WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ТОРОПЫГИН Сергей Григорьевич

разработка технологии

низкоэнергетической фемтосекундной

лазерной нанохирургии и микроскопии

тонких интраокулярных структур

(экспериментальное исследование)

14.01.07 глазные болезни

14.03.02 патологическая анатомия

 

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО “Тверская государственная медицинская академия” Росздрава, ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования” Росздрава и клинике глазных болезней университета Саарланда (Хомбург/Саар, Германия)

Научные консультанты:

докт. мед. наук, акад. РАМН, проф.                                Мошетова Л.К.

докт. мед. наук, член-корр. РАМН, проф.                                Франк Г.А.

Официальные оппоненты:

докт. мед. наук, проф.                                                        Гусева М.Р.

докт. мед. наук, проф.                                                        Шишкин М.М.

докт. мед. наук, проф.                                                        Ягубов А.С.

Ведущая организация: ГОУ ВПО “Российский университет дружбы народов” Рособразования

Защита состоится “ 05”  апреля 2011 года в “­10” часов на заседании диссертационного совета Д 208.071.03 при ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования” Росздрава (123995, Москва, Баррикадная, 2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования” Росздрава (125445, Москва, Беломорская, 19).

Автореферат разослан “___” ___________ 2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета                        Мосин И.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Микрохирургическая техника является “золотым” стандартом лечения в современной офтальмологии (Волков В.В. 1977, Гундорова Р.А. 1978, Краснов М.М. 1970, Мошетова Л.К. 1984, Нестеров А.П. 1982, Федоров С.Н. 1980), однако ее возможности ограничены разрешением операционного микроскопа и несовершенством стандартного инструментария. Недостаточная  прецизионность микрохирургических технологий особенно ощущается при работе на тонких интраокулярных структурах, таких как капсула хрусталика, сетчатка, внутренняя пограничная мембрана (ВПМ) сетчатки, эпиретинальные мембраны, ретинальные сосуды, толщина которых измеряется в микронах (Балашевич Л.И. 2007, Бойко Э.В. 2008, Нероев В.В. 2007, Тахчиди Х.П. 2005, Шишкин М.М. 2008, Kuhn F. 2002).

Одной из последних технических инноваций в офтальмологии является внедрение фемтосекундных (фс) лазеров (Корниловский И.М. 2009), способных создавать в ткани очень высокую плотность мощности – порядка 1012 Вт/см2 и больше – посредством дифракционно-ограниченной фокусировки излучения ближнего инфракрасного оптического диапазона в субфемтолитровом объеме. Энергия фемтосекундных лазерных импульсов разрушает химические связи в ткани-мишени и приводит к ее абляции (Knig K. 1994, Lubatschowski H. 2009).

Благодаря ультракороткой продолжительности импульсов, измеряемых в фемтосекундах, излучение фс-лазеров не сопровождается  побочным тепловым воздействием на окружающую ткань. Результатом является прецизионный “холодный” разрез ткани без коагуляционного коллатерального некроза. Преимуществами фс-лазера (по сравнению с предыдущими поколениями “холодных” лазеров) являются минимальный порог абляции, незначительная трансформация оптической энергии в деструктивную механическую энергию и практически полное отсутствие термического повреждения ткани (Knig K. 1998, Sugar A. 2002).

Исследования последнего десятилетия показали, что с помощью ультракоротких лазерных импульсов возможно выполнение прецизионных разрезов роговицы любой геометрии, что и сделало рефракционную хирургию аметропий и кератопластику основными областями применения фемтолазеров (Birnbaum F. 2010, Shah S.A. 2010); также появились пилотные работы по фс-лазерной факохирургии (Nagy Z. 2009).  В настоящее время на рынке представлены рефракционные фс-лазеры, работающие при энергии в импульсе от 10 нДж до 5 мкДж (Grabner G. 2008).

Низкоэнергетический фемтолазер генерирует импульсы с меньшей энергией, до 10-11 нДж. В отличие от рефракционного, излучение низкоэнергетического фс-лазера может доставляться до ткани-мишени через оптическое волокно без повреждения последнего. Кроме того, с помощью низкоэнергетического фс-лазера возможна не только прецизионная бесконтактная внутритканевая абляция тонких биоструктур, но и одновременное выполнение трехмерной мультифотонной сканирующей микроскопии ткани-мишени, что превращает инструмент в “видящий” лазерный скальпель (Knig K. 1994, Tirlapur U.K. 1999).

Пилотные работы научной группы проф. K. Knig впервые продемонстрировали выполнение операций с применением низкоэнергетического фемтолазера на внутриклеточных структурах, в том числе, генетическом материале. Авторы получали нанометровые разрезы клеточных органелл без коллатерального повреждения последних и перфорации клеточной стенки (Knig K. 1994-2010).

Возможность выполнения нанометровых разрезов ткани через оптическое эндоволокно делает низкоэнергетический фемтосекундный лазер привлекательным для его потенциального использования в хирургии тонких интраокулярных структур; тем не менее, в доступных литературных источниках подобных сообщений найдено не было.

Целью исследования явилась разработка технологии низкоэнергетической бесконтактной Ti:Sa фемтосекундной лазерной нанохирургии и микроскопии тонких интраокулярных структур в пилотном эксперименте in vitro.

Достижение поставленной цели осуществлялось путем решения следующих задач:

  1. Разработать технику бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной передней капсулы хрусталика (ПКХ) человека с помощью низкоэнергетического фс-лазера.
  2. Разработать технику бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной задней капсулы хрусталика (ЗКХ) свиньи с помощью низкоэнергетического фс-лазера.
  3. Разработать технику низкоэнергетической фемтолазерной бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной ВПМ сетчатки человека.

Изучить фотосенсибилизирующий эффект витального красителя ICG (indocyanine green, индоцианиновый зеленый, с англ.) по отношению к длине волны 750 нм, обосновать целесообразность его использования при абляции внутренней пограничной мембраны сетчатки с помощью фемтосекундного лазера.

  1. Изучить возможность выполнения бесконтактной ретинотомии с помощью низкоэнергетического фс-лазера при абляции и микроскопии слоя нервных волокон изолированной сетчатки свиньи.
  2. Изучить возможность выполнения бесконтактного интраваскулярного разрушения и микроскопии тромба ретинальной вены с помощью низкоэнергетического фс-лазера на модели тромбоза ветви центральной вены сетчатки (ЦВС) свиньи собственного дизайна.

Научная новизна

  1. Впервые разработана технология низкоэнергетической фс-лазерной нанохирургии и микроскопии тонких интраокулярных структур в пилотном эксперименте in vitro.
  2. Впервые разработана техника бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной ПКХ человека с помощью низкоэнергетического фс-лазера.
  3. Впервые разработана техника бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной ЗКХ свиньи с помощью низкоэнергетического фс-лазера.
  4. Впервые разработана техника низкоэнергетической фемтолазерной бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной ВПМ сетчатки человека.
  5. Впервые изучен фотосенсибилизирующий эффект витального красителя ICG по отношению к длине волны 750 нм при абляции ВПМ сетчатки, обоснована целесообразность его использования при удалении ВПМ с помощью фс-лазера.
  6. Впервые разработана техника бесконтактной ретинотомии с помощью низкоэнергетического фс-лазера при абляции и микроскопии слоя нервных волокон изолированной сетчатки свиньи.
  7. Впервые разработана техника бесконтактной интраваскулярной абляции и микроскопии с помощью низкоэнергетического фс-лазера на модели тромбоза ветви ЦВС свиньи собственного дизайна.

Практическая значимость

  1. Предложена технология низкоэнергетической фс-лазерной абляции в полостной офтальмохирургии, позволяющая прецизионно бесконтактно рассекать (иссекать) и, одновременно, визуализировать тонкие интраокулярные структуры (ПКХ, ЗКХ, ВПМ сетчатки и ретинальный слой нервных волокон) без коллатерального повреждения высокодифференцированных окружающих тканей.
  2. Показано, что при выполнении низкоэнергетического фс-лазерного рассечения и иссечения ПКХ и ЗКХ отсутствует необходимость применения витальных красителей для улучшения их визуализации. В тоже время использование витального красителя ICG при минимальных концентрации (0,05%) и экспозиции (30 с) при выполнении фс-лазерного удаления ВПМ сетчатки является целесообразным.
  3. Предложена технология низкоэнергетической фс-лазерной абляции и микроскопии для контролируемого бесконтактного разрушения тромба внутри непроходимой ретинальной вены для немедленного восстановления кровотока без повреждения эндотелиальной выстилки, вскрытия стенки сосуда и его катетеризации.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Концепция низкоэнергетической фс-лазерной нанохирургии и микроскопии различных тонких интраокулярных структур. Техника бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной ПКХ человека с помощью низкоэнергетического фемтосекундного лазера.
  2. Техника бесконтактной нанохирургии и микроскопии изолированной ЗКХ свиньи с помощью низкоэнергетического фс-лазера.
  3. Техника низкоэнергетической фемтолазерной бесконтактной нанохирургии и сканирующей микроскопии изолированной ВПМ сетчатки человека. Фотосенсибилизирующий эффект витального красителя ICG по отношению к длине волны 750 нм, а также целесообразность его (красителя) использования при удалении внутренней пограничной мембраны сетчатки с помощью фемтосекундного лазера.
  4. Техника бесконтактной ретинотомии с помощью низкоэнергетического фс-лазера при абляции и микроскопии слоя нервных волокон изолированной сетчатки свиньи.
  5. Техника бесконтактной интраваскулярной абляции и микроскопии с использованием низкоэнергетического фемтосекундного лазера на модели тромбоза ветви центральной вены сетчатки свиньи собственного дизайна.

