WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ХАЛДОЯНИДИ София Константиновна

РОЛЬ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ В РЕГУЛЯЦИИ ИММУНО- И МИЕЛОПОЭЗА

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск – 2011

Работа выполнена в лаборатории стволовых клеток и регенеративной медицины (руководитель лаборатории к.м.н. С. К. Халдояниди) Торрей Паинс Института Молекулярных Исследований (Сан-Диего, США) и Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ирина Анатольевна Орловская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Валерий Степанович Ширинский доктор медицинских наук, профессор Анна Вениаминовна Шурлыгина доктор медицинских наук, профессор Иван Генрихович Козлов Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН.

Защита состоится 15 сентября 2011 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 Института клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099 г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Высокая значимость проблемы гемопоэтической стволовой клетки (ГСК) для биологии и медицины определяется ее иерархическим положением в клеточной дифференцировке, дающей начало пулу жизненно важных популяций клеток периферической крови - лимфоцитам (естественным киллерам, Т- и В-клеткам), мононуклеарным фагоцитам (моноцитам и макрофагам), дендритным клеткам, гранулоцитам (нейтрофилам, базофилам и эозинофилам), тучным клеткам, тромбоцитам и эритроцитам, формируемым через дочерние клетки-предшественники - миелоидные и лимфоидные предшественники. Проблема регуляции иммунологической реактивности – ключевая в теоретической и практической иммунологии – не может быть полностью решена без знания механизмов регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и миграции ГСК, которые постоянно пополняют пул иммунных клеток в процессе жизнедеятельности организма [Козлов В.А. и др., 1982; Essers et al., 2009; Sato et al., 2009; Massberg et al., 2007; Martijn et al, 2005].

Вовлечение ГСК в процесс иммуногенеза иллюстрируется данными 6070-х годов об усилении пролиферативной активности (а также повышении миграции ГСК из костного мозга в селезенку) при антигеном воздействии любого характера: растворимые и корпускулярные антигены, опухолевые и трансплантационные антигены [Козлов В.А. и др., 1982; Feher, Antal et al., 1974].

Регуляцию пролиферации, дифференцировки и самоподдержания ГСК в костном мозге осуществляет гемопоэтическое микроокружение (ниша ГСК), концепция которой была сформулирован три десятилетия назад [Schofield, 1983].

Однако стратегии, используемые в настоящее время в клинике для стимуляции супрессированного химиотерапией или облучением гемопоэза, не рассматривают гемопоэтическую нишу как мишень для терапевтических воздействий. Этот недостаток обьясняется тем, что фундаментальные молекулярные механизмы, регулирующие функционирование ниши, изучены недостаточно и, следовательно, не могут быть использованы для разработки новых стратегий.

Cегодня признанно, что клеточный состав гемопоэтической ниши гетерогенен и представлен популяциями клеток гемопоэтического (макрофаги, лимфоциты, остеокласты и т.д.) и мезенхимального (стромальные клетки, остеобласты, адипоциты и т.д.) происхождения [Bianco and Gehron Robey 2000; Minguell, Conget et al., 2000]. Внеклеточный компартмент ниши состоит из свободных и ассоциированных с клеточной поверхностью ростовых факторов, адгезивных молекул, а также молекул внеклеточного матрикса, продуцируемых клетками ниши [Gupta, Oegema et al., 1998]; [Chabannon, Torok-Storb, 1992; Klein, 1995;

Verfaillie, 1998]. Важным компонентом внеклеточного матрикса в костном мозге являются гликозаминогликаны, одной из важнейших функций которых является связывание ростовых факторов и поддержание их локальной концентрации в микроокружении ГСК. Основным небелковым гликозаминогликановым компонентом внеклеточного матрикса (ВКM) в костном мозге является гиалуроновая кислота (ГК) [Siczkowski, Andrew et al., 1993], которая представляет собой одно цепочечную молекулу, состоящюю из повторяющихся дисахаридных комплексов глюкуроновой кислоты и N-ацетиглюкозамина [Linker, Mayer, 1954]. Первоначально считалось, что ГК выполняет роль структурного организатора внеклеточного пространства, связывая соли и воду. Более поздние исследования продемонстрировали, что гиалуроновая кислота является активным компонентом ВКM, взаимодействуя со множеством внеклеточных молекул [Fraser, Laurent et al. 1997]. Идентификация рецепторов, связывающих гиалуроновую кислоту, продемонстрировала ее вовлечение в специфические взаимодействия между лигандом и рецептором, определяющие функции гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток, такие как пролиферация [Brecht, Mayer et al., 1986; Hamann, Dowling et al., 1995], миграция [Andreutti, Geinoz et al., 1999], продукция цитокинов [Noble, Lake et al., 1993; Hodge-Dufour, Noble et al., 1997; Khaldoyanidi, Moll et al., 1999] и экспрессия молекул адгезии [Oertli, Beck-Schimmer et al., 1998].

Тем не менее в опубликованных работах наблюдаются противоречивые результаты, что, по-видимому, связано с использованием ГК различной молекулярной массы.

Гиалуроновая кислота является нестабильной молекулой. В нормальных условиях ГК деградируется специфическим энзимом гиалуронидазой. Деградацию гиалуроновой кислоты, или нарушение ее синтеза и аккумуляции могут вызывать и другие факторы, такие как ультрафиолетовое облучение [Schmut, Ansari et al., 1994; Koshiishi, Horikoshi et al., 1999], 5-флуороурацил [Young, Hehn et al., 1994], гидрокортизон и др. [Yaron, Yaron et al., 1977]. Обнаружено, что в условиях тотального облучения организма происходит снижение уровня гликозаминогликанов, включая гиалуроновую кислоту, в селезенке и костном мозге [Noordegraaf, Erkens-Versluis et al., 1981]. Показано, что в процессе облучения гиалуроновая кислота подвергается химической деградации и деполимеризации [Rehakova, Bakos et al.,1994], степень которой зависит от дозы облучения. Облучение нарушает трехмерную структуру полимера, индуцируя фрагментацию ГК цепи [Srinivas, Ramamurthi, 2007]. В то же время облучение не влияет на синтез гиалуроновой кислоты [Matsumoto, Iwasaki et al., 1994; Pye, Kumar et al., 1994].

В настоящее время остается неисследованной роль гиалуроновой кислоты в регуляции гемопоэтического микроокружения (ниши). Индуцированное химиотерапией или облучением снижение концентрации гиалуроновой кислоты в костном мозге может нарушить гомеостаз в системе гемопоэза и усугубить состояние гипоплазии и панцитопении. Это положение определило цель и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, цель исследования заключалась в выявлении молекулярно-клеточных механизмов, опосредующих участие гиалуроновой кислоты в регуляции функциональной активности гемопоэтических стволовых клеток и гемопоэтического микроокружения (ниши).

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить экспрессию ГК полимеров, ГК синтетаз и ГК рецепторов в клетках костного мозга.

2. Исследовать зависимость лимфо- и миелопоэтической активности от уровня гиалуроновой кислоты в костном мозге.

3. Изучить молекулярные механизмы, опосредующие эффекты гиалуроновой кислоты на лимфо- и миелопоэз.

4. Выяснить влияние гиалуроновой кислоты на миграцию гемопоэтических клеток.

5. Изучить влияние экзогенной гиалуроновой кислоты на восстановление супрессированного химиотерапией и облучением гемопоэза.

6. Охарактеризовать роль гиалуроновой кислоты в процессе дифференцировки эмбриональной стволовой клетки (ЭСК) в гемопоэтические клетки.

Научная новизна:

Впервые показано, что для поддержания активного костномозгового гемопоэза необходимо присутствие гиалуроновой кислоты, синтетаз, продуцирующих гиалуроновую кислоту (HAS), и рецептора CD44, опосредующего эффекты гиалуроновой кислоты на лимфо- и миелопоэз.

Получены новые данные о молекулярных механизмах, доказывающих важную роль гиалуроновой кислоты как компонента гемопоэтического микроокружения, вовлеченного в регуляцию гемопоэтического гомеостаза: показана способность гиалуроновой кислоты регулировать 1) продукцию цитокинов, стимулирующих пролиферацию ГСК и коммитированных предшественников: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-12, Г-КСФ, IGFBP-3 и LIX; 2) экспрессию поверхностных молекул (VCAM-1), обуславливающих адгезию гемопоэтических стволовых клеток и их удержание в нише. Впервые показано, что регуляторные эффекты гиалуроновой кислоты в гемопоэтической нише зависят от молекулярной массы ГК полимеров: стимулирующим эффектом обладают полимеры гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой, в то время как полимеры с низкой молекулярной массой не эффективны.

Впервые получены данные о стимулирующем эффекте гиалуроновой кислоты на супрессированный облучением или химиотерапией костномозговой гемопоэз: внутривенное введение экзогенной гиалуроновой кислоты приводит к ускорению восстановления численности клеток в костном мозге и периферической крови у животных.

Получены новые данные, доказывающие регуляторную роль гиалуроновой кислоты в процессах миграции ГСК: показано, что гиалуроновая кислота стимулирует рекрутирование ГСК и удержание их в костномозговой нише посредством усиления продукции хемокинов и экспрессии молекул адгезии. Обнаружено, что после введения гиалуроновой кислоты наблюдается временное повышение числа зрелых клеточных элементов в периферической крови: гиалуроновая кислота усиливает мобилизацию из костного мозга зрелых клеток, но не их предшественников.

