой терапии.

Определение уровня содержания молекул sICAM-1 в сыворотке крови может использоваться в качестве прогностического критерия развития гестоза, а также для оценки выраженности эндотелиальной дисфункции при различных заболеваниях.

Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, обобщении и анализе полученных результатов, написании статей. Проведение морфологического и иммуногистохимического анализа осуществлялось при консультативной помощи сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, анализ содержания липидов в сыворотке крови осуществлялся при консультативной помощи сотрудников лаборатории биохимии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII, VIII, IX, X конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), конференции «Объединенный иммунологический форум - 2008» (Санкт-Петербург, 2008), 2-м региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008г.), конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007г.), первом региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007г), конференции II-го междисциплинарного конгресса «Ребенок, врач, лекарство», (Санкт-Петербург, 2007г.), I съезде патологоанатомов Республики Беларусь (Беларусь, г. Минск, 2006г), конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006 г.), девятой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2007 г.), первом международном конгрессе по репродуктивной медицины (Москва, 2006 г.).

По теме диссертации опубликовано 29 работ, в том числе глава в учебнике для
ВУЗ`ов; журнальных статей 14, из них 12 статей в рекомендованных ВАК РФ журналах; 14 тезисов докладов.

Реализация работы. Диссертация выполнена на базе НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН. Результаты исследований внедрены в практическую и научную деятельность лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, научную деятельность отдела иммунологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН. Материалы диссертации использованы в учебнике для ВУЗ`ов «Руководство по нейроиммуноэндокринологии». Основные положения, материалы и выводы диссертации используются в учебном процессе на кафедре патологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный Университет».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 344 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Текст диссертации иллюстрирован 88 рисунками и 21 таблицей. Список литературы включает 671 источник, из них 75 отечественных и 596 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе работы обследовано 450 женщин во время и вне беременности. В первую группу вошли беременные с гестозом первой и второй степени тяжести без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования в III триместре беременности. Вторую группу составили беременные на сроке 32-39 недель с физиологическим течением беременности. В третью группу включены здоровые небеременные женщины без признаков воспалительных изменений и гиперлипидемии. Диагноз гестоза у женщин первой группы установлен в Отделении физиологии и патологии беременности НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности – наличия протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм. рт. ст. и выше, диастолического давления от 85 мм. рт. ст. и выше). При оценке тяжести гестоза использовали классификацию акад. РАМН Г.М. Савельевой, принятую на форуме «Мать и Дитя»  в 2005 году. Степень тяжести гестоза оценивали по бальной системе: до 7 баллов – легкая степень тяжести; 8-11 баллов – средняя; 12 и более – тяжелая. Отечественная классификация адекватно сочетается с Международной классификацией болезней Х пересмотра. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, паритету родов и акушерскому анамнезу. Периферическую кровь здоровых небеременных женщин получали в отделении переливания крови НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН. Объектом исследования также явились 80 плацент, полученных на разных сроках беременности. Обследованы плаценты, полученные при искусственном аборте у женщин с физиологическим течением беременности (9-11 недель); плаценты женщин, у которых беременность протекала без осложнений (38-39 недель); плаценты женщин с течением беременности, осложненным гестозом (38-39 недель). Все плаценты на сроке 38-39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. У обследованных женщин оценивали содержание и свойства мононуклеаров периферической крови и содержание иммунологически значимых молекул в сыворотке крови.

Оценка популяционного состава лимфоцитов. Использовали стандартный набор для определения популяций лимфоцитов периферической крови IMKPlus (BD, США), позволяющий определять количество: CD3+ лимфоцитов, CD19+ (B-лимфоцитов), CD3+\CD4+ лимфоцитов, CD3+CD8+ лимфоцитов, CD3+\CD4+\CD8+ лимфоцитов, CD3+\HLA-DR лимфоцитов, CD3–\CD16+\CD56+ натуральных киллеров, CD3+\CD16+\CD56+ NKT лимфоцитов. Гепаринизированную периферическую кровь обрабатывали антителами в соответствии с рекомендациями производителя (BD, США). Учет проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США).

Оценка функции адгезии мононуклеаров периферической крови к эндотелию. В работе использовали эндотелиальные клетки линии EA.hy926, воспроизводящие характеристики эндотелия крупных сосудов [Edgell C.J., 1983]. Клетки линии EA.hy926 культивировали 24 часа (5% СО2, 37°С) в плоскодонном 24-луночном планшете. Затем в часть лунок вносили 100 ЕД/мл рекомбинантного TNF («Рефнолин», Латвия) и инкубировали 22 часа. Затем отмывали теплым раствором Хенкса. Мононуклеары выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл\верографин. В лунки c монослоем интактных или активированных TNF клеток линии EA.Hy926 вносили 1106 мононуклеаров и культивировали 30 минут. Затем отмывали теплым раствором Хенкса от неадгезированных клеток. Адгезированные клетки вместе с монослоем эндотелиальных клеток переводили в суспензию раствором версена. Суспензию клеток обрабатывали моноклональными антителами в комбинациях: анти-VEGF-R1+анти-CD45; анти-CD3(FITC)+анти-CD16+56(PE); анти-CD3(PerCP)+анти-CD4(FITC)+анти-CD8(PE), анти-CD14(FITC) +анти-CD16(PE); контрольными изотип-антителами (BD, США). Анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США). При анализе в координатах прямого и бокового светорассеяния контролировали наличие эндотелиальных клеток, моноцитов и лимфоцитов в суспензии, полученной после их совместного культивирования. Лимфоциты и моноциты экспрессировали CD45, но обладали низкой экспрессией VEGF-R1. Эндотелиальные клетки экспрессировали VEGF-R1, но не экспрессировали CD45. Затем настройку проточного цитофлюориметра проводили так, чтобы выделить области, занимаемые лимфоцитами и мононуклеарными фагоцитами. Обладающие большими размерами эндотелиальные клетки находились вне пределов выделенных областей. Проводили гейтирование исследуемых клеток в координатах FSC и SSC, анализировали на наличие флюоресценции лимфоциты и моноциты. При анализе данных дополнительно определяли соотношения популяций мононуклеаров периферической крови среди мононуклеаров, адгезировавших к эндотелию. После отсечения зоны дебриса число клеток в популяциях мононуклеаров периферической крови пересчитывали на 100 эндотелиальных клеток.

Определение липидов в сыворотке крови проводили в соответствии с протоколом производителя стандартного набора фирмы Dia Sys (Германия) на автоматическом биохимическом анализаторе Alcyon 300 (Abbot , США). Определение концентрации триглицеридов, липопротеинов высокой плотности, ЛПНП, ЛПОНП, холестерина и оценку индекса атерогенности проводили при консультативной помощи сотрудников лаборатории биохимии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН.

Оценка интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови или эндотелиальными клетками линии EA.Hy926. Метод окраски липидов красителем OIL RED O [Luna, L.G., 1968] модифицировали для оценки интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови в культуре. Мононуклеары выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл\верографин и культивировали 3 часа (5% СО2, 37С) в среде RPMI1640, 10% ЭТС («ICN», США) в лунках стерильного предметного стекла с 4-луночной камерой (3106 клеток на лунку в 1000 мкл среды). Затем отмывали от неприлипших лимфоцитов теплым раствором Хенкса, и культивировали в 1000 мкл среды 24 часа. Затем из лунок отбирали по 500 мкл среды и добавляли в первую лунку 500 мкл ЭТС (контроль), во вторую лунку с клетками того же пациента 500 мкл аутологичной сыворотки крови (опыт), инкубировали 24 часа.

Для оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальные клетки линии EA.Hy926 помещали в концентрации 8105 клеток на лунку в 500 мкл культуральной среды на стерильное предметное стекло, снабженное 4-луночной камерой, культивировали 24 часа (5% СО2, 37С). Затем в лунки вносили 500 мкл сыворотки здоровых небеременных, здоровых беременных или беременных женщин с гестозом. В контрольные лунки вносили 500 мкл ЭТС, инкубировали 24 часа.

После инкубации моноциты или клетки линии EA.Hy926 отмывали теплым раствором Хенкса, фиксировали 10% формалином 10 минут, отмывали дистилированой водой 15 минут. Подготовленные таким образом препараты моноцитов или эндотелиальных клеток промывали 70% изопропанолом 10 минут и окрашивали 0,25% раствором OIL RED O («ICN», США) в 70% изопропаноле 10 минут; промывали дистилированой водой 10 минут; окрашивали гематоксилином 5 минут и промывали дистилированой водой. Препараты фиксировали в глицерин-желатине. Анализировали площадь липидных включений при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 4.0 (Видеотест, Россия). Площадь липидов в каждом поле зрения делили на количество ядер и умножали на 100. Из полученных значений площади липидов в клетках, проинкубированных в присутствии сывороток крови, вычитали значение площади экспрессии липидов, полученное для тех же клеток, но проинкубированных в обычной среде с добавлением 500 мкл ЭТС.