Практическое внедрение полученных результатов

Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения микрохирургии глаза ГУЗ “Областная клиническая больница” г. Твери, отделения микрохирургии глаза № 2 МУЗ “Городская клиническая больница №7” г. Твери, отдела травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования ФГУ “Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца” Росмедтехнологий. Основные положения диссертации используются при чтении лекционного курса студентам, клиническим ординаторам и интернам кафедры глазных болезней ГОУ ВПО “Тверская государственная медицинская академия” Росздрава и курсантам кафедры офтальмологии с курсом детской офтальмологии, курсом офтальмоонкологии и орбитальной патологии ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования” Росздрава (Москва).

Апробация работы

Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на конгрессах немецкого общества офтальмологов (DOG) в 2005, 2006, 2007, 2009 гг. в Германии, конгрессе европейской ассоциации исследователей органа зрения (EVER) в 2006 г. в Португалии, международных научно-практических конференциях немецкого фонда Александра фон Гумбольдта (Humboldt-Kolleg) в 2006, 2007, 2008 гг. в Пензе, в 2010 г. в Москве, заседаниях Тверского отделения Общероссийской общественной организации “Общество офтальмологов России” в 2006-2010 гг. в Твери, международных научно-практических конференциях “Современные технологии лечения витреоретинальной патологии” в 2007, 2008 гг. в Москве, конгрессах европейского общества катарактальных и рефракционных хирургов (ESCRS) в 2007 г. Швеции, в 2008 г. в Германии, научно-практической конференции “Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения” в 2008 г. в Москве, конгрессе немецких офтальмохирургов (DOC) в 2008 г. в Германии, научно-практической конференции офтальмологов “Ижевские родники” в 2008 г. в Ижевске, научно-практической конференции “Лазеры в офтальмологии: вчера, сегодня, завтра” в 2009 г. в Москве, юбилейной конференции “Тверская государственная медицинская академия: 55 лет на Тверской земле” в 2009 г. в Твери, научной конференции молодых ученых МГМСУ “Актуальные проблемы современной медицины” в 2010 г. в Москве.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 51 печатной работе. Из них, 15 – в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук (10 – в отечественной печати, 5 – в зарубежных изданиях). Получен патент РФ на изобретение № 2364383 от 20.08.2009

Объем и структура работы

Работа изложена на 242 страницах машинописи, иллюстрирована 12 таблицами, 59 рисунками, фотографиями и диаграммами. Список литературы включает 510 источников, из них 91 – отечественных и 419 – иностранных. Диссертация состоит из введения, семи глав, содержащих данные обзора литературы, материалов и методов, собственных  экспериментальных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы исследования. Работа состояла из пяти ex vivo экспериментальных серий с применением низкоэнергетического фемтолазера: передней капсулотомии в препаратах ПКХ человека, задней капсулотомии в препаратах ЗКХ свиньи, абляции ВПМ сетчатки человека, ретинотомии при абляции слоя нервных волокон сетчатки свиньи и интраваскулярной хирургии в препаратах магистральных ретинальных вен свиньи.

Фрагменты ПКХ (n = 22) удалялись в ходе стандартной ультразвуковой факоэмульсификации по поводу неосложненной начальной возрастной катаракты у 19 пациентов на 22 глазах при выполнении переднего кругового непрерывного капсулорексиса диаметром 5,0-5,5 мм. Препараты ЗКХ (n = 12) были получены в 12 энуклеированных свиных глазах при стандартной факоаспирации с помощью заднего кругового непрерывного капсулорексиса диаметром 4,5-5,0 мм.

Пилинг ВПМ сетчатки (n = 50) был произведен в ходе стандартной витрэктомии у 50 пациентов на 50 глазах по поводу клинически значимого диабетического макулярного отека вокруг макулярной зоны, не доходя до магистральных сосудистых аркад около 0,5 диаметра диска зрительного нерва. В 24 случаях пилинг ВПМ выполнялся без интраоперационного окрашивания мембраны; в остальных 26 случаях ВПМ удалялась после ее предварительного окрашивания 0,05% раствором ICG (Pulsion Medical Systems AG, Германия) в течение 30 с в воздушной среде. Четырнадцать из 26 окрашенных ВПМ сетчатки были вторично помещены в более концентрированный (0,5%) раствор ICG на 1 мин., после чего промыты в растворе BSS plusTM в течение 2 мин. Таким образом, 10 ВПМ остались слабо окрашенными и 12 мембран стали интенсивно окрашенными.

Препараты слоя нервных волокон сетчатки (n = 42) и магистральных ретинальных вен (n = 25) готовились при препаровке 47 энуклеированных свиных глаз. Для этого в каждом глазу иссекались 1-2 прямоугольных фрагмента сетчатки 6 х 8 мм с магистральными ретинальными сосудами, отступя 1 мм от диска зрительного нерва. Для проведения эксперимента в оригинальной модели окклюзии ветви ЦВС в 21 препарате в просвет магистральной ретинальной вены имплантировался отрезок нерезорбирующейся черной полиамидной нити диаметром 10-0 и длиной 8 мм (3 глаза – 5 препаратов) или светлого человеческого волоса длиной 8 мм (8 глаз – 16 препаратов).

Удаленные ex vivo препараты помещались в специальные герметичные тканевые камеры с двумя окнами (MiniCeMTM, JenLab GmbH, Германия) и сохранялись до направления в лазерную лабораторию при температуре 50 C в течение не более 6 часов.

Методы исследования. В работе использованы два низкоэнергетических твердотельных Ti:Sa фемтолазера ChameleonTM и VitesseTM (Coherent Inc., США) с диодной накачкой, работающих в режиме синхронизации мод и излучающих в ближней инфракрасной области спектра (таб. 1).

Фемтолазер ChameleonTM при длине волны 750 нм использовался для абляции и микроскопии в серии экспериментов с ЗКХ, ВПМ сетчатки и моделью окклюзии ветви ЦВС; при длине волны 760 нм – для проведения ретинотомии. В эксперименте с ПКХ, а также для выполнения ретинотомии применялся фемтолазер VitesseTM при длине волны 800 нм. Выбор лазера зависел от доступности того или иного аппарата в лаборатории в данный момент и не ставил задачи сравнения биологического эффекта между ними.

Таблица 1

Технические характеристики фемтолазеров, использованных в эксперименте

Тип лазера

Низкоэнергетический  Ti:Sa ChameleonTM

Низкоэнергетический  Ti:Sa VitesseTM

Длительность импульса, фс

< 190

< 160

Длина волны, нм

715-930,

регулируемая

800,

фиксированная

Частота, МГц

90

80

Мощность на выходе, Вт

1,0

0,8

Энергия импульса, нДж

11

2,5

Плотность энергии, Дж/см2

5,5

1,3

Оптическая система состояла из фс-лазера, лазерного сканирующего микроскопа LSM 410 (Carl Zeiss Jena GmbH, Германия) и интерфейса, включающего расширитель пучка, моторизованный делитель мощности, скоростной затвор, регулятор мощности и устройство синхронизации (JenLab GmbH, Германия). Лазерное излучение фокусировалось в субмикрометровое дифракционно-ограниченное пятно с помощью 40-кратного иммерсионного объектива с числовой апертурой 1,3 (Carl Zeiss Jena GmbH, Германия). Мощность лазерного излучения измерялась на выходе из объектива с помощью ваттметра (FieldMaster™, Coherent Inc., США).

С помощью фс-лазеров выполнялась бесконтактная мультифотонная сканирующая микроскопия и абляция изучаемых препаратов в среде солевого раствора, которая является типичной для проведения большинства стандартных интраокулярных манипуляций. Сканирующая микроскопия производилась в режимах трансмиссии и  аутофлюоресценции при мощности излучения в лазерном импульсе от 2 до 4 мВт. Для выполнения абляции препаратов тем же самым фемтолазером мощность его излучения увеличивалась на порядок и более. Применялись следующие паттерны абляции препаратов: по форме – линейные, плоскостные, по глубине – полнослойные и послойные (поверхностные и внутритканевые).