Показана важная роль ГК как аутокринного регуляторного агента, определяющего дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в направлении гемопоэтической линии.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Представленная работа расширяет представления о структуре гемопоэтического микроокружения (ниши ГСК) и впервые демонстрирует регуляторную роль гиалуроновой кислоты как важного компонента ниши ГСК. На моделях in vitro продемонстрированы регуляторные эффекты гиалуроновой кислоты в отношении продукции цитокинов и экспрессии молекул адгезии. На моделях in vivo показана роль гиалуроновой кислоты в регенерации ниши и восстановлении супрессированного гемопоэза. В совокупности, полученные в работе результаты представляют собой крупное научное достижение в исследовании гемопоэтического микроокружения, формирующее взгляд на роль гемопоэтической ниши как мишени для терапевтического воздействия в процессе регенерации иммуно- и миелопоэза и теоретически обосновывают регуляторную роль гиалуроновой кислоты в этом процессе, эффекты которой определяются балансом ростовых факторов и адгезивных молекул в нише.

Полученные результаты представляют собой основу для дальнейшего изучения ГК как потенциального терапевтического средства. Использование ГК в клинической гематологии позволяет сократить период костномозговой гипоплазии и панцитопении и может сочетаться с применением ростовых факторов (цитокинов) после химио- или радиотерапии, в том числе в сочетании с трансплантацией ГСК.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гиалуроновая кислота является элементом гемопоэтического микроокружения, регулирующим продукцию цитокинов и экспрессию адгезивных молекул в клетках костного мозга путем активации CD44.

2. Гиалуроновая кислота регулирует рекрутирование ГСК, но не их мобилизацию.

3. Гиалуроновая кислота необходима для дифференцировки ЭСК в мезодермальном направлении и генерирования гемопоэтических клеток.

Личный вклад автора в проведение исследования.

Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация материалов диссертации.

Результаты работы обсуждены на семинарах, в т.ч. Stem Cell Consortium, 2003, Burnham Institute, La Jolla, California; Noble lecture tour with Dr. Gunter Blobel, Nobel Price Laureate, 2004, Beijing, Dalian, Nanjin and Shanghai, China; Jawaharlal Nehru University, December, 2005, Delhi, India; Результаты работы докладывались на международных конференциях, включая 2nd Annual Congress of International Drug Discover Science and Technology (IDDST), 2004, Beijing, China;

International Conference on Hyaluronan 2007, Charleston, USA; Stem Cell Symposium, Children’s Hospital Orange County, March 15th, 2007; American Academy of Allergy, Asthma and Immunology 56th Annual Meeting, San Diego, California, USA, 1999; 13th International Symposium on Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of Leukemia, Lymphoma & Cancer, New York, USA, 2000; International Symposium Recent Advances in Stem Cell Transplantation, San Diego, California, 2003; 32nd, 33rd, 35th и 37th Annual Meeting of the International Society for Experimental Hematology (Paris, France 2003; New Orleans, 2004; Minneapolis, 2006; Boston, 2008); и International Conference Hyaluronan 2010, Kyoto, Japan. Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании Проблемной комиссии МНС 56.08 «Иммунология» с участием сотрудников НИ Института клинической иммунологии СО РАМН 2 сентября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 41 работа, из них обзора и 22 статьи в изданиях, включенных в системы цитирования, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 7 таблицами. Список цитируемой литературы включает 275 источников, из них 7 работ отечественных авторов.

Работа выполнена в лаборатории стволовых клеток и регенеративной медицины (руководитель лаборатории к.м.н. С. К. Халдояниди) Торрей Паинс Института Молекулярных Исследований (Сан-Диего, США) и лаборатории иммунобиологии стволовой клетки (руководитель лаборатории д.м.н. И.А. Орловская) Института клинической иммунологии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Животные. Мыши-самки BALB/c, С56Bl/6 и NOD/SCID, полученные из Джексоновской Лаборатории (Bar Harbor, Maine, USA), и мыши (CBAxC57Bl/6)F1гибриды, полученные из лаборатории экспериментальных животных НИИКИ СО РАМН (г. Новосибирск). Животные поддерживались в стандартных лабораторных условиях.

Моделирование ксенотрантплантата человек/мышь. NOD/SCID содержались в стерильных условиях. Клетки человеческой карциномы прямой кишки (HCT-8; ATCC) имплантировались инъекциями 5 x 106 клеток под кожу. Рост опухоли в каждой мыши фиксировался ежедневным измерением размера опухоли. По достижении размера опухоли 5 5мм (6 день) мышей подвергали химиотерапии. Контрольные мыши (без химиотерапии) забивались по достижении размеров опухоли 10х10 мм.

Химиотерапевтический протокол. Мыши подвергались подкожной инъекции иринотекана и 5-флуороурацила (5ФУ) начиная с 7 дня после имплантации опухоли (50мг/кг/неделю каждого препарата с интервалом 24 часа). В процессе химиотерапии мыши получали в/в 3мг/кг ГК (Sigma) или физраствор (ФР).

Клеточные культуры и реагенты. Для культивирования долгосрочных культур клеток костного мозга (ДКККМ), ККМ (106/мл) помещались в среду Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMM) с добавлением 20%-ой лошадиной сыворотки и гидрокортизона (Stem Cell Technologies, Canada) и выращивались в 6-луночных планшетах при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. ДКККМ обрабатывались 300 мкМ 4-methylumbelliferone (4-MU) или 100мкг/мл ГК (Sigma).

Неприлипшие клетки извлекались из культуральной среды, количество гемопоэтических предшественников определялось методом колониеобразующих единиц (КОЕ).

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), линия WH09, культивировались на фидерном слое (человеческие фибробласты HS27). HS27 выращивались в среде DMEM с добавлением аминокислот, L-Glutamax и 10%-ой фетальной сыворотки (ФС) и подвергались облучению 40Gy. Человеческие ЭСК культивировались на фидерном слое в среде DMEM/F12 с добавлением 20%-ой замещающей knockout сыворотки (KSR), 10 мM аминокислот, 1 мM L-Glutamax, 10нг/мл h-bFGF и 0.1mM 2-mercaptoethanol (2-ME) (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Фидинг культур производился каждые два дня; культуры пассировались каждые 6 дней. Для индукции дифференцировки колонии ЭСК отделялись от фидерного слоя и культивировались в DMEM/F12 с добавлением 20% ФС, 10 мM аминокислот, 2 мM L-Glutamax и 0.1 мM 2-ME в виде суспензии кластерных сфероидов (эмбриоидные тельца, ЭТ). В ряде случаев культуры подвергались обработке гиалуронидазой (1Е/мл, Sigma и Seikagaku), 4MU (100 мкM, MP Biomedicals, Solon, OH,) или ГК (100 мк/мл, Sigma).

HCT-8 клетки (ATCC) культивировались как монослой в RPMI 1640 с добавлением 10 % ФС (Gibco). До имплантации в мышей линии NOD/SCID клетки тестировались на наличие микоплазмы (Mycoplasma T.C. Rapid Detection System (Gen-Probe, San Diego, CA).

Исследование колониеобразующей активности клеток (КОЕ). ККМ (2 104/мл) или мононуклеарные клетки, выделенные из крови (5 105/мл), смешивались с метилцеллюлозной средой, обогащенной 10% ФС, 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), L-глутамином, 5 10-4М 2-МЕ, 10 нг/мл ИЛ-3, нг/мл ИЛ-6, 50нг/мл фактора стволовых клеток, и 3Е/мл ЭПО (StemCell Technologies, Canada). Культуры инкубировались в 24-луночных планшетах во влажной среде с 5%-ым CO2 при температоре 37°C в течение 7-14 дней. Для исследования колониеобразования in vivo клетки трансплантировались летально облученным реципиентам. На 8-е сутки селезенки извлекались и фиксировались в жидкости Телесницкого, и колонии (КОЕс) посчитывались после нескольких часов фиксации.

Трансмиграция (хемотаксис). ККМ помещались в верхние лунки Transwells камеры, покрытые матригелем (Costar, размер пор 5 мкм, 106 клеток/лунку).

Нижние лунки содержали среду, 50 нг/мл SDF-1, контрольную кондиционную среду (КС) или КС, полученную из ДКККМ стимулированных ГК. Культуры инкубировалось в течение 4 часов в инкубаторе, после чего верхние компартменты были удалены, клетки, содержащиеся в нижних лунках, собирались, подсчитывались и исследовалась их колониеобразующая активность (КОЕ).

Проточная цитометрия (FACS). Экспрессия поверхностного CDопределялась при помощи антител HERMES-3 (для CD44s), VFF-8 (для CD44v5), VFF-18 (для CD44v6), VFF-9 (для CD44v7) и VFF-14 (для CD44v10) с последующим использованием вторичных FITC-конъюгированных антител.

Также использовались PE-конъюгированные CD45 и CD31-специфические моноклональные антитела и контрольные изотипические PEконъюгированные IgG (PharMingen, San Diego, CA). Окрашенные клетки отмывались FACS буфером (ФР, 2% ФС, 0.1 % БСА, 0.01 % NaN3).

Связывание ГК определялось при помощи FITC-конъюгированной ГК (Seikagaku, Япония). Для негативного контроля клетки, инкубированные с FITC-ГК, обрабатывались гиалуронидазой (Seikagaku, Япония).

Флуоресцентный анализ был выполнен на FACScan (Becton Dickinson) и анализиролся с использованием программы CellQuest.

Конфокальная микроскопия. Клетки фиксировались 4%-ым параформальдегидом и были пермебилизированы с Тритон-X100 в 0.1 % ФР. Fc рецепторы на моноцитах были заблокированы человеческой плазмой (1:100). После блокирования с 2%-ой ФС в течение 30 минут при 20 С, клетки инкубировались со специфическими антителами в течение 1 часа. Далее клетки окрашивались DAPI (Sigma) в течение 10 минут, отмывались в ФР, покрывались AntiFade (Molecular Probes) и исследовались на конфокальном микроскопе Olympus FV1000.