Оценку концентрации растворимых форм мембранных рецепторов в сыворотке крови проводили при помощи стандартных наборов для иммуноферментного анализа: sICAM-1 (BD, США), sFas, sFasL, sVEGF-R1, sVE-cadherin (Bender MedSystems, Австрия). Учет результатов проводили на планшетном ридере (Labsystems, Финляндия).

Оценка продукции цитокинов и растворимых форм мембранных рецепторов тканью плаценты. Для иммуногистохимического анализа экспрессии различных факторов экспланты из центральной части плацент фиксировали в 10% формалине. Экспланты из центральной части тех же плацент культивировали в среде DMEM\F12, 10% ЭТС (Sigma, США) 24 часа. Кондиционированные среды собирали и замораживали. Экспланты плацент взвешивали для пересчета концентрации факторов на 1мг ткани. В полученных кондиционированных средах определяли содержание ангиогенина, VEGF, bFGF, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, RANTES, TNF, IFN, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-5, IL-10 с использованием тест-систем BD Cytometric Bead Array (BD, США) и цитофлюориметра FACSCanto II (BD, США) в соответствии с указаниями производителя. При помощи стандартных наборов для иммуноферментного анализа определяли содержание sICAM-1 (BD, США), sFas, sFasL, sVEGF-R1 и sVE-cadherin (Bender MedSystems, Австрия). Учет результатов проводили на планшетном ридере (Labsystems, Финляндия). Концентрация указанных факторов в среде DMEM\F12, 10% ЭТС не превышала 2 пг/мл.

Иммуногистохимический анализ экспрессии факторов клетками плаценты. Зафиксированные в 10% формалине экспланты из центральной части плацент использовали для иммуногистохимического анализа на серийных срезах экспрессии VEGF, VEGF-R3, bFGF, PDGF, MMP-2, TGF, TGF-R, CD105, TSP-1, Fas (CD95), FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9 и Mcl-1. Визуализацию проводили с применением универсального набора иммуноглобулинов (Novocastra, UK) и стандартного проявляющего набора (ABC-kit, Novocastra, UK). Для контроля использовали антитела против гемоцианина. Анализ площади экспрессии VEGF, VEGF-R3, bFGF, PDGF, MMP-2, TGF, TGF-R, CD105, TSP-1 в ткани плаценты, выраженную в процентах от площади поля зрения, проводили при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 5.0. Локализацию апоптоза в ткани плаценты оценивали TUNEL-методом при помощи стандартного набора (Chemicon, США). Анализ площади экспрессии Fas (CD95), FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9 и Mcl-1 в ткани плаценты, проводили при помощи микроскопа Leica DMR и программы Leica QWin. Иммуногистохимический анализ проводился при консультативной помощи сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, за что автор выражает благодарность д.м.н., профессору Кветному И.М., к.м.н. Колобову А.В. и Соповой Е.С.

Статистический анализ проводили при помощи критерия Манна-Уитни, медианного теста, используемого для определения тенденции изменения признака [Makhseed M., 2001], и корреляционного анализа Спирмена в программе STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Секреция и экспрессия тканью плаценты на разных сроках беременности факторов, контролирующих ее развитие. При морфологическом исследовании плацент на сроках 9-11 недель и 38-39 недель при физиологически протекающей беременности отмечали нормальное строение ткани. При гестозе на сроке 38-39 недель в плацентах отмечали нарушение формирования и ветвления ворсин, инволютивно-дистрофические изменения, мононуклеарные инфильтраты с преобладанием лимфоцитов. Для оценки влияния различных факторов на формирование ткани плаценты в норме и при гестозе оценивали их секрецию и экспрессию клетками плаценты.

Таблица 1. Секреция тканью плаценты bFGF.

Цитокины

Группы

Концентрация в пикограммах в 1мл кондиционированной среды

Концентрация в пикограммах в пересчете на 1мг ткани

bFGF

9-11 недель (n=15)

1309,3±239,1*

12,7±1,7**

38-39 недель (n=30)

655,3±76,5

5,9±0,5

гестоз, 38-39 недель (n=35)

545,4±22,4

5,6±0,3

Достоверность различий между группами: группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» * – р<0,05; ** – р<0,01; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «9-11 недель» – р<0,01; – p<0,001.

Секреция bFGF тканью плаценты на сроке 9-11 недель была в два раза выше, чем на сроке 38-39 недель (Таблица 1). Экспрессия bFGF в ткани плаценты на ранних и поздних сроках беременности не различалась (Таблица 2). Статистически значимых различий между уровнями секреции bFGF на сроке 38-39 недель и при гестозе не обнаружено. При гестозе выявлена статистически недостоверная тенденция к снижению секреции bFGF тканью плаценты. В тоже время, экспрессия bFGF клетками плацент беременных с гестозом была достоверно ниже (Таблица 2), чем клетками плацент здоровых беременных на сроке 38-39 недель, что подтверждает данные, полученные нами при анализе секреции bFGF тканью плацент и отражает нарушение процессов ангиогенеза.

Ангиогенин обнаружен в высоких концентрациях как при физиологической беременности, так и при гестозе. Статистически значимых различий в секреции ангиогенина между группами не выявлено, однако медианный тест показал тенденцию к повышению секреции ангиогенина клетками плаценты к третьему триместру физиологически протекающей беременности и в большей степени при гестозе (Рисунок 1).

VEGF принимает активное участие в контроле всех этапов формирования сосудистого русла плаценты [Clark D.E., 1998]. Однако VEGF не был обнаружен нами в надосадочных жидкостях, полученных после культивирования эксплантов плацент. В то же время, при помощи метода иммуногистохимического анализа нами обнаружена экспрессия VEGF в ткани плаценты (Таблица 2). Полученные данные можно объяснить способностью VEGF связываться с экстрацеллюлярным матриксом [Brewster L.P., 2008].

Рисунок 1. Концентрация ангиогенина в кондиционированных средах, полученных после культивирования эксплантов плацент, медианный тест.

Экспрессия VEGF-R3, PDGF, MMP-2, TSP-1, TGF, TGF-R1, CD105 плацент беременных на сроке 38-39 недель была ниже (Таблица 2), чем экспрессия этих факторов клетками плацент на сроке 9-11 недель. На ранних этапах развития локализация указанных факторов в ткани плаценты и проангиогенный цитокиновый профиль отражают активацию процессов ангиогенеза и формирование сосудистой сети. Снижение секреции проангиогенных и антиангиогенных факторов тканью плаценты в третьем триместре свидетельствует о завершении формирования ткани плаценты. Экспрессия VEGF-R3, bFGF, MMP-2, TGF-R1, CD105 клетками плацент беременных с гестозом была ниже, а экспрессия PDGF, TSP-1, TGF была выше (Таблица 2), чем экспрессия этих факторов клетками плацент здоровых беременных на сроке 38-39 недель. Сниженная экспрессия проангиогенных факторов при гестозе может являться причиной нарушения процессов ангиогенеза в плаценте, и отражает нарушение функций клеток плаценты. Увеличенная экспрессия антиангиогенных факторов TSP-1 и TGF и их локализация при гестозе отражают нарушение регуляции формирования ткани плаценты.

Приведенные результаты показывают, что для ранних и поздних этапов развития плаценты характерен определенный баланс между проангиогенными и антиангиогенными цитокинами. Нарушение такого равновесия у беременных с гестозом может приводить к снижению жизнеспособности клеток плаценты. В то же время, снижение экспрессии TGF-R1 и CD105 клетками плаценты при гестозе по сравнению с физиологически протекающей беременностью свидетельствует о компенсаторной реакции в ответ на действие антиангиогенных факторов. Дополнительно при гестозе повышенная продукция PDGF и ангиогенина в плаценте обеспечивает поддержание жизнеспособности клеток.

Таблица 2. Экспрессия факторов и рецепторов, контролирующих ангиогенез в ткани плаценты на разных этапах ее развития в норме и при гестозе.

Маркеры

Площадь экспрессии маркера в ткани плаценты (%)

в 9-11 недель (n=15)

в 38-39 недель, физиологически протекающая беременность (n=10)

в 38-39 недель, гестоз (n=10)

VEGF

21,33±2,7

3,11±0,49***

0,58±0,13

VEGF-R3

14,43±1,9

4,88±1,1**

2,31±0,47

bFGF

5,39±0,59

5,2±0,52

2,0±1,01

PDGF

15,33±2,11

2,67±0,3***

6,2±0,32

MMP-2

27,02±6,7

11,60±0,19*

6,91±0,74

TSP-1

1,76±0,24

0,08±0,01***

0,61±0,05

TGF

25,52±5,2

0,69±0,33***

4,55±0,65

TGF-R1

7,42±2,95

0,96±0,25**

0,21±0,02

CD105

21,87±4,65

9,35±0,76*

3,1±0,63

Достоверность различий между группами: группа «38-39 недель, физиологически протекающая беременность» отличается от группы «9-11 недель» ** – р<0,01; *** - p<0,001; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «38-39 недель, физиологически протекающая беременность» – р<0,01.