Для выполнения световой микроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) препараты фиксировались в растворе 1% фосфатно-буферного глютаральдегида, 1% параформальдегида и 0,1% пикриновой кислоты при температуре 40С в течение 18 часов. Последующая фиксация была выполнена в растворе 0,06 моль/л фосфатного буфера и 2% тетроксида осмия при комнатной температуре в течение 90 мин. в темноте. После стандартной дегидратации препараты были залиты в эпоксидную смолу; затем с помощью ультратома готовились полутонкие (500 нм) пошаговые срезы. Полутонкие срезы препаратов исследовались с использованием светового микроскопа Vanox-S (Olimpus, Германия) (рис. 2.8), а ультратонкие – с помощью трансмиссионного микроскопа Tecnai™ G2 (FEI Company, США).

Для проведения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) препараты сетчатки фиксировались в растворе 5% глютаральдегида, окрашивались в растворе 2% тетроксида осмия, дегидратировались, высушивались до критической точки и покрывались напылением платины. Сканирование и фотографирование препаратов осуществлялось с использованием сканирующего микроскопа FEI Tecnai™ FEG XL30 ESEM (FEI Company, США).

Основную группу исследования составили 135 препаратов, которые подвергались фс-лазерной микроскопии и абляции, а затем исследовались с помощью световой и электронной микроскопии. В 16 препаратах контрольной группы фс-лазерная абляция не производилась; однако, эти ткани исследовались при фс-лазерной, световой и электронной микроскопии.

Методика анализа результатов исследования. Полученные цифровые данные выражались в единицах международной системы измерений. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью статистической программы SPSS 10,0 for Windows (SPSS Inc., США). Вариационный анализ (ANOVA) был проведен для оценки различий в сравниваемых группах. Post hoc тесты включали анализ множественных сравнений Bonferroni и Dunnett. Были рассчитаны средняя ширина лазерных разрезов, средняя ширина коллатерального повреждения ткани, стандартные отклонения от средних величин и 95% доверительные интервалы. Данные считались статистически достоверными при p < 0,05.

Организация и дизайн исследования. Работа является пилотным ex vivo экспериментальным исследованием, выполненным на тонких структурах глаза человека и свиньи в 2004-2010 гг. в рамках гранта федерального канцлера Германии фонда Александра фон Гумбольдта (Германия).

Первый этап исследования включал приготовление препаратов, фс-лазерную микроскопию и абляцию. Все операции, в ходе которых удалялись ПКХ и ВПМ сетчатки, выполнялись в клинике глазных болезней (директор – Prof. Dr. med. B. Seitz) университета Саарланда (Хомбург/Саар, Германия). Свиные глаза энуклеировались на местной скотобойне непосредственно после забоя животного. Все препараты готовились автором исследования. Фемтолазерная микроскопия и абляция выполнялись в лазерном отделе (директор – Prof. Dr. rer. nat. K. Knig) института биомедицинских технологий Фраунгофера (С.-Ингберт, Германия) автором исследования.

На втором этапе исследования выполнялись световая микроскопия, ТЭМ и СЭМ препаратов в отделе электронной микроскопии, отделении анатомии и клеточной биологии (директор – Prof. Dr. med. P. Mestres) университета Саарланда (Хомбург/Саар, Германия).

На третьем, заключительном, этапе данной работы автором производились системный анализ, статистическая обработка, публикация результатов исследования и написание диссертации в целом. Этап выполнялся на кафедре глазных болезней ГОУ ВПО “Тверская государственная медицинская академия” Росздрава (Тверь) (ректор – докт. мед. наук, проф. М.Н. Калинкин) и кафедре офтальмологии с курсом детской офтальмологии, курсом офтальмоонкологии и орбитальной патологии ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования” Росздрава (Москва) (зав. кафедрой и ректор – акад. РАМН, докт. мед. наук, проф. Л.К. Мошетова).

Дизайн и методики исследования были этически приемлемы. Исследования структур глаза человека ex vivo одобрены Этическим комитетом университета Саарланда в Германии (протокол № 172/05 от 23.01.2006) и Этическим комитетом ГОУ ВПО “Тверская государственная медицинская академия” Росздрава в России (протокол от 12.10.2009); все положения Хельсинкской декларации были соблюдены.

Результаты исследования

Низкоэнергетическая фемтолазерная нанохирургия ПКХ. В серию исследования было включено 22 ПКХ: в 20 препаратах выполнялась низкоэнергетическая фс-лазерная передняя капсулотомия, две ПКХ являлись контрольными. В каждом препарате выбирались от двух до четырех несмежных участков, в каждом из которых производилось от 10 до 18 линейных внутритканевых фс-лазерных разрезов.

Фемтолазерная сканирующая микроскопия демонстрировала высокую точность, однородность нано- и микрометровых разрезов, а также отсутствие коллатерального повреждения ткани, окружающей область абляции. Было показано превосходство в прецизионности лазерной абляции капсулы перед стандартным передним непрерывным капсулорексисом. При использованных параметрах лазерного излучения абляция ПКХ не сопровождалась образованием газовых пузырьков по ходу разрезов капсулы (рис. 1).

Рис. 1. Фемтолазерная микроскопия одной и той же области ПКХ после внутритканевой линейной абляции (70 мВт, 1 с) в режимах трансмиссии (А) и аутофлуоресценции (Б). Стрелка указывает на край ПКХ, сформированный в ходе капсулорексиса. Средняя ширина абляции составляет 750 нм (!). Обращает внимание большая прецизионность лазерных разрезов по сравнению с разрезом капсулы при капсулорексисе, а также большая ширина лазерных разрезов ПКХ при аутофлюоресценции по сравнению с режимом трансмиссии (при данном увеличении в режиме трансмиссии (А) линейные разрезы визуализируются с трудом).

При ТЭМ выявлялись лазерные разрезы ПКХ в виде округлых или овальных внутритканевых дефектов капсулы, окруженные ободком уплотнения ткани толщиной менее 100 нм. Разрезы имели правильную форму и соответствовали снимкам при фс-лазерной микроскопии; их ширина находилась в прямой зависимости от параметров лазерного излучения. В просвете разрезов обнаруживались вуалеподобные включения, по всей видимости представляющие собой тканевой детрит (рис. 2).

Была показана прямо пропорциональная зависимость ширины фс-лазерных разрезов ПКХ от мощности и экспозиции излучения (рис. 3 и 4).

Рис. 2. ТЭМ после фс-лазерной внутритканевой линейной абляции ПКХ (70 мВт, 1 с): А – при малом увеличении, Б-Е – при большем увеличении микроскопа (цифры соответствуют номерам разрезов на снимке А). Обращает внимание овальное сечение разрезов диаметром в среднем 750 нм (!) и отсутствие коллатерального повреждения ткани вокруг разрезов.

Рис. 3. Зависимость средней ширины фс-лазерных разрезов ПКХ от мощности излучения при постоянной экспозиции (1 с). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения от среднего.

Рис. 4. Зависимость средней ширины фс-лазерных разрезов ПКХ от экспозиции излучения при постоянной мощности (100 мВт). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения от среднего.

Таким образом, в нашем исследовании было впервые показано, что фс-лазерная система позволяет выполнять in vitro прецизионный разрез ПКХ, превосходящий по регулярности и однородности рассечение капсулы, получаемое при проведении переднего кругового капсулорексиса (рис. 1). Мы продемонстрировали, что фс-лазерная передняя капсулотомия не требует применения витальных красителей перед ее проведением и не сопровождается термическим коллатеральным повреждением ткани, окружающей область абляции (рис. 1 и 2). При этом минимальный диаметр разреза ПКХ составил несколько сотен нанометров (рис. 1-4). Необходимы дальнейшие исследования техники низкоэнергетической фс-лазерной передней капсулотомии в ходе факохирургии.

Низкоэнергетическая фемтолазерная нанохирургия ЗКХ. Фс-лазерная внутритканевая и поверхностная абляция без использования витальных красителей при мощности 95 мВт выполнялась в 10 ЗКХ основной группы; две ЗКХ являлись контрольными. В каждом препарате выбирались от двух до четырех несмежных участков; в каждом участке было сделано от 10 до 16 линейных лазерных разрезов. Выявлялась прямо пропорциональная зависимость ширины лазерной капсулотомии от времени излучения  (таб. 2).

Таблица 2

Характеристика препаратов ЗКХ основной группы (n = 10)

Глубина абляции

Экспозиция лазерного излучения, с

Количество паттернов линейной абляции

Средняя ширина разрезов, ± стандартное отклонение, мкм

Внутритканевая (8)

1 (2)

39

0,69 ± 0,19

2 (2)

50

1,75 ± 0,36

3 (2)

46

2,28 ± 0,30

4 (2)

23

3,34 ± 0,30

Поверхностная (2)

4 (2)

22

2,81 ± 0,50

Примечание к таблице 2. Цифры в скобках первых двух столбцов указывают количество препаратов, подвергнутых фс-лазерной абляции.