Экспрессия MMP-9 в нейтрофильных гранулоцитах. Нейтрофилы помещались на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином и обрабатывались 100 мкг/мл ГК или 50 нM C5a в течение 30 минут при 37 C. Клеточные супернатанты использовались для обнаружения MMP-9 при использовании метода ELISA, как ранее описано (DiScipio, Schraufstatter и др. 2006). Экспрессия внутриклеточных MMP-9 в нейтрофилах определялась методом конфокальной микроскопии при использовании очищенных кроличьих поликлональных анти-MMP-9 антител против каталитического домена MMP-9 New Zealand White rabbits (DiScipio, Schraufstatter и др. 2006) и анти-кроличьих Alexa-488-IgG (Invitrogen, Калифорния) в качестве детектирующих антител.

Зимограмма. Образцы бессывороточной КС, собранной с контрольных и обработанных ГК клеток, смешивались с Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) и наносились на гель, приготовленный для зимографии. После электрофореза гель промывали и помещали в активирующий буфер. MMP активность визуализировалась обесцвеченными участками геля, содержащего окрашенный Coomassie Blue желатин.

Иммуноблоттинг. Клетки лизировались буфером RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10% glycerol, 1% NP-40, 150 мM NaCl, 5 мM MgCl2, 2 мM EDTA, 0.2 мM PMSF, 2 мкг/мл leupeptin, 2 мкг/мл aprotinin, 2 мM sodium pyrophosphate, 2 мM sodium vanadate and 10 мM NaF), лизаты анализировались с помощью SDSPAGE, переносились на нитроцеллюлозные мембраны и инкубировались со спе цифическими антителами, которые детектировалось с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) антител хемилюминесцентным методом (ECL Plus, GE Lifesciences).

Иммуногистохимия. ЭТ помещались на покрытые матригелем стекла, культивировались в среде, стимулирующей дифференцировку: для индукции ЭСК дифференцировки ЭСК колонии отделялись от фидерного слоя и культивировались в DMEM/F12 с 20% FBS, 10mM аминокислот, 2 mM L-Glutamax и 0.1 mM 2-ME в суспензии как кластерные сфероиды (ЭТ). ЭТ фиксировались в 4%-ом параформальдегиде, пермебилизировались с 0.2% Triton-X100 и инкубировались с мышиными анти-OCT4, козьими анти-BMP2, кроличьими анти-FGF-5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), мышиными анти-SSEA1, мышиными антиFP и козьими анти-T-brachyury (R&D Systems). Вторичные анти-мышиные, кроличьи или козьи антитела, конъюгированные с Alexa-Fluor 568 (Invitrogen, Carlsbad, CA) или Alexa-Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (1:400), использовались для визуализации антигенов, и DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole) использовался для окрашивания ядра. ГК полимеры определялись при помощи биотинконъюгированного ГК-связывающего протеина (bHABP) и последующей инкубацией с PE-конъюгированным авидином (Sigma). Изображения исследовались на конфокальном микроскопе Olympus FV1000 и анализировались с использованием Open Lab программного обеспечения.

Экспрессия генов. Тотальная РНК была изолирована из клеток с использованием Qiagen RNA isolation kit, согласно рекомендациям изготовителя (Illumina, San Diego, CA). Наличие искомых генов регистрировалось, если интенсивность сигнала гибридизации в трех используемых образцах была обнаружена с достоверностью 99%.

RT-PCR. Применялся метод обратного транкрибирования РНК с использованием Omniscript Reverse Transcription kit (Qiagen). PCR анализ был выполнен с соответствующими праймерами, амплификация выполнялась 35 циклами, с использованием прямых и 1:10 разведенных cDNA образцов.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Иссеченные опухоли фиксировались в 4% параформальдегиде. Для гистологического исследования срезы опухолей были окрашены краской Giemsa. Для иммуногистохимии образцы инкубировались с FITC-конъюгированными CD44 и CD31специфическими антителами (BD Pharmingen, San Diego, CA). После инкубации (30 минут при +4 C) образцы отмывались и анализировались на конфокальном микроскопе. Экспрессия эндогенной ГК в опухолях определялась с помощью биотин-конъюгированного ГК-связанного белка (bHABP) и FITCконъюгированного авидина (Seikagaku, Япония).

Статистический анализ проводился с помощью пакета статистических программ Statistical Analysis System. t-критерий Стьюдента, множественный регрессионный анализ и дисперсионный анализ применялись для статистической обработки результатов. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения. Различия между группами считались достоверными при уровне значимости р<0,05. Обработку данных по выживаемости животных проводили с использованием критерия Каплан-Мейера.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Роль эндогенной ГК в регуляции гемопоэза Вовлечение ГК в регуляцию клеточных функций предполагает ее постоянный синтез, который осуществляется ГК синтетазами (hyaluronic acid synthase, HAS), интегрированными в клеточную мембрану [DeAngelis, Papaconstantinou et al., 1993]. Исследование показало, что в ККМ HAS2 экспрессируются в эндотелиальных клетках (клоны TrHBMEC и HBME, дорожки 1 и 2), в мезенхимальных стволовых клетках (MСК, дорожка 6), в остеобластах (дорожка 7) и стромальных клетках (линии M10B4, MS-5 и S-17, дорожки 3-5). Экспрессия HASбыла обнаружена в адгерентном слое ДКККМ (дорожка 8) и в клетках периферической крови (дорожка 9) (рис. 1А). Экспрессия HAS2 коррелировала с присутствием ГК на клеточной поверхности (рис. 1Б). Кроме того, ГК рецепторы (включая CD44s, TLR4 и RHAMM) экспрессируются в ККМ (рис. 1В). Таким образом, все элементы системы (HAS2, ГК полимеры, ГК рецепторы) присутствуют в костном мозге.

А Б 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 В TLRTLR4 RHAMM HA CDРисунок 1. Экспрессия HAS2 (А), ГК (Б) и ГК рецепторов (В) в клетках ко- стного мозга (n=3).

Таким образом, ГК является компонентом костномозгового внеклеточного матрикса. Чтобы исследовать значение эндогенной ГК в регуляции лимфо- и гемопоэза, уровень ГК в ДКККМ снижался двумя методами: 1) деградацией ГК с помощью специфического энзима гиалуронидазы; и 2) блокированием синтеза ГК с помощью ингибитора HAS4MU. Количество коммитированных предшественников (КОЕ) в культурах, обработанных гиалуронидазой, было снижено по сравнению с контролем в течение всего периода культивирования в метилцеллюлозных культурах (рис.

2Б). В то время как обработка гиалуронидазой не влияла на рост клеток гемопоэтического микроокружения в ДКККМ, в этих культурах наблюдалось существенное уменьшение количества гемопоэтических очагов и отсутствие «cobblestone areas» в адгерентном слое (рис. 2В).

1A * Контроль К B 1Г'аза * * 1 2 3 4 5 6 7 8 Фидинг (недели) Контроль Г’аза Б Г'аза * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 Фидинг (недели) Рисунок 2. Деградация ГК гиалуронидазой ингибирует гемопоэз в ДКККМ.

Количество зрелых клеток (A) и предшественников (Б) в ДКККМ. В: Фотографии репрезентативных зон адгерентных слоев (n=3).

Подобные результаты были получены при культивировании ДКККМ в присутствии 4MU, ингибитора HAS2. 4MU-индуцированное блокирование синтеза ГК в ДКККМ привело к полной блокаде гемопоэтической активности.

Восстановление уровня ГК путем добавления экзогенной ГК в культуральную среду улучшало гемопоэз в 4MU-обработанных ДКККМ, что проявлялось увеличением количества зрелых клеток и их коммитированных предшественников (данные не приведены). Эти результаты подтверждают, что эндогенно синтезированная ГК необходима для гемопоэза.

культуре Числоклеток x10 в культуре Число КОЕx10 в Далее исследовалось влияние экзогенной ГК на гемопоэтическую активность в ДКККМ. Добавление ГК в ДКККМ значительно усиливает гемопоэз в культурах, что демонстрируется увеличением количества зрелых клеток (рис.

3A) и их коммитированных предшественников (рис. 3Б). Увеличение количества клеток в ГК-обработанных культурах наблюдалось в течение всего периода культивирования, что свидетельствует о том, что ГК-индуцированная экспансия коммитированных предшественников в ДКККМ происходит не за счет уменьшения пула ГСК. Этот факт также подтверждается тем, что формирование и функционирование «cobblestone areas», представляющих собой очаги активного гемопоэза в адгерентном слое, стимулируется в присутствии ГК (рис. 3В).

80 * Контроль К A B * 70 ГК * * 1 2 3 4 5 6 7 8 Фидинг (недели) 1Б Контроль * ГК ГК 1К * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 Фидинг (недели) Рисунок 3. ГК стимулирует продукцию зрелых клеток (А) и предшественников (Б) в ДКККМ. В: Фотографии репрезентативных зон адгерентных слоев (n=3).

культуре Число клеток x 10 в культуре Число КОЕ x10 в 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A Б 1,51,59922ГК 900 kD Контроль ГК 1,500 kD В ГК 600 kD ГК 200 kD ГК 15 kD Рисунок 4. Зависимость эффекта ГК на гемопоэз в ДКККМ от размера ГК полимера. А: Распределение размеров пуповинной (дорожки 5 и 6) и очищенной ГК (дорожки 1-4). Б: Продукция клеток из ДКККМ. B: Фотографии репрезентативных зон адгерентных слоев (n=3).

В зависимости от источника и метода получения, ГК полимеры различаются по молекулярной массе, вязкости и трехмерной структуре, и соответственно обладают различной лиганд-связывающей способностью и биологической активностью [Fieber, Baumann et al., 2004]. Анализ в агарозном геле показал, что ГК, полученная из пуповины, состоит из смеси полимеров различных размеров, большинство которых составляют высокомолекулярные (ВМ) полимеры (рис.

4A). Далее исследовалась зависимость эффекта ГК на гемопоэз от размера ГК полимеров. Было обнаружено, что ВМ ГК стимулирует продукцию клеток в ДКККМ, тогда как низкомолекулярная (НМ) ГК оказывала супрессирующий эффект на гемопоэз (рис. 4Б). Аналогично, формирование «cobblestone areas» в мышиных ДКККМ стимулировалось ВМ ГК (1 500 kD и 900 kD), тогда как НМ ГК (200 kD и 15 kD) оказывали ингибиторный эффект (рис. 4В).