Продукция тканью плаценты sVE-cadherin на сроке 9-11 недель не обнаружена. При гестозе повышалась продукция sVE-cadherin тканью плаценты в сравнении с физиологически протекающей беременностью (Таблица 3). В сыворотке sVE-cadherin не обнаружен ни в одной из групп. Продукция тканью плаценты sVE-cadherin при гестозе указывает на нарушение функций эндотелиальных клеток плаценты и на гибель клеток трофобласта.

Продукция тканью плаценты sVEGF-R1 была ниже на сроке 38-39 недель, чем на сроке 9-11 недель, что может быть связано с активным контролем ангиогенеза клетками трофобласта на ранних этапах развития плаценты. При гестозе повышалась секреция sVEGF-R1 тканью плаценты в сравнении с физиологически протекающей беременностью (Таблица 3), что может свидетельствовать об активной секреции sVEGF-R1 клетками плаценты, повышенной активности протеолитических ферментов и усиленной гибели клеток, экспрессирующих этот рецептор. Концентрация sVEGF-R1 в сыворотке женщин с физиологически протекающей беременностью и при гестозе была одинаковой, то есть повышенная секреция sVEGF-R1 тканью плаценты при гестозе не оказывала существенного влияния на концентрацию этих молекул в сыворотке крови беременных с гестозом.

Таблица 3. Продукция секреторных вариантов поверхностных рецепторов тканью плаценты.

Секреторные молекулы

Группы

Концентрация

в 1мл кондиционированной среды, пг\мл

Концентрация

в пересчете на 1мг

ткани, пг\мл

sVE-cadherin (sCD144)

9-11 недель (n=15)

0,1±0,1

0,001±0,001

38-39 недель (n=30)

307,4±117,5**

2,75±1,0*

гестоз, 38-39 недель (n=35)

665,2±155,2 ‡

6,98±1,63 ‡

sVEGF-R1

9-11 недель (n=15)

77000,0±527,68

996,6±68,9

38-39 недель (n=30)

28513,6±305,9***

313,7±25,7***

гестоз, 38-39 недель (n=35)

40779,3±400,6 ‡

490,9±54,2 ‡

Достоверность различий между группами: группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» * – р<0,05; ** – р<0,01; *** – р<0,001; группа «38-39 недель» отличается от группы «гестоз, 38-39 недель» ‡ – р<0,05; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «9-11 недель» – p<0,001.

Продукция тканью плаценты sICAM-1 на сроке 38-39 недель при гестозе (3351,4±613,3 пг\мл) и при физиологически протекающей беременности была одинаковой (3362,7±546,1 пг\мл). Концентрация sICAM-1 в сыворотках здоровых беременных (22800±450 пг\мл) не отличалась от таковой в сыворотках здоровых небеременных женщин (21500±350 пг\мл). Концентрация sICAM-1 в сыворотках беременных с гестозом (40370±420 пг\мл) была достоверно выше, чем в сыворотках здоровых беременных (p <0,05). Обнаруженное нами при гестозе увеличение концентрации в сыворотке крови sICAM-1 подтверждается данными литературы [Kim S., 2004] и может быть следствием системной дисфункции эндотелиальных клеток или активации лейкоцитов.

Обнаружено достоверное снижение секреции IL-8 клетками плаценты к третьему триместру физиологически протекающей беременности (Таблица 4). При отсутствии статистически значимых различий секреции IL-8 клетками плацент женщин с физиологическим течением беременности на 38-39 неделе и с гестозом, медианный тест показал тенденцию к повышению секреции IL-8 клетками плаценты в последнем случае. Очевидно, при физиологическом течении беременности на ранних этапах IL-8 участвует в контроле процессов ангиогенеза, а повышение его продукции при гестозе свидетельствует об его участии в реализации воспалительной реакции.

При отсутствии статистически значимых различий в уровнях секреции хемокинов IP-10, MCP-1, RANTES тканью плаценты выявлена тенденция к повышению их секреции клетками плаценты к третьему триместру и снижению при гестозе. Продукция MIG снижалась к третьему триместру при физиологически протекающей беременности и при гестозе. Отмечена положительная корреляционная зависимость между IP-10 и MCP-1, IP-10 и MIG, а также ангиогенином и RANTES (p<0,01) при гестозе. Изменение секреции тканью плаценты хемокинов отражает различную степень активности плацентарных и децидуальных макрофагов, эндотелиальных клеток плаценты в динамике физиологического течения беременности и при гестозе.

Таблица 4. Секреция тканью плаценты цитокинов.

Цитокины

Группы

Концентрация в пикограммах в 1мл кондиционированной среды

Концентрация в пикограммах в пересчете на 1мг ткани

IL-8

9-11 недель (n=15)

17837,9±5345,5*

294,3±109,7*

38-39 недель (n=30)

6445±833

61,1±7,8

гестоз, 38-39 недель (n=35)

7437±1482

66,8±13,4

IFN

9-11 недель (n=15)

113,3±6,6*

2,0±0,4

38-39 недель (n=30)

151,5±13,6

1,8±0,2

гестоз, 38-39 недель (n=35)

164,0±14,7

1,7±0,2

IL-2

9-11 недель (n=15)

32,6±1,7*

0,6±0,08

38-39 недель (n=30)

45,8±4,2

0,5±0,07

гестоз, 38-39 недель (n=35)

48,8±5,0

0,5±0,07

IL-4

9-11 недель (n=15)

25,1±1,2*

0,4±0,07

38-39 недель (n=30)

36,2±3,4

0,4±0,06

гестоз, 38-39 недель (n=35)

37,5±3,0

0,39±0,04

IL-5

9-11 недель (n=15)

12,1±0,5**

0,2±0,03

38-39 недель (n=30)

16,6±1,2

0,19±0,03

гестоз, 38-39 недель (n=35)

16,9±1,1

0,18±0,02

IL-6

9-11 недель (n=15)

3496,5±767,3**

51,5±11,4**

38-39 недель (n=30)

1013,9±144,1

17,9±6,4

гестоз, 38-39 недель (n=35)

2479,0±592,1

44,2±7,6

IL-10

9-11 недель (n=15)

26,8±1,4*

0,5±0,1

38-39 недель (n=30)

33,8±2,4

0,39±0,06

гестоз, 38-39 недель (n=35)

34,0±2,2

0,35±0,04

Достоверность различий между группами: группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» * – р<0,05; ** – р<0,01; группа «38-39 недель» отличается от группы «гестоз, 38-39 недель» ‡ – р<0,05; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «9-11 недель» – р<0,05; – р<0,01; – p<0,001.

В полученных после культивирования эксплантов плацент надосадочных жидкостях IL-12p70 не был выявлен ни в одной из групп. Достоверных различий концентраций IL-1 не было обнаружено. При отсутствии статистически значимых различий секреции TNF при физиологически протекающей беременности на 9-11 неделе и на 38-39 неделе, медианный тест показал тенденцию к повышению его секреции клетками плаценты в последнем случае. Секреция IFN, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 тканью плаценты при физиологически протекающей беременности на сроке 38-39 недель была достоверно выше, чем секреция указанных цитокинов на сроке 9-11 недель (Таблица 4). Секреция IL-6 тканью плаценты при физиологически протекающей беременности на сроке 38-39 недель была достоверно ниже, чем его секреция на сроке 9-11 недель (Таблица 4). С отмеченным повышением секреции цитокинов IL-10 и IL-4 к третьему триместру при физиологически протекающей беременности можно связать компенсаторное усиление их антиапоптотической роли в отношении клеток плаценты и участие в ингибиции активности цитотоксических лимфоцитов.

Достоверных различий между уровнями секреции IL-1, TNF IFN, IL-2, IL-4, IL-6, IL-5 и IL-10 при физиологически протекающей беременности на сроке 38-39 недель и при гестозе на сроке 38-39 недель не обнаружено. Таким образом, от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности наблюдалось увеличение секреции тканью плаценты IFN, IL-4 и IL-10, а также IL-2, IL-5 и TNF. При гестозе в третьем триместре по сравнению с физиологически протекающей беременностью уровень их секреции не изменялся. Эта закономерность подтверждается положительными коэффициентами корреляции между концентрациями указанных цитокинов (p<0,01). Увеличение секреции тканью плаценты указанных цитокинов от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности сопровождалось снижением экспрессии ангиогенных и антиангиогенных факторов, что указывает на роль этих цитокинов в формировании плаценты. Наблюдаемое по результатам медианного теста увеличение секреции тканью плаценты IL-6 при гестозе на сроке 38-39 недель по сравнению с физиологически протекающей беременностью на сроке 38-39 недель, может отражать описанную ранее активацию плацентарных макрофагов, а также участие IL-6 в воспалительных реакциях в ткани плаценты. Увеличение при гестозе секреции тканью плаценты IL-6 и IL-8 и сохранение уровня секреции IFN, IL-10 может отражать нарушение формирования к третьему триместру сбалансированной цитокиновой сети.