Фс-лазерная микроскопия и ТЭМ демонстрировали разрезы без коллатерального повреждения окружающей ткани (рис. 5-8), превосходящие в прецизионности задний капсулорексис и капсулотомию с помощью ножниц. Лазерная микроскопия не выявляла пузырьков по ходу абляции (рис. 5 и 7). При ТЭМ по краю разрезов определялось уплотнение ЗКХ до 100 нм, а в просвете разрезов – нежные вуалеподобные включения (рис. 7 и 8).

Рис. 5. Фс-лазерная микроскопия одной и той же области ЗКХ после внутритканевой линейной абляции (95 мВт, 2 с) в режимах трансмиссии (А) и аутофлуоресценции (Б). Горизонтальная стрелка указывает на край ЗКХ, сформированный при капсулорексисе, вертикальная – на край препарата, полученный с помощью ножниц. Средняя ширина абляции составляет 650 нм (!). Обращает внимание большая ширина линейных разрезов ЗКХ в режиме аутофлюоресценции по сравнению с режимом трансмиссии.

Рис. 6. ТЭМ после фс-лазерной внутритканевой линейной абляции ЗКХ (95 мВт, 2 с): А – при малом увеличении (стрелки указывают на сечения лазерных разрезов), Б-Д – при большем увеличении микроскопа (цифры соответствуют номерам разрезов на снимке А). Обращает внимание округлое сечение четко очерченных разрезов диаметром в среднем 650 нм (!).

Рис. 7. Фс-лазерная микроскопия одной и той же области ЗКХ после поверхностной линейной абляции (95 мВт, 4 с) в режимах трансмиссии (А) и аутофлуоресценции (Б). Горизонтальная стрелка указывает на край ЗКХ, сформированный при капсулорексисе, вертикальная – на край препарата, полученный с помощью ножниц. Средняя ширина абляции составляет 2,5 мкм. Обращает внимание большая ширина линейных лазерных разрезов ЗКХ в режиме аутофлюоресценции по сравнению с режимом трансмиссии.

Рис. 8. ТЭМ после фс-лазерной поверхностной линейной абляции ЗКХ (95 мВт, 4 с): А – при малом увеличении (стрелки указывают на сечения лазерных разрезов), Б-Г – при большем увеличении микроскопа (цифры соответствуют номерам разрезов на снимке А). Обращает внимание овальное сечение четко очерченных разрезов диаметром в среднем 2,5 мкм, а также отсутствие коллатерального повреждения ткани ЗКХ вокруг разрезов.

Таким образом, в нашем исследовании впервые предложена концепция бесконтактной хирургии ЗКХ с помощью низкоэнергетического фс-лазера, который позволяет выполнять прецизионную абляцию капсулы, превосходящую по качеству разрезы при заднем круговом капсулорексисе и рассечение ЗКХ с помощью микроножниц (рис. 5 и 7).  Было показано, что выполнение фс-лазерной задней капсулотомии не требует применения витальных красителей и не сопровождается коллатеральным повреждением ткани, окружающей область абляции (рис. 5-8). Минимальный диаметр разрезов капсулы составил несколько сотен нанометров (рис. 5 и 6), что позволяет говорить о нанохирургии ЗКХ. Настоящая in vitro работа предполагает  продолжение исследований фс-лазерной нанохирургии ЗКК в эксперименте in vivo.

Низкоэнергетическая фемтолазерная нанохирургия ВПМ сетчатки выполнялась в 44 препаратах основной группы; 6 препаратов являлись контрольными. Для изучения эффекта воздействия низкоэнергетического фс-лазера на подлежащую сетчатку также выполнялась абляция 6 препаратов ретинального слоя нервных волокон свиных глаз.

Линейная фс-лазерная абляция была выполнена в 20 неокрашенных, 8 слабо окрашенных, 10 интенсивно окрашенных препаратах ВПМ и 4 неокрашенных препаратах слоя нервных волокон сетчатки. В каждом препарате было выбрано от двух до восьми несмежных участков, в каждом из которых было сделано от 2 до 22 линейных фс-лазерных разрезов. В 32 ВПМ производилась послойная (внутритканевая и поверхностная) абляция ВПМ (в 4 из них – плоскостная абляция), в 10 препаратах – полнослойная абляция ВПМ (в 2 из них – плоскостная абляция), в 4 препаратах – послойная абляция слоя нервных волокон сетчатки.

В неокрашенных ВПМ сетчатки с помощью фс-лазера были получены линейные прецизионные однородные разрезы мембран без коллатерального повреждения окружающей ткани (рис. 9 и 10).

Рис. 9. Фс-лазерная микроскопия одной и той же области неокрашенной ВПМ после внутритканевой линейной абляции (50 мВт, 0,5 с) в режимах трансмиссии (А) и аутофлуоресценции (Б). Средняя ширина абляции составляет 750 нм (!). Обращает внимание высокая прецизионность лазерных разрезов по сравнению с краями препарата, полученными при макулорексисе, а также большая ширина лазерных разрезов ВПМ в режиме аутофлюоресценции по сравнению с режимом трансмиссии.

Рис. 10. ТЭМ двух неокрашенных ВПМ под разным увеличением после фс-лазерной внутритканевой линейной абляции (50 мВт, 0,5 с). Обращает внимание округлое сечение внутритканевых лазерных разрезов (стрелки), составляющих в среднем 750 нм (!) в диаметре, а также отсутствие какого-либо коллатерального повреждения ткани ВПМ вокруг разрезов.

В окрашенных ВПМ красителем ICG ширина абляции была больше, чем в неокрашенных; при этом обнаруживалась деформация ВПМ (рис. 11).

Рис. 11. Фс-лазерная микроскопия одной и той же области ВПМ, интенсивно окрашенной ICG, перед (А и Б) и после (В и Г) полнослойной линейной абляции (10 мВт, 0,5 с) в режимах трансмиссии (А и В) и аутофлуоресценции (Б и Г). В сравнении с неокрашенной ВПМ на рис. 9 при меньших параметрах лазерного излучения обнаруживается большая, в среднем 6 мкм, ширина абляции, сморщивание (деформация) ткани вдоль лазерных разрезов, а также более интенсивная поверхностная аутофлюоресценция ВПМ. Обращает внимание большая ширина лазерных разрезов ВПМ сетчатки в режиме аутофлюоресценции по сравнению с режимом трансмиссии.

Была выявлена достоверная (p < 0,001) прямопропорциональная зависимость ширины линейной абляции ВПМ от параметров лазерного излучения. Окраска мембран ICG позволяла достоверно (p < 0,001) снижать параметры лазерного излучения, необходимые для абляции, что свидетельствовало о фотоэффекте красителя. В окрашенных ВПМ ширина абляции была больше, чем в неокрашенных препаратах, и была прямопропорциональна интенсивности окраски. Было показано, что при всех использованных параметрах фс-лазерного излучения слой нервных волокон сетчатки был особенно резистентен к лазерному повреждению (рис. 12 и 13).

Рис. 12. Зависимость среднего диаметра линейной абляции ВПМ от мощности лазерного импульса при постоянной (0,5 с) экспозиции. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения от среднего. Диаметр линейных разрезов достоверно (p < 0,001) отличается между интенсивно, слабо окрашенными и неокрашенными препаратами ВПМ сетчатки. Показано, что при использованных значениях мощности и экспозиции лазерного излучения слой нервных волокон сетчатки не повреждается.

Рис. 13. Зависимость среднего диаметра линейной абляции ВПМ и слоя нервных волокон сетчатки от экспозиции лазерного импульса при постоянной (50 мВт) мощности. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения от среднего. Диаметр лазерных разрезов достоверно (p < 0,001) различается между интенсивно окрашенными, слабо окрашенными и неокрашенными препаратами ВПМ сетчатки. Показано, что экспозиции лазерного излучения до 0,5 с являются подпороговыми для повреждения слоя нервных волокон сетчатки.

Для плоскостной абляции ВПМ паттерн фс-лазерного излучения в виде квадрата фокусировался на поверхность или в толщу мембраны. В зависимости от выбранных параметров луча наблюдалось послойное (рис. 14 и 15) или полнослойное прецизионное иссечение ткани в форме квадрата запланированного размера. В области лазерного воздействия происходило образование газовых пузырьков от 2-30 мкм в диаметре, что не сказывалось на прецизионности абляции (рис. 14); в зависимости от их величины пузырьки спонтанно резорбировались в течение 1-10 мин. после абляции.

Рис. 14. Аутофлуоресцентная фс-лазерная микроскопия одной и той же области ВПМ, слабо окрашенной ICG, перед (А) и после (Б) поверхностной плоскостной абляции (25 мВт, 0,5 с) в форме квадрата 30х30 мкм. Обращает внимание наличие газовых пузырьков разного диаметра в проекции зоны абляции препарата ВПМ.