Влияние ГК на функциональную активность клеток опосредуется специфическим ГК рецептором CD44, экспрессируемым в стандартной форме (CD44s) или как сплайс-варианты (CD44v), на клетках,, составляющих гемопоэтическую нишу [Khaldoyanidi, Karakhanova et al., 2002]. Для исследования роли CD44s в регуляции иммунопоэза ККМ культивировались в условиях, обеспечивающих выживание и дифференцировку лимфоидных предшественников (культуры Витлока). Лимфоидные ДКККМ культивировались с CD44sспецифическими антителами, блокирующими связывание ГК с CD44, что приводило к снижению продукции лимфоидных клеток (рис. 5 А) и их предшественников (рис. 5 Б) в костномозговых культурах. Подобный эффект наблюдался в миелоидных ДКККМ (данные не приведены).

А Б 1Контроль Контроль 1CD44s Ат CD44s Ат 11 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Фидинг культур (недели) Фидинг культур (недели) Рисунок 5. CD44s-специфические антитела ингибируют продукцию зрелых лимфоидных клеток (А) и коммитированных лимфоидных предшественников (Б) в ДКККМ (n=3).

В следующей серии экспериментов использовались антитела, распознающие сплайс-варианты CD44 (CD44v4, CD44v6, CD44v7, CD44v10), имитирующие эффект лиганда и активирующие CD44 [Sleeman, Rudy et al., 1996]. Добавление CD44v6- и CD44v10-специфичных антител в лимфоидные ДКККМ стимулировало продукцию лимфоидных клеток (рис. 6 А) и их предшественников (рис. 6 Б). В миелоидных ДКККМ инкубация с CD44v4- и CD44v6специфичными аитителами (Ат) увеличивало продукцию миелоидных клеток и коммитированных миелоидных предшественников (данные не приведены). Таким образом показано, что CD44 регулирует продукцию как иммунных лимфоидных клеток, так и миелоидных. Полученные данные демонстрируют, что ГК эффекты на гемопоэз опосредуются взаимодействием с CD44.

в культуре Число КОЕ в культуре Число клеток (х) Б А 40 2Контроль Контроль 35 CD44v4 Ат CD44v4 Ат 2CD44v6 Ат 30 CD44v6 Ат CD44v7 Ат CD44v7 Ат 1CD44v10 Ат CD44v10 Ат 11 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Фидинг культур (недели) Фидинг культур (недели) Рисунок 6. CD44v-специфические антитела стимулируют продукцию лимфоидных клеток (А) и коммитированных лимфоидных предшественников (Б) в ДКККМ (n=3).

Чтобы определить, обладает ли ГК способностью непосредственно связываться с предшественниками и стимулировать колониеобразование, исследовалась экспрессия CD44 на гемопоэтических предшественниках. При использовании multicolor FACS было показано, что CD44 экспрессируются на LinСВ34+c-kit+ гемопоэтических предшественниках. Однако добавление ГК или гиалуронидазы в метилцеллюлозную среду не влияло на количество и размер колоний, образованных гемопоэтическими предшественниками (рис. 7 А), тогда как добавление ГК-индуцированной кондиционированной среды в метилцеллюлозные культуры стимулировало колониеобразование (рис. 7 Б).

Б А КС/IgG К ГК КС/ИЛ-1/ИЛ-6 Ат Г’за К О Е к Контроль ГК ИЛ-3 ГМ-КСФ Г-КСФ ИЛ-Кондиционированная среда (КС) Рисунок 7. Влияние ГК (А) и ГК-индуцированной кондиционированной среды (Б) на колониеобразование (n=3).

культуре Число клеток (x10 ) в Число КОЕ в культуре КОЕ/10 ККМ Таким образом, ГК непосредственно не влияет на пролиферацию гемопоэтических предшественников. Очевидно, что эффекты ГК на гемопоэз обусловлены вторичными факторами, продукция которых в ДКККМ индуцируется ГК [Khaldoyanidi, Moll et al., 1999].

Поскольку гемопоэтическое микроокружение, представленное в ДКККМ адгезивным слоем, продуцирует ростовые факторы и цитокины, было исследовано влияние ГК на эту функцию. Для идентификации ГКиндуцируемых факторов, содержащихся в кондиционных средах, использовалась технология protein microarray. Адгерентные слои ДКККМ инкубировались с ВМ ГК (~1000kD) или НМ ГК (200kD) в бессывороточной среде. В контрольные культуры вносилась только среда. Было обнаружено, что ВМ ГК, но не НМ ГК, стимулирует продукцию ряда цитокинов, вовлеченных в регуляцию пролиферации ГСК и предшественников (рис. 8). ВМ ГК стимулирует продукцию ИЛ-(метки в g7-8) и ИЛ-6 (метки в c5-6). Аналогично, ВМ ГК, но не НМ ГК, повышала продукцию Г-КСФ (d7-8). ВМ ГК являлась также позитивным регулятором IGFBP-3 (g7-8), фактора, стимулирующего пролиферацию ГСК [Liu, Sposato et al., 2003], в то время как НМ ГК снижала уровень продукции Г-КСФ и IGFBP-3.

Другим цитокином, экспрессирующимся в ДКККМ после ВМ ГК обработки, является ИЛ-12, оказывающий синергический с другими цитокинами эффект на пролиферативную активность ГСК [Jacobsen, Veiby et al., 1993]. Полученные результаты свидетельствуют об увеличении продукции ИЛ-12 под воздействием ВМ ГК, тогда как НМ ГК не обладает таким эффектом. Так же ВМ ГК увеличивает продукцию LIX – стимулятора пролиферации и поддержания ранних ГСК [Choong, Yong et al., 2004] и ИЛ-9, стимулятора мегакариоцитопоэза. Таким образом, в костномозговых клетках, обработанных ВМ ГК, но не НМ ГК, повышается продукция ряда цитокинов–стимуляторов пролиферативной активности как мультипотентных гемопоэтических предшественников, так и коммитированных предшественников.

Контроль ВМ ГК НМ ГК 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 a b c d e f g h i g k a b c d e f g h i g k a b c d e f g h i g k l m n l m n l m n MCP-1 IL-6 G-CSF IL-12 IGFBP-3 IL-8 IL-1 VCAM-1 LIX Рисунок 8. ГК стимулирует продукцию цитокинов клетками гемопоэтического микроокружения (n=3).

Было также показано, ВМ ГК стимулирует продукцию хемокинов, которые регулируют миграцию как зрелых гемопоэтических клеток, так и их предшественников. ГК стимулирует продукцию нескольких хемокинов, включая MIP-1, CTACK (l9-10), CXCL16 (m9-10), SDF-1, RANTES (m3-4) и других (данные не приведены). Поскольку ГК-индуцированные хемокины, локально продуцируемые нишей, могут стимулировать миграцию ГСК в гемопоэтическую нишу, исследовлся эффект кондиционной среды (КС) ГК на хемотаксис ГСК.

SDF-1-опосредованная трансмиграция гемопоэтических клеток была значительно выше в культурах, содержащих ГК КС в нижних лунках (рис. 9 A, В), что коррелировало с увеличением количества предшественников, мигрирующих в нижние лунки, содержащие ГК КС (рис. 9 Б, Г). Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что ВМ ГК влияет на миграционную активность клеток, регулируя экспрессию хемокинов клетками ниши.

A Б 10 0 Контроль SDF-1 SDF-1+ ККС SDF-1+ГККС Контроль SDF-1 SDF-1+ККС SDF-1+ГККС В Г 6 5 4 Контроль SDF-1 ККС ГККС Контроль SDF-1 ККС ГККС Рисунок 9. Стимуляция миграции ККМ (А, В) и предшественников (Б, Г) ГК-индуцированными хемокинами (n=3).

Поскольку миграция клеток связана с высвобождением и активацией MMP-9, исследовался эффект ВМ ГК и НМ ГК на экспрессию MMP-9 в ККМ. В то время как экспрессия MMP-9 в ККМ, обработанных ВМ ГК, не изменялась, экспрессия растворимых и ассоциированных с клеткой MMP-9 была повышена в Чмсло КОЕ Число ККМ (x10 ) Число КОЕ Число ККМ ( х 10 ) культурах, обработанных НМ ГК. Так как высокие уровни растворимых MMP-могут быть обусловлены освобождением MMP-9 нейтрофилами, исследовался уровень экспрессии MMP-9 в нейтрофилах. Было показано, что НМ ГК, но не ВМ ГК, оказывала стимулирующий эффект на MMP-9 продукцию нейтрофилами. НМ ГК-индуцированное повышение концентрации внеклеточной MMP-коррелировало со снижением уровня внутриклеточной MMP-9 (данные не приведены).

Поскольку лигинд-рецепторные взаимодействия VCAM1/VLA4 и CXCR4/SDF1 являются основными механизмами удержания мигрировавших ГСК в нише [Lapidot, Petit, 2002), исследовался эффект ГК на экспрессию CXCR4 и VCAM-1. Инкубация с ВМ ГК усиливала экспрессию CXCR4 и VCAM-1 в ДКККМ, в то время как обработка НМ ГК приводила к снижению уровня экспрессии CXCR4 и VCAM-1 в ДКККМ (данные не приведены).

Полученные результаты позволяют утверждать, что ГК является важным регуляторным компонентом гемопоэтической ниши. Очевидно, что ГК выполняет несколько функций: 1) регуляция продукции цитокинов для поддержания пролиферации; 2) регуляция экспрессии адгезивных молекул для удержания клеток; и 3) регуляция продукции цитокинов для рекрутмента. В целом, представленные результаты говорят о том, что ГК является необходимым и биологически активным компонентом гемопоэтического микроокружения в костном мозге и вовлечена в регуляцию гемопоэтического гомеостаза. Наши данные представляют собой теоретическую основу для дальнейшего исследования эффектов экзогенной ГК на моделях in vivo в ситуациях, сопровождающихся деградацией ГК.