Секреция и экспрессия апоптогенных и антиапоптогенных факторов тканью плаценты на разных сроках ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе. Исследование срезов ткани плаценты при помощи TUNEL-метода показало одинаковую интенсивность процессов апоптоза в первом триместре (3,31%±1,68% (n=15)), в третьем триместре (5,29%±2,43% (n=10)) физиологически протекающей беременности, при беременности с гестозом (4,22%±1,86% (n=10)). Локализация апоптоза на ранних сроках выражена в трофобласте, а при доношенной беременности - в синцитиотробласте ворсин, что соответствует стратегии развития плаценты. При гестозе преимущественная локализация апоптоза в синцитиотрофобласте ворсин, а также повышенная экспрессия апоптогенного фактора TSP-1 в синцитиотрофобласте ворсин, строме ворсин и вокруг эндотелиальных клеток плодовых сосудов сопровождалась нарушением строения ткани плаценты и уменьшением количества плодовых сосудов.

Экспрессия FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-9, Mcl-1 клетками плацент беременных на сроке 38-39 недель была ниже, а экспрессия каспазы-3 была выше (Таблица 5), чем экспрессия этих факторов клетками плацент на сроке 9-11 недель. Экспрессия Fas (CD95), каспазы-8 в ткани плаценты на ранних и поздних сроках беременности не различались (Таблица 5).

Таблица 5. Экспрессия факторов и рецепторов, контролирующих апоптоз в ткани плаценты на разных этапах ее развития.

Молекулы

Площадь экспрессии молекулы в ткани плаценты (%)

в 9-11 недель (n=15)

в 38-39 недель, физиологически протекающая беременность (n=10)

в 38-39 недель, гестоз (n=10)

Fas (CD95)

13,85±4,07

13,79±1,33

5,41±0,47

FasL (CD95L)

12,75±3,81

3,82±1,46***

3,96±0,31

TRAIL

20,39±3,46

3,14±1,11***

16,32±1,32

Каспаза-2

12,75±3,81

3,82±1,46***

1,58±0,36

Каспаза-3

5,78±0,57

8,29±1,31*

2,23±0,2

Каспаза-8

7,47±0,99

6,75±1,71

2,36±0,16

Каспаза-9

17,15±3,26

6,37±2,01**

3,97±1,09

Mcl-1

16,12±3,75

2,72±0,27***

1,45±0,65

Достоверность различий между группами: группа «38-39 недель, физиологически протекающая беременность» отличается от группы «9-11 недель» * – р<0,05; ** – р<0,01; *** - p<0,001; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «38-39 недель, физиологически протекающая беременность» – р<0,01.

Отсутствие различий экспрессии Fas (CD95) клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологически протекающей беременности свидетельствует о сбалансированном механизме контроля апоптоза. Снижение экспрессии FasL (CD95L) к третьему триместру физиологически протекающей беременности и его экспрессия в синцитиотрофобласте и фибробластах стромы ворсин указывает на снижение роли Fas-FasL взаимодействий в индукции апоптоза, с чем связано поддержание жизнеспособности клеток плаценты. Экспрессия TRAIL клетками плаценты очевидно способствует их защите от цитотоксических эффектов лимфоцитов на ранних сроках физиологически протекающей беременности. Экспрессия каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9 в развивающейся и зрелой плацентах соответствовала локализации апоптоза в ткани плаценты. Полученные результаты могут свидетельствовать о регулируемом блокировании апоптотического сигнала от каспазы-2 и каспазы-9 к эффекторным каспазам за счет экспрессии Mcl-1. Незначительное увеличение экспрессии каспазы-3 и снижение экспрессии каспазы-2, каспазы-9 и Mcl-1 к концу беременности свидетельствует о снижении роли блокирующих антиапоптотических стимулов при передаче сигнала от каспазы-2 и каспазы-9 к эффекторным каспазам в условиях завершения формирования ткани плаценты.

Таблица 6. Продукция секреторных вариантов поверхностных молекул тканью плаценты.

Секреторные молекулы

Группы

Концентрация

в 1мл кондиционированной среды, пг\мл

Концентрация

в пересчете на 1мг

ткани, пг\мл

sFas (sCD95)

9-11 недель (n=15)

298,8±40,1

3,98±0,68

38-39 недель (n=30)

277,8±15,6

3,0±0,19

гестоз, 38-39 недель (n=35)

331,3±19,4 ‡

3,4±0,18

sFasL (sCD95L)

9-11 недель (n=15)

50,9±9,3

0,61±0,1

38-39 недель (n=30)

16,78±3,5***

0,18±0,03***

гестоз, 38-39 недель (n=35)

26,0±4,68

0,27±0,05

Достоверность различий между группами: группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» *** – р<0,001; группа «38-39 недель» отличается от группы «гестоз, 38-39 недель» ‡ – р<0,05; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «9-11 недель» – р<0,05; – р<0,01.

Экспрессия Fas (CD95), каспазы-3, каспазы-8, клетками плацент беременных с гестозом была ниже, а экспрессия TRAIL была выше (Таблица 5), чем экспрессия этих факторов клетками плацент здоровых беременных на сроке 38-39 недель. Экспрессия FasL (CD95L), каспазы-2, каспазы-9, Mcl-1 в ткани плаценты при физиологически протекающей беременности и при гестозе не отличались (Таблица 5). Таким образом, в плаценте при гестозе апоптоз активно управляется при помощи TRAIL при одновременном снижении роли Fas-FasL взаимодействий. Обнаруженное нами при гестозе снижение экспрессии каспазы-3 и каспазы-8, при неизменном уровне интенсивности апоптоза, экспрессии каспазы-2, каспазы-9 и Mcl-1 в сравнении с физиологически протекающей беременностью свидетельствует в пользу компенсаторного защитного действия ангиогенина и PDGF, продукция которых тканью плаценты увеличивалась при гестозе.

Концентрация sFas (sCD95) в надосадочных жидкостях, полученных после культивирования плацент здоровых беременных, была одинаковой как на сроке 38-39 недель, так и на сроке 9-11 недель (Таблица 6). Концентрация sFas (sCD95) в надосадочных жидкостях при гестозе была выше, чем при физиологически протекающей беременности. Молекула sFas не обнаружена в сыворотках крови, что свидетельствует о роли этой молекулы в местной регуляции процессов апоптоза.

Продукция тканью плаценты sFasL при физиологически протекающей беременности была ниже на сроке 38-39 недель, чем на сроке 9-11 недель (Таблица 6). При отсутствии статистически значимых различий медианный тест показал, что при гестозе происходило незначительное повышение секреции sFasL тканью плаценты в сравнении с физиологически протекающей беременностью. Повышенная секреция клетками плаценты sFasL при гестозе по сравнению с физиологически протекающей беременностью свидетельствует об активированном состоянии клеток плаценты и компенсаторном механизме, позволяющем клеткам плаценты избегать апоптотических сигналов за счет индукции апоптоза цитотоксических лимфоцитов. В сыворотке крови sFasL не обнаружен ни в одной из групп. Сохранение способности sFasL связываться с лигандами на поверхности клеток, в том числе лимфоцитов матери, снижает вероятность появления sFasL в кровотоке. Таким образом, продукция sFas и sFasL тканью плаценты является местным механизмом защиты против цитотоксического действия лимфоцитов матери.

Популяционный состав лимфоцитов периферической крови и функция адгезии мононуклеаров периферической крови беременных женщин. Относительное содержание популяций лимфоцитов периферической крови у здоровых небеременных, здоровых беременных и у женщин с гестозом находилось в пределах физиологической нормы (Таблица 7). У здоровых беременных содержание CD3+\CD4+ T-лимфоцитов хелперов (50,4%±2,2%) было выше содержания CD3+\CD8+ цитотоксических лимфоцитов (35,5%±1,6%, p<0,001) (Таблица 7). Относительное содержание CD3+\CD4+ лимфоцитов (42,7%±2,7%) и CD3+\CD8+ лимфоцитов (42,1%±2,4%) у беременных женщин с гестозом находилось на одинаковом уровне. Отмечено снижение соотношения CD3+\CD4+ лимфоцитов к CD3+\CD8+ лимфоцитам у беременных с гестозом по сравнению со здоровыми беременными (Таблица 7). У беременных с гестозом количество CD3+\CD4+ лимфоцитов было ниже, а количество CD3+\CD8+ лимфоцитов выше, чем у здоровых беременных. Также отмечено, что у беременных с гестозом количество активированных T-лимфоцитов CD3+\HLA-DR+, натуральных киллеров CD3–\CD16+\CD56+ и NKT-лимфоцитов CD3+\CD16+\CD56+ было выше (Таблица 7) по сравнению со здоровыми беременными. Общее количество CD3+ лимфоцитов, CD19+ B-лимфоцитов и CD3+\CD4+\CD8+ T-лимфоцитов у беременных с гестозом не отличалось от такового у здоровых беременных женщин.

Таблица 7. Соотношение популяций лимфоцитов периферической крови у небеременных, здоровых беременных женщин и у беременных женщин с гестозом.