Рис. 15. ТЭМ слабо окрашенной ВПМ после фс-лазерной плоскостной абляции ее внутренней поверхности (25 мВт, 0,5 с). Горизонтальная стрелка показывает край абляции препарата в виде ступеньки, вертикальные стрелки – ровную поверхность участка мембраны после его плоскостной абляции. Толщина удаленного слоя ВПМ составляет около толщины мембраны, то есть порядка  1,5 мкм.

Таким образом, в нашем исследовании мы впервые продемонстрировали возможность выполнения прецизионной бесконтактной абляции ВПМ сетчатки с помощью низкоэнергетического фс-лазера (рис. 9-11, 14 и 15). Была выявлена достоверная (p < 0,001) прямопропорциональная зависимость ширины линейной абляции ВПМ от параметров лазерного излучения. Диаметр линейных разрезов мембран, полученных при минимальных энергетических параметрах, составлял лишь несколько сотен нанометров (рис. 9, 10, 12 и 13), что позволяет говорить о нанохирургии ВПМ. Используя окраску мембран ICG удалось достоверно (p < 0,001) снизить параметры лазерного излучения, необходимые для абляции ВПМ. В окрашенных препаратах ширина линейной абляции была больше, чем в неокрашенных, и, к тому же, прямопропорциональна интенсивности окраски (рис. 12 и 13). Отмечено, что при использованных параметрах излучения слой нервных волокон сетчатки не повреждался вообще (рис. 12) или повреждался очень незначительно (рис. 13), что свидетельствовало о потенциальной безопасности фс-лазерной нанохирургии ВПМ.

Низкоэнергетическая фемтолазерная ретинотомия. Внутритканевая линейная фс-лазерная абляция ретинального слоя нервных волокон была выполнена в 34 препаратах сетчатки; два препарата являлись контрольными.

Фс-лазерная микроскопия демонстрировала генерацию газовых пузырьков диаметром от 1 до 40 мкм по ходу паттерна линейной абляции сетчатки; пузырьки подвергались коллапсу спустя несколько десятков секунд после абляции. В центре спадающегося пузырька появлялся светлый участок, свидетельствующий о феномене кавитации. По краю кавитации наблюдалось появление темной зоны, что свидетельствовало об уплотнении ткани (рис. 16). В режиме аутофлуоресценции паттерны линейной ретинотомии выглядели как прерывистые линии с участками люминисценции (рис. 17).

По аналогии со снимками, полученными при лазерной микроскопии, фс-лазерная ретинотомия при ТЭМ и СЭМ представляла собой линейные паттерны, состоящие из зон кавитации, чередующихся с мостиками плотной гомогеннизированной ткани. Электронная микроскопия не выявляла коллатерального повреждения окружающей ткани сетчатки (рис. 18 и 19).

Рис. 16. Трансмиссионная фс-лазерная микроскопия слоя нервных волокон сетчатки после выполнения внутритканевой линейной абляции. Разрез слева (30 с после абляции и резорбции газовых пузырьков при 85 мВт и 4 с): короткие стрелки указывают на зоны уплотнения ткани, звездочки – на участки кавитации. Разрез справа (5 с после абляции при 85 мВт и 2 с): длинные стрелки указывают на газовые пузырьки по ходу разреза.

Рис. 17. Аутофлуоресцентная фс-лазерная микроскопия слоя нервных волокон сетчатки после выполнения 7 линейных лазерных разрезов при мощности излучения 300 мВт и при различной экспозиции: a, b – 1 с; c, d – 0,5 с; g – 0,25 с; e, f – 0,125 с.

Рис. 18. ТЭМ слоя нервных волокон сетчатки после выполнения линейной фс-лазерной ретинотомии (90 мВт, 1 с). Нервные волокна (NF) визуализируются в виде широких, более ярких полос, в то время как отростки мюллеровских клеток (MC) – в виде узких, более темных структур. Между участками кавитации (стрелка) по ходу линейного лазерного разреза прослеживаются полные и неполные тканевые мостики.

Рис. 19. СЭМ паттерна внутритканевой линейной абляции слоя нервных волокон сетчатки при мощности лазерного излучения 90 мВт и экспозиции 1 с. Линейный лазерный разрез сканирован на глубине 2 мкм от внутренней поверхности сетчатки.

Была выявлена прямопропорциональная зависимость ширины линейной абляции слоя нервных волокон сетчатки при различных параметрах фс-лазерного луча. В таб. 3 показано изменение ширины ретинотомических разрезов при постоянной мощности импульса и различной экспозиции фемтолазерного излучения на примере одного из препаратов слоя нервных волокон сетчатки.

Таблица 3

Зависимость ширины паттернов линейной абляции ретинального слоя нервных волокон при постоянной мощности фемтолазерного излучения 

(195 мВт)

Экспозиция излучения, секунды

0,5

2

4

Количество паттернов линейной абляции, шт.

23

48

21

Средняя ширина абляции, мкм

2,8

4,5

6,4

Стандартное отклонение, ± мкм

0,4

1,0

1,3

Таким образом, настоящее экспериментальное исследование впервые продемонстрировало технику бесконтактной фс-лазерной ретинотомии (рис. 16-19). Было показано, что низкоэнергетический фемтолазер является самым прецизионным инструментом для рассечения / иссечения сетчатки. В отличие от лазеров с более продолжительными импульсами (в частности, Er:YAG-эндолазера с длиной волны 2,94 мкм и продолжительностью импульса 300 мкс) он не приводит к коллатеральному термическому повреждению ретинальных структур – ВПМ и слоя нервных волокон. Высокая прецизионность получаемых нано- (ВПМ) и микрометровых (слой нервных волокон) “холодных” разрезов структур сетчатки и возможность применения фемтолазера в среде обычного солевого раствора делают такой инструмент перспективным для дальнейшей апробации in vivo как в эксперименте, так и в клинике.

Низкоэнергетическая фемтолазерная интраваскулярная хирургия выполнялась в 23 препаратах магистральных ретинальных вен основной группы; 2 препарата оставались контрольными.

В 2 препаратах паттерн фс-лазерной абляции в форме пятна диаметром 50 мкм фокусировался на скоплении форменных элементов крови в просвете магистральной вены. При этом были получены округлые дефекты кровяных сгустков с четкими границами, приблизительно (в связи с флотацией форменных элементов крови) соответствующие по форме и размеру паттерну абляции. Отмечалось отсутствие коллатерального повреждения сосудистой стенки и форменных элементов крови вокруг зоны абляции (рис. 20).

Рис. 20. Трансмиссионная фс-лазерная микроскопия магистральной ретинальной вены до (А) и после (Б) выполнения фс-лазерной точечной абляции форменных элементов крови паттерном в форме пятна диаметром 50 мкм (103 мВт, 0,5 с). Черные стрелки указывают на стенки вены, просвет которой заполнен форменными элементами крови, белые – на округлую зону абляции. Обращает внимание высокая прецизионность абляции, отсутствие коллатерального повреждения сосудистой стенки и форменных элементов крови вокруг зоны абляции (Б).

На модели тромбоза ветви ЦВС с имплантированной в просвет вены полиамидной нитью 10/0 (5 препаратов) и человеческим волосом (16 препаратов) паттерны линейной внутритканевой абляции  ориентировались параллельно длиннику инородного материала. Фс-лазерная микроскопия, световая микроскопия и ТЭМ выявляли линейные внутритканевые разреры шовного материала и волоса, которые носили несколько иррегулярный характер, что проявлялось в неравномерности ширины абляции на протяжении разреза волокна. Средняя ширина фс-лазерной абляции нити при 103 мВт с экспозицией 0,5 с составляла 5,2 ± 0,7 мкм, волоса при 136 мВт с экспозицией 0,5 с – 3,4 ± 1,0 мкм (рис. 21 и 22). Большая ширина абляции нити при меньшей мощности излучения была связана, по-видимому, с большей оптической плотностью ткани волоса.

Рис. 21. Фс-лазерная микроскопия магистральной ретинальной вены после фс-лазерной внутритканевой линейной абляции волоса, имплантированного в просвет вены (136 мВт, 0,5 с), в режимах трансмиссии (А) и аутофлуоресценции (Б): в – волос, п – просвет вены, с – стенки вены. Обращает внимание некоторая иррегулярность разреза, большая ширина разреза в режиме аутофлуоресценции и отсутствие коллатерального повреждения ткани, окружающей область абляции. Ширина абляции в зоне, указанной стрелкой, в режиме аутофлуоресценции составила 4,4 мкм.

Рис. 22. ТЭМ сечения той же магистральной ретинальной вены, что и на рис. 21, то есть после выполнения фемтолазерной внутритканевой линейной абляции (стрелки) волоса, имплантированного в просвет вены. Просвет вены частично заполнен форменными элементами крови. Б – ТЭМ фрагмента препарата, выделенного рамкой на снимке А. Обращает внимание округлое сечение фс-лазерного разреза волоса (в) диаметром 3,5 мкм (стрелки) с тканевым детритом внутри, практическое отсутствие термического коллатерального повреждения ткани волоса вокруг разреза и интактность внутренней поверхности сосудистой стенки (с).