Исследование роли ГК в регуляции гемопоэза на моделях in vivo Деградация ГК, изменение ее синтеза и аккумуляции индуцируются различными факторами, такими как 5-ФУ [Young, Hehn et al., 1994], гидрокортизон и другие химические препараты [Yaron, Yaron et al., 1977] и иррадиация [Noordegraaf, Erkens-Versluis et al., 1981]. Поскольку участие ГК в регуляции гемопоэза показано на моделях in vitro [Khaldoyanidi, Moll et al., 1999], очевидно, что изменение структуры или количества ГК в костном мозге могут индуцировать «разбалансировку» гемопоэтического гомеостаза in vivo. Т.к. снижение уровня эндогенной ГК коррелирует с миелосупрессией, исследовалась способность экзогенной ГК восстанавливать подавленный гемопоэз in vivo на следующих экспериментальных моделях: 1) Мыши со сниженным уровнем ГК, индуцированным с помощью HAS knockout; 2) Интактные мыши, получившие иньекции ГК; 3) Мыши с миелосупрессией, индуцированной химиотерапией, получившие иньекции ГК и 4) Мыши с миелосупрессией, индуцированной облучением, получившие иньекции ГК.

Исследования, проведенные на HAS1/3 и HAS1/2/3 knockout мышах, у которых отсутствуют гены Has1 и Has3, кодирующие ГК синтетазы (Has1–/– ;Has3–/–) показали, что число гемопоэтических предшственников, циркулирующих в крови double knockout (dKO) мышей было значительно повышено по сравнению с контрольными мышами (wild type, WT). Число циркулирующих предшественников было еще выше у triple KO (tKO) (Prx1-Cre;Has2flox/flox;Has1–/– ;Has3–/–), что коррелировало с увеличенным количеством гемопоэтических предшственников в селезенке dKO мышей и tKO мышей по сравнению с WT контролем (данные не приведены). Эти данные подтверждают важную роль ГК регуляции гемопоэтического гомеостаза.

Облучение оказывает разрушительное действие на биологически активную эндогенную ГК, что проявляется деградацией полимеров. Исследование влияния экзогенной ГК на процесс восстановления гемопоэза после летальной дозы облучения и трансплантации ККМ показало, что внутривенное введение ГК повышало количество лейкоцитов у ГК-обработанных мышей на 13 день (рис. 10 А), в то время как количество лейкоцитов у мышей контрольной группы оставалось низким.

Б A 10Контроль Контроль ГК 812 ГК 6420 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Дни после трансплантации ККМ Дни после трансплантации ККМ Г Д В 5Контроль ГК Контроль 3300 ГК 422 3212110 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Контроль ГК Бласты ЭБ Дни после трансплантации ККМ Рисунок 10. Эффект ГК на миелосупрессию, индуцированную облучением.

Исследовалось количество лейкоцитов (A) и тромбоцитов (Б) в периферической крови. Динамика процесса восстановления количества тромбоцитов представлена в процентах (В). Показано количество бластных клеток и эритробластов (Г) и мегакариоцитов (Д) в ККМ (число мышей/группе=10).

Лейкоциты (x10 /мл) Тромбоциты (x10 /мл) Тромбоциты (%) МКЦ/слайд Число клеток (%) Кроме того, было обнаружено ускоренное восстановление численности эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови ГК-обработанных мышей.

Количество тромбоцитов было повышенным начиная с 5 дня после трансплантации и на протяжении всего периода исследования (рис. 10 Б). Динамика восстановления численности тромбоцитов представлена в виде увеличения процентного содержания, начиная с 5 дня (рис. 10 В). Морфологический анализ костного мозга показал, что на 7 день общее количество бластных клеток в костном мозге ГК-обработанных мышей в 10 раз превышало контрольные показатели (рис. 10 Г). Кроме того, в костном мозге ГК-обработанных мышей наблюдалось 3-кратное увеличение количества эритробластов (рис. 10 Г) и 18.8кратное увеличение числа мегакариоцитов (рис. 10 Д) по сравнению с контролем. Повышенное количество мегакариоцитов коррелировало с повышенным количеством тромбоцитов в костном мозге ГК-обработанных мышей. Количество тромбоцитов у этих мышей составляло 20 1.5/поле зрения, в то время как в контрольной группе этот показатель оставался низким (4 0.2/поле зрения). Стимуляция гемопоэтической активности в костном мозге ГК-обработанных мышей коррелировала с повышением их выживания. Смертность мышей контрольной группы составляла 50%, ГК обработка улучшила показатель выживаемости до 90 %.

Для изучения эффекта ГК на миелосупрессию, индуцированную химиотерапией, использовался 5-ФУ, вызывающий выраженную лейкопению и умеренную тромбоцитопению. Анализ экспрессии ГК на ККМ после 5-ФУ показал значительное снижение уровня ГК на клеточной поверхности (данные не приведены). Поскольку 5-ФУ нарушает процесс аккумуляции ГК [Matrosova, Orlovskaya et al., 2004], исследовалось влияние экзогенной ГК на процесс восстановления гемопоэза, супрессированного 5-ФУ. Введение ГК после 5-ФУ приводило к ускоренному восстановлению количество лейкоцитов и тромбоцитов в крови ГК-обработанных мышей (данные не приведены), что свидетельствует о том, что ГК не вызывает конкуренции ростков у мышей, как, например, показано для Г-КСФ [Scheding, Media et al., 1994]. Чтобы исследовать, является ли увеличение количества клеток периферической крови следствием восстановления гемопоэза в костном мозге, ККМ забирались и подсчитывалось их количество до обработки и на 7, 14, 21 и 28 дни после введения 5-ФУ. Было обнаружено, что начиная с 7 дня после введения 5-ФУ общее количество ККМ в 5-ФУ/ГК группе было выше, чем в контроле (5-ФУ/ФР) (рис. 11А).

В A Б 25 5ФУ/ФР * * * 5ФУ/ФР * 5ФУ/ГК 5ФУ/ГК * 15 * 5ФУ/ФР 5ФУ/ГК 0 7 14 21 28 БОЕ-э КОЕ-ГМ Бласты MKЦ (x10) Дни после начала терапии Рисунок 11. ГК ускоряет процесс восстановления числа ККМ (А), КОЕ-ГМ, и БОЕэ (Б) и мегакариоцитов (МКЦ) после введения 5-ФУ (число мышей/группе=10).

Морфологический анализ Giesma-окрашенных мазков ККМ показал, что количество как лимфоидных и миелоидных элементов, так и тромбоцитов было выше в костном мозге мышей, которые получили ГК после введения 5-ФУ (Таблица 1).

Tаблица 1. Влияние ГК на восстановление количества ККМ после введения 5ФУ Тип клеток ФР 5ФУ/ФР 5ФУ/ГК /день 0 7 14 21 7 14 нейтрофилы 27.3 2 22 39 17.6 19 эозинофилы 1 0 0.5 0.3 0.6 0 0.моноциты 0.7 0.5 2 2 1 2.5 2.лимфоциты 21.3 11.1 6.5 13.3 33 20.3 29.тромбоциты 7 2 2 5 25 20 У животных, обработанных ГК, наблюдалось 6-кратное увеличение количества ККМ в митозе, по сравнению с контролем, что позволило предположить экспансию клеток-предшественников в костном мозге ГК-обработанных мышей. Анализ метилцеллюлозных культур показал, что количество миелоидных предшественников (КОЕ-ГМ) в костном мозге ГК-обработанных мышей в 2,8 раза превышало контрольные значения, а число ранних эритроидных предшественников (БОЕэ) было увеличено в 2,9 раза (рис. 11 Б). Количество мегакариоцитов в костном мозге ГК-обработанных мышей было увеличено в 3,7 раза (рис. 11 В), что коррелировало с увеличением числа тромбоцитов в костном мозге (Таблица 1) и периферической крови. Полученные данные, а также предшествующие исследования in vitro [Khaldoyanidi, Moll et al. 1999; Khaldoyanidi, % клеток/пз ККМ (x10 )/бедр.к.

КОЕ x 10 /бедр.к.

Karakhanova et al., 2002], демонстрируют ранее неизвестную роль ГК в регуляции гемопоэза и доказывают, что экзогенная ГК обладает способностью поддерживать лимфопоэз и миелопоэз in vivo.

Представленные результаты предполагают возможность использования ГК для ускорения восстановления гемопоэза после химиотерапии. Поскольку препятствием для использования ГК в терапевтических протоколах является потенциально возможное воздействие на резидуальные опухолевые клетки, исследовался эффект экзогенной ГК на рост вторичных опухолей после химиотерапии у мышей-опухоленосителей. Химиотерапия редко полностью элиминирует все опухолевые клетки, что может повлечь за собой вторичный рост опухоли.

CD44/ГК путь вовлечен в регуляцию пролиферации и роста опухолевых клеток.

Возможно, что опухолевые клетки, остающиеся после химиотерапии, могут отвечать на повторные инъекции ГК. В соответствии с основной целью данного исследования, была выбрана опухолевая линия, удовлетворяющая следующим критериям: 1) способность расти в организме мышей; 2) чувствительность к химиотерапии; 3) экспрессия CD44 рецепторов для ГК; 4) способность клеток опухоли связывать ГК (данные не приведены). Таким критериям удовлетворяла клеточная линия HCT-8, способная формировать опухоли в иммунодефицитных мышах NOD/SCID. Используя FACS анализ, было показано, что HCT-8 клетки экспрессируют CD44s, сплайс-варианты CD44v5, CD44v7, CD44v10, но не CD44v6, а также низкие уровни эндогенной ГК. Кроме того, HCT-8 клетки способны связывать экзогенную ГК, что было показано при использовании FITCконъюгированной ГК.