Популяции
лимфоцитов

Содержание лимфоидных клеток с различным фенотипом

здоровые небеременные женщины, %

здоровые беременные женщины, %
(M±m, n=30)

беременные женщин с гестозом, % (M±m, n=30)

по данным производителя; указано минимальное и максимальное значение

по собственным данным
(M±m, n=100)

CD3+

62,8-85,0

75,2±0,6

81,1±1,8

77,1±2,8

CD19+

7,1-23,3

10,1±0,4

8,6±0,7

7,2±0,8

CD3+\CD4+

31,4-56,7

46,3±0,9

50,4±2,2

42,7±2,7*

CD3+\CD8+

18,9-47,9

38,4±0,8

35,5±1,7

42,06±2,4*

CD3+\CD4+\CD8+

0-3,2

2,8±0,4

1,8±0,6

2,5±0,9

CD3+\HLA-DR+

3,6-25,9

6,9±0,6

3,93±0,6

8,00±1,7*

CD3–\CD16+\CD56+

6,7-33,5

14,4±0,6

10,47±1,0

17,6±2,9*

CD3+\ CD16+CD56+

3,1-8,1

6,6±0,4

1,11±0,1

6,29±0,9***

Отношение CD3+\CD4+ к CD3+\CD8+

0,6-3,0

1,3±0,04

1,49±0,1

1,11±0,1*

* - достоверность отличия группы беременных женщин с гестозом от группы здоровых беременных женщин p<0,05; *** - достоверность отличия группы беременных женщин с гестозом от группы здоровых беременных женщин p<0,001.

Таким образом, обнаруженное нами увеличение содержания цитотоксических лимфоцитов в периферической крови и очаги мононуклеарных инфильтратов с преобладанием лимфоцитов в ткани плаценты подтверждают данные литературы о развитии цитотоксического иммунного ответа у беременных с гестозом.

Гестоз сопровождается активацией эндотелиальных клеток сосудистого русла матери. Мы предположили, что снижение количества CD4+\CD8+ Т-лимфоцитов хелперов в периферической крови у беременных с гестозом по сравнению со здоровыми беременными может быть связано с повышением их способности к адгезии. Для проверки этой гипотезы мы оценивали функцию адгезии различных популяций мононуклеаров периферической крови небеременных и беременных женщин.

Рисунок 2. Количество лимфоцитов периферической крови женщин адгезировавших к эндотелиальным клеткам линии EA.Hy926. ** - p<0,01 (достоверность различий между показателем адгезии к интактному эндотелию и показателем адгезии к активированному TNF эндотелию); †† - p<0,01 (достоверность различий между группой здоровых небеременных и здоровых беременных женщин); - p<0,01 (достоверность различий между группой здоровых небеременных и беременных женщин с гестозом); - p<0,05 (достоверность различий между группой здоровых беременных и беременных женщин с гестозом).

Адгезия лимфоцитов (Рисунок 2) здоровых небеременных женщин к интактному и активированному TNF эндотелию была одинаковой. Адгезия лимфоцитов здоровых беременных к активированному TNF эндотелию превышала адгезию к интактному эндотелию в два раза, а у беременных с гестозом – в четыре раза. Количество адгезировавших лимфоцитов к интактному эндотелию у здоровых беременных и у беременных с гестозом была в 1,5 раза меньше, чем у здоровых небеременных женщин. Количество адгезировавших лимфоцитов к активированному TNF эндотелию у беременных с гестозом была в 2 раза больше, чем у здоровых небеременных и у здоровых беременных женщин. Оценка популяционного состава лимфоцитов (CD3+\CD4+, CD3+\CD8+, CD16+/CD56+), адгезировавших к интактному и активированному TNF эндотелию, у небеременных и беременных женщин показала незначительные различия в их составе.

Адгезия моноцитов (Рисунок 3) здоровых небеременных женщин к интактному и активированному TNF эндотелию также была одинаковой. Адгезия моноцитов здоровых беременных и беременных с гестозом к активированному TNF эндотелию превышала в два раза адгезию к интактному эндотелию. Количество адгезировавших моноцитов к интактному эндотелию у здоровых беременных была в 1,3 раза больше, а у беременных с гестозом была в 2 раза больше, чем у здоровых небеременных женщин. Количество адгезировавших моноцитов к активированному TNF эндотелию у здоровых беременных было в 2 раза больше, чем у здоровых небеременных женщин. Оценка популяционного состава моноцитов (CD14+\CD16–, CD14+\CD16+), адгезировавших к интактному и активированному TNF эндотелию, у небеременных и беременных женщин показала незначительные различия в их составе. При этом количество адгезировавших моноцитов к активированному TNF эндотелию у беременных женщин с гестозом была в 2 раза больше, чем у здоровых небеременных и в 1,3 раза больше, чем у здоровых беременных женщин.

Рисунок 3. Количество моноцитов периферической крови женщин адгезировавших к эндотелиальным клеткам линии EA.Hy926. * - p<0,05 (достоверность различий между показателем адгезии к интактному эндотелию и показателем адгезии к активированному TNF эндотелию); † - p<0,05 (достоверность различий между группой здоровых небеременных и здоровых беременных женщин); - p<0,05; - p<0,01 (достоверность различий между группой здоровых небеременных и беременных женщин с гестозом); ® - p<0,05 (достоверность различий между группой здоровых беременных и беременных женщин с гестозом).

Таким образом, у здоровых небеременных женщин лимфоциты и моноциты одинаково адгезируют к интактному и активированному эндотелию. Напротив, как лимфоциты, так  и моноциты здоровых беременных и беременных женщин с гестозом адгезируют к активированному эндотелию значительно интенсивнее. При этом, по сравнению с небеременными, адгезия лимфоцитов беременных к интактному эндотелию снижена, в то время как адгезия к активированному эндотелию при нормальной беременности увеличивается и носит еще более выраженный характер при гестозе. Адгезия моноцитов к интактному и активированному эндотелию увеличивается при нормальной беременности и еще более при гестозе.

Суммируя полученные нами данные необходимо отметить, что изменения в степени адгезии проанализированных нами популяций лимфоцитов и моноцитов не зависят от их фенотипической принадлежности к определенной популяции, но, возможно, определяются их функциональным состоянием и экспрессией адгезионных молекул. Снижение в периферической крови количества CD4+\CD8+ Т-лимфоцитов хелперов у беременных с гестозом по сравнению со здоровыми беременными не связано с повышением их способности к адгезии. Следует отметить, что значительное увеличение степени адгезии мононуклеаров женщин с гестозом по сравнению со здоровыми небеременными и беременными женщинами к активированному эндотелию может свидетельствовать об их изначально активированном состоянии и потенциально высокой экспрессии адгезионных молекул. При этом моноциты женщин с физиологическим течением беременности и беременных с гестозом, в отличие от лимфоцитов, также обладали повышенной адгезией к интактным эндотелиальным клеткам, что может указывать на определенную роль моноцитов в индукции эндотелиальной дисфункции. Таким образом, местная воспалительная реакция в ткани плаценты при гестозе, а также повышенное содержание в периферической крови беременных с гестозом цитотоксических лимфоцитов и повышенная функция адгезии лимфоцитов и моноцитов периферической крови к эндотелию позволяет рассматривать гестоз беременных как иммунопатологическое состояние.

Поглощение липидов моноцитами периферической крови и эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 из сыворотки крови женщин с физиологически протекающей беременностью и беременных с гестозом. Гестоз сопровождается нарушением обмена липидов и изменением функциональной активности моноцитов периферической крови и эндотелиальных клеток. Это определило необходимость изучения влияния сывороток крови беременных на интенсивность поглощения липидов моноцитами периферической крови и эндотелиальными клетками.

Мы установили, что значения атерогенного индекса, концентраций триглицеридов, ЛПВП, ЛПНП, ЛПНОП, холестерина в сыворотках крови беременных с гестозом, не отличались от таковых в сыворотках здоровых беременных и здоровых небеременных женщин. Вместе с тем, поглощение липидов моноцитами/макрофагами периферической крови из аутологичной сыворотки, полученных от беременных с гестозом было выше, чем поглощение липидов моноцитами/макрофагами периферической крови из аутологичной сыворотки, полученных от здоровых беременных и небеременных женщин (Таблица 8). Поглощение липидов из эмбриональной телячьей сыворотки моноцитами\макрофагами периферической крови у здоровых беременных и у беременных с гестозом было одинаковым.

Таблица 8. Поглощение липидов моноцитами периферической крови.

Группы женщин

Средняя площадь (%) липидных включений при культивировании моноцитов периферической крови в присутствии культуральной среды (500 мкл) с добавлением 500 мкл:

Средняя разница между контролем и опытом, %

эмбриональной телячьей сыворотки (контроль)

аутологичной сыворотки крови (опыт)

Доноры (n=20)

14,61±1,97

17,1±2,66

2,49±1,07

с физиологически протекающей беременностью (n=20)

17,52±1,51

19,36±1,58

1,84±0,48

беременные с гестозом (n=20)

19,78±1,58

32,6±1,74‡‡‡

12,85±1,3***‡‡‡

Достоверность различий между группами: *** - p<0,001 - группа женщин с физиологически протекающей беременностью отличается от группы беременных женщин с гестозом; ‡‡‡ - p<0,001 - группа здоровых небеременных женщин отличается от группы беременных женщин с гестозом; - p<0,001 - достоверность отличия культивирования в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки от культивирования в присутствии аутологичной сыворотки крови.