Таким образом, в настоящем исследовании было впервые показано, что применение низкоэнергетического фемтолазера перспективно при тромбозах ветвей ЦВС (рис. 20-22). В эксперименте на модели окклюзии ретинальной вены собственного дизайна было продемонстрировано, что с помощью фемтолазера выполнима бесконтактная внутрисосудистая абляция материала, окклюдирующего просвет магистральной вены сетчатки (рис. 21 и 22). Фемтолазер способен производить прямое разрушение (абляцию) тромбирующего материала для немедленного восстановления кровотока в непроходимом сосуде; при этом вмешательство не сопровождается повреждением стенки ретинальной вены (в том числе эндотелиальной выстилки сосуда) и не требует ее катетеризации.

Низкоэнергетическая фемтолазерная трехмерная сканирующая микроскопия тонких интраокулярных структур выполнялась с помощью той же низкоэнергетической фс-лазерной системы путем снижения мощности лазерного импульса до 1-2 мВт (рис. 1, 5, 7, 9, 11, 14, 16, 17, 20 и 21). Несмотря на то, что ТЭМ позволяла изучать препараты при большем увеличении (рис. 2, 6, 8, 10, 15, 18 и 22), разрешения фс-лазерной микроскопии было достаточно для того, чтобы качественно визуализировать ткань, намечать область абляции и контролировать процесс ее проведения.

Использовались два основных режима фс-лазерной микроскопии: трансмиссионный (1 мВт при сканировании 2 с) и аутофлуоресцентный (2 мВт при сканировании 16 с). Оба режима микроскопии в черно-белом изображении показывали структуру препаратов, паттерны линейной и плоскостной фс-лазерной абляции ткани, в том числе нанометрового диаметра (рис. 1, 5, 7, 9, 11, 16, 17 и 21). Однако диагностические возможности этих методик и показания к их применению различались.

Трансмиссионная микроскопия дифференцировала края препарата, выявляла инородные включения в ткань и фокальные иррегулярности ее поверхности. Данный режим микроскопии позволял получить обзорное изображение препарата, при этом были видны как области, находящиеся в фокусе микроскопа, так и зоны вне фокуса; дифференцировка между ними часто была затруднена (рис. 1, 5, 7, 9, 11 и 14). Линейные лазерные разрезы ткани в режиме трансмиссии оказывались в среднем на 40% уже истинной ширины абляции (рис. 1, 5, 7, 9, 11 и 21), которая определялась при ТЭМ. Поэтому трансмиссионный режим был полезен при обзоре зоны вмешательства и разметке паттернов фс-лазерного рассечения / иссечения, однако менее информативен для оценки объема выполненной абляции ткани.

При аутофлуоресцентной фс-лазерной микроскопии выявлялись истинные размеры линейной абляции, соответствующие тем, которые определялись при ТЭМ (рис. 1, 5, 7, 9, 11 и 21). Поэтому именно аутофлуоресцентная микроскопия использовалась для измерения ширины линейных разрезов препаратов. Зоны препаратов, находящиеся в фокусе микроскопа, визуализировались в виде участков аутофлуоресценции (рис. 1, 5, 7, 9, 11, 14, 17 и 21). В серии исследования с ВПМ сетчатки было показано, что степень флуоресценции была прямопропорциональна степени окраски препарата (рис. 9, 11 и 14). В неокрашенных ICG препаратах выявлялась минимальная флуоресценция. Напротив, зоны препаратов, находящиеся вне фокуса микроскопа, на аутофлуоресцентных снимках не выявлялись. Кроме того, при аутофлуоресцентной микроскопии не дифференцировались края препаратов, инородные включения в ткань и иррегулярности на поверхности мембран. Поэтому аутофлуоресцентный режим микроскопии использовался исключительно для контроля за объемом абляции ткани препарата.

Путем изменения фокусировки луча по Z-оси с помощью фс-лазерной микроскопии получали трехмерное изображение препарата и оценивали его толщину. Это давало возможность фокусировать лазерный луч при абляции как на поверхности препарата, так и в его толще (рис. 1, 5, 7, 9, 14, 16, 17, 20 и 21), что получило подтверждение при дальнейшем выполнении ТЭМ (рис. 2, 6, 8, 10, 15, 18 и 22) и СЭМ (рис. 19).

Также было показано, что разрешения фс-лазерной микроскопии недостаточно для дифференцировки внутренней и наружной поверхности мембран. Так, снимок, полученный при ТЭМ на рис. 15 показывает, что с помощью фс-лазера был удален не внутренний (витреальный), а наружный (ретинальный) слой ВПМ, имеющий иррегулярную поверхность. Тем не менее, эта проблема не должна негативно отражаться при применении фс-лазера in vivo, поскольку ориентиром для различения этих двух поверхностей мембраны будет служить прилежащий к ВПМ слой нервных волокон, четко дифференцирующийся при лазерной микроскопии (рис. 16 и 17). Кроме того, оба режима микроскопии не отличали поверхностные и внутритканевые разрезы мембран после абляции (рис. 1, 5, 7, 9, 14, 16 и 17), что потребует совершенствования программного обеспечения фемтосекундной лазерной системы.

В 16 препаратах контрольной группы, которые не подвергались абляции, но исследовались с помощью фс-лазерной микроскопии, при последующем выполнении ТЭМ было показано, что ни трансмиссионный, ни аутофлуоресцентный режимы микроскопии не приводили к повреждению как неокрашенных препаратов (рис. 23), так и ICG-окрашенных ВПМ сетчатки. Параметры фс-лазерного излучения при микроскопии были существенно ниже тех, которые могли привести к морфологически значимому повреждению исследуемых тканей (рис. 23).

Рис. 23. Фс-лазерная микроскопия (А и Б) и ТЭМ (В) одного и того же участка ЗКХ контрольной группы. Стрелки указывают на включения на поверхности ткани, которые хорошо видны при трансмиссионной микроскопии (А) и практически невидимы в аутофлуоресцентном (Б) режиме (лишь крупному включению на снимке А соответствует зона гипофлуоресценции, на которую указывает белая стрелка на снимке Б). ТЭМ демонструрует нормальную морфологию капсулы.

Таким образом, в данном исследовании мы показали, что низкоэнергетическая фемтолазерная система в ходе нанохирургии позволяла одновременно и с высоким разрешением выполнять мультифотонную бесконтактную микроскопию тонких интраокулярных структур, что превращало инструмент в “видящий” лазерный скальпель. Гистологические исследования не выявили морфологических изменений, специфичных для лазерного повреждения, что подтверждает безопасность фс-лазерной микроскопии для облучаемой ткани.