Предполагалось два возможных варианта влияния ГК на опухолевые клетки in vivo: 1) стимуляция пролиферации и выживания [Nasreen, Mohammed et al., 2002], и 2) ингибиция пролиферации [Morrison, Sherman et al., 2001]. Исследования демонстрируют, что на поздних стадиях наблюдения, начиная с пятой недели после имплантации опухоли, тенденция к сокращению размеров опухоли была отмечена у мышей, получавших инъекции ГК. К 6-й неделе задержка вторичного роста опухоли у ГК-обработанных мышей была статистически значимой (рис. 12 А). На 42 день вес иссеченных опухолей ГК-обработанных мышей в 1.8 раза ниже, чем в контроле (рис. 12 Б).

p=0.p=0.8A Б 3 0.7Контроль 600 0.ГК 50.40.320.17 14 21 28 35 Контроль ГК Дни после трансплантации опухоли Рисунок 12. Эффект ГК на размер опухолей после химиотерапии (А) и вес опухолей (Б) (число мышей/группе=10).

Одно из возможных объяснений полученного феномена состоит в том, что ГК может оказывать влияние на рост опухоли косвенно, ингибируя ангиогенез. Морфологическое исследование опухолей обнаружило большие области некроза в опухолях, полученных от мышей контрольной группы, по сравнению с мышами, получавшими инъекции ГК после химиотерапии. Однако микроскопическое и иммуногистохимическое исследования не выявили изменений в сосудистой структуре контрольных опухолей по сравнению с опухолями, подвергавшимися воздействию экзогенной ГК. Экспрессия CD31, маркера эндотелиальных клеток, не былa изменена в контрольных опухолях (7±3.6 vessels/field) по сравнению с опухолями, выделенными из ГК-обработанных мышей (6.9±3.vessels/field). Другая возможность состоит в том, что ГК влияет как на пролиферацию HCT-8 клеток, так и на их апоптоз.

А Б К К ГК ГК Overlay DAPI TUNEL Overlay DAPI KiРисунок 13. Эффект ГК на пролиферацию (А) и апоптоз (Б) HCT-8 клеток in vivo (число мышей/группе=10).

Введение ГК in vivo привело к снижению экспрессии Ki67 (маркера пролиферации, показан красным) в HCT-8 клетках, что является показателем сниженного числа пролиферирующих клеток (рис. 13А). Кроме того, TUNEL тест показал, что в ГК-обработанных мышах число апоптозных опухолевых клеток было увеличено по сравнению с контролем (рис. 13Б, показано зеленым).

Объем опухоли (г) Обем опухоли (mm ) Таким образом, ГК ингибирует пролиферацию HCT-8 клеток in vivo и усиливает их апоптоз. Полученные данные обосновывают возможность использования ГК у онкологических больных.

Роль ГК в регуляции формирования гемопоэтических клеток на модели эмбриональной стволовой клетки (ЭСК) Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) представляют собой альтернативный источник для получения ГСК. Одним из лимитирующих факторов, препятствующих использованию ПСК, является низкая эффективность их дифференцировки в ГСК. Исследование молекулярных механизмов, регулирующих процесс дифференцировки, позволит разработать экспериментальные протоколы, позволяющие направлять дифференцировку ПСК для получения достаточных для трансплантации количеств ГСК.

Представленные данные демонстрируют важную роль ГК в регуляции постнатального гемопоэза. Кроме того, существуют данные о важности ГК для формирования клеток мезодермильного происхождения в процессе эмбриогенеза у мышей [Camenisch, Spicer et al., 2000]. Поскольку гемопоэтическая система происходит из мезодермы, мы предположили, что ГК может быть вовлечена в процесс формирования гемопоэтической линии на ранних этапах развития эмбриона. Для изучения роли ГК в процессе дифференцировки ПСК использовались человеческие ЭСК, чья плюрипотентность подтверждалась экспрессией OCT4, исчезающей в процессе дифференцировки в культурах эмбриоидных телец (ЭТ) [Loring, Wesselschmidt et al., 2007]. Изучение экспрессии генов, кодирующих компоненты ГК системы, показало, что ГК синтаза 2 (HAS2) экспрессируется как в недифференцированных, так и в дифференцирующихся ЭСК (данные не приведены). Кроме того, показана экспрессия генов, кодирующих ГК рецепторы (CD44, RHAMM), а также гиалуронидазу. Активность синтаз (HASs) была подтверждена обнаружением ГК полимеров в ЭСК и ЭТ культурах. Наличие столь гибкой регуляции синтеза и деградации ГК в недифференцированных и дифференцированных ЭСК может свидетельствовать о важной роли ГК в функционировании ЭСК.

Для изучения роли эндогенно продуцируемой ГК использовался метод ферментативной деградации ГК гиалуронидазой, которая добавлялась в культуры во время спонтанной дифференцировки ЭТ. Индуцированная гиалуронидазой деградация ГК была подтверждена иммуноцитохимическим исследованием.

Ферментативная деградация ГК в ЭТ привела к значительному снижению общего количества клеток, генерируемых в обработанных гиалуронидазой культурах, по сравнению с контролем (18.6 1.7 105/culture против 31.3±2.9 105/culture, p=0.0008). Процент гемопоэтических клеток в дифференцированных ЭТ оценивался с помощью экспрессии пан-лейкоцитарного маркера CD45. Количество CD45+ клеток, генерируемых в подвергнутых обработке гиалуронидазой ЭТ, снижалось в 2 раза по сравнению с контролем (рис.14А). Это коррелировало с 4кратным снижением относительного количества коммитированных предшест венников (рис. 14Б). Общее количество гемопоэтических предшественников в культуре было в 7 раз ниже в обработанных гиалуронидазой культурах по сравнению с необработанными. Внесение ГК в обработанные гиалуронидазой ЭТ культуры приводило к восстановлению количества предшественников, генерируемых в ЭТ (рис. 14Б), что свидетельствует о специфичности воздействия.

Кроме того, клетки, полученные из обработанных гиалуронидазой ЭТ, образовывали гемопоэтические колонии меньшего размера по сравнению с контролем (рис. 14В).

В А 10.% % Контроль p=0.0К Б О Е/ 106 * кл Гиалуронидаза Контроль Г’аза Г’аза/ГК Control HA'ase HA'ase/HA Рисунок 14. Эффект депривации ГК на число CD45+ клеток (А) и гемопоэтических предшественников (Б) в ЭТ. В: Гемопоэтические колонии из контрольных и обработанных гиалуронидазой ЭТ (n=3).

Кроме того, было показано, что деградация ГК снижает продукцию других клеток мезодермального происхождения в дифференцирующихся ЭТ. В частности, продукция CD31+ эндотелиальных клеток была в 1.6 раз ниже в ЭТ культурах, обработанных гиалуронидазой, по сравнению с контролем. Клетки, полученные из обработанных гиалуронидазой ЭТ, демонстрировали пониженную способность дифференцироваться в сокращающиеся миоциты и фибробласты (данные не приведены).

Представленные данные впервые демонстрируют, что следствием деградации эндогенной ГК гиалуронидазой является снижение продукции клеток мезодермального происхождения. Для изучения роли ГК в процессе формирования мезодермы, синтез ГК в спонтанно дифференцирующихся ЭТ ингибировался с помощью ингибитора HAS2 4MU. Культивирование с 4MU не оказывало видимого эффекта на экспрессию маркера OCT4 в ЭТ, что исследовалось методом RT-PCR (рис. 15 А). Подобные результаты были получены при исследовании экспрессии других маркеров плюрипотентности Nanog и Sox2, что свидетельствует о том, что ЭСК не арестованы в стадии плюрипотентности, и, следовательно, их способность к дифференцировке не нарушена.

CFU/10 cells Чтобы определить, вовлечена ли ГК в регуляцию процесса дифференцировки ЭСК в направлении мезодермы, исследовалась динамика экспрессии двух мезодермальных маркеров: BRY (маркер ранней мезодермы) и BMP2 (маркер поздней мезодермы) в условиях ГК депривации. Обработка 4MU дифференцирующихся ЭСК привела к снижению экспрессии как BRY (рис. А), так и BMP2 (данные не приведены) начиная с 4 дня культивирования ЭТ; эти показатели оставались ниже контрольных на протяжении всего периода культивирования, что может свидетельствовать о необходимости ГК для мезодермальной дифференцировки ЭСК.

ГК - + Day 0 4 7 10 13 - + + + А Б 4MU - - 4MU - + - + - + - + - + -Actin -Actin OCTOCTBR BR Y Y -FP -FP FGFFGFРисунок 15. Эффект 4MU (А) и ГК (Б) на экспрессию mRNA генов-маркеров (n=3).

Так как мезодермальная дифференцировка ЭСК снижается в отсутствии ГК, мы предположили, что доля ЭСК, выбравших эндодермальное или эктодермальное направление дифференцировки (либо оба направления), будет увеличена. Чтобы проверить эту гипотезу, исследовался эффект ГК-депривации на экспрессию маркеров эндодермы -FP и Sox17 и эктодермальных маркеров FGF5 и GFAP. На ранних стадиях дифференцировки (дни 4 и 7) экспрессия эктодермальных маркеров FGF5 (рис. 15 А) и GFAP (данные не приведены) была увеличена в 4MU-обработанных ЭТ по сравнению с контролем. Исследование эффекта 4MU на экспрессию эндодермальных маркеров -FP (рис. 15 А) и Sox17 (данные не приведены) продемонстрировало уменьшение уровней их экспрессии в ЭТ в условиях ГК депривации. Экспрессия всех маркеров была подтверждена методом иммунофлуоресценции (данные не приведены).