Поглощение липидов эндотелиальными клетками из сыворотки крови беременных с гестозом (площадь экспрессии 6,35%±0,55% (n=30)) была выше, чем из сыворотки крови здоровых беременных (площадь экспрессии 2,43%±0,28% (n=20), p<0,01), и здоровых небеременных женщин (2,7%±0,49% (n=10), p<0,01). Поглощение липидов эндотелиальными клетками из эмбриональной телячьей сыворотки было незначительным (0,68%±0,28% (n=20).

Таким образом, усиленное поглощение липидов из сывороток больных с гестозом вело к образованию пенистых клеток из эндотелиальных клеток и из моноцитов периферической крови. Сыворотки здоровых беременных не вызывали такого эффекта. Следует отметить, что мы не определяли содержание модифицированных и окисленных ЛПНП и ЛПОНП в составе липидной фракции сыворотки крови. Вместе с тем, результаты исследования можно объяснить повышенным содержанием в сыворотке крови беременных с гестозом модифицированных или окисленных ЛПНП или ЛПОНП, что ранее описано в литературе [Wang Y.P., 1991; Belo L, 2004]. Полученные нами данные также можно объяснить наличием в сыворотке крови беременных с гестозом факторов, способствующих поглощению липидов эндотелиальными клетками или моноцитами\макрофагами. Выявленное нами повышенное поглощение липидов эндотелиальными клетками и моноцитами\макрофагами может способствовать развитию дисфункции эндотелиальных клеток беременной женщины, что в конечном итоге может приводить к таким патологическим проявлениям гестоза, как отеки и гипертензия.

Суммируя полученные данные, необходимо отметить, что физиологическое развитие ткани плаценты контролируется сбалансированной системой клеточных взаимодействий, ангиогенных, антиангиогенных, апоптогенных, антиапоптогенных факторов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, а также растворимыми формами различных поверхностных рецепторов (Рисунок 4). Физиологическое течение беременности и успешное формирование ткани плаценты связано с подавлением цитотоксического иммунного ответа. Ведущую роль в этом подавлении приписывают экспрессии молекул локуса HLA-G клетками трофобласта [Rajagopalan S., 2006]. Однако существуют и другие защитные механизмы. Формирование структуры плаценты связано с активацией процессов ангиогенеза и апоптоза. В результате апоптотической гибели клеток плаценты в кровоток матери могут поступать антигены плода [Huppertz B., 2004]. Однако при физиологически протекающей беременности активации цитотоксических лимфоцитов не происходит. Вероятно, это связано с деятельностью плацентарных макрофагов, поглощающих апоптотический материал, что сопровождается усилением секреции этими клетками TGF и IL-10 [Duffield J.S., 2001]. Обнаруженное нами усиление секреции IL-10 тканью плаценты к третьему триместру физиологически протекающей беременности отражает усиление активности плацентарных макрофагов. Нами установлено, что в первом триместре беременности клетки плаценты секретируют большие количества TGF, что может компенсировать сниженную по сравнению с третьим триместром беременности продукцию IL-10 и IL-4 клетками плаценты. Нами показано, что к концу физиологически протекающей беременности происходит усиление продукции тканью плаценты IFN, TNF, IL-2, IL-5, активирующих цитотоксические клетки, при параллельном снижении продукции TGF. Обнаруженное нами усиление секреции IFN к третьему триместру физиологически протекающей беременности может быть связано с повышением активности NK-клеток к концу беременности. Следовательно, при физиологически протекающей беременности клетки трофобласта успешно справляются с подавлением цитотоксических эффектов лимфоцитов в условиях нарастания концентраций IFN и TNF и снижения концентрации TGF. На ранних этапах формирования плаценты ограничение активности цитотоксических клеток матери может обеспечиваться обнаруженным нами высоким уровнем экспрессии TRAIL клетками трофобласта.

Нами установлено, что в динамике от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности в ткани плаценты сохраняется преимущественная продукция ангиогенных факторов. От первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности снижалась секреция как ангиогенных факторов, так и антиангиогенных факторов и экспрессия их рецепторов. Вместе с тем происходило усиление секреции ангиогенина, который может поддерживать жизнеспособность клеток плаценты в конце беременности в условиях снижения секреции других ангиогенных факторов, а также подавляет пролиферацию активированных лимфоцитов [Matousek J., 1995]. Роль ограничителей ангиогенеза при физиологически протекающей беременности выполняют sVEGF-R1, TGF, TSP-1, продукция которых снижалась от первого триместра к третьему. Экспрессия клетками плаценты TGF-R1, CD105, TRAIL и секреции sFasL также снижалась от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности. Снижение экспрессии проангиогенных, антиангиогенных, проапоптогенных и антиапоптогенных факторов в ткани плаценты свидетельствует о стабилизации структуры плаценты в третьем триместре. Однако при помощи TUNEL-метода нам удалось показать одинаковую выраженность процессов апоптоза как в первом, так и в третьем триместре физиологически протекающей беременности. При этом локализация апоптоза была различной. На ранних этапах развития плаценты апоптотической гибели подвергаются преимущественно клетки инвазивного трофобласта, что подтверждает активную перестройку ткани плаценты. Экспрессия Fas (CD95) на ранних этапах развития плаценты в синцитиотрофобласте и в цитотрофобласте также свидетельствует об активной перестройке трофобласта при его инвазии в эндометрий. Защите от избыточных апоптотических сигналов на ранних этапах формирования плаценты способствует экспрессия клетками плаценты Mcl-1. При доношенной беременности локализация апоптоза выражена преимущественно в синцитиотробласте ворсин, что может свидетельствовать об усилении активности цитотоксических клеток матери в условиях снижения экспрессии клетками плаценты ангиогенных факторов. Экспрессия Fas (CD95) на поздних сроках беременности в синцитиотрофобласте и в строме ворсин способствует стабилизации структуры плаценты.

Физиологическое развитие ткани плаценты протекает на фоне продукции IFN при участии NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов матери. Нами показано, что на протяжении физиологически протекающей беременности клетки плаценты ингибируют цитотоксическую активность лимфоцитов матери за счет экспрессии TRAIL, FasL, секреции TGF, IL-4, IL-10. Параллельно клетки плаценты создают зону маточно-плацентарного контакта, обеспечивающую достаточный уровень обмена веществ плода. Это достигается продукцией факторов, контролирующих ангиогенез и апоптоз, которые, действуя слаженно, обеспечивают рост ткани плаценты. Несмотря на выявленное нами снижение экспрессии и секреции клетками плаценты ангиогенных факторов к третьему триместру физиологически протекающей беременности усиления цитотоксических реакций и массовой апоптотической гибели клеток плаценты не происходит. Полученные нами данные позволяют предположить, что это связано с параллельным снижением экспрессии тканью плаценты как ангиогенных, так и апоптогенных и антиангиогенных факторов и объясняется необходимостью выполнения плацентой биологической функции поддержания жизнеспособности плода вплоть до родов. Вероятно, этот процесс контролируют плацентарные макрофаги, которые на ранних этапах физиологически протекающей беременности стимулируют продукцию клетками плаценты ангиогенных факторов, а в конце физиологически протекающей беременности тормозят ангиогенез за счет продукции TSP-1. Это подтверждается полученными нами данными: в третьем триместре TSP-1 экспрессирован в ткани плаценты диффузно и в особенности вокруг плодовых сосудов. За счет зафиксированного нами усиления продукции IL-10 тканью плаценты в конце беременности плацентарные макрофаги могут повышать жизнеспособность клеток трофобласта [Moreau P., 1999]. Поддержание жизнеспособности клеток плаценты также может обеспечивать ангиогенин, секреция которого, как установлено нами, повышается к концу физиологически протекающей беременности.

В третьем триместре беременности, осложненной гестозом, нами обнаружена высокая интенсивность апоптоза в клетках синцитиотрофобласта. Это может быть связано с нарушением механизмов, ответственных за подавление активности цитотоксических лимфоцитов матери. О реализации воспалительной реакции в ткани плаценты при гестозе свидетельствует обнаруженное нами наличие мононуклеарных инфильтратов. Документированное нами при гестозе по сравнению с физиологически протекающей беременностью повышение экспрессии тканью плаценты TGF, увеличение секреции тканью плаценты IL-6 и IL-8, сохранение уровня секреции IL-2, IL-5, IFN и TNF, также свидетельствуют о реализации воспалительной реакции. Повышение активности цитотоксических клеток матери, кроме того, может быть обусловлено снижением экспрессии клетками трофобласта молекул локуса HLA-G или продукции их секреторных вариантов [Goldman-Wohl D.S., 2000], снижением фагоцитарной активности плацентарных макрофагов [Voll R.E., 1997], нарушением толерантности в системе мать – плод [Visser N., 2007]. Важным патогенетическим фактором гестоза представляется выявленное нами нарушение секреции проангиогенных и антиангиогенных факторов в плаценте, приводящее к нарушению строения ткани плаценты, гипоксии, нарушению активности антиокислительной системы в ткани плаценты, продукции кислородных радикалов, повышению гибели клеток трофобласта. Это подтверждается обнаруженным нами при гестозе снижением экспрессии в ткани плаценты VEGF, bFGF, MMP-2 и рецептора VEGF-R3, сопровождающимся увеличением экспрессии антиангиогенных факторов TSP-1 и TGF и секреции sVEGF-R1. Увеличение экспрессии TSP-1 вокруг плодовых сосудов плаценты свидетельствует о вовлечении плацентарных макрофагов в воспалительный процесс в ткани плаценты при гестозе.