ВЫВОДЫ

  1. Показано, что с помощью низкоэнергетического инфракрасного Ti:Sa фемтосекундного лазера при длинах волн в диапазоне 750-800 нм возможно выполнение бесконтактных внутритканевых вмешательств на тонких интраокулярных структурах. Морфологически доказано, что низкоэнергетический фемтолазер является самым прецизионным в офтальмологии инструментом для рассечения и иссечения передней и задней капсулы хрусталика, внутренней пограничной мембраны сетчатки и ретинального слоя нервных волокон.
  2. Показано, что наименьшие разрезы тонких интраокулярных мембран в процессе низкоэнергетической фемтолазерной хирургии составили в среднем 150 нм (!) в диаметре при контролируемой глубине вмешательства.
  3. На модели окклюзии ретинальной вены показана возможность выполнения бесконтактного низкоэнергетического фемтосекундного лазерного разрушения тромба, окклюдирующего просвет магистральной вены сетчатки, с немедленным восстановлением кровотока в непроходимом сосуде. При этом вмешательство не сопровождается повреждением стенки ретинальной вены (в том числе эндотелиальной выстилки) и не требует ее катетеризации.
  4. Морфологически доказано, что низкоэнергетический фемтолазер производит “холодное” рассечение и иссечение тонких внутриглазных структур без коллатерального термического повреждения облучаемых тканей.
  5. Показано, что в ходе вмешательства на тонких интраокулярных структурах низкоэнергетическая фемтосекундная лазерная система предоставляет возможность одновременного выполнения мультифотонной бесконтактной микроскопии оперируемых тканей, что превращает инструмент в “видящий” лазерный наноскальпель. Фемтолазерная микроскопия позволяет с высоким разрешением визуализировать внутриглазные структуры, намечать зону рассечения и иссечения ткани и контролировать процесс операции. Гистологические исследования подтвердили безопасность фемтолазерной микроскопии для облучаемых тканей: морфологически не было выявлено никаких изменений, специфичных для лазерного повреждения.
  6. Доказано, что применение низкоэнергетической фемтолазерной микроскопии освобождает от необходимости прокрашивать переднюю и заднюю капсулы хрусталика для улучшения их визуализации в ходе операции. Напротив, применение витального красителя indocyanine green позволяет достоверно (p < 0,001) снизить энергетические параметры излучения при фемтолазерном удалении внутренней пограничной мембраны сетчатки, что исключает повреждение подлежащих ретинальных слоев (в том числе слоя нервных волокон) при случайной дефокусировке лазерного луча.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. Технологию низкоэнергетической Ti:Sa фемтолазерной хирургии и микроскопии следует считать новой перспективной энергетической методикой в офтальмологии, позволяющей рассекать, иссекать и одновременно визуализировать различные тонкие интраокулярные структуры. Высокая прецизионность, бесконтактность, возможность выполнения разрезов нано- и микрометрового диапазона в обычной солевой среде, “холодный” характер воздействия, не сопровождающегося термическим коллатеральным повреждением тканей, выгодно отличают технологию от традиционных инструментальных и энергетических способов рассечения тканей и позволяют рекомендовать для дальнейшей апробации в эксперименте in vivo.
  2. Технология низкоэнергетической фемтолазерной хирургии и микроскопии позволяет бесконтактно производить разрушение тромба внутри ретинальной вены с немедленным восстановлением кровотока в непроходимом сосуде. Вмешательство не сопровождается повреждением эндотелиальной выстилки, выполняется без вскрытия стенки сосуда и без его катетеризации. Обоснованы дальнейшие исследования по апробации методики в эксперименте in vivo.
  3. При выполнении низкоэнергетического фемтолазерного вмешательства отсутствует необходимость в прокрашивании передней и задней капсул хрусталика для улучшения их визуализации. Учитывая, что витальные красители являются потенциально токсичными для высокодифференцированных внутриглазных структур, данная технология является более безопасной по сравнению с традиционными методиками. Напротив, использование витального красителя indocyanine green при минимальных концентрации (0,05%) и экспозиции (30 с) является целесообразным при выполнении фемтолазерного удаления внутренней пограничной мембраны сетчатки. Такая техника позволяет достоверно (p < 0,001) снизить энергетические параметры излучения в ходе операции, что исключает повреждение подлежащих ретинальных слоев (в том числе слоя нервных волокон) при случайной дефокусировке лазерного луча.
  4. Целесообразны дальнейшие исследования в плане использования низкоэнергетического фемтосекундного лазера для удаления эпиретинальных мембран, разрушения эмболов при острой непроходимости ретинальных артерий и рассечения общего адвентициального сосудистого влагалища в месте артериовенозного перекреста при тромбозах ветвей центральной вены сетчатки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Toropygin S., Knig K., Hille K., Riemann I., Ruprecht K., Krause M. Femtosecond laser scanning microscopy and surgery of the retinal internal limiting membrane: pilot study // 103rd Annual Meeting of the German Ophthalmologic Society (DOG) in conjunction with the 15th European Ophthalmologic Society (SOE) Congress: E-Abstract 2909-2.11. – Berlin / Germany, 2005 (published in Ophthalmologe. – 2005. – Suppl. – P. 1002).
  2. Калинкин М.Н., Торопыгин С.Г., Заварин В.В. Опыт международного сотрудничества медицинских вузов Твери (Россия) и Саарланда (Германия) в научно-практической и образовательной сферах // Наука и образование 21 века: тенденции развития центрального региона России как части Европейского исследовательского и образовательного пространства: Сб. науч. тр. – Пенза, 2006. – С. 55-58.
  3. Торопыгин С.Г. Инновационные лазерные технологии в хирургии персистирующего макулярного отека // Новые технологии в территориальном здравоохранении: Сб. науч. тр. – Тверь, 2006. – С. 279-281.
  4. Торопыгин С.Г. Экспериментальные исследования в области лазерной хирургии внутренней пограничной мембраны сетчатки // Наука и образование 21 века: тенденции развития центрального региона России как части Европейского исследовательского и образовательного пространства: Сб. науч. тр. – Пенза, 2006. – С. 119-121.
  5. Khurieva E., Krause M., Toropygin S., Lw U., Seitz B., Ruprecht R.W., Hille K. Comparison of pars plana vitrectomy with ILM peeling and intravitreal triamcinolone in diffuse diabetic macular edema // 104th  Annual Meeting of the German Ophthalmologic Society (DOG): on CD. –  Berlin / Germany, 2006.
  6. Lw U., Knig K., Toropygin S.G., Hild M., Riemann I., Akaya A., Khurieva E.L., Mestres P., Krause M.H.J. Non-contact intravascular femtosecond laser (FSL) surgery and laser scanning microscopy in retinal vein occlusion: experimental pilot study // 11th Meeting of the European Society of Neurosonology and Cerebral Hemodynamics: on CD. – Dusseldorf / Germany, 2006.
  7. Lw U., Knig K., Toropygin S.G., Hild M., Riemann I., Akaya A., Khurieva E.L., Mestres P., B. Seitz, Krause M.H.J. Non-contact ablation and high-resolution imaging of experimental retinal thrombi with a non-amplified laser // 104th  Annual Meeting of the German Ophthalmologic Society (DOG): on CD. –  Berlin / Germany, 2006.
  8. Toropygin S. Germany through the eyes of a Russian eye doctor // Trilateral dialog about politics, culture and environment – Reflections by the 15th group of German Chancellor Scholars 2004/2005. – Bonn / Germany, 2006. – P. 119-127.
  9. Toropygin S.G., Krause M.H.J., Riemann I., Hild M., Khurieva E.L., Lw U., Mestres P., Seitz B., Ruprecht K.W., Knig K. Femtosecond laser surgery and scanning microscopy in branch retinal vein occlusion: experimental pilot study // Annual Meeting of the European Association for Vision and Eye Research (EVER): Book of abstracts. – Vilamoura / Portugal, 2006. – P. 145. (Published in Acta. Ophthalmol. Scand. – 2006. – 84 (Suppl.) – P. 239.
  10. Калинкин М.Н., Гнусаев С.Ф., Еремеев А.Г., Торопыгин С.Г., Заварин В.В. Перспективы международного сотрудничества медицинских ВУЗов Твери (Россия) и Саарланда (Германия) в научно-практической и образовательной сферах // Наука и политика в 21 веке: новые импульсы международного сотрудничества: Сб. науч. тр. – Пенза, 2007. – С. 89-92.
  11. Торопыгин С.Г. Внутрисосудистая фемтосекундная лазерная хирургия в лечении окклюзии ветви центральной вены сетчатки // Наука и политика в 21 веке: новые импульсы международного сотрудничества: Сб. науч. тр. – Пенза, 2007. – С. 126-128.
  12. Торопыгин С.Г. Инновационные лазерные технологии в хирургическом лечении непроходимости ветви центральной вены сетчатки // Лечебно-диагностические, морфо-функциональные и гуманитарные аспекты медицины: Сб. науч. тр. – Тверь, 2007. – С. 195-196.
  13. Торопыгин С.Г., Knig K., Hille K., Riemann I., Mestres P., Seitz B., Ruprecht K.W., Krause M.H.J. Фемтосекундная лазерная хирургия внутренней пограничной мембраны сетчатки: экспериментальное пилотное исследование // Современные технологии лечения витреоретинальной патологии: Сб. науч. тр. – М., 2007. – С. 205-209.
  14. Khurieva E., Krause M., Hille K., Riemann I., Mestres P., Brckner K., Seitz B., Toropygin S., Lw U., Knig K. Femtosecond laser scanning microscopy and surgery of epiretinal membranes // 105th Annual Meeting of the German Ophthalmologic Society (DOG): on CD. – Berlin / Germany, 2007.