Добавление экзогенных ГК полимеров в 4MU-обработанные культуры привело к восстановлению BRY и BMP2 mRNA экспрессии. Это коррелировало с увеличением уровней Bry и BMP2, продуцируемых в 4MU/ГК культурах, по сравнению с культурами, обработанными только 4MU. Однако добавление ГК не усиливало экспрессию маркеров в ЭТ, выращенных при отсутствии ингибитора синтеза ГК. При добавлении экзогенной ГК в 4MU-обработанные культуры экспрессия FGF5 mRNA снижалась до нормальных значений (рис. 15 Б).

Остается вопрос, можно ли использовать экзогенную ГК в качестве регулятора мезодермальной дифференцировки ЭСК. Наши результаты показывают, что и недифференцированные, и дифференцированные ЭСК экспрессируют высокие уровни гиалуронидазы. Это свидетельствует о том, что любой избыток ГК полимеров подвергается ферментативной деградации. Экспрессия гиалуронидазы зависит от уровней ГК [Deschrevel, Lenormand et al., 2008], что, очевидно, является системой поддержания оптимального уровня ГК. Этим можно объяснить, почему внесение экзогенной ГК в необработанные контрольные культуры не влечет за собой изменений уровня экспрессии маркеров ПСК, а следствием внесения ГК в культуры, освобожденные от ГК, является восстановление экспрессии маркеров стволовой клетки до уровня, наблюдаемого в контрольных необработанных культурах (данные не приведены). В соответствии с нашими наблюдениями, Ventura с соавторами опубликовали данные, что только модифицированная ГК (эфирная ГК, связанная с масляной и ретиноевой кислотами), которая не может подвергаться деградации гиалуронидазой, направляет дифференцировку ЭСК в направлении мезодермы (Ventura, Maioli et al. 2004).

Эти результаты свидетельствуют о том, что воздействия на ГК-опосредованные молекулярные пути в ЭСК возможны и могут представлять собой продуктивный подход к регуляции выбора дифференцировки ЭСК. В целом, полученные данные свидетельствуют, что ГК играет важную роль на самых ранних стадиях формирования зародышевых слоев, являясь частью регуляторной сети, контролирующей конкурентные взаимоотношения зародышевых линий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные результаты подтверждают и доказывают гипотезу о регуляторной роли ГК в процессе гемопоэза. Показано, что в условиях депривации ГК, вызванной деградацией ГК или блокированием ее синтеза, гемопоэтическая активность костного мозга снижается. Аналогичным образом, гемопоэтическая активность снижается в условиях блокирования CD44, основного ГК рецептора.

Молекулярные исследования показали, что ГК регулирует экспрессию позитивных и негативных регуляторов пролиферации ГСК и предшественников.

Кроме того, ГК регулирует экспрессию молекул адгезии, которые удерживают ГКС в нише.

Полученные результаты расширяют представление о роли ГК в процессе развития гемопоэтической системы и организма в целом. В частности, показана роль ГК в регуляции дифференцировки ЭСК в мезодерму и, как следствие, в гемопоэтическую линию. Исследования в этом направлении важны для разработки новых протоколов направленной дифференцировки ЭСК и эффективного генерирования клеток для терапевтических целей.

Наиболее интересным и перспективным результатом проведенных исследований является полученный эффект экзогенной ГК in vivo, восстанавливающий функционирование ниши и ускоряющий процесс восстановления гемопоэза после химиотерапии и иррадиации. Поскольку применение стимулирующих препаратов у онкологических больных связано с риском опухолевой прогрессии, важным результатом является негативный эффект ГК на вторичный рост опухоли после химиотерапии.

Использование ГК потенциально более выгодно по сравнению с альтернативной, основанной на цитокинах терапией, поскольку:

1) ГК стимулирует пролиферацию мультипотентных ГСК до их коммитирования;

2) ГК улучшает качество регуляторной ниши ГСК, стимулируя экспрессию адгезивных молекул ГСК и позитивных регуляторов пролиферации ГСК;

3) ГК не индуцирует конкуренции гемопоэтических ростков;

4) ГК не вызывает истощения пула ГСК в костном мозге;

5) ГК не вызывает боли или другого физического дискомфорта;

6) производство ГК не требует больших материальных затрат, поэтому препарат окажется доступным для всех контингентов пациентов;

7) ГК способна улучшать качество жизни большой когорты пациентов и ее использование позволит уменьшить медицинские расходы.

ВЫВОДЫ 1. Эндогенная гиалуроновая кислота выполняет регуляторную роль в поддержании активного гемопоэза: деградация ГК в костномозговых культурах с помощью специфического энзима гиалуронидазы приводит к значительному снижению числа зрелых миелоидных и лимфоидных клеток, а также их коммитированных предшественников, продуцируемых in vitro.

2. Синтетаза гиалуроновой кислоты (HAS2) является необходимым элементом гемопоэза и ее блокирование приводит к ингибиции гемопоэза: воздействие 4MU, ингибитора активности HAS2, приводит к полному прекращению продукции зрелых миелоидных и лимфоидных клеток, а также их коммитированных предшественников in vitro.

3. Гликопротеин CD44 является основным рецептором, опосредующим эффекты ГК в костном мозге: блокада взаимодействия ГК с ее рецептором CD44 с помощью специфических антител приводит к значительному снижению числа зрелых миелоидных и лимфоидных клеток, а также их коммитированных предшественников, продуцируемых в костномозговых культурах in vitro. Использование антител, связывающихся со сплайс-вариантами CD44 и имитирующих естественный лиганд (ГК), приводит к увеличению продукции зрелых миелоидных и лимфоидных клеток, а также их коммитированных предшественников in vitro.

4. Гиалуроновая кислота поддерживает функционирование гемопоэтического микроокружения посредством регуляции продукции факторов, стимулирующих пролиферацию ГСК и коммитированных предшественников: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-12, Г-КСФ, IGFBP-3 и LIX. Подобным стимулирующим эффектом обладают полимеры гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой, в то время как полимеры гиалуроновой кислоты с низкой молекулярной массой не эффективны.

5. Гиалуроновая кислота поддерживает функционирование гемопоэтического микроокружения посредством регуляции экспрессии поверхностных молекул (VCAM-1), обуславливающих адгезию ГСК и ее удержание в нише. Этот эффект показан для гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой, в то время как полимеры гиалуроновой кислоты с низкой молекулярной массой таким эффектом не обладали.

6. Экзогенная гиалуроновая кислота стимулирует восстановление гемопоэза после химиотерапии или облучения, что проявляется ускоренным восстановлением численности гемопоэтических предшественников в костном мозге и зрелых клеток периферической крови.

7. В отсутствии миелосупрессии (облучение и химиотерапия) гиалуроновая кислота не влияет на костномозговой гемопоэз, но усиливает мобилизацию из костного мозга зрелых клеток: после введения гиалуроновой кислоты наблюдается временное повышение числа зрелых клеточных элементов в периферической крови.

8. Гиалуроновая кислота, продуцируемая эмбриональными стволовыми клетками, играет роль аутокринного регуляторного агента, определяющего направление ЭСК дифференцировки: снижение уровня гиалуроновой кислоты в культурах эмбриональных стволовых клеток приводит к торможению их дифференцировки в мезодермальном направлении с супрессией генерирования гемопоэтических стволовых клеток, коммитированных предшественников и зрелых клеток крови.

9. Гемопоэтическое микроокружение ГСК является мишенью для терапевтических воздействий; функциональная активность гемопоэтического микроокружения может регулироваться гиалуроновой кислотой - одним из важнейших компонентов ниши ГСК.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Khaldoyanidi S., Achtnich, M., Hehlmann, Zller M. Expression of CD44 variant isoform in peripheral blood leukocytes in malignant lymphoma and leukemia: inverse correlation between expression and tumor progression // Leukemia Research. – 1996. – Vol.20. – Р. 839-851.

2. Khaldoyanidi S.K., Denzel A., Zller M. Requirement for CD44 in proliferation and homing of hematopoietic precursor cells // J. of Leukocyte Biol. – 1996. – Vol.60. – P.579-592.

3. Khaldoyanidi, S.K., Schnabel D., Fhr N., Zller M. Functional activity of CD44 isoforms in haemopoiesis of the rat // British J. of Haematol. – 1997. – Vol. 96. – P. 31-45.

4. Moll J., Khaldoianidi S.K., Sleeman J.P., Achtnich M., Preuss I., Ponta H., Herrlich P. Two different functions for CD44 proteins in human myelopoiesis // J. Clin. Invest. – 1998. – Vol. 102. – P. 1024-1034.

5. Khaldoyanidi S.K., Moll J., Karakhanova S.S., Herrlich P., Ponta H. Hyaluronate-enhanced hematopoiesis: Tow different receptors trigger the release of interleukin-1beta and interleukin-6 from bone marrow macrophages // Blood – 1999. – Vol. 94. – P. 940-949.

6. Roesel M., Khaldoyanidi S., Zawadzki V., Zoeller M. Involvement of CDvariant isoform v10 in progenitor cell adhesion and maturation // Exp. Hematol. – 1999. – Vol. 27. – P. 698-711.

7. Muller-Sieburg C., Deryugina E., Khaldoyanidi S., O’Rourke A. Tissue- and epitope-specific mechanisms account for the diverse effect of anti-CD44 antibodies on the maintenance of primitive hematopoietic progenitors in vitro // Blood Cells, Molecules, and Diseases – 2000. – Vol. 26. – P. 291-302.

8. Khaldoyanidi S., Sikora L., Orlovskaya I., Matrosova V., Kozlov V., Sriramarao P. Correlation between nicotine-induced inhibition of hematopoiesis and decreased CD44 expression on bone marrow stromal cells // Blood – 2001. – Vol. 98. – P. 303-312.

9. Khaldoyanidi S., Karakhanova S., Sleeman J., Herrlich P., Ponta H. CDvariant specific antibodies trigger hemopoiesis by selective release of cytokines from bone marrow macrophages // Blood. – 2002. – Vol. 99. – P. 39553961.