Нами обнаружено, что при гестозе в ткани плаценты запускаются некоторые компенсаторные механизмы защиты против цитотоксических эффектов лимфоцитов матери. Увеличение секреции PDGF и ангиогенина повышает жизнеспособность клеток плаценты в условиях сниженной секреции bFGF, VEGF, экспрессии VEGF-R3 и повышенной секреции sVEGF-R1. Снижение экспрессии TGF-R1 и CD105 обеспечивает снижение апоптогенных эффектов TGF в условиях его повышенной продукции. Повышение продукции TGF может обеспечивать снижение активности цитотоксических лимфоцитов матери. Интенсивная экспрессия рецептора TRAIL клетками трофобласта при одновременном слущивании рецепторов Fas и FasL обеспечивает снижение значимости Fas-FasL взаимодействий в индукции апоптоза и является основным механизмом подавления цитотоксических лимфоцитов при гестозе.

Рисунок 4. Иммунологические механизмы контроля физиологического развития плаценты.

Рисунок 5. Иммунопатогенетические механизмы развития гестоза.

Перечисленные механизмы защиты против цитотоксических эффектов лимфоцитов матери действуют и на начальных этапах развития плаценты, что указывает на сходство молекулярных механизмов при реализации защиты ткани плаценты в норме и при патологии. Однако необходимо отметить, что запуск указанных компенсаторных механизмов при гестозе может иметь отрицательное значение для формирования ткани плаценты в условиях нарушенного равновесия между факторами, контролирующими ангиогенез и апоптоз. Так TGF обладает ингибирующим действием в отношении цитотоксических лимфоцитов, но также обладает мощным антиангиогенным действием, что в условиях обнаруженной нами повышенной экспрессии TSP-1 может приводить к нарушению формирования ткани плаценты и последующей гипоксии. Выявленная нами повышенная продукция в ткани плаценты ангиогенина и PDGF может нарушать формирование ткани плаценты при гестозе, например, за счет переключения стратегии развития сосудистого русла от неразветвляющего к разветвляющему ангиогенезу или за счет индукции пролиферации эндотелиальных клеток в уже сформированных структурах плаценты. При этом снижение экспрессии клетками плаценты Fas, обнаруженное нами при гестозе, способствует нарушению контроля формирования новых сосудов. Эти предположения подтверждаются продемонстрированными нами нарушениями в строении ткани плаценты при гестозе.

Результатом активации цитотоксических клеток матери и воспалительной реакции в плаценте, продукции провоспалительных цитокинов, активных радикалов кислорода вследствие нарушения активности антиокислительной системы может стать активация лейкоцитов, проходящих через зону маточно-плацентарного кровообращения [Mellembakken J.R., 2002]. Параллельно развивается системная эндотелиальная дисфункция, сопровождающая гестоз. Об активации лейкоцитов свидетельствуют полученные нами данные об увеличении адгезионной активности мононуклеаров периферической крови при одновременном сдвиге в сторону повышенного содержания цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров и NKT-клеток у беременных женщин с гестозом по сравнению со здоровыми беременными и здоровыми небеременными женщинами. Это позволяет рассматривать гестоз как иммунопатологическое состояние беременных, связанное с развитием хронического очага воспаления в плаценте. Повышение продукции активных радикалов кислорода в зоне маточно-плацентарного кровообращения может способствовать перекисному окислению липидов и их накоплению в сыворотке крови, что также может способствовать возникновению эндотелиальной дисфункции. В пользу этого свидетельствуют полученные нами данные об усиленном поглощении липидов эндотелиальными клетками и моноцитами\макрофагами при гестозе. Повышение концентрации sICAM-1 в сыворотке крови при гестозе тоже косвенно свидетельствует об активации эндотелиальных клеток сосудистого русла и об активированном состоянии лейкоцитов матери.

Таким образом, при гестозе происходит нарушение сбалансированной системы взаимодействий ткани плаценты и иммунной системы матери (Рисунок 5), что приводит к изменению цитокинового баланса в плаценте, сопровождающемуся нарушением строения плаценты, усиленной гибелью клеток трофобласта и эндотелиальных клеток сосудов плаценты, активацией лейкоцитов и эндотелиальных клеток организма матери. Нарушения механизмов антиоксидантной защиты и активация клеток иммунной системы матери обусловливает активацию эндотелиальных клеток кровеносного русла матери, что ведет к клиническим проявлениям гестоза.

Выводы.

1. Формирование ткани плаценты и развитие ее сосудистой сети при физиологически протекающей беременности контролируется иммунологическими факторами. В динамике от первого к третьему триместру повышается секреция клетками плаценты одних цитокинов (IFN), снижается секреция других цитокинов (IL-6, IL-8), снижается экспрессия не только проангиогенных факторов (VEGF, bFGF, PDGF, MMP-2, VEGF-R3), но и антиангиогенных факторов (TGF, TSP-1) и рецепторов (TGF-R1, CD105). Изменения локализации факторов, контролирующих процессы ангиогенеза в ткани плаценты, отражают физиологическую динамику ее развития.

2. Снижение экспрессии в клетках плаценты от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности проапоптогенных факторов (каспазы-2, каспазы-8, каспазы-9) и антиапоптогенного фактора Mcl-1 при одновременном повышении секреции ряда цитокинов (IL-4, IL-10) не сказывается на интенсивности процессов апоптоза в ткани плаценты. Для физиологической динамики развития ткани плаценты характерны изменения локализации апоптоза.

3. Подавление цитотоксических эффектов лимфоцитов матери при физиологически развивающейся беременности можно связать с изменениями экспрессии поверхностных рецепторов (FasL и TRAIL) и секреции их растворимых форм (sFasL) клетками плаценты.

4. При гестозе нарушение формирования ткани плаценты сопровождается усилением продукции антиангиогенных факторов (TGF, TSP-1, sVEGF-R1) и снижением экспрессии проангиогенных факторов (VEGF, bFGF, MMP-2, VEGF-R3), что ведет к нарушению физиологических процессов ангиогенеза.

5. При гестозе по сравнению с физиологически протекающей беременностью в третьем триместре в ткани плаценты наблюдается усиление секреции провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8) при  сохранении уровней секреции противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10), что свидетельствует в пользу развития процесса воспаления.

6. В третьем триместре при гестозе, как и в первом триместре физиологически протекающей беременности, реализуются сходные молекулярные механизмы поддержания жизнеспособности клеток плаценты и их защиты от цитотоксических эффектов лимфоцитов матери. К таким механизмам относятся: повышение продукции проангиогенных факторов (ангиогенина, PDGF), экспрессии TGF и рецептора TRAIL, увеличение секреции растворимых форм поверхностных рецепторов (sFas, sFasL), снижение экспрессии рецепторов (Fas, FasL, TGF-R1, CD105).

7. Местные иммунологические сдвиги в ткани плаценты при гестозе сопровождаются увеличением содержания в периферической крови активированных лимфоцитов (CD3+\HLA-DR+), цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+, NK-клеток, NKT-клеток) при одновременном снижении содержания субпопуляции хелперов (CD3+CD4+), что свидетельствует о развитии клеточного цитотоксического иммунного ответа.

8. При гестозе моноциты периферической крови отличаются от моноцитов здоровых беременных женщин способностью к усиленной адгезии как к интактному, так и к активированному эндотелию. У лимфоцитов периферической крови беременных женщин с гестозом усилена адгезия к активированному эндотелию. Это свидетельствует о повышении функциональной активности мононуклеаров периферической крови при гестозе.

9. Сыворотка периферической крови беременных с гестозом содержит факторы, усиливающие интенсивность поглощения липидов эндотелиальными клетками и моноцитами периферической крови, и способствующие системному нарушению функций эндотелиальных клеток кровеносных сосудов.

10. Для гестоза характерны нарушения механизмов взаимного контроля функций клеток иммунной системы матери и клеток плаценты, изменения равновесия факторов, регулирующих процессы ангиогенеза и апоптоза, участвующих в формировании плаценты.

Практические рекомендации.

  1. С целью уточнения степени риска развития гестоза у женщин в первом, втором и третьем триместрах беременности следует определять в периферической крови содержание sICAM-1, повышение концентрации которого является ранним прогностическим признаком гестоза.
  2. У беременных женщин с целью уточнения степени риска развития гестоза рекомендуется проводить оценку интенсивности поглощения липидов из аутологичной сыворотки крови моноцитами периферической крови. Повышение интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови является ранним прогностическим признаком гестоза.
  3. С целью выявления нарушений формирования плаценты рекомендуется наряду с морфологическим исследованием плаценты проводить иммуногистохимическое определение уровня экспрессии ангиогенных факторов VEGF, bFGF, MMP-2, VEGF-R3 и антиангиогенных факторов TSP-1, TGFb.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Глава в учебнике для ВУЗ`ов:

  1. Соколов Д.И., Сельков С.А., Полякова В.О., Полянин А.А., Лапина Е.А., Колобов А.В., Пальцев М.А., Кветной И.М. Нейроиммуноэндокринология плаценты. // Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство по нейроиммуноэндокринологии. 2-е изд., учебник для ВУЗ`ов. –М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2008. -с.417-442.