  15. Khurieva E., Krause M., Riemann I., Mestres P., Lw U., Seitz B., Toropygin S., Hille K., Knig K. Femtosecond laser scanning microscopy and surgery of the epiretinal membranes // Lasers in Manufacturing: Book of abstracts. – Munich / Germany, 2007. – P. 899-901.
  16. Krause M., Khurieva E., Lw U., Hild M., Huss C., Riemann I., Mestres P., Seitz B., Toropygin S., Hille K., Knig K. Femtosecond laser in vitreoretinal surgery // 105th Annual Meeting of the German Ophthalmologic Society (DOG): on CD. – Berlin / Germany, 2007.
  17. Toropygin S., Krause M., Riemann I., Ruprecht K.W., Seitz B., Knig K. Femtosecond laser-assisted surgery of the posterior lens capsule: experimental pilot study // XXV Congress of the European Society of Cataract and Refractive Surgeons (ESCRS): Book of abstracts. – Stockholm / Sweden, 2007. – P. 146.
  18. Калинкин М.Н., Гнусаев С.Ф., Еремеев А.Г., Торопыгин С.Г., Заварин В.В. Международное сотрудничество Тверской государственной медицинской академии и медицинского факультета университета земли Саар (Германия) в научно-практической и образовательной сферах: итоги и перспективы // Верхневолжский медицинский журнал. – 2008. – №3. – С. 3-5.
  19. Торопыгин С.Г. Внутрисосудистая фемтолазерная хирургия при тромбозе ветви центральной вены сетчатки в эксперименте // Российская научно-практическая конференция офтальмологов “Ижевские родники”: Сб. науч. тр. – Ижевск, 2008. – С. 538-540.
  20. Торопыгин С.Г. Фемтолазерная абляция передней капсулы хрусталика в эксперименте // Современные технологии диагностики и лечения в медицине: Сб. науч. тр. – Тверь, 2008. – С. 242-244.
  21. Торопыгин С.Г. Фемтолазерная нанохирургия задней капсулы хрусталика: экспериментальное исследование // Фундаментальные и прикладные аспекты медицины: Сб. науч. тр. – Тверь, 2008. – С. 282-284.
  22. Торопыгин С.Г. Фемтолазерная ретинотомия в эксперименте // Современные технологии диагностики и лечения в медицине: Сб. науч. тр. – Тверь, 2008. – С. 239-241.
  23. Торопыгин С.Г. Экспериментальная фемтолазерная нанохирургия задней капсулы хрусталика // Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения: Сб. науч. тр. – М., 2008. – С. 95-97.
  24. Торопыгин С.Г. Экспериментальная фемтолазерная передняя капсулотомия в хирургии катаракты // Наука и культура в 21 веке: новые пути к бесконфликтному обществу: Сб. науч. тр. – Пенза, 2008. – С. 85-87.
  25. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К., Гундорова Р.А.  Способ удаления внутриглазных инородных тел из заднего отдела глаза передним путем. Заявка на патент РФ № 2008113486/11 от 10.04.2008; патент РФ на изобретение № 2364383 от 20.08.2009.
  26. Торопыгин С.Г., Krause M.H.J., Riemann I., Hild M., Mestres P., Seitz B., Ruprecht K.W., Knig K. Экспериментальная интраваскулярная фемтолазерная хирургия в лечении тромбоза ветви центральной вены сетчатки // Современные технологии лечения витреоретинальной патологии: Сб. науч. тр. – М., 2008. – С. 184-186.
  27. Akaya A., Krause M., Riemann I., Toropygin S., Troeber L., Loew U., Mestres P., Seitz B., Koenig K. Femtosecond laser ablation and imaging of human lens capsule in vitro // XXI International congress of German ophthalmic surgeons (DOC): available at http://doc-nuernberg.de/index_en.html. – Nuernberg / Germany, 2008.
  28. Hild M., Krause M., Riemann I., Mestres P., Toropygin S., Lw U., Brckner K., Seitz B., Jonescu-Cuypers C., Knig K. Femtosecond laser-assisted retinal imaging and ablation: experimental pilot study // Cur. Eye Res. 2008. Vol. 33. P. 351-353.
  29. Toropygin S., Krause M., Riemann I., Akkaya A., Seitz B., Knig K. Experimental femtosecond laser-assisted nanosurgery of the anterior lens capsule // XXVI Congress of the European Society of Cataract and Refractive Surgeons (ESCRS): Book of abstracts. – Berlin / Germany, 2008. – P. 155.
  30. Toropygin S.G., Krause M.H.J., Riemann I., Hild M., Khurieva E.L., Mestres P., Seitz B., Ruprecht K.W., Knig K. In vitro intravenous femtosecond laser-assisted surgery in models of branch retinal vein occlusion // Cur. Eye Res. 2008. Vol. 33. P. 277-283.
  31. Toropygin S., Krause M., Riemann I., Seitz B., Mestres P., Ruprecht K.W., Knig K. In vitro femtosecond laser-assisted nanosurgery of porcine posterior lens capsule // J. Cataract Refract. Surg. 2008. Vol. 34. P. 2128-2132.
  32. Торопыгин С.Г. Перспективы использования низкоэнергетическо-го фемтосекундного лазера в интраокулярной хирургии: экспериментальное исследование // Лазеры в офтальмологии: вчера, сегодня, завтра: Сб. науч. тр. – Москва, 2009. – С. 530-532.
  33. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К. Современные аспекты этиопатогенеза, медикаментозного и лазерного лечения тромбоза ветви центральной вены сетчатки: обзор литературы // Вест. Российской академии медицинских наук. 2009. №7.   С. 37-40.
  34. Торопыгин С.Г. Современные аспекты хирургического лечения тромбоза ветви центральной вены сетчатки // Вест. Российской академии медицинских наук. 2009. №8.   С. 29-32.
  35. Торопыгин С.Г. Способ интравитреального введения лекарственных веществ в ходе экстракапсулярной экстракции катаракты. Заявка на патент РФ № 2009140675 от 06.11.2009. Формальная экспертиза пройдена.
  36. Торопыгин С.Г. Тромбоз ветви центральной вены сетчатки: современный взгляд на проблему // Верхневолжский медицинский журнал. – 2009. – №2 – С. 43-50.
  37. Торопыгин С.Г. Удаление вколоченного в сетчатку инородного тела передним путем через отверстия переднего и заднего капсулорексисов: случай из практики // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины: Сб. науч. тр. – Тверь, 2009. – С. 255-257.
  38. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К. Ретинотомия / ретинэктомия в процессе витрэктомии: показания, эволюция развития и современная техника // Офтальмохирургия. 2009. №6.   С. 48-54.
  39. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К. Хирургия внутренней пограничной мембраны сетчатки (сообщение 1) // Вест. офтальмол. 2009. №6.   С. 46-51.
  40. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К. Хирургия внутренней пограничной мембраны сетчатки (сообщение 2) // Вест. офтальмол. 2009. №6.   С. 51-55.
  41. Торопыгин С.Г., Krause M.H.J., Riemann I., Hille K., Mestres P., Ruprecht K.W., Seitz B., Knig K. Фемтосекундная лазерная абляция и сканирующая микроскопия внутренней пограничной мембраны сетчатки (экспериментальное исследование) // Вест. офтальмол. 2009. №5. С. 21-28.
  42. Hild M., Seitz B., Krause M., Khurieva E., Toropygin S., Riemann I., Koenig K. In vitro femtosecond laser ablation and imaging of ocular tissues // 107th Annual Meeting of the German Ophthalmologic Society (DOG): E-Abstract DO.14.08. – Berlin / Germany, 2009.
  43. Торопыгин С.Г. Бесконтактная низкоэнергетическая фемтолазерная нанохирургия и микроскопия тонких интраокуоярных структур в эксперименте // Наука и инновации в модернизации России и развитии мира: Сб. науч. тр. – Москва, 2010. – С. 169-171.
  44. Торопыгин С.Г. Новая техника интравитреальных инъекций лекарственных препаратов в ходе факоэмульсификации с имплантацией интраокулярной линзы // Общие и частные вопросы медицины: Сб. науч. тр. – Тверь, 2010. – С. 164-166.
  45. Торопыгин С.Г. Перспективные направления применения низкоэнергетического фемтосекундного лазера в полостной офтальмохирургии // Актуальные проблемы современной медицины: Сб. науч. тр. – Москва, 2010. – С. 403-404.
  46. Торопыгин С.Г. Случай успешного удаления вколоченного в сетчатку инородного тела передним путем через отверстия переднего и заднего капсулорексисов // Международная научно-практическая конференция по офтальмохирургии “Восток – Запад”: Сб. науч. тр. – Уфа, 2010. – С. 279-280.
  47. Торопыгин С.Г. Типичные окклюзии ретинальных вен: этиопатогенез, диагностика и лечение (обзор литературы) // Международная научная конференция офтальмологов “Невские горизонты”: Сб. науч. тр. – С.-Петербург, 2010. – на CD.
  48. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К. Капсулотомия / капсулэктомия в факохирургии: эволюция развития и современная техника (сообщение 1) // Вест. офтальмол. 2010. №2. -  С. 56-60.
  49. Торопыгин С.Г., Мошетова Л.К. Капсулотомия / капсулэктомия в факохирургии: эволюция развития и современная техника (сообщение 2) // Вест. офтальмол. 2010. №3. -  С. 49-52.
  50. Khurieva-Sattler E., Krause M., Lw U., Gatzioufas Z., Toropygin S., Seitz B., Ruprecht K., Hille K. Comparison of pars plana vitrectomy with ILM peeling and intravitreal triamcinolone in diffuse diabetic macular edema // Klin. Monatsbl. Augenheilkd. 2010. Vol. 227. №6. P. 496-500.
  51. Toropygin S.G., Krause M., Akkaya A., Riemann I., Seitz B., Mestres P., Ruprecht K.W., Troeber L., Gatzioufas Z., Knig K. Experimental femtolaser-assisted nanosurgery of anterior lens capsule // Eur. J. Ophthalmol. 2010. Sep. 10 [Epub ahead of print].

Список сокращений

ВПМ                внутренняя пограничная мембрана

ЗКХ                задняя капсула хрусталика

ПКХ                передняя капсула хрусталика

СЭМ                сканирующая электронная микроскопия

ТЭМ                трансмиссионная электронная микроскопия

ЦВС                центральная вена сетчатки

ICG                indocyanine green (индоцианиновый зеленый, с англ.)




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.