10. Khaldoyanidi S.K., Glinsky V.V., Sikora L., Glinskii A.B., Mossine V.V., Glinsky G.V., Sriramarao P. MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions // The Journal of Biological Chemistry – 2003. – Vol. 278. – P. 4127-4134.

11. Khaldoyanidi S., Sikora L., Rothenberg M., Broide D., Sriramarao P. Constitutive overexpression of IL-5 induces extramedullary hematopoiesis in the spleen // Blood – 2003. – Vol. 101. P. 863-868.

12. Matrosova V., Orlovskaya I., Serobyan N., Khaldoyanidi S. Hyaluronic acid facilitates recovery of hematopoiesis impaired by 5-fluouracil administration // Stem Cells – 2004. – Vol. 22. P. 544-555.

13. Serobyan N., Schraufstatter I. U., Strongin A., Khaldoyanidi S.K. Nicotinic acetylcholine receptor-mediated activation of endothelial cells results in the arrest of hematopoietic progenitor cells on endothelium // British J. of Haematol. – 2005. – Vol. 129. – P. 257-265.

14. Serobyan N., Orlovskaya I., Kozlov V., Khaldoyanidi S.K. Exposure to nicotine during gestation interferes with the colonization of fetal bone marrow by hematopoietic stem/progenitor cells // Stem Cell and Development – 2005. – Vol. 14. – P. 81-91.

15. Matrosova V., Orlovskaya I., Serobyan N., McClelland M., Khaldoyanidi S.

Hyaluronan facilitates recovery of hematopoiesis after therapy-induced myelosuppression // In: Hyaluronan, structure, metabolism, biological activities, therapeutic applications. Editors: E. Balazs and V. Hascall. – 2005. – Vol. II.

– P. 813-820.

16. Mueller F.-J., Serobyan N., Schraufstatter I. U., DiScipio R., Loring J. F., Snyder E.Y., Khaldoyanidi S.K. Adhesive interactions between human neur al stem cells and inflamed human vascular endothelium are mediated by integrins // Stem Cells – 2006. – Vol. 24. – P. 2367-2372.

17. Wimmer A., Khaldoyanidi S., Judex M., Serobyan N., DiScipio R.G., Schraufstatter I.U. PARC/CCL18 stimulates hematopoiesis in long-term bone marrow cultures through its effect on accessory cells // Blood – 2006. – Vol. 108. – P. 3722-3729.

18. Serobyan N., Jagannathan S., Orlovskaya I., Schraufstatter I., Loring J., Skok M., Khaldoyanidi S. The Cholinergic System is involved in Regulation of the Development of the Hematopoietic System //Life Sciences. – 2007. – Vol.

80. – P. 2352-2360.

19. Топоркова Л.Б., Халдояниди С.К., Орловская И.А. Механизмы регуляции самоподдержания гемопоэтической стволовой клетки // Успехи современной биологии – 2008. – Т. 128. – С. 458-466.

20. Orlovskaya I., Schraufstatter I., Loring J., Khaldoyanidi S. Hematopoietic differentiation of embryonic stem cells // Methods – 2008. – Vol. 45. – P.

159-167.

21. Khaldoyanidi S. Directing stem cell homing // Cell Stem Cell – 2008. – Vol.

2. – P. 198-200.

22. Schraufstatter I.U., Serobyan N., Loring J., Khaldoyanidi S.K. Hyaluronan is required for generation of hematopoietic cells // J. of Stem Cells – 2010. – Vol. 5. – P. 9-21.

23. Schraufstatter I., Serobyan N., DiScipio R., Feofanova N., Orlovskaya I., Khaldoyanidi S. Hyaluronan Stimulates Mobilization of Mature Hematopoietic Cells but Not Hematopoietic Progenitors // J. of Stem Cells – 2009. – Vol.

4. – P. 191-202.

24. Mueller B.M., Schraufstatter I.U., Goncharova V., Povaliy T., Khaldoyanidi S.K. Hyaluronan inhibits postchemotherapy tumor re-growth in a colon carcinoma xenograft model // Molecular Сancer Therapeutics – 2010. – Vol. 9.

– P. 3024-3032.

25. Omelyanchuk N., Orlovskaya I.A., Schraufstatter I.U., Khaldoyanidi S.K.

Key players in the gene networks guiding ESCs toward mesoderm // J. of Stem Cells – 2009. – Vol. 4. – P. 147-160.

26. Khaldoianidi S.K., Karakhanova S.S., Herrlich P., Ponta H., Moll J. Hyaluronic acid stimulates hemopoiesis in vitro via upregulation of interleukin production by macrophages. 10th Symposium on Molecular Biology of Hematopoiesis // In: Acta Haematologica – 1997. – Vol. 98 (suppl. 1). – P.79.

27. Khaldoiandi S.K., Karakhanova S., Moll J., Herrlich, P., Ponta H. Hyaluronic acid stimulates hemopoiesis in vitro. XIX Symposium of the International Association for Comparative Research on Leukemia and Pelated Diseases // In: J. of Molecular Medicine. – 1997. – Vol. 75. – P. B206.

28. Khaldoyanidi S.K., Broide D.H., Sriramarao P. Comparison of hematopoiesis in bone marrow of allergen challenged and IL-5 transgenic mice. American Academy of Allergy, Asthma and Immunology 56th Annual Meeting, San Diego, California, USA // In: J. of Allergy and Clin. Immunol. – 1999. – Vol.

105. – P. S88.

29. Khaldoyanidi S.K., Burger J.A., Kipps T.J., Sriramarao P. CD44 and Lselectin support rolling of chronic lymphocytic leukemia cells on endothelial cells in vitro. Annual Scientific Meeting of the American Society of Hematology, 1999, New Orleans, USA // In: Blood – 1999. – Vol. 94, No (suppl. 1). – p.546a.

30. Khaldoyanidi S., Sleeman J., Herrlich P., Ponta H. Monoclonal antibody to CD44 splice variants enhances hematopoiesis in LTBMC via up-regulation of GM-CSF and IL-6. 13th International Symposium on Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of Leukemia, Lymphoma & Cancer, New York, USA // In: Acta Haematologica. – 2000. – Vol. 103(suppl 1). – P.19.

31. Khaldoyanidi S. Hyaluronan enhances hematopoietic recovery after 5-FU via up-regulation of cytokine production by bone marrow macrophages. Annual Scientific Meeting of the American Society of Hematology, 2001, Orlando, USA // In: Blood. – 2001. – Vol. 98, No 11. – p.297a.

32. Orlovskaya I.A., Matrosova V.Y., McClelland M., Khaldoyanidi S.K. Hyaluronan facilitates recovery of ablated hematopoiesis via activation of cytokine production by bone marrow macrophages. 32nd Annual Meeting of the International Society for Experimental Hematology, Paris, France, 2003. // In:

Experimental Hematology, Vol. 31, No. 7, Supplement 1– p. 152.

33. Khaldoyanidi S.K. The CD44/HA pathway regulates the hematopoiesissupportive function of the bone marrow microenvironment. 33rd Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, New Orleans, 2004. USA // In: Experimental Hematology, Vol. 32, No. 7, Supplement 1 – p.55.

34. Khaldoyanidi S., Schraufstatter I. CCL18/PARC is a novel factor that regulates hematopoiesis-supportive function of bone marrow microenvironmental niche. 34th Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, 2005, Glasgow, Scotland. // In: Experimental Hematology, Vol 33, No. 7, Supplement 1 – p. 126.

35. Serobyan N., Khaldoyanidi S. The role of hyaluronan in recruitment and retention of HSC in the hematopoietic niche. 35th Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, Minneapolis, 2006.

USA // In: Experimental Hematology, Vol. 34, No 9, Supplement 1 – p. 62.

36. Serobyan N., Khaldoyanidi S. 3D-parallel laminar flow chamber: A novel tool to study homing of human hematopoietic stem cells (HSC). 35th Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, Minneapolis, 2006. USA // In: Experimental Hematology, Vol. 34, No 9, Supplement 1 – p. 84.

37. Schraufstatter I., Orlovskaya I., Loring J., Khaldoyanidi S. The Cholinergic System is involved in Regulation of the Development of the Hematopoietic System. 37th Annual Scientific meeting of the International Society for Expe rimental Hematology, Boston, 2008. USA // In: Experimental Hematology, Vol. 36, No 7, Supplement 1– p.S13.

38. Schraufstatter I., Loring J., Khaldoyanidi S. Endogenously produced hyaluronan is required for mesodermal differentiation of human embryonic stem cells. 38th Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, 2009, Athens, Greece. // In: Experimental Hematology, Vol. 37, No 9, Supplement 1 – p. S58.

39. Schraufstatter I.U., DiScipio R.G., Khaldoyanidi S.K. Activation of nonneural acetylcholine receptors attenuates anaphylatoxin-mediated migration of mesenchymal stem cells. 38th Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, 2009, Athens, Greece. // In:

Experimental Hematology, Vol. 37, No 9, Supplement 1 – p. S58.

40. Goncharova V., Schraufstatter I., Orlovskaya I., Khaldoyanidi S. Hyaluronan associated with the bone marrow hematopoietic microenvironment is required for the recruitment of circulating hematopoietic stem cells into the bone marrow. 39th Annual Scientific meeting of the International Society for Experimental Hematology, 2010, Melbourne, Australia. // In: Experimental Hematology, Vol. 38, No 9, Supplement 1, – p. S32.

41. Valentina Goncharova, Shinji Iizuka, Ingrid Schraufstatter, Irina Orlovskaya, Yu Yamaguchi and Sophia Khaldoyanidi. Hyaluronan associated with the bone marrow hematopoietic microenvironment is required for the recruitment and retention of hematopoietic stem and progenitor cells in the bone marrow. Annual Scientific Meeting of the American Society of Hematology, 2010, Orlando, USA // In: Blood. Vol. 116, No 21. – p.1072.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.