Статьи:

  1. Фрейдлин И.С., Соколов Д.И. Кооперативные эффекты цитокинов. // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сб. трудов. -Т.1: Москва, ВИНИТИ РАН. -2001. -с.311-324
  2. Д.И. Соколов, А.В. Селютин, С.А. Сельков. Методы оценки пролиферации эндотелиальных клеток. // Лабораторная диагностика. -2006. -Том 1. -№9. -с.15-18.
  3. Соколов Д.И. Васкулогенез и ангиогенез в развитии плаценты. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2007. –Том.LVI. -№3. –с.129-133.
  4. Соколов Д.И., Селютин А.В., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови беременных женщин с гестозом. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2007. –Том.LVI. -№4. –с.17-23.
  5. Соколов Д.И., Старикова Э.А., Селютин А.В., Сельков С.А., Фрейдлин И.С. Оценка функции адгезии различных субпопуляций мононуклеаров периферической крови человека к эндотелиальным клеткам. // Медицинская иммунология. -2007. -№4-5. –с.473-478.
  6. Соколов Д.И. Иммунологические механизмы контроля апоптоза при развитии плаценты. // Медицинская иммунология. -2008. –Т.10. - №2-3. –с.125-138.
  7. Соколов Д.И., Колобов А.В., Лесничия М.В., Костючек И.Н., Боля К.В., Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А. Роль проангиогенных и антиангиогенных факторов в развитии плаценты. // Медицинская иммунология. -2008. –Т.10. - №4-5. –с.347-352.
  8. Соколов Д.И., Колобов А.В., Печерина Л.В., Крамарева Н.Л., Мозговая Е.В., Кветной И.М., Сельков С.А. Экспрессия VEGF и рецептора VEGF-R3 эндотелиальными клетками плаценты в норме и при гестозе. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. –Т.145. -№ 3. –с.321-325.
  9. Соколов Д.И., Лесничия М.В., Селютин А.В., Климова В.А., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Оценка функции адгезии к эндотелиальным клеткам различных субпопуляций мононуклеаров периферической крови беременных женщин в норме и при гестозе. // Регионарное кровообращение. -2008. -№9. –с.34-41.
  10. Соколов Д.И., Колобов А.В., Лесничия М.В., Боля К.В., Селютин А.В., Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А., Айламазян Э.К.. Продукция тканью плаценты проангиогенных и антиангиогенных факторов. // Молекулярная медицина. -2009. –№2. –с.49-53.
  11. Соколов Д.И., Лесничия М.В., Селютин А.В., Климова В.А., Аржанова О Н., Сельков С.А. Роль цитокинов в контроле развития плаценты в норме и при гестозе. // Иммунология. -2009. -№1. –с.22-27.
  12. Айламазян Э.К., Соколов Д.И., Сельков С.А. Гестоз и атеросклероз: общность патогенетических механизмов. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2009. –Том.LVIII. -№1. –с.4-16.
  13. Соколов Д.И., Лесничия М.В., Аминова Э.А., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Оценка концентрации sICAM-1 в сыворотке крови беременных и продукции sICAM-1 тканью плаценты. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2009. –Том.LVIII. -№1. –с.44-49.
  14. Соколов Д.И., Лесничия М.В., Мирашвили М.И., Львова Т.Ю, Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А. Оценка интенсивности поглощения липидов сыворотки крови беременных эндотелиальными клетками. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2009. –Том.LVIII. -№2. –с.57-64.

Тезисы докладов:

  1. Соколов Д.И., Колобов А.В., Печерина Л.В., Крамарева Н.Л., Мозговая Е.В., Кветной И.М., Сельков С.А. Экспрессия VEGF-R3 эндотелиальными клетками плаценты в норме и при гестозе. // Медицинская иммунология. -2006. –Том 8, №2-3. с.320-321.
  2. Колобов А.В., Соколов Д.И., Печерина Л.В., Крамарева Н.Л., Мозговая Е.В., Кветной И.М., Сельков С.А Морфологические и иммуногистохимические особенности клеток плаценты при гестозе. // Сборник материалов I съезда патологоанатомов Республики Беларусь. – 2006. -с.33-34.
  3. Соколов Д.И., Колобов А.В., Кветной И.М., Сельков С.А. Экспрессия VEGF-R3 эндотелиальными клетками линии EA.Hy926. // Цитология. - 2006. Vol. 48, с.799-800.
  4. Соколов Д.И., Колобов А.В., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А. Экспрессия проангиогенных и антиангиогенных факторов в плаценте. // Медицинская иммунология. -2007. –Том.9 -№.2-3. –с.262-263.
  5. Колобов А.В., Соколов Д.И., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А. Экспрессия антиангиогенных факторов в плаценте. // Сборник конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», г.Санкт-Петербург, СПб МАПО, 2007. -с.297.
  6. Колобов А.В., Соколов Д.И., Лесничия М.В., Крамарева Н.Л., Мозговая Е.В., Кветной И.М., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Роль TGF-R1 в процессах ангиогенеза плаценты в норме и при гестозе. // Сборник конференции «Материалы первого регионального научного форума «Мать и дитя». -2007. -с.74.
  7. Соколов Д.И., Селютин А.В., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови беременных женщин с гестозом. // Сборник конференции «Материалы первого регионального научного форума «Мать и дитя». -2007. -с.80.
  8. Соколов Д.И., Селютин А.В., Старикова Э.А., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Метод оценки адгезии субпопуляций мононуклеаров периферической крови к эндотелиальным клеткам. // Медицинская иммунология. -2007. –Том.9 -№.2-3. –С.161-162.
  9. Sokolov D.I., Kolobov A.V., Lesnichiya M.V., Kvetnoy I.M., Arzhanova O.N., Selkov S.A. Expression factors of angiogenesis in the placenta. // Virchows Archiv. -2007. –Vol.451. -№2. –P.385.
  10. Соколов Д.И., Колобов А.В., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А., Кветной И.М. Метод оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальными клетками. // Сборник конференции «Современные проблемы клинической цитоморфологии», СПб МАПО. -Санкт-Петербург. -2007. -с.103-104.
  11. Мирашвили М.И., Соколов Д.И., Лесничия М.В., Колобов А.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Оценка интенсивности поглощения липидов эндотелиальными клетками. // Сборник тезисов 2-го регионального научного форума «Мать и дитя», Сочи. -2008. –с.55-56
  12. Лесничия М.В., Соколов Д.И., Мирашвили М.И., Аминова Э.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А. Оценка концентрации sICAM-1 в сыворотке крови беременных и продукции sICAM-1 тканью плаценты. // Сборник тезисов 2-го регионального научного форума «Мать и дитя», Сочи. -2008. –с.51.
  13. Соколов Д.И., Колобов А.В., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А. Выраженность процессов ангиогенеза и апоптоза на разных этапах развития плаценты. // Российский иммунологический журнал. -2008. – Т.2. -№2-3. –С.296.
  14. Соколов Д.И., Колобов А.В., Лесничия М.В., Боля К.В., Селютин А.В., Аржанова О.Н., Кветной И.М., Сельков С.А. Экспрессия цитокинов тканью плаценты в норме и при гестозе. // Сборник тезисов 2-го регионального научного форума «Мать и дитя», Сочи. -2008. –с.85.

Список сокращений:

ЛПНП – липопротеины низкой плотности

ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности

bFGF – основный фактор роста фибробластов

Fas – рецептор суперсемейства TNF

FasL – лиганд для рецептора Fas

ICAM-1 –молекула межклеточной адгезии-1

IFN – интерферон

IL – интерлейкин

IP-10 - интерферон-индуцибельный белок

MCP-1 –моноцитарный хемотактический протеин-1

MIG – монокин, индуцируемый гамма-интерфероном

MMP – металлопротеиназа матрикса

NK-клетки – натуральные киллеры

PDGF - тромбоцитарный ростовой фактор

RANTES –фактор, секретирующийся T-лимфоцитами после активации

sFas – секреторный вариант рецептора Fas

sFasL – секреторный вариант рецептора FasL

sICAM-1 – секреторный вариант рецептора ICAM-1

sVE-cadherin – секреторный вариант рецептора VE-cadherin

sVEGF-R1 – секреторный вариант рецептора VEGF-R1

TGF - трансформирующий ростовой фактор-

TNF – фактор некроза опухолей-

TRAIL – TNF-подобный лиганд, индуцирующий апоптоз

TSP-1 - тромбоспондин-1

VE-cadherin –кадгерин эндотелия сосудов

VEGF – фактор роста эндотелия сосудов

VEGF-R – рецептор фактора роста эндотелия сосудов




